最详细的WesternBlot过程步骤详解
最详细的W e s t e r n B l o t 过程步骤详解
最详细的W e s t e r n B l o t
过程步骤详解
Pleasure Group Office【T985AB-B866SYT-B182C-BS682T-STT18】
Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答)
Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术:
一、原理
二、分类
i.放射自显影
ii.底物化学发光ECL
ECF
iv.底物DAB呈色
三、主要试剂
四、主要步骤
五、实验常见的问题指南
1.参考书推荐
2.针对样品的常见问题
3.抗体
4.滤纸、胶和膜的问题
的相关疑问
6.染色的选择
7.参照的疑问
8.缓冲液配方的常见问题
9.条件的摸索
10.方法的介绍
11.结果分析
一、原理
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、分类
现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
三、主要试剂
1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺
1g，加H2O至100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。
2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)，1mlH2O去离子水配制，室温保存。
3、分离胶缓冲液:LTris-HCL:和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。
4、浓缩胶缓冲液:LTris-HCL:溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL调至加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用。
5、TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml，临用前配制.
6、SDS-PAGE加样缓冲液: L Tris缓冲液8ml，甘油，10%SDS ，巯基乙醇，%溴酚蓝，H2O 32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
7、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶
解至1000ml，得L L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释10倍。
8、转移缓冲液：配制1L转移缓冲液，需称取甘氨酸、碱、 SDS，并加入200ml甲醇，加水至总量1L。
9、丽春红染液储存液：丽春红S 2g 三氯乙酸30g 磺基水杨酸 30g 加水至100ml 用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。使
用后应予以废弃。
10、脱脂奶粉5%(w/v)。
11、NaN3 % 叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。
12、Tris缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL，500mmol/LnaCl。
13、Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。
14、过氧化物酶标记的第二抗体。
15、NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。
16、BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。
17、100mmol/LTris-HCL。
18、100mmol/L NaCl。
19、50mmol/LTris-HCL，5mmol/L EDTA。
（可以参看分子克隆）
四、主要步骤
主要包括以下4个基本步骤
1.样品制备
原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。
1．培养细胞或药物处理。
2．弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。
3．加入1X SDS样品缓冲液(6-well plate, 100 μl /w或 75 cm2 plate, 500-1000 μl/瓶)，刮落细胞，转移到Ep管。注意：冰上操作。
4．超声 10~15秒剪切DNA以减低样品粘性。
5．煮沸样品5 minutes。
6．离心 12000g, 5 min，取上清。
7．电泳分离：上样15μl~20 μl 至 SDS-PAGE 胶 ( 10 cm x 10 cm)电泳。
如要定量检测某蛋白的表达水平，应用RIPA裂解液(1 ml per 107 cells/ 100 mm dish/ 150 cm2 flask)裂解细胞，收集裂解液至离心管中，在振荡器上混匀4～15min， 14000g离心15min
（ 4℃），弃沉淀，用Bradford法或其它蛋白质测定方法测定上清
中蛋白浓度以调整上样体积和上样量，进行Western杂交时还需设置内或外参照，通常用beta-actin。
注意：一般上样20~30 μg已足够，如待检蛋白为低丰度蛋白，可加大上样量至100μg，但电泳条带易拖尾，可制备亚细胞组份或采用更敏感的检测方法。
2.电泳分离（参照SDS-PAGE电泳方法）
3.转膜
杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于Western blot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜(NC) 和PVDF膜。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。通常用μm和μm两种规格的NC膜。大于20kD 的蛋白可用μm的膜，小于20kD的蛋白就要用μm的膜了，如用μm 的膜就会发生“Blowthrough”的现象。PVDF膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和1-5秒钟。
蛋白质常用的转移方法主要有两种：槽式湿转和半干转移。前者操作容易，转移效率高；而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。以下为槽式湿转的操作步骤。
1. 将胶浸于转移缓冲液中平衡10min。
注意：如检测小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易扩散出胶。
2. 依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入转移缓冲液中平衡
10min。如用PVDF膜需用纯甲醇浸泡饱和3-5秒钟。
3. 装配转移三明治：海绵3层滤纸胶膜3层滤纸海绵，每层放好后，用试管赶去气泡。切记：胶放于负极面（黑色面）。
4. 将转移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面对黑色面），加转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为）。注意：应再次检查三明治和电极是否装配正确，电源是否接通。
5. 转膜结束后，切断电源，取出杂交膜
4.免疫杂交与显色
1．用25 ml TBS 洗膜5min，室温，摇动。
2．置膜于25 ml 封闭缓冲液中1h, 室温，摇动。
3．15ml TBS/T洗3次（5 min/T）。
4．加入合适稀释度的一抗，室温孵育1-2h或 4°C过夜，缓慢摇动。
5．15 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。
6．加入合适稀释度的碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化酶（HRP）标记的二抗，室温孵育1h，缓慢摇动。
