Western blot的原理、操作及注意事项

Western blot的原理、操作及注意事项

原理：

通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。

一、抗原的选择和制备

A：样品的制备

1 组织：

组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。加入β-ME加入，溴酚蓝（加入）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。

2 细胞：

细胞的处理方法：离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer，收集，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。加入β-ME加入，溴酚蓝（加入）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。

3 分泌蛋白的提取（特例）：

直接收集分泌液，加入β-ME、溴酚蓝制样。

B：蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因

1.双缩脲法：

双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。在需要快速，但不很准确的测定中，常用此法。硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。双缩脲法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。双缩脲法常用于L～10g/L含量的蛋白质溶液测定。干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等。可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1m NaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定。

法：

此法是双缩脲法的进一步发展。他的第一步就是双缩脲反应，即Cu++与蛋白质在碱性溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂（福林-酚试剂），结果得到深蓝色物。此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定20mg/L～400mg/L含量的蛋白质溶液。其干扰物质与双缩脲法相同，而且受他们的影响更大，硫醇和许多其他物质的存在会使结果严重偏差。另外要注意的是，加入福林试剂时要特别小心，试剂只在酸性pH环境中才稳定，上述提到的还原反应只有在pH10时才发生，因此，福林试剂加入到碱性的Cu2+-蛋白质溶液中时，必须立刻搅拌，以使磷钼酸-磷钨酸试剂在未被破坏之前能有效地被Cu2+-蛋白质络合物所还原。

3.紫外吸收法：

大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故，因此，利用这个特异性吸收，可以计算蛋白质的含量。如果没有干扰物质的存在，在280nm处的吸收可用于测定～ml含量的蛋白质溶液。部分纯化的蛋白质常含有核酸，核酸在260nm波长处有最大吸收。有核酸时，所测得的蛋白质浓度必须作适当校正，一般按下述公式粗略计算：

是蛋白质溶液在280nm波长处（光程1厘米）测得的光密度值。是蛋白质溶液在260nm小波长处（光程1厘米）处所测得的光密度值。

此方程是从烯醇酶（在酵母核酸存在时）得出来的。因此，对其他蛋白质和其他核酸不一定适用。由于各种蛋白质所含芳香族氨基酸的量不同，因此，浓度为%的各种蛋白质在280nm

处的消光系数（）在～之间变化。

所有的蛋白质在230nm以下都有强吸收。例如，牛血清白蛋白的α%在225nm和215nm处分别为和，而在280nm处测为。在230nm以下的强吸收是由于肽键的存在，因此，此值对所有的蛋白质都是一样的。从215nm和225nm处的光密度之差可用于测定浓度为10μl/ml～100μl/ml 的蛋白质。蛋白质浓度可以近似地由下式得到：

光密度之差求

得，这一公式是减去溶液中非蛋白质成分产生的误差。但是，蛋白质之间的分子量差异比较大，因此，在比较几种蛋白质含量时，必须作适当的校正。由于蛋白质的吸收峰常因pH改变而变化，所以在制作标准曲线时，必须与样品条件一致。

4. Bradford比色法：

Bradford比色法比Lowry法测定蛋白浓度更简单迅速。用脱氧胆酸/三氯乙酸沉淀蛋白可排除甘油、去污剂、2-巯基乙醇、乙酸、硫酸铵、Tris和一些碱性缓冲系统的干扰。

分别在两组微量离心管中各加入ml牛血清白蛋白（5，10，15和20μl），以l NaCl补足至100μl，同时以两管100μl的l NaCl作空白对照。每管各加入1ml考马斯亮蓝染料溶液，振荡混匀，室温放置2分钟。用1cm光径的微量比色杯测A595，取A595吸光值对标准蛋白浓度作图，画标准曲线，并测量待测样品的A595。从BSA标准曲线中确定待测样品的浓度。测定10-100μg的蛋白质，要在较大试管中将染料溶液体积增大5倍进行。样品浓度过高，可稀释后进行，或在10-100μg 另作一标准曲线进行测定。

5．电泳估算法（我们选择此法）：

样品倍比稀释，SDS-PAGE电泳，同时做定量marker对照，可以估算样品大概浓度。

以提取癌组织总蛋白为例：

①取等量胰腺癌组织、癌旁组织及正常胰腺组织，用dH2O漂洗5～10次，再用预冷的1×PBS 洗涤3次，目的是去除样本中的血液。

②每2克组织加入3ml 1×PBS匀浆，保持在4℃条件进行。

③加入5×STOP Buffer缓冲液1ml，混匀，4℃下超声碎化。再加入β-ME，溴酚蓝，煮沸10mins，至此，制样过程完成；

④SDS-PAGE电泳，以BAS作为对照估计样品蛋白浓度。

二、SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS－PAGE）

A：实际操作

做胶前的准备

1)检查是否有足够的、干净的spacer、comb 和架子。

2)检查是否有新鲜的，足量10%APS，没有立刻重配。

3)按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子量大小，计算出胶的浓度，并算出分离胶各组分的用量。

制胶，电泳

1）装好架子。

在胶上面加入一层蒸馏水，促进胶更好的凝集。

3)

倒好后插入预先准备好的梳子。

4)待胶凝集好后，上样，电泳。上层胶用60-80V电压，当样品至分离胶时，用100-120V电压。一般电泳时间在小时左右。

B ：注意事项及常遇到的问题

1）分离胶不要倒的太满，需要有一定的浓缩胶空间，否则起不到浓缩效果。

2）上样蛋白量不应超过30ug/mm2 (载荷面即：如果你的胶槽是5mm×1mm，则载荷面为：1mm ×5mm=5mm2) 。

3）gel通常在内凝集最好，过快表示TEMED、APS用量过多，此时胶太硬易龟裂，而且电泳时容易烧胶。太慢则说明两种试剂用量不够或者系统实际不纯或实效。

4）混合搅拌速度太快产生气泡影响聚合，导致电泳带畸形。太慢不均匀，特别是甘油。

5）电泳中常出现的一些现象：

︶条带呈笑脸状，原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。

︵条带呈皱眉状，可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。

拖尾：样品溶解不好。

纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒。

条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏斜。

条带两边扩散：加样量过多。

三、转移

在电流的作用下，使蛋白质从胶转移至固相载体（膜）上。

膜的选择：印迹中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF等。我们选用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性。有两种规格：Immobilon-P（）和Immobilon-PSQ for MW<20kDa)。