7．15 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。
8．15 ml TBS洗1次。
9．蛋白检测(显色法或发光法，按相应试剂说明操作)。
注意事项：
1．操作中戴手套，不要用手触膜。
2．PVDF膜在甲醇中浸泡时间不要超过5秒。
3．如检测小于20kD的蛋白应用μm的膜，并可省略转移时的平衡步骤。
4．某些抗原和抗体可被Tween-20 洗脱，此时可用% BSA代替Tween-20。
5．关于封闭剂的选择：5%脱脂奶/TBS or PBS: 能和某些抗原相互作用，掩盖抗体结合能力；~3% BSA in PBS：低的内源性交叉反应性。
6．如用0. 1% Tween 20、% NaN 3 in PBS or TBS作封闭剂和抗体稀释液，抗体检测后可进行蛋白染色。
如要同时检测大分子量和小分子蛋白，最好用梯度胶分离蛋白。五、实验常见的问题指南
根据问题的类型主要分成以下几类（以下资料权作参考，请勿盲目模仿！）：
1.参考书推荐
A.对初学者看什么资料比较好
解答：《抗体技术实验指南》和Antibodies（a laboratory manual， wrote by Ed Harlow ，david lane）两本书不错。
2.针对样品的常见问题
B.做线粒体膜UCP2蛋白的Western Blot （以下简写成Western Blot），提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，换了个santa cloz的一抗仍不行。是什么原因蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗
解答：怀疑是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂。同时，建议检查Western Blot过程，提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。
E.同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗
解答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。
F.如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么
解答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。
G.我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决
解答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，多加5－10％甲醇。
H.想分离的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适积层胶的浓度又该用多少这么大分子量的蛋白容易作Western Blot吗
解答：260kd的蛋白不好做，分离胶用6％， Stacking Gel ％。
I.如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。
解答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30％是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试的comb。
J.蛋白变性后可以存放多久
解答：－ 80℃，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。
K.我所测定的蛋白分子量是105KD，按理说分离胶应当采用%，但我所查资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11％的配方，不知为何
解答：上述您提到的两种凝胶均可以使用，因为105ＫＤ的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置。
L.接下来我准备采用DAB显色技术，二抗是生物素化的多克隆抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗
解答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替应该好一点．
M.还有一问题，一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗
解答：Western Blot一般上样30－100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合Western Blot的怎样做也不行。所以拿到好的结果不容易。N.做组织样品的western的时候，处理样品有什么诀窍吗还有，您用过大牛血清做封闭剂吗浓度如何效果是不是比BSA好一点
解答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ和蛋白酶抑制剂cocktail），封闭剂一般5%脱脂奶粉较常用。如果一抗为多克隆抗体，使用ＢＳＡ也是不错的选择。
O.您是否可以介绍一下大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢
解答：做200kd蛋白的Western Blot时要注意，分离胶最好选择>7%的；剥胶时要小心；转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）。
P.有什么方法可以提高上样量
解答：可以浓缩样品；增大上样体积来增大上样量。
Q.我要检测的目的蛋白是分子量大概为42kd的膜蛋白，膜蛋白提取可不可以不用到超速离心机，有没有直接用低温高速离心机就可以的提到膜蛋白的方法，42kd的蛋白分子量算不算大
解答：如是需要提取膜蛋白，（而不是只需要提取膜蛋白），可以用Ripa buffer提取膜蛋白和胞浆蛋白，用这个做Western Blot就可以了。如果是非要只提取膜蛋白就要用到超速离心机。42kd 不算大，也不算小，所以，可以按照一般的转移方法实施。
R.蛋白的上样量有没有什么具体的要求
解答：上样量要根据实验的要求来定，如果要求是定量和半定量的Western Blot 则上样量要均等，如果只是要定性，则没有太大的关系，尽量多上就行了，但是不要超过μg/mm2。
S.一抗，二抗的比例是否重要
解答：比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特异的本底。
3.抗体
做细胞信号传导，要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求
解答：对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用HRP标记的二抗。
U.同一公司的另外抗体用这个稀释度做出来效果很好，所以没做预试，怕费时间，用什么样的稀释度比较好呢我用的ELL+plus试剂盒显色。转膜过夜，一抗孵育也是过夜的，若封闭也过夜的话就要四天才看的到结果了。
解答：不同抗体，即使是同一公司的抗体，其最佳的抗体稀释度也是不一样的，需要你实验摸索。我觉得转膜过夜好像没有必要吧，转膜的目的也就是将蛋白转到膜上就行啦，何必浪费时间呢。至于具体的转膜时间，还要看你的目的蛋白分子量的大小；转膜的设备，是半干式，还是湿式。一抗当然可以过夜，如果你想所短Western Blot时间的话，可以增高一抗的孵育温度，我们实验室一般37度，两小时就足够了；你可以参照抗体说明书。至于一抗和二抗得稀释度，你可以一抗1：1500；二抗1：20000试试。另外建议你洗膜时，多洗几次，最好是在封闭；一抗和二抗后至少是
5x5min，跑一张好膜不容易，多尽点心吧，这样不会浪费你的时间，只会节省你的时间！
V.免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗
解答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受
蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。（限于单抗）
W.Western Blot 中抗体的重复应用问题
解答：抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3次。稀释后应在2－3天内使用，4度保存，避免反复冻融。
4.滤纸、胶和膜的问题
X.NC膜\ PVDF膜\ 尼龙膜怎样鉴别
解答：尼龙膜是较理想的核酸固相支持物，有多种类型；硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价格最便宜；PVDF膜介于二者之间。
就结合能力而言：尼龙膜结合DNA和RNA能力可达480－600μ
g/cm2，可结合短至10bp的核酸片段；硝酸纤维素膜结合DNA和RNA能力可达80－100μg/cm2，对于200bp的核酸片段结合能力不强；PVDF膜结合DNA和RNA能力可达125－300μg/cm2。
就温度适应性而言：尼龙膜经烘烤或紫外线照射后，核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合；硝酸纤维素膜依靠疏水性相互作用结合DNA，结合不牢固；PVDF膜结合牢固，耐高温，特别适合于
蛋白印迹。
就韧性而言：尼龙膜较强；硝酸纤维素膜较脆，易破碎；PVDF膜较强。
就重复性而言：尼龙膜可反复用于分子杂交，杂交后，探针分子可经碱变性被洗脱下来；硝酸纤维素膜不能重复使用；PVDF膜可以重复使用。
Y.在做Western Blot时，PBDF膜用甲醇浸泡的目的
解答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。
Z.检测磷酸化的JNK 和非磷酸化的JNK可以在同一张膜上吗
解答：可以。
AA.转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端（即点样空的一侧）的转膜好象不是很好，为什么
解答：这是正常的，大分子的蛋白转移的慢，你延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的就有可能会变淡。BB.我想问您裂解细胞用三去污裂解法，还是用上样缓冲液
解答：用上样缓冲液，这样有几个好处，可以提取总蛋白，同时又可以让磷酸化酶失活。
CC.采用tank system有什么讲究
解答：建议低电压，长时间，（一般tank System 用衡压好点），如 28V 14－16hrs。
DD.做HSP WESTEN定量，同样的抗体免疫组化能做出，而WESTEN却不能
解答：这多半是抗体的问题，要看抗体的说明，是否能做Western Blot和IHC。
EE.膜一般要如何处理
解答：一般用甲醇泡泡就可以了。
FF.如果是6×8转印膜，要加多少一抗
解答：一抗的稀释度是有说明的，根据你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育体积一般最少为3－5ml。
GG.上下槽缓冲液有何要求，怎样才能达到最佳效果。
解答：无要求。
HH.跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原因呢是有的成分不对吗解答：没什么问题，就是你胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以了。如果过夜，胶里的水分被蒸发，采用保鲜膜包上也可以；也可能母液（30%聚丙酰胺）有问题，你可以重新配制一份观察；能够替换的试剂，尽量换一下，选用好的试剂，避免找问题麻烦。脱色液中甲醇的含量太高也会造成
胶缩。
II.膜、滤纸、胶大小有何讲究
解答：如果是用的是半干转，顺序为：阴极－》滤纸－》胶－》膜－》滤纸。滤纸的长宽分别比胶小1－ 2mm，而膜的长宽分别比胶大1－ 2mm。绝对禁忌：上下两层滤纸因为过大而相互接触，这样会短路，电流不会通过胶和滤纸。
JJ.蛋白质的分子量跨度很大，如要分离小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好吗
解答：这么广的分布不好转移，一般建议：21kd和66kd可以一起转，12％SDS-PAge，湿转36V ， 3－5hrs就可以了，可以根据你实验室的经验调节；170kd 用7%SDS－page， 48V 10hrs－16hrs。KK.不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低怎么样解决
解答：可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度）(优化的转移缓冲液，可以参考《蛋白质技术手册》)，因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜（微米）；使用戊二醛交联；低浓度胶，如低至
westernblot详细图解
Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以
检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材 电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素 膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
WB实验步骤
Western blotting实验步骤 1．蛋白质的样品制备： 取心肌组织50mg，待组织块自行溶解，用滤纸吸去其表面水分，将组织块放入玻璃匀浆器球状部位，用组织剪尽量将其剪碎，将剪碎的心肌组织放入玻璃匀浆器的杆状部，按1mlRIPA+10ulPMSF/100mg心肌组织的比例加入RIPA和PMSF（先加RIPA再加PMSF），将玻璃匀浆器插入冰中，匀浆约30分钟。 将心肌组织匀浆转移到离心管中，4℃12000g离心5分钟，收集上清（如有粘稠物进一步用超声处理），样品分装冻存于-20℃备用。 2 .测定蛋白浓度： 2.1 按50：1配置BCA工作液。 2.2 10ulC液（蛋白标准）+90ulPBS液稀释成0.5mg/ml的蛋白标准液。 2.3 分别以0、1、2、4、8、12、16、20ul将蛋白标准液加入96孔板的第1~8标准孔中，在其他样品孔中加入10ul待测样品。 2.4 分别加PBS定容至20ul。 2.5 各孔中加入200ulBCA工作液，室温放置2小时。 2.6 用酶标仪测定蛋白浓度：测定A562，依标准曲线算出蛋白浓度。 3 SDS-PAGE电泳： 3.1 制胶: 按比例配制分离胶，缓缓地摇动溶液，使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水，以阻止氧气进入凝胶溶液中，静置40min。同前按比例配制浓缩胶，但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，连续
平稳的注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静制60min以上以保证完全聚合。 3.2 预电泳：将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入电泳缓冲液后低电压10-20V的预电泳20-30min。（目的是清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通）。 3.3 样品准备：首先计算上样体积，然后按样品：上样buffer=4：1的比例加入上样bufer混匀，沸水煮10分钟，冰上5分钟。 3.4 加样：预电泳后依次加入标准品（Marker）和待分析样品。（加样时间要尽量短，以免样品扩散，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免边缘效应。每个泳道加5ul。 3.5 电泳：加样完毕，选择80V恒压进行电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿到达两胶交界处（一般约20分钟），更换至100V恒压电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳（一般约为1小时20分钟）。 4．转膜： 4.1 切胶：将电泳完毕的胶完整的放在盛有电转液的玻璃皿中，将目的蛋白所在区域切下来，测量其长宽，并记录。 4.2 剪膜和滤纸：按胶的尺寸剪膜和滤纸（滤纸长宽较凝胶小0.5~1mm，PVDF 膜长宽较凝胶大0.5~1mm），滤纸浸入盛有电转液的玻璃皿中10秒钟，膜放入盛有10%甲醇的玻璃皿中10秒钟，然后将两者都放入盛有去离子水的玻璃皿中3分钟，进一步放入盛有电转液的玻璃皿中3分钟。 4.3 向电转槽中倒入部分电转液，将海绵浸入。按如下顺序制作“三明治”（注意避免两边滤纸相互接触，以免发生短路）。从正极到负极按如下顺序排列：