A 半干法

即将凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间，通过滤纸上吸附的缓冲液传导电流，起到转移的效果。因为电流直接作用在膜胶上，所以其转移条件比较严酷，但是其转移时间短，效率高。

1 实验条件的选择

电流1mA-2mA/cm2，我们通常100mA/膜，按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间，具体

可以根据实际适当调整。

目的蛋白分子大小(kDa)胶浓度转移时间(h)

80---1408%

实验操作

（1）滤纸和膜的准备(在电泳结束前20分钟应开始准备工作)。

检查是否有足够的transfer buffer，没有立即配制。

检查是否有合适大小的滤纸和膜。

将膜泡入甲醇中，约1-2分钟。再转入transfer buffer中。

将合适的靠胶滤纸和靠膜滤纸分别泡入transfer buffer 中。

（2）转移

在电转移仪上铺好下层滤纸。一般用三层。

将膜铺在靠膜滤纸上，注意和滤纸间不要有气泡，再倒一些transfer buffer到膜上，保持膜的湿润。

将胶剥出，去掉stack gel，小心的移到膜上。

剪去膜的左上角，在膜上用铅笔标记出胶的位置。

将一张靠胶滤纸覆盖在胶上。倒上些transfer buffer，再铺两张靠胶滤纸。

装好电转移仪，根据需要选定所需的电流和时间。

转移过程中要随时观察电压的变化，如有异常应及时调整。

靠胶滤纸

胶

膜

靠膜滤纸

3 注意事项及常遇到的问题

1）滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸>=膜>=胶。

2）滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。

3）因为膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全浸湿。而且在以后的操作中，膜也必须随时保持

湿润（干膜法除外）。

4）滤纸可以重复利用，上层滤纸（靠膜）内吸附有很多转移透过的蛋白质，所以上下滤纸一定不能弄混，在不能分辨的情况下，可以将靠胶滤纸换新的。

5）转移时间一般为小时，( 1mA-2mA/cm2，10% gel)，可根据分子量大小调整转移时间和电流大小。

B 湿法

我们基本上不用此方法，这里暂不做介绍。

C 转移后效果的鉴定

1．染胶

用考马斯亮兰染色经destain脱色后，看胶上是否还有蛋白来反映转移的效果。

2．染膜

有两类染液选择，可逆的和不可逆的。可逆的有ponceau-s red 、Fastgreen FC、CPTS等，这类染料染色后，色素可以被洗掉，膜可以用做进一步的分析用。但是不可逆的染料，如考马斯亮兰、india ink、10B等，染色后膜就不能用于进一步的分析。

四、封闭（block）

封闭是为了使我们的抗体仅仅只能跟特异的蛋白质结合而不是和膜结合。

常用的封闭液有bovine serum albumin(BSA)，non-fat milk，casein，gelatin，tween-20等，我们一般用non-fat milk。

在转移结束前配好5%的Milk(TBST溶解)。转移结束后将膜放入milk中block(一定要放在干净的容器里，避免污染而且要足以覆盖膜)，并清洗整理好用过的滤纸，以便下次使用。Block 4°C O/N，或RT 1小时。

五、孵育一抗

先将需要检测的抗体准备好，并决定好它们的稀释度。

配好5%的Milk(TBST溶解)，按要求稀释好抗体。注意，如需高比例稀释，

最好采用梯度稀释。

将稀释好的抗体和膜一起孵育。一般采用RT 1小时，可根据抗体量和膜上

抗原量适当延长或缩短时间。

注意：为了便于后面分析结果，我们一般会选用已确定分子量大小而且纯度高的抗体作为marker 与一抗同时孵育。

六、洗涤

用TBST先快速洗三次，把milk尽快的wash掉。然后5mins *5。

洗涤是为了洗去一抗与抗原的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅。

七、孵育二抗

孵育RT1 小时。一般采用HRP标记的二抗，稀释比例为1:5000。

二抗的稀释比例不能太低，否则容易导致非特异性的结合。

注意二抗的选择有多种，要根据一抗来选择抗兔、抗鼠或者抗羊的二抗，以及根据后面的显色条件来选择HRP、AP或者GOD（葡萄糖氧化酶）酶链的二抗或者标志其他探针（如核素等）的。

八、洗涤

用TBST先快速洗三次，把milk尽快的wash掉。然后5mins *5。

洗涤是为了洗去二抗的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅，所以洗涤一定要干净。

九、显色（HRP酶）

1．增强化学发光法(ECL)

Ecl 显色原理：氨基苯二酰肼类主要是鲁米诺及异鲁米诺衍生物，是最常用的一类化学发光剂。鲁米诺（luminol，5＇-氨基-2，3-二氢-1，4-酞嗪二酮）的分子结构及化学反应式如下：

鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物，也可用作过氧化物酶的底物。在Ecl底物中，含有H2O2和鲁米诺，在HRP（辣根过氧化物酶）的作用下，发出荧光来。

试验步骤：

1）将两种显色底物1：1等体积混合（一般各1ml/membrane）。

2）将混合物覆盖在膜表面，1-2分钟，摇晃使均匀。

3）用保鲜膜把膜包起来，放入夹板中。

4）在暗室中将X光片，覆盖在膜的上面，夹好夹子，曝光1min。

5）显影、定影。

6）根据结果调整曝光时间和曝光区域，得到最佳结果。

注意：荧光在一段时间后会越来越弱。

显色

DAB（3,3二氨基联苯胺）和HRP反应产生棕色的不溶终产物。这种棕色沉淀不溶于酒精和其它有机溶剂，对于必需使用传统复染和封固介质的免疫组化染色应用特别理想。

对于AP标记的二抗我们选用BCIP and NBT 显色，它们在碱性磷酸酶（AP）作用下反应可生成一种不溶性黑紫色沉淀的强信号。

十、分析结果及其判断

常见问题原因分析及处理方法：见附录一、二。

附录一：Troubleshooting Blotting Problems （P43－48）

附录二：Western Blotting Troubleshooting Logic Tree （P390－394）

附录三：试验中所用到的试剂和缓冲溶液

5x Stop Solution (Sample buffer) :

Stock: to use:

20% Glycerol 100ml take stock

10% SDS 50g or 250ml 20% SDS add BME

250mM Tris bromphenol blue or total pyronine 4 to taste 2) Gel solution (30% w/v acrylamide mix):

bis-acrylamide

% acrylamide

total 100ml

3) 2x Laemmli Separation Buffer:

Tris-HCl

% SDS 10ml 20% SDS

total 1000ml

4) 2x Laemmli Stacking Buffer:

Tris

% SDS 1g

total 500ml

5) 10x Laemmli Running Buffer:

250mM Tris

Glycine

1% SDS 20g

total 2 liters

6) Transfer Buffer:

48mM Tris base

39mM Glycine

% SDS

20% MeOH 200ml

total 1000ml

7) TBST:

10mM Tris-HCl，

100mM NaCl

% Tween-20

Total 1000ml

8) Coomassie Stain :

40%MeOH 400ml

10%HAc 100ml

%BBR 1g Brilliant Blue R

total 1000ml

9) Destain:

30%MeOH 300ml

%HAc 75ml

total 1000ml

10) 10×丽春红染液配方：

丽春红2g

磺基水杨酸30g

三氯醋酸30g

total 100ml

11）DAB

DAB 50mg

L TB （）100ml

30%H2O230-40ul

先配成2-5倍的储存液，过滤后分装，-20℃避光保存，H2O2在工作液中终浓度％。

westernblot详细图解

Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以

检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材 电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素 膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。

Westernblot实验步骤及注意事项1(精)

Westernblot实验步骤及注意事项 Westernblot 实验步骤 1. 组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃ 4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟 6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度 8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液 9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA） 12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟） 13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色 15. 分析比较记录 western blot的实验步骤及注意事项的资料 1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。 1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。 2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。 3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。

4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。 5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。 6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。 2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。 3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。 4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。 5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。 6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。 7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。 8．混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜） 9．用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。 10．将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时。 11．按步骤9洗涤。 12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS），于室温下摇动。注意事项： western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。实验中取胶和膜需带手套。 Western实验步骤 Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western可以参 考如下步骤进行操作。 1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation) O 可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚 细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒 进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。 O 收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要 采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生

WB实验步骤

Western blotting实验步骤 1．蛋白质的样品制备： 取心肌组织50mg，待组织块自行溶解，用滤纸吸去其表面水分，将组织块放入玻璃匀浆器球状部位，用组织剪尽量将其剪碎，将剪碎的心肌组织放入玻璃匀浆器的杆状部，按1mlRIPA+10ulPMSF/100mg心肌组织的比例加入RIPA和PMSF（先加RIPA再加PMSF），将玻璃匀浆器插入冰中，匀浆约30分钟。 将心肌组织匀浆转移到离心管中，4℃12000g离心5分钟，收集上清（如有粘稠物进一步用超声处理），样品分装冻存于-20℃备用。 2 .测定蛋白浓度： 2.1 按50：1配置BCA工作液。 2.2 10ulC液（蛋白标准）+90ulPBS液稀释成0.5mg/ml的蛋白标准液。 2.3 分别以0、1、2、4、8、12、16、20ul将蛋白标准液加入96孔板的第1~8标准孔中，在其他样品孔中加入10ul待测样品。 2.4 分别加PBS定容至20ul。 2.5 各孔中加入200ulBCA工作液，室温放置2小时。 2.6 用酶标仪测定蛋白浓度：测定A562，依标准曲线算出蛋白浓度。 3 SDS-PAGE电泳： 3.1 制胶: 按比例配制分离胶，缓缓地摇动溶液，使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水，以阻止氧气进入凝胶溶液中，静置40min。同前按比例配制浓缩胶，但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，连续

平稳的注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静制60min以上以保证完全聚合。 3.2 预电泳：将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入电泳缓冲液后低电压10-20V的预电泳20-30min。（目的是清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通）。 3.3 样品准备：首先计算上样体积，然后按样品：上样buffer=4：1的比例加入上样bufer混匀，沸水煮10分钟，冰上5分钟。 3.4 加样：预电泳后依次加入标准品（Marker）和待分析样品。（加样时间要尽量短，以免样品扩散，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免边缘效应。每个泳道加5ul。 3.5 电泳：加样完毕，选择80V恒压进行电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿到达两胶交界处（一般约20分钟），更换至100V恒压电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳（一般约为1小时20分钟）。 4．转膜： 4.1 切胶：将电泳完毕的胶完整的放在盛有电转液的玻璃皿中，将目的蛋白所在区域切下来，测量其长宽，并记录。 4.2 剪膜和滤纸：按胶的尺寸剪膜和滤纸（滤纸长宽较凝胶小0.5~1mm，PVDF 膜长宽较凝胶大0.5~1mm），滤纸浸入盛有电转液的玻璃皿中10秒钟，膜放入盛有10%甲醇的玻璃皿中10秒钟，然后将两者都放入盛有去离子水的玻璃皿中3分钟，进一步放入盛有电转液的玻璃皿中3分钟。 4.3 向电转槽中倒入部分电转液，将海绵浸入。按如下顺序制作“三明治”（注意避免两边滤纸相互接触，以免发生短路）。从正极到负极按如下顺序排列：

westernblot实验详细步骤(1)