westernblot实验详细步骤(1)
Western Blot实验技术一、制胶 SDS-PAGE分离胶配方表 1、检查制胶器是否漏水，吸干玻璃中水分
2、配置分离胶，加入玻璃板中（注意：不能有气泡和杂物），距离玻璃上口1.5mL停止加胶。 3、再加ddH2O或异丁醇水封除去气泡，凝胶后倒掉水，吸干水到浓缩胶插梳。 二、上样 1、先在内槽加满电泳液才可以拔梳子。 2、拔梳子时垂直向上拔出，不可左右摇晃梳子。 3、拔完梳子后观察梳子孔，是否有缺口和歪，用针头拨正。 4、上样时从左到右依次上样。 5、若上样组不多时，左右第一孔不加样。 6、要预留Marker的上样孔。 三、电泳 四、转膜
PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。 （转膜缓冲液：需4度预冷，现配现用，不能放太久。） 1、转印滤纸：全胶长8.5cm，宽5.5cm，需剪裁成7层滤纸，压平后约3mm。需在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 2、海绵垫：在转膜液中平衡浸泡备用。 3、PVDF膜：剪裁8.5cm*5.5cm ，需在甲醇中浸润2min（活化膜上正电基团），然后在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 4、凝胶：凝胶也需要在预冷的转膜转膜缓冲液中平衡浸泡3－5分钟。否则在转膜过程中会出现皱缩，导致出现转移的条带变形。 三明治夹心法：负极（黑）-海绵垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-正极（白） 转膜时间：通电恒流，60V，一个槽100mA左右，1h
（注意：在操作过程中用玻棒赶走气泡。 装置转膜仪时注意黑对黑（负对负），白对红（正对正）。 装置运行时需冰浴。） 五、封闭 在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止抗体对非转印蛋白区域的非特异性吸附。 封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，本实验室常用的有5%BSA，10%脱脂奶等，至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测目的相适应（做l酪氨酸磷酸化时不推荐non-fat milk 封闭）。 1、将脱脂奶粉封闭液（1xTBST:脱脂奶粉=20mL：2g一块膜用量。牛血清蛋白、5%BSA 效果更好）倒好。 2、将PVDF膜取出放入封闭液中，盖子改好。 3、封膜一般常温1-2小时即可，也可4℃封闭过夜。 六、一抗 抗体反应主要采用间接法: 即先加入未标记特异性一抗与膜上抗原结合后，再加入标记的二抗进行杂交检测，标记二
Westernblot基本操作步骤
W e s t e r n b l o t基本操作步骤 一、细胞蛋白的提取 弃去培养基，加入预冷的PBS洗一遍，加入的RIPA裂解液（含1mM PMSF(100×)，每10ml加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂各一片，六孔板每孔150-250μl，60mm×15mm 培养皿300-400μl，），于冰上裂解约5分钟，裂解总液12000rpm离心10 min。取上清，用BCA法测定蛋白浓度。用于western blot的蛋白样品取一定量加4×loading buffer，10×reducing，再用裂解液补齐到所需上样体积。离心，使蛋白沉底。将EP管于沸水中煮5min，变性，之后再离心后准备上样。 二、BCA法测蛋白浓度操作步骤 将蛋白标准配制溶液溶解蛋白标准（BSA），配制成5mg/ml的蛋白标准溶液，10μl 分装，-20℃冷冻保存。 完全溶解蛋白标准品，取10μl用PBS稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。 据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μl加到96孔板的标准品孔中，加稀释标准品的溶液补足到20μl。 加适当体积样品到96孔板的样品孔中（可以通过预实验摸索稀释倍数），加PBS 到20μl。 各孔加入100μl BCA工作液，37℃放置30分钟。 测定580nm条件下吸光度。根据标准曲线计算出蛋白浓度。 三、Western blot基本操作步骤 1、溶液配制： ①Runnig Buffer(1×)：SDS Runnig Buffer（20×）50mL，加MiliQ水至1L； ②Transfer Buffer(1×): Transfer Buffer(10×)100mL,甲醇200mL（20%，v/v），加MiliQ水至1L； ③TBST缓冲液 1M Tris·HCl（pH7.6）：60.5g Tris-base，加入约30ml浓盐酸，调PH至7.6，加MiliQ 水至500ml。 TBS缓冲液（10×）：1M Tris·HCl 100ml+80g NaCl加MiliQ水1L TBST缓冲液（1×）：TBS缓冲液（10×）100ml+0.5ml Tween-20（0.05%，v/v），加MiliQ水至1L。 ④封闭液：5% BSA（5g/100ml，称取1g BSA至20ml TBST，充分混匀溶解） 2、样品准备与加样 ①用4×SDS loading buffer, 10×reducing与蛋白质样品混合，并将此EP 管放在水浴锅中沸水煮5min，使蛋白质变性。 ②将预制胶固定到电泳装置中，并在装置中加满Runnig Buffer(1×)，内槽加入0.5mL 抗氧化剂，小心拔下梳子； ③向上样孔中加入一定体积的蛋白样品（总蛋白量20μg以上）。向marker孔中加入2.5μl marker（按照实验要求设定marker量），向空白孔中加入一定体积的加样缓冲液(loading buffer)。注意采用相同（或相近）的上样体积，以保证蛋白的各带宽度相同。防止体积较大的上样孔中的蛋白质将向相邻的泳道扩散。 3、电泳
最详细的WesternBlot过程步骤详解
最详细的W e s t e r n B l o t 过程步骤详解
最详细的W e s t e r n B l o t 过程步骤详解 Pleasure Group Office【T985AB-B866SYT-B182C-BS682T-STT18】
Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答) Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术: 一、原理 二、分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL ECF iv.底物DAB呈色 三、主要试剂 四、主要步骤 五、实验常见的问题指南 1.参考书推荐 2.针对样品的常见问题 3.抗体 4.滤纸、胶和膜的问题 的相关疑问 6.染色的选择 7.参照的疑问
8.缓冲液配方的常见问题 9.条件的摸索 10.方法的介绍 11.结果分析 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、分类 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
WB操作步骤-自己整理
Western Blot 相关实验方法与试剂（湿转法） 人工肝实验室学习姚瑶 （一）目的蛋白提取： （1）单层贴壁细胞总蛋白的提取： 1、倒掉细胞培养液，加入Hanks液洗涤一次后倒掉，根据所用细胞决定是否用胰酶消化，加入适量（约5ml）新鲜细胞培养液后，将贴壁细胞吹起，并转移至4支离心管内，配平后，1500转离心10min。 2、倒掉上清，用4度预冷PBS溶液洗涤沉淀，1500转离心10min。 共洗三次，每次十分钟。 3、倒掉上清，吸净，每管加入50ul 细胞裂解液RIPA，吹散，加入后由于DNA的释放可迅速变粘稠，故应尽快转移至1.5ml EP 管内，-20℃裂解30min。 4、超声波细胞裂解仪上将各管裂解15s。（可不做） 5、4℃，12000转离心10min。 6、将上清转移至0.5ml EP管中，每管100ul，冰浴待用。 （2）组织中总蛋白的提取： 1、取约100mg肝组织于研磨器内，加入500ul 细胞裂解液RIPA，研磨后吸出于1.5ml EP管内，再加入500ul RIPA，研磨后吸出于上EP管内。冰上裂解30min。