Western Blot实验技术一、制胶 SDS-PAGE分离胶配方表 1、检查制胶器是否漏水，吸干玻璃中水分

2、配置分离胶，加入玻璃板中（注意：不能有气泡和杂物），距离玻璃上口1.5mL停止加胶。 3、再加ddH2O或异丁醇水封除去气泡，凝胶后倒掉水，吸干水到浓缩胶插梳。 二、上样 1、先在内槽加满电泳液才可以拔梳子。 2、拔梳子时垂直向上拔出，不可左右摇晃梳子。 3、拔完梳子后观察梳子孔，是否有缺口和歪，用针头拨正。 4、上样时从左到右依次上样。 5、若上样组不多时，左右第一孔不加样。 6、要预留Marker的上样孔。 三、电泳 四、转膜

PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。 （转膜缓冲液：需4度预冷，现配现用，不能放太久。） 1、转印滤纸：全胶长8.5cm，宽5.5cm，需剪裁成7层滤纸，压平后约3mm。需在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 2、海绵垫：在转膜液中平衡浸泡备用。 3、PVDF膜：剪裁8.5cm*5.5cm ，需在甲醇中浸润2min（活化膜上正电基团），然后在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 4、凝胶：凝胶也需要在预冷的转膜转膜缓冲液中平衡浸泡3－5分钟。否则在转膜过程中会出现皱缩，导致出现转移的条带变形。 三明治夹心法：负极（黑）-海绵垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-正极（白） 转膜时间：通电恒流，60V，一个槽100mA左右，1h

（注意：在操作过程中用玻棒赶走气泡。 装置转膜仪时注意黑对黑（负对负），白对红（正对正）。 装置运行时需冰浴。） 五、封闭 在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止抗体对非转印蛋白区域的非特异性吸附。 封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，本实验室常用的有5%BSA，10%脱脂奶等，至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测目的相适应（做l酪氨酸磷酸化时不推荐non-fat milk 封闭）。 1、将脱脂奶粉封闭液（1xTBST:脱脂奶粉=20mL：2g一块膜用量。牛血清蛋白、5%BSA 效果更好）倒好。 2、将PVDF膜取出放入封闭液中，盖子改好。 3、封膜一般常温1-2小时即可，也可4℃封闭过夜。 六、一抗 抗体反应主要采用间接法: 即先加入未标记特异性一抗与膜上抗原结合后，再加入标记的二抗进行杂交检测，标记二

高中会考复习Word操作要点

1 W ord 操作要点 一、文本编辑 文本编辑先选中对象，再施加命令（这是Windows 系统操作的特征） 1、字体设置（格式/字体）

2 2.段落设置（格式/段落。必须先选中要编辑的段落，再设置命令） 选定文本技巧：鼠标在文本左侧，进行单击、双击和三击的不同作用。 经过西安交通大学附属中学与欧盟教育基金会长期准备，备受教育界关注的第四届世界名中学校长论坛于 4月4日在古城西安隆重开幕。 第四届世界名中学校长论坛是全球教育界最为重要的盛会之一。世界名中学校长论坛由欧盟教育基金会于2005 年发起，

3 使用标尺滑竿也可调整左右缩进与首行缩进。特别注意对标题居中处理时，首行缩进为0，否则不能达到标题完全居中。 3、页面设置（文件/页面设置）

4 4、插入页眉/页脚（视图/

5 5、图文混排编辑 （1）插入图片（插入/图片/来自文件） 插入剪贴画与艺术字的方法类似 选择插入点，插入图片，默认插入的图片是“嵌入式”，图片四周有八个调整柄，用它可以调整图的大小。（当鼠标指针变为 时，可调整图片大小） （2）在图中右击，选择“设置图片格式”，弹出对话框设置图的环绕格式，一般使用“四周型”环绕。（在“高级”中还可对环绕方式做更为详细的设置）

6 （3）鼠标移到图内，变为十字箭头形状时，拖动鼠标，调整图片位置。 第四届世界名中学校长论坛是全球教育界最为重要的盛会之一。世界名中学校长论坛由欧盟教育基金会于2005年发起，旨在促进中外基础教育的交流与合作，提供表达观点、交换意见、形成共识的平台，此前已经分别在上海、伦敦、北京成功地举办了三次。本届论坛不仅秉承传统，而且盛况空前，参加此次盛会的中外教育专家、政府官员近200人，英国伊顿公学校长Tony Little 、英国GDST 基金会总裁Barbara Harrison 、美国大学理事会高级副总裁James Michael Montoya 、英国剑桥大学国际考试委员会课程开发主任Kevin Stannard 、欧盟教育基金会董事长Berry Bock 、美国密歇根大学副校长 Lester.P.Monts 、美国 宾夕法尼亚大学研究生院副院长Davis Cheng 、德国联邦外交部国际教育司中国区专员Diana Amann 、美国University School 校长Stephen Murray 、中国教育国际交流协会会长柳斌、中国信息化推进联盟专家委员会刘延宁、中国教育学会高中教育专业委员会理事长王本中、北京大学法学院教授孙东东、北京市第四中学校长刘长铭等知名教育专家出席了会议。 6、插入文本框（插入/文本框）