2、配平后，4℃，14000转离心10min。 3、将上清分装于0.5ml EP管内，每管100ul，冰浴待用（二）蛋白含量的测定： 1、稀释标准品：10ul标准品C液+90ul PBS溶液，混匀。 2、按0、1、2、4、8、12、16、20ul将稀释后的标准品加入于96孔板内，并用PBS将各孔补足20ul。 3、将第2、3排96孔板分别加入样品1ul、0.5ul，（可采用倍比稀释法），并用PBS将各孔补足20ul。 4、配制工作液：按A液：B液=50：1配制适量工作液，每孔加入200ul。 5、37℃水浴30min。 6、酶标仪测定各孔OD值（A570，Mode1）。 7、绘制标准曲线，计算样品蛋白浓度。 （三）SDS-PAGE电泳： （1）清洗玻璃板 （2）灌胶与上样： 1、配胶：根据目的蛋白的大小，决定分离胶的浓度。
WB实验步骤
蛋白电泳（制胶、SDS-PAGE电泳） 实验材料： SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、电泳缓冲液、提取的蛋白或全细胞裂解液、广谱彩虹预染中分子量蛋白Marker、SDS-PAGE Loading Buffer（还原，5×）、G250蛋白快速染色试剂、若干蒸馏水 实验仪器、耗材： 蛋白电泳仪、制胶仪、水平摇床、15ml离心管、5ml移液器、微量移液器、1.5ml离心管、塑料饭盒（可在微波炉里加热使用） 配制溶液： ●配制10%APS溶液：-20度保存 0.5g APS + 5ml蒸馏水、2.5g APS + 25ml蒸馏水 ●配制200 ml电泳缓冲液：CW0045 Tris-Glycine SDS（ph8.3,10×） 20 ml Tris-Glycine SDS + 180 ml 蒸馏水 ●配制1 ml loading buffer： 200 ul 5×loading buffer +800 ul蒸馏水 实验步骤： 一．制胶： 1.参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。 2.根据分离蛋白的大小配制分离胶和浓缩胶。 3.配制10%分离胶： 将不同体积的30%Acr-Bis(29:1)、分离胶缓冲液和双蒸水在小烧杯或试管中混合。 加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。 配制SDS-PAGE分离胶
4.待胶灌至距离玻璃板顶端1.5cm的时候停止灌胶，加入蒸馏水水封。静置40分钟 至1小时。 5.待分离胶凝固后（水层胶层中间出现折线），倒掉蒸馏水，用滤纸将水溶液吸干。 6.配制5%浓缩胶： 7.将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。 注意：灌胶速度要快，防止凝胶。 8.将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。静置20分钟，等待浓缩胶聚合。 9.待凝胶聚合后，小心地拔出梳子，以免破坏加样孔。赶走气泡。 二．SDS-PAGE电泳: 1. 在电泳槽的内外槽灌至电泳缓冲液。 2. 制备样品： 1）蛋白样品： 根据植物蛋白或动物组织蛋白定量结果，计算蛋白提取液加入量，制备上样溶液。 蛋白提取液+ 5×上样缓冲液+ 蒸馏水，上样量为40-60ug。 制备的样品，煮沸5分钟，12,000 rpm离心5分钟，取上清，上样。
Western_Blot操作步骤
Western Blot操作步骤 一、 Western blot 实验步骤概述 1. 组织取材：组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液(每克组织3 ml RIPA)，PMSF(每克组织30μl，10 mg/ml PMSF)，利用Polytron进一步匀浆(15,000转/分*1分钟)维持4℃ 4. 加入PMSF(每克组织30μl，10 mg/ml PMSF)，冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃约20,000 g(约15,000转)15分钟 6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度 8. 取相同质量的细胞裂解液(体积*蛋白质浓度)，并加等体积的2×电泳加样缓冲液 9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳(浓缩胶20mA，分离胶35mA) 12. 电转膜仪转膜(100mA 40分钟) 13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色 15. 分析比较记录 二、 Western具体实验步骤 Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western可以参考如下步骤进行操作。 1.收集蛋白样品(Protein sample preparation):可以使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提。收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用北京博奥森生物技术公司生产的WIP细胞裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。 2.电泳(Electrophoresis) (1) SDS-PAGE凝胶配制:SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用博奥森生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
新手Western blot步骤及注意事项
WesternBlot操作步骤及注意事项 【原理】 Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 【试剂及配制】 1、SDS-PAGE试剂：见试剂盒说明书。 2、电泳缓冲液 Tris（分子量121.14） 3.03g 甘氨酸（分子量75.07） 18.77g SDS 1g 蒸馏水定容至1000ml 溶解后室温保存，可配制成10X电泳缓冲液进行保存（Tris、甘氨酸、SDS用量X10倍，蒸馏水定容至1000ml）。电泳缓冲液使用2~3次后推荐更换。 3、转膜缓冲液 湿转法 48mmol/L Tris 2.375g 39mmol/L甘氨酸11.25g 0.0375%SDS 0.375g 加少部分蒸馏水溶解 20%甲醇200ml 蒸馏水定容至1000ml 溶解后室温保存，可配制成10X转膜缓冲液（不含甲醇）进行保存（Tris、甘氨酸、SDS用量X5倍，蒸馏水定容至500ml，或按10倍用量定容至1000ml等；用时取100ml，加入200ml 甲醇再加蒸馏水稀释至1000ml）。使用转膜缓冲液时注意室内通风。转膜缓冲液用于转膜一次后，建议更换新转移缓冲液，旧转移缓冲液可用于转膜前浸泡物品。 4、TBS缓冲液 1mol/LTris·HCl（pH7.5）10ml NaCl 8.8g 蒸馏水定容至1000ml 配制后室温保存，可配制成10XTBS缓冲液，使用时稀释10倍。 5、TBST缓冲液（洗膜液） 20%Tween20 1.65ml TBS 700ml 混匀后即可使用，现配现用，因含Tris缓冲液，其PH易受空气中二氧化碳影响，此外注意使用时不要直接接触到皮肤，其有致癌作用。
westernblot详细图解