Westernblot基本操作步骤

W e s t e r n b l o t基本操作步骤 一、细胞蛋白的提取 弃去培养基，加入预冷的PBS洗一遍，加入的RIPA裂解液（含1mM PMSF(100×)，每10ml加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂各一片，六孔板每孔150-250μl，60mm×15mm 培养皿300-400μl，），于冰上裂解约5分钟，裂解总液12000rpm离心10 min。取上清，用BCA法测定蛋白浓度。用于western blot的蛋白样品取一定量加4×loading buffer，10×reducing，再用裂解液补齐到所需上样体积。离心，使蛋白沉底。将EP管于沸水中煮5min，变性，之后再离心后准备上样。 二、BCA法测蛋白浓度操作步骤 将蛋白标准配制溶液溶解蛋白标准（BSA），配制成5mg/ml的蛋白标准溶液，10μl 分装，-20℃冷冻保存。 完全溶解蛋白标准品，取10μl用PBS稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。 据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μl加到96孔板的标准品孔中，加稀释标准品的溶液补足到20μl。 加适当体积样品到96孔板的样品孔中（可以通过预实验摸索稀释倍数），加PBS 到20μl。 各孔加入100μl BCA工作液，37℃放置30分钟。 测定580nm条件下吸光度。根据标准曲线计算出蛋白浓度。 三、Western blot基本操作步骤 1、溶液配制： ①Runnig Buffer(1×)：SDS Runnig Buffer（20×）50mL，加MiliQ水至1L； ②Transfer Buffer(1×): Transfer Buffer(10×)100mL,甲醇200mL（20%，v/v），加MiliQ水至1L； ③TBST缓冲液 1M Tris·HCl（pH7.6）：60.5g Tris-base，加入约30ml浓盐酸，调PH至7.6，加MiliQ 水至500ml。 TBS缓冲液（10×）：1M Tris·HCl 100ml+80g NaCl加MiliQ水1L TBST缓冲液（1×）：TBS缓冲液（10×）100ml+0.5ml Tween-20（0.05%，v/v），加MiliQ水至1L。 ④封闭液：5% BSA（5g/100ml，称取1g BSA至20ml TBST，充分混匀溶解） 2、样品准备与加样 ①用4×SDS loading buffer, 10×reducing与蛋白质样品混合，并将此EP 管放在水浴锅中沸水煮5min，使蛋白质变性。 ②将预制胶固定到电泳装置中，并在装置中加满Runnig Buffer(1×)，内槽加入0.5mL 抗氧化剂，小心拔下梳子； ③向上样孔中加入一定体积的蛋白样品（总蛋白量20μg以上）。向marker孔中加入2.5μl marker（按照实验要求设定marker量），向空白孔中加入一定体积的加样缓冲液(loading buffer)。注意采用相同（或相近）的上样体积，以保证蛋白的各带宽度相同。防止体积较大的上样孔中的蛋白质将向相邻的泳道扩散。 3、电泳

western blot操作注意事项

一．配胶 1．注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。 2．分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）即可 3．封胶：灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。封胶后切记，勿动。待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。 4．灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡进入梳孔使梳孔变形。拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶。若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。 二．样品处理 1．培养的细胞（定性）： ⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。 ⑵对于6孔板来说每孔加200~300μl，60~80℃的1×loading buffer。 ⑶100℃，1min。 ⑷用细胞刮刮下细胞后在EP管中煮沸10min，期间vortex 2~3次。 ⑸用干净的针尖挑丝，如有团块则将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，则可以将EP 管置于0℃后在14000~16000g离心2min，再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可通过使用1ml注射器反复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。 ⑹待样品恢复到室温后上样。 2．培养的细胞（定量）： ⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。 ⑵加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。 ⑶用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。 ⑷12000g离心，4℃，2min。 ⑸取少量上清进行定量。 ⑹将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。 3．组织： ⑴匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。 ⑵12000g离心，4℃，2min。 ⑶取少量上清进行定量。 ⑷将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液

(完整word版)呼吸机的操作步骤及注意事项

操作步骤 1、连接电源、气源（压缩气和氧气），湿化罐中加入灭菌注射用水并安装，正确紧密连接管道。 2、开机程序：依次打开压缩机开关→主机开关→湿化器开关。 3、根据病情遵医嘱选择呼吸模式和正确设置参数及报警范围。 4、接模拟肺，观察呼吸机运行是否正常。 5、脱模拟肺，将呼吸机和病人人工气道正确连接。 6、观察胸廓起伏，听诊两肺呼吸音，评估病人通气后状况。 7、严密观察神志、血氧饱和度、呼吸、循环、等各项指标，及时排除呼吸机故障，并作好记录。 8、通气半小时后抽动脉血气分析，根据血气结果调节参数。 9、掌握撤机指征，病人自主呼吸恢复，血气分析正常可试脱机。 10、备好氧气装置和呼吸囊。 11、脱开呼吸机，吸氧。 12、关机程序：脱机→关主机开关→压缩机开关→湿化器开关→拔电源、气源。 13、整理床单位，协助病人舒适体位。 14、清洁消毒呼吸机管道，清洁呼吸机表面。 15、洗手，正确记录护理单。 注意事项 1、清醒的病人给以解释，躁动的病人给以适当镇静或约束。 2、呼吸机管路连接正确。 3、湿化罐护理：保持湿化罐灭菌注射用水在所需刻度，保持吸入气温度在32℃~36℃。 4、保持集水杯处于低位，底处于朝下方向，及时倾倒集水。 5、调节呼吸机机臂时，先取下管道再安装，以免在调节过程中将导管拉出。 6、及时处理报警。 7、定期更换呼吸机管道，建议：48小时更换呼吸机管道。 8、合理消毒呼吸机各种管道。 呼吸机操作相关理论 1、相对禁忌证：（没有绝对禁忌证） 肺大泡、肺囊肿、气胸未行引流者、纵隔气肿、气管食管瘘、大咯血 2、根据病人病情及体重选择模式 控制通气CMV IPPV 辅助通气SIMV 自主通气CPAP PSV 3、呼吸机通气模式 IPPV（间歇正压通气）； CMV (机械控制通气) ； SIMV (同步间歇指令性通气) ； PSV （压力支持通气）； PEEP（呼气末正压通气）；

蛋白质印迹法westernblot

蛋白质印迹法 蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。 其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。 蛋白免疫印迹(Western Blot )是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。 中文名蛋白质印迹法外文名Western Blot 蛋白免疫印迹Western Blot 类似方法1 Southern Blot 杂交方法 类似方法2 Northern Blot 杂交方法 使用材料聚丙烯酰氨凝胶电泳⑴

原理 与Southern Blot 或Northern Blot 杂交方法类似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAG（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。⑴ 分类 Western Blot 显色的方法主要有以下几种: i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色

最详细的WesternBlot过程步骤详解

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Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答) Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术: 一、原理 二、分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL ECF iv.底物DAB呈色 三、主要试剂 四、主要步骤 五、实验常见的问题指南 1.参考书推荐 2.针对样品的常见问题 3.抗体 4.滤纸、胶和膜的问题 的相关疑问 6.染色的选择 7.参照的疑问

8.缓冲液配方的常见问题 9.条件的摸索 10.方法的介绍 11.结果分析 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、分类 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

WORD注意事项

问：WORD里边怎样设置每页不同的页眉？如何使不同的章节显示的页眉不同？ 答：分节，每节可以设置不同的页眉。文件——页面设置——版式——页眉和页脚——首页不同 问：请问word中怎样让每一章用不同的页眉？怎么我现在只能用一个页眉，一改就全部改了？ 答：在插入分隔符里，选插入分节符，可以选连续的那个，然后下一页改页眉前，按一下“同前”钮，再做的改动就不影响前面的了。简言之，分节符使得它们独立了。这个工具栏上的“同前”按钮就显示在工具栏上，不过是图标的形式，把光标移到上面就显示出”同前“两个字来了 问：如何合并两个WORD文档，不同的页眉需要先写两个文件，然后合并，如何做？ 答：页眉设置中，选择奇偶页不同/与前不同等选项 问：WORD编辑页眉设置，如何实现奇偶页不同？比如：单页浙江大学学位论文，这一个容易设；双页：（每章标题），这一个有什么技巧啊？ 答：插入节分隔符，与前节设置相同去掉，再设置奇偶页不同 问：怎样使WORD文档只有第一页没有页眉，页脚？ 答：页面设置－页眉和页脚，选首页不同，然后选中首页页眉中的小箭头，格式－边框和底纹，选择无，这个只要在“视图”——“页眉页脚”，其中的页面设置里，不要整个文档，就可以看到一个“同前”的标志，不选，前后的设置情况就不同了。 问：如何从第三页起设置页眉？ 答：在第二页末插入分节符，在第三页的页眉格式中去掉同前节，如果第一、二页还有页眉，把它设置成正文就可以了 ●在新建文档中，菜单—视图—页脚—插入页码—页码格式—起始页码为0，确定；

●菜单—文件—页面设置—版式—首页不同，确定； ●将光标放到第一页末，菜单—文件—页面设置—版式—首页不同—应用于插入点之后，确定。 第2步与第三步差别在于第2步应用于整篇文档，第3步应用于插入点之后。这样，做两次首页不同以后，页码从第三页开始从1编号，完成。 问：WORD页眉自动出现一根直线，请问怎么处理？ 答：格式从“页眉”改为“清除格式”，就在“格式”快捷工具栏最左边；选中页眉文字和箭头，格式－边框和底纹－设置选无 问：页眉一般是---------，上面写上题目或者其它，想做的是把这根线变为双线，WORD中修改页眉的那根线怎么改成双线的？ 答：按以下步骤操作去做： ●选中页眉的文字，包括最后面的箭头 ●格式－边框和底纹 ●选线性为双线的 ●在预览里，点击左下小方块，预览的图形会出现双线 ●确定 ▲上面和下面自己可以设置，点击在预览周围的四个小方块，页眉线就可以在不同的位置 问：Word中的脚注如何删除？把正文相应的符号删除，内容可以删除，但最后那个格式还在，应该怎么办？ 答：步骤如下： 1、切换到普通视图，菜单中“视图”——“脚注”，这时最下方出现了尾注的编辑栏。

westernblot详细图解详细版.docx

Western免疫印迹（Western Blot） 是将蛋白质转移到膜上，然后利用 抗体进行检测的方法。对已知表达 蛋白，可用相应抗体作为一抗进行 检测，对新基因的表达产物，可通 过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法 类似，但Western Blot采用的是聚 丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋 白质，“探针”是抗体，“显色”用标记 的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转 移到固相载体（例如硝酸纤维素薄 膜）上，固相载体以非共价键形式 吸附蛋白质，且能保持电泳分离的 多肽类型及其生物学活性不变。以 固相载体上的蛋白质或多肽作为抗 原，与对应的抗体起免疫反应，再 与酶或同位素标记的第二抗体起反 应，经过底物显色或放射自显影以 检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；

SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。 4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。 5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。 6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺0.1 ml；H2021.0 μl。 二、蛋白样品制备 1. 单层贴壁细胞总蛋白的提取 （1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 （2）每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS （0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1 min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。 （3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。） （4）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 （5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） （6）于4℃下12000 rpm离心5 min。（提

WB操作步骤-自己整理

Western Blot 相关实验方法与试剂（湿转法） 人工肝实验室学习姚瑶 （一）目的蛋白提取： （1）单层贴壁细胞总蛋白的提取： 1、倒掉细胞培养液，加入Hanks液洗涤一次后倒掉，根据所用细胞决定是否用胰酶消化，加入适量（约5ml）新鲜细胞培养液后，将贴壁细胞吹起，并转移至4支离心管内，配平后，1500转离心10min。 2、倒掉上清，用4度预冷PBS溶液洗涤沉淀，1500转离心10min。 共洗三次，每次十分钟。 3、倒掉上清，吸净，每管加入50ul 细胞裂解液RIPA，吹散，加入后由于DNA的释放可迅速变粘稠，故应尽快转移至1.5ml EP 管内，-20℃裂解30min。 4、超声波细胞裂解仪上将各管裂解15s。（可不做） 5、4℃，12000转离心10min。 6、将上清转移至0.5ml EP管中，每管100ul，冰浴待用。 （2）组织中总蛋白的提取： 1、取约100mg肝组织于研磨器内，加入500ul 细胞裂解液RIPA，研磨后吸出于1.5ml EP管内，再加入500ul RIPA，研磨后吸出于上EP管内。冰上裂解30min。

2、配平后，4℃，14000转离心10min。 3、将上清分装于0.5ml EP管内，每管100ul，冰浴待用（二）蛋白含量的测定： 1、稀释标准品：10ul标准品C液+90ul PBS溶液，混匀。 2、按0、1、2、4、8、12、16、20ul将稀释后的标准品加入于96孔板内，并用PBS将各孔补足20ul。 3、将第2、3排96孔板分别加入样品1ul、0.5ul，（可采用倍比稀释法），并用PBS将各孔补足20ul。 4、配制工作液：按A液：B液=50：1配制适量工作液，每孔加入200ul。 5、37℃水浴30min。 6、酶标仪测定各孔OD值（A570，Mode1）。 7、绘制标准曲线，计算样品蛋白浓度。 （三）SDS-PAGE电泳： （1）清洗玻璃板 （2）灌胶与上样： 1、配胶：根据目的蛋白的大小，决定分离胶的浓度。