Western免疫印迹（Western Blot） 是将蛋白质转移到膜上，然后利用 抗体进行检测的方法。对已知表达 蛋白，可用相应抗体作为一抗进行 检测，对新基因的表达产物，可通 过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法 类似，但Western Blot采用的是聚 丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋 白质，“探针”是抗体，“显色” 用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移 到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜） 上，固相载体以非共价键形式吸附 蛋白质，且能保持电泳分离的多肽 类型及其生物学活性不变。以固相 载体上的蛋白质或多肽作为抗原， 与对应的抗体起免疫反应，再与酶 或同位素标记的第二抗体起反应， 经过底物显色或放射自显影以检测 电泳分离的特异性目的基因表达的 蛋白成分。该技术也广泛应用于检 测蛋白水平的表达。 ? 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺 SDS? Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸 Tris 甲醇 PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺 H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 ? 1. ?SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 ? 2. ?匀浆缓冲液： M Tris-HCl(pH ml；10%SDS ml；β-巯基乙醇 ml；ddH 2 O ml。
3. ?转膜缓冲液：甘氨酸 g；Tris g；SDS g；甲醇200 ml；加ddH 2 O定容至1000 ml。? 4. ? M PBS：NaCl g；KCl g；Na 2HPO 4 g； KH 2PO 4 g；加ddH 2 O至1000 ml。 ? 5. ?膜染色液：考马斯亮兰 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH 2 O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉 g 溶于20 ml的 M PBS 中。 ? 6. ?显色液：DAB mg； M PBS ml；硫酸镍 胺 ml；H 20 2 μl。 二、蛋白样品制备 ? 1. ? 单层贴壁细胞总蛋白的提取 ? （1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 ? （2）?每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS（～）。平放轻轻摇动1 min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。? （3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。） ? （4）?每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 ? （5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） ? （6）于4℃下12000 rpm离心5 min。（提前开离心机预冷）
WB实验步骤详细总结
蛋白提取（所有操作在冰上进行） 1. 裂解 1) 配裂解液：PMSF=100：1，（裂解液和PMSF 在-20℃保存，提前一天4℃解冻） 取2ml 裂解液，加20μlPMSF 混匀 2) 称取30mg 组织，切碎放入标记好的AP 管中，加入600μl 上述1中液体（加入液 体与组织比例为20：1），冰上静置10min 2. 匀浆 先用超纯水润洗一下匀浆机的钢头，（同时进行几组匀浆时，组间也要润洗钢头） 在匀浆机（在生化室）上每次匀浆10s ，两次（间隔5s ），冰上静置30min 3. 离心（在基础4楼416室） 1) 自带1ml 枪以及蓝枪头和黄枪头，三个的离心管（①，②两个标记，③加少量超 纯水，③号是为了离心平衡，对称放置） 2) 将离心机预冷至4℃为止，以1200×10r/min 离心15min 3) 用移液枪将上层清液取出放入①②号管中 4. 变性（上样缓冲液：样品=4：1） 将样品转移至2~3个管中 加上样缓冲液，100℃变性10min 仪器屏幕： 5. 保存 变性结束 AP 管盖放一然后4℃1. 清洗玻璃板：清洗玻璃板后风干，将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，操作时要使两玻璃对 齐，以免漏胶。 2. 配制分离胶 1) 准备：1ml 枪（蓝色枪头），200μl 枪（黄色枪头）10μl （白色枪头） 2) 10%分离胶的配置：（用50ml 烧杯。板配块胶，板配2块板） 混合摇匀（用移液枪抽吸混匀液体，不要将液体完全打出防止气泡） 3. 灌胶 沿玻璃板右上角缓慢匀速加入分离胶（用1ml 移液枪，不要将移液管内液体完全打出防止气泡）保持液面平稳上升至上方绿色线为止 4. 水封
Westernblot基本操作步骤
W e s t e r n b l o t基本操作 步骤 标准化工作室编码[XX968T-XX89628-XJ668-XT689N]
W e s t e r n b l o t基本操作步骤 一、细胞蛋白的提取 弃去培养基，加入预冷的PBS洗一遍，加入的RIPA裂解液（含 1mMPMSF(100×)，每10ml加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂各一片，六孔板每孔150-250μl，60mm×15mm培养皿300-400μl，），于冰上裂解约5分钟，裂解总液12000rpm离心10min。取上清，用BCA法测定蛋白浓度。用于westernblot的蛋白样品取一定量加4×loadingbuffer，10×reducing，再用裂解液补齐到所需上样体积。离心，使蛋白沉底。将EP管于沸水中煮5min，变性，之后再离心后准备上样。 二、BCA法测蛋白浓度操作步骤 将蛋白标准配制溶液溶解蛋白标准（BSA），配制成5mg/ml的蛋白标准溶液，10μl分装，-20℃冷冻保存。 完全溶解蛋白标准品，取10μl用PBS稀释至100μl，使终浓度为 0.5mg/ml。 据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。 将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl加到96孔板的标准品孔中，加稀释标准品的溶液补足到20μl。 加适当体积样品到96孔板的样品孔中（可以通过预实验摸索稀释倍数），加PBS到20μl。 各孔加入100μlBCA工作液，37℃放置30分钟。 测定580nm条件下吸光度。根据标准曲线计算出蛋白浓度。 三、Westernblot基本操作步骤 1、溶液配制： ①RunnigBuffer(1×)：SDSRunnigBuffer（20×）50mL，加MiliQ水至1L； ②TransferBuffer(1×):TransferBuffer(10×)100mL,甲醇200mL（20%， v/v），加MiliQ水至1L； ③TBST缓冲液 1MTris·HCl（pH7.6）：60.5gTris-base，加入约30ml浓盐酸，调PH至7.6，加MiliQ水至500ml。 TBS缓冲液（10×）：1MTris·HCl100ml+80gNaCl加MiliQ水1L TBST缓冲液（1×）：TBS缓冲液（10×）100ml+0.5mlTween-20（0.05%， v/v），加MiliQ水至1L。 ④封闭液：5%BSA（5g/100ml，称取1gBSA至20mlTBST，充分混匀溶解） 2、样品准备与加样 ①用4×SDSloadingbuffer,10×reducing与蛋白质样品混合，并将此EP管放在水浴锅中沸水煮5min，使蛋白质变性。 ②将预制胶固定到电泳装置中，并在装置中加满RunnigBuffer(1×)，内槽加入0.5mL抗氧化剂，小心拔下梳子； ③向上样孔中加入一定体积的蛋白样品（总蛋白量20μg以上）。向marker孔中加入2.5μl marker（按照实验要求设定marker量），向空白孔中加入一定
westernblot步骤