OFFICE操作注意事项

WORD操作手册 1.设置自定义纸张大小: 点击菜单“文件”—“页面设置”，打开“纸张” 标签页，在纸张大小栏目选择“自定义大小”，设置纸张的宽度和高度并 确定。外文名字中间的点添加方法：插入-----特殊符号。着重号：选中 需要添加着重号的文字---“格式”菜单---“字体”项---在“着重号” 处设置即可。等栏分栏操作意外情况处理办法：如果出现分栏不等，有两种办法：（1）撤消分栏，然后在段落最后按回车。重新在进行分栏操作。 （2）把光标定在段落最后，选择菜单插入-----分隔符，选择分隔符类型为“连续”。分栏和首字下沉：有分栏和首字下沉操作时，一定先进行分栏再进行首字下沉。设置水印方法：格式-------背景-------水印。插入剪贴画：插入-----图片-------剪贴画，务必选择管理剪辑，且勿直接搜索，以免电脑死机。水印文字：在“格式”菜单下，选择“背景”“水印” 命令——选择“文字水印”选项，输入文字，选择颜色，透明选项即可。 图片冲蚀效果：将图片插入文档后，在图片上点击鼠标右键，选择“设置图片格式”，进入“版式”标签页，选择“衬于文字下方”并确定，把图片调整到合适大小后，再选择“设置图片格式”，进入“图片”标签页，在颜色栏目选择“冲蚀”并确定。四周型环绕：将图片插入文档后，在图片上点击鼠标右键，选择“设置图片格式”，进入“版式”标签页，选择“四周型”并确定，把图片调整到合适大小后，把图片移至第一段适当的 位置。表格中使用公式：把光标定在要显示结果的单元格，选择表格菜单 下的公式。注意：一个计算出结果后，只需把结果复制到其他单元格，按 F9刷新。表格边框设置：选中表格，然后格式-----边框和底纹。斜线表头制作：表格---绘制斜线表头。要尽量使表头单元格够大，如果出现表 头不全的情况，可以使用插入文本框的方法。插入----文本框，设置文本框格式，填充和线条颜色设置为无。单元格设置底纹和边框：设置底纹时，注意选择应用范围为“单元格”；在设置边框时，要选择“自定义”类型，然后选择线条类型和宽度，最后在右侧预览窗口选择要求改变的线条位置 单击即可。注意观察预览窗口中的变化，若单击后线条消失，再次单击即 可。取消边线：直接选择“自定义”后点击预览窗口中相应的线条即可。 2.艺术型边框：在边框底纹对话框中选择“页面边框”——在边框类型里选 择“四周型”。绘制图形：选择“视图”菜单下的“工具栏”——“绘 图”命令，从自选图形中添加相应的图形——选择所有图形（可配合ctrl 键单击）——选择“绘图”下的“组合图形”。 Excel 常用操作 1.表格编辑//内容自动填充：对于数值型数据，如果需要按照某 种规律自动填充，可先录入前两个数据，选中前两个单元格，把鼠标移至 选中单元格区域右下角，等鼠标变成黑色实心十字架后，点击左键向下拖 动即可； 对于带有数字的文本数据或日期型数据，选中第一个单元格，把鼠标移至

安全带的正确使用及注意事项word版本

安全带的正确使用及注意事项 1、根据行业性质，工种的需要选择符合特定使用范围的安全带。如架子工、油漆工、电焊工种选用悬挂作业安全带，电工选用围杆作业安全带，在不同岗位应注意正确选用。 2、安全带应高挂低用，使用大于3m长绳应加缓冲器（除自锁钩用吊绳外），并要防止摆动碰撞。 3、安全绳不准打结使用。更不准将钩直接挂在安全绳上使用，钩子必须挂在连接环上用。 4、在攀登和悬空等作业中，必须佩戴安全带并有牢靠的挂钩设施。严禁只在腰间佩戴安全带，而不在因定的设施上拴挂钩环。 5、油漆工刷外开窗、电焊工焊接梁柱（屋架）、架子工搭（拆）架子等都必须佩戴安全带，并将安全带挂在牢固的地方。 6、安全带使用期一般为3～5年，发现异常应提前报废。 7、绳使用长度在3米以上的应加缓冲器。 8、使用安全带前应进行外观检查，检查： 1）组件完整、无短缺、无伤残破损； 2）绳索、编带无脆裂、断股或扭结； 3）金属配件无裂纹、焊接无缺陷、无严重锈蚀； 4）挂钩的钩舌咬口平整不错位，保险装置完整可靠； 5）铆钉无明显偏位，表面平整。 9、安全带应系在牢固的物体上，禁止系挂在移动或不牢固的物件上。不得系在棱角锋利处。安全带要高挂和平行拴挂，严禁低挂高用。 10、在杆塔上工作时，应将安全带后备保护绳系在安全牢固的构件上（带电作业视其具体任务决定是否系后备安全绳），不得失去后备保护。 11、安全带上的各种部件不得任意拆掉，当需要换新绳时要注意加绳套。 12、使用频繁的绳，要经常做外观检查，发现异常时应立即更换新绳，带子使用

期为3~5年，发现异常应提前报废。但使用2年后，按批量购入情况，必须抽验一次。如悬挂式安全带冲击试验时，以80kg重量做自由坠落试验，若不破断，可使用。围杆带做静负荷试验，以2206N（225kgf）拉力拉5min，无破断可继续使用。对已抽试过的样带，应更换安全绳后才能继续使用。 13、安全带应储藏在干燥、通风的仓库内，妥善保管，不可接触高温、明火、强酸、强碱和尖锐的坚硬物体，更不准长期暴晒雨淋。 正确佩戴安全带需还要加大宣传力度，使攀登和悬空作业者自觉地抵制野蛮违章作业行为，让安全带在施工作业中发挥其更大的安全效益。

WB实验步骤

蛋白电泳（制胶、SDS-PAGE电泳） 实验材料： SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、电泳缓冲液、提取的蛋白或全细胞裂解液、广谱彩虹预染中分子量蛋白Marker、SDS-PAGE Loading Buffer（还原，5×）、G250蛋白快速染色试剂、若干蒸馏水 实验仪器、耗材： 蛋白电泳仪、制胶仪、水平摇床、15ml离心管、5ml移液器、微量移液器、1.5ml离心管、塑料饭盒（可在微波炉里加热使用） 配制溶液： ●配制10%APS溶液：-20度保存 0.5g APS + 5ml蒸馏水、2.5g APS + 25ml蒸馏水 ●配制200 ml电泳缓冲液：CW0045 Tris-Glycine SDS（ph8.3,10×） 20 ml Tris-Glycine SDS + 180 ml 蒸馏水 ●配制1 ml loading buffer： 200 ul 5×loading buffer +800 ul蒸馏水 实验步骤： 一．制胶： 1.参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。 2.根据分离蛋白的大小配制分离胶和浓缩胶。 3.配制10%分离胶： 将不同体积的30%Acr-Bis(29:1)、分离胶缓冲液和双蒸水在小烧杯或试管中混合。 加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。 配制SDS-PAGE分离胶

4.待胶灌至距离玻璃板顶端1.5cm的时候停止灌胶，加入蒸馏水水封。静置40分钟 至1小时。 5.待分离胶凝固后（水层胶层中间出现折线），倒掉蒸馏水，用滤纸将水溶液吸干。 6.配制5%浓缩胶： 7.将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。 注意：灌胶速度要快，防止凝胶。 8.将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。静置20分钟，等待浓缩胶聚合。 9.待凝胶聚合后，小心地拔出梳子，以免破坏加样孔。赶走气泡。 二．SDS-PAGE电泳: 1. 在电泳槽的内外槽灌至电泳缓冲液。 2. 制备样品： 1）蛋白样品： 根据植物蛋白或动物组织蛋白定量结果，计算蛋白提取液加入量，制备上样溶液。 蛋白提取液+ 5×上样缓冲液+ 蒸馏水，上样量为40-60ug。 制备的样品，煮沸5分钟，12,000 rpm离心5分钟，取上清，上样。

2019-最新提车注意事项-word范文 (4页)

本文部分内容来自网络整理，本司不为其真实性负责，如有异议或侵权请及时联系，本司将立即删除！ == 本文为word格式，下载后可方便编辑和修改！ == 最新提车注意事项 汽车对于大部分国人来说，仍属于比较贵重的物品，谁都不希望买到问题 产品。今天小编为大家准备了最新提车注意事项，欢迎阅读! 最新提车注意事项 提车需要带哪些材料? 1. 身份证(这个证少不了，办手续、办临牌都需要); 2. 钞票(当然现在都是带信用卡、支付宝什么的了); 3. 自己贷款的盆友还要打印一张提车函以及检查尾款的到账情况; 4. 当地居住证或暂住证(有些地方不需要)。 另外为了提车顺利，最好能带上懂车的老司机一同前往，这样就可以事半 功倍，减少许多不必要的麻烦。 随车手续检查 到了4S店之后，首先要先办一张临牌才能上路，可以委托工作人员办理，不过有的店需要另外付费，而且找别人代办的临牌时间只有15天;如果是你自 己亲自办理，临牌时间为30天，而且只要5元钱，当然略微麻烦一些，填表格、排队等等。两种方法有利有弊，看大家的各自需要了。 办好临牌之后，就是检查随车手续了。 1. 购车发票(记住一定是购车专用发票，共三联) 2. 车辆合格证(这个证的重要性不用说了) 3. 三包服务卡保修单(出现质量问题时的三包维修凭证) 4. 保险合同正本和副本(大家都懂的) 5. 交强险合同正副本(国家实行的强制保险)

6. 车架号和车辆识别代号(上牌需要交给车管部门) 7. 车辆使用说明书(就是操作手册，建议大家拿回去之后还是要翻开看一看) 以上的凭证和单据都收集完成之后，还要核对合格证上的号码必须与车上 的发动机号、车架号、排气量、出厂年月以及车辆铭牌上的信息一致。这些都 请您务必仔细检查，以免由于文字或者其他方面的原因使您掉进奸商的陷阱。如果发现有任何的遗漏、错误都必须要求销售商立刻解决。 车辆外部检查 1. 车身漆面 主要是对车身外部的漆面进行的检查，应该把车停放到光线充足的地方， 围着车身走一圈，依次检查车漆颜色是否均匀、有无鼓包、划痕等现象，必要 时还可以用手摸一摸。 2. 车窗玻璃 检查全车玻璃有无损伤和划痕，重点检查前挡风玻璃的视觉效果。前挡风 玻璃必须具有良好的透光性，不能出现气泡、折射率异常的区域。 3. 轮胎检查 检查轮胎时，要查看轮胎胎面是否干净、轮圈表面是否有刮伤的痕迹以及 看看轮胎的毛刺是否有过多的磨损(短距离的行驶一般对轮胎毛刺的磨损较小)。必要时还要看一下胎压是否正常。 4. 检查发动机 打开引擎盖，检查出厂日期，看看引擎各部分是否干净，尤其是犄角旮旯(gālá)之处(开过的车这些地方容易藏污纳垢且不易清理)。然后拉出机油尺， 观看机油的容量和清洁度。 5. 底盘检查 如果条件允许的话，把它开出来进仓库升降机上看底盘是否有刮碰伤痕， 管路是否有明显不合理的地方。 6. 细节接缝处 应检查引擎盖、后备箱盖、车门、大灯、尾灯等处的缝隙是否均匀，同邻 近位置的车身是否处于同一平面，有无错位等现象。 7. 后备箱检查