Westernblot 实验步骤 1. 组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃ 4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟 6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度 8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液 9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA） 12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟） 13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色 15. 分析比较记录 western blot的实验步骤及注意事项的资料 1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。 1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。 2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。
3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。 4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。 5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。 6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。 2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。 3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。 4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。 5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。 6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。 7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。 8．混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜） 9．用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。 10．将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时。 11．按步骤9洗涤。 12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS），于室温下摇动。 注意事项： western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。实验中取胶和膜需带手套。 Western实验步骤 Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western可以参 考如下步骤进行操作。
WB步骤
Western blot 的详细操作步骤 一．蛋白样品的提取 1.先从-80°冰箱内取出sham 1d/3d组，SAH+PBS 1d/3d组，SAH+SP 1d/3d组， SAH+Tregs 1d/3d组脑组织样品(区分脑皮层，海马区)，并对这四种样品进行编号样品1,2,3,4,等脑组织在室温下复温后，用预冷的PBS将脑组织表面的血性物质冲洗掉，并用吸水纸吸掉组织表面多余的水分，然后分别把样品1,2,3,4放到预冷的培养皿1,2,3,4中，分别用眼科剪刀1,2,3,4将脑组织分别剪成一个大块以及几个小块。然后分别将样品1,2,3,4称重，每个脑组织样品秤取500mg(可变化)并分别装入2ml的预冷的EP管中，同时把匀浆器（编上编号）置于冰盒内预冷。 2.按照每250mg脑组织加入1ml的RIPA的比例加入对应量的RIPA于盛有脑组织的 EP管1,2,3,4中，同时按照裂解液：cocktail=1:500的体积比加入cocktail(我们有现成的试剂)（一种蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶降解蛋白），然后用眼科剪刀（注意：不同的样品用不同的剪刀，提前把剪刀编上号1,2,3,4）将脑组织剪碎，尽量剪的碎一点以利于下一步的匀浆。 注意：这一步的处理过程要在冰盒中进行以抑制蛋白质的降解。 3将已经剪碎的EP管1,2,3,4中的脑组织倒入对应序号的匀浆器1,2,3,4中，在冰上匀浆脑组织，直至匀浆液变得无颗粒（大致用30min，最少是1次/分钟，尽量多匀浆几次）。 4.匀浆结束后，用1ml的移液枪将匀浆好的脑组织匀浆液从匀浆器中转移到对应序号的 预冷的EP管1,2,3,4（提前将要用的EP管编上号1,2,3,4并置于冰上预冷）中.每个样品转移2ml样品匀浆液。 5. 先将盛有脑组织匀浆液的EP管配平(移液枪吸取等量)后，将其放入离心机内，4℃ 离心，18000 rpm 20min。 6. 用移液枪从分层后的液体中抽取上清液(大约吸取0.5-1ml)，并转移到在冰盒中预冷的另外4个EP管1,2,3,4中，保存上清于-80度冰箱内直至使用。 二，Western blot之蛋白定量（蛋白浓度测定） 采用96孔板法 （1.）试剂如下表配置 注意：样品BSA栏中加入稀释后的样品25ul，根据样品稀释倍数来决定PBS与原液的比例，最后保证加入的样品总体积达到25ul。
WB操作步骤
Western Blotting试验步骤 一，组织蛋白提取 1.准备组织细胞裂解液：1000ul RIPA+10ul PMSF, 装于1.5mlEP管中，充 分混合。 注：如发现RIPA有沉淀，放室温半小时或常温水域使其溶解，若PMSF为粉剂，将其配置成100 mM液体备用。 2.组织准备：将组织从-80℃冰箱取出，放入1.5mlEP管，用小剪刀将组织 建成碎片，用研磨杵研磨/玻璃匀浆器5ml匀浆充分。加RIPA裂解液（按每20mg组织加裂解液150-200微升的量添加），研磨/匀浆5分钟（在冰浴下研磨/匀浆），冰上静止30分钟。 注：1）若用玻璃匀浆器可先加3/2的裂解液，匀充分，倒到EP管，再加剩下的裂解液，把匀浆器壁上的匀浆液充分倒出来。 3.将裂解后的样品10000-14000g离心3-5分钟，取上清，分装至200ulEP 管（一般有约400ul的上清？）即可进行PAGE、Western和免疫印迹等操作。 二，提取液中总蛋白的测定 用BCA法测定，试剂盒：索莱宝BCA蛋白浓度测定试剂盒。 1.配工作液：根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂加1体积Cu试剂 （50:1）配制成BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内温度。注：BCA工作液每个孔要加入200ul，标准曲线8个孔， 2.稀释标准品（BSA）：取10微升BSA标准品用PBS稀释至100微升（样品 一般可用PBS稀释），使终浓度为0.5mg/ml。将标准品按
0,2,4,6,8,12,16,20微升加到96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS补足至20ul。 3.稀释样品：最好多做几个梯度，如做2倍，4倍，8倍稀释），加稀释好的 样品20微升到96孔板的样品孔中。由于移液器在取小量时的误差，标准线前面的点可能不很准确，所以尽可能让样品点落在标准线1/2以后。 4.在各孔中加入200微升的BCA工作液，37℃放置15-30分钟。用酶标仪测 定A562nm，根据标准曲线计算出蛋白浓度。使用温箱孵育时，应注意防止因水分蒸发影响检测结果。 样品蛋白布板： 空白对照布板：
WB原理、步骤与总结
实验原理 蛋白质印迹是把电泳分离的蛋白质转移到固定基质上，然后利用抗原抗体反应来检测特异性的蛋白分子的技术，包括三个部分：SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳转移，免疫印迹分析。 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于测定蛋白质相对分子质量，SDS是阴离子去污剂，能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏其高级结构。SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4:1，由于SDS带有大量的负电荷，与蛋白质结合时掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，使各种蛋白质带有相同密度的负电荷，形似长椭圆棒，蛋白迁移率与蛋白质相对分子质量的对数呈线性关系。因此，利用相对分子质量标准蛋白所作的标准曲线，可以求得未知蛋白的相对分子质量。 电泳后蛋白质分子嵌在凝胶介质中，探针分子很难通过凝胶孔，将蛋白质从凝胶转移到固定基质上可以对蛋白质进行免疫检测分析。方法有两种：①水平半干式转移即将凝胶和固定基质似三明治样夹在缓冲液浸湿的滤纸中间，通电10~30min可完成②垂直湿式转移即将凝胶和固定基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电2~4h或过夜可完成。固定基质通常有硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯膜和尼龙膜。 蛋白质转移到固定化膜上之后，通过蛋白质染料如丽春红S检测膜上的总蛋白，或用考马斯亮蓝检测凝胶上的蛋白剩余量，以验证转移是否成功。用抗体作为探针进行特异性的免疫反应检测抗原蛋白，分为4步：①用非特异性、非反应活性分子封阻固定化膜上未吸附蛋白的自由结合区，以防止作为探针的抗体结合到膜上，出现检测时的高背景②固定化膜用专一性的一抗温育，使一抗与膜上
的抗原蛋白分子特异性结合③酶标二抗与一抗特异结合④加入酶底物，适当保温，膜上便可见到颜色反应，检测出抗原蛋白区带。 主要溶液 10%分离胶 水3.3mL、30% 丙烯酰胺混合液4.0mL、1.0mol/L Tris（pH8.8）2.5mL、10% SDS 0.1mL、10%过硫酸铵0.1mL、TEMED 0.004mL 5%浓缩胶 水2.7mL、30%丙烯酰胺混合液0.67mL、1.0mol/L Tris0.5mL、10%SDS0.04Ml/10%过硫酸铵0.04mL、TEMED0.004mL 1×Tris –甘氨酸电泳缓冲液 Tris碱3.03g、甘氨酸18.77g、SDS 1g，用去离子水定容至1L 2×SDS凝胶加样缓冲液 Tris-HCl（pH6.8）100mmol/L，β-巯基乙醇10%，10%甘油，0.01%溴酚蓝，10%SDS 转移缓冲液 Tris 2.45g，甘氨酸11.25g，甲醇100mL，加去离子水至1L TBST Tris 1.21g NaCl 8.77g，Tween-20 1 mL，加去离子水至1L Stripping 1.3mL Tris （pH 6.8），4mL10%SDS，140μlβ-巯基乙醇，用水定容到20mL 实验步骤
WB实验步骤详细总结
WB实验步骤详细总结
蛋白提取（所有操作在冰上进行） 1.裂解 1)配裂解液：PMSF=100：1，（裂解液和PMSF 在-20℃保存，提前一天4℃解冻） 取2ml裂解液，加20μl PMSF混匀 2)称取30mg组织，切碎放入标记好的AP管中，加入600μl上述1中液体（加入液体与组织比例为20：1），冰上静置10min 2.匀浆 先用超纯水润洗一下匀浆机的钢头，（同时进行几组匀浆时，组间也要润洗钢头） 在匀浆机（在生化室）上每次匀浆10s，两次（间隔5s），冰上静置30min 3.离心（在基础4楼416室） 1)自带1ml枪以及蓝枪头和黄枪头，三个1.5的离心管（①，②两个标记，③加少量超纯水，③号是为了离心平衡，对称放置）
2)将离心机预冷至4℃为止，以1200×10r/min 离心15min 3)用移液枪将上层清液取出放入①②号管中 4.变性（上样缓冲液：样品=4：1） 将样品转移至2~3个0.5mlAP管中 加上样缓冲液，100℃变性10min 仪器屏幕： S5 00：10 S5 100．0 00：10 温度时间（时： 5.保存 变性结束后，打开AP管盖放一下气，然后4℃保存，点样是取出即可用 WB实验步骤
1.清洗玻璃板：清洗玻璃板后风干，将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。 2.配制分离胶 1)准备：1ml枪（蓝色枪头），200μl枪（黄色枪头）10μl（白色枪头） 2)10%分离胶的配置：（用50ml烧杯。1.0mm板配1.5块胶，1.5mm板配2块板） 5.91ml 超纯水 4.95ml 丙烯酰胺（30%）避光保存极易失效 3.75ml Ph8.8Tris?HCL 10%SDS 150μl AP（催化剂促凝作用） 150μl TEMED 9μl 3.灌胶 沿玻璃板右上角缓慢匀速加入分离胶（用1ml 移液枪，不要将移液管内液体完全打出防止气泡）保持液面平稳上升至上方绿色线为止4.水封
Westernblot实验步骤及注意事项
Westernblot实验步骤及注意事项 1. 组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃ 4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟 6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度 8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液 9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA） 12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟） 13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色 15. 分析比较记录 western blot的实验步骤及注意事项的资料 1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。 1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。 3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。 4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。 5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。 6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。 2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。 3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。 4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。 5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。 6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。 7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。 8．混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜）9．用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。 10．将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时。11．按步骤9洗涤。 12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS），于室温下摇动。 注意事项： western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。实验中取胶和膜需带手套。 Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。 1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation) O 可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。 O 收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。