WB注意事项及常见问题
WB注意事项及常见问题
注意事项
一、样本收集
1.组织样本
原则上要求客户或我们的技术员把组织分切剪碎至研磨管（根据实验的需要告知他们取多少组织），并加入适量裂解液和研磨珠，然后放置于-80℃保存。具体详情参照“组织样本收集注意事项.doc”；
2.细胞样品
原则上要求客户或我们的技术员不要用胰酶把细胞消化下来，特别是分选对象是膜蛋白时，具体详情参照“细胞样品收集注意事项.doc”；
二、总蛋白提取
1.组织样品
具体详情参照“组织样本收集注意事项.doc”；记得加入蛋白酶抑制剂，如果分选对象是磷酸化蛋白时，记得加入磷酸化酶抑制剂；
2.细胞样品
具体详情参照“细胞样品收集注意事项.doc”；记得加入蛋白酶抑制剂，如果分选对象是磷酸化蛋白时，记得加入磷酸化酶抑制剂；
三、蛋白样本保存
裂解细胞或组织提取总蛋白时，细胞碎片沉淀一般-20℃保存以防万一，提取好的蛋白样品分装2份，一份加入上样缓冲液变性后-20℃保存，一份直接-20℃保存；
四、蛋白变性
提取好的总蛋白取一部分（不是全部）加入上样缓冲液进行加热变性（100℃，5min），变性好的蛋白应该-20℃保存，冻融后不再需要加热变性；
五、SDS-PAGE
1.浓缩胶的胶浓度一般为5%，用于压沉样品；
2.分离胶的胶浓度取决于分析对象的分子量大小，详情见Western Blotting 全攻
略.pdf第4页；
3.分离胶和浓缩胶的高度比为8:3；
4.电泳结束后，应及时用清洗干净玻璃板，清洗时应使用海绵擦布，切勿使用
刷子，以免刮花玻璃板；
5.电泳结束后，应及时冲洗电泳槽，以免盐离子沉积，导致电泳丝腐蚀；
6.清洗电泳芯时，一定要注意别弄段电泳丝；
六、转膜
1.注意海绵垫，滤纸（转膜专用滤纸），转印膜，胶的叠放位置，以保证正确的
转印方向；
2.注意海绵垫，滤纸（转膜专用滤纸），转印膜，胶的相对大小，以免造成短路；
3.转印结束后，应及时取出转印膜，并立即用TBST漂洗1-2遍，并立即加入
封闭液，这样可以避免膜上的杂质残留或膜变干导致背景高的问题；
4.转印结束后，应及时冲洗转印槽和转印芯，以免盐离子沉积，导致电泳丝腐
蚀；
5.转印结束后，应及时用水泡洗海绵垫和滤纸，以免盐离子沉积，导致转膜时
短路，并放在篮子上晾干，如果海绵垫和滤纸不及时晾干，容易导致海绵垫和滤纸内部的结构破坏；
七、封闭
1. 进行封闭时，应加入足量的封闭液（以完全覆盖膜为底限），并保证整个封闭过程中，膜与封闭液充分接触，避免长时间离开封闭液，特别进行4℃静止封闭过夜时，一定要加入足量的封闭液和保证平坦放置；上述注意事项主要为了避免膜变干，导致背景升高；
八、一抗杂交
1.一抗的稀释比例：第一次使用时参考具体抗体说明书建议的稀释比例，并根
据实际的实验结果进行调整；
2.杂交条件：如果是室温孵育，至少保证孵育1-2小时，并放置脱色摇床上进
行摇晃，如果是4℃孵育，应孵育过夜，可静止亦可放置脱色摇床上进行摇
晃；
3.应使用专用的一抗稀释液进行稀释，使用后进行回收并4℃保存，如果回收
的稀释抗体用沉淀或长菌，应丢弃；
九、一抗杂交后洗膜
1.一般使用标准的TBST缓冲液，如果判断因为是一抗的原因导致的背景过高，
可以把NaCl的浓度提高到500 nM (标准的为150nM);
2.一般洗涤3次，每次10min，如果判断因为是一抗的原因导致的背景过高，
可以把洗涤次数提高到4-6次；
十、二抗杂交
1. 二抗的稀释比例：第一次使用时参考具体抗体说明书建议的稀释比例，并根据实际的实验结果进行调整；
2. 杂交条件：一般室温孵育，孵育1小时即可（时间延长会产生非特异杂交，从而导致背景过高），并放置脱色摇床上进行摇晃（一定要避免膜变干，否则背景其高）；
3. 应使用封闭液进行稀释，使用后进行不回收；
十一、二抗杂交后洗膜
1. 一般使用标准的TBST缓冲液，如果判断因为是一抗的原因导致的背景过高，可以把NaCl的浓度提高到500 nM (标准的为150nM);
2. 一般洗涤3次，每次10min，如果判断因为是一抗的原因导致的背景过高，可以把洗涤次数提高到4-6次；
十二、拍照
1. 注意选择曝光时间，同时兼顾工作效率，因选择连续拍照模式，这样总有一个何时曝光时间；
十三、报告单整理
1.原始图片；
2.对比度和亮度调整的图片；
3.图片说明：上样顺序；
4.灰度值：原始值，数据标准化（同一个样品的目标蛋白的灰度值除以内参蛋
白的灰度值），相对表达量（实验样品的数据标准化比值除以参照样品（问客户）的数据标准化比值），参照样品的相对表达量一定为1；
5.实验方法：准确的一抗，二抗，稀释比例；
常见问题
一、没信号
1.膜一片空白，没有任何条带，阳性对照样品也无条带：实验失败？抗体失效？；
重新进行实验，重新稀释抗体；
2.膜一片空白，没有任何条带，阳性对照样品有条带：实验样品降解？实验样
品无该蛋白的表达？转膜效率过低？；重新进行实验，复核查找上述原因，以寻找对策；
二、背景过高
1.目的条带以外的区域有信号，如果是片状，甚至整块膜，一般是封闭不好，
膜变干，一抗非特异杂交或二抗的非特异杂交导致；如果是条纹状，一般是由于膜上有压痕导致，如果是点状，一般是膜上有杂质，或泡膜时膜没有充分浸泡；
三、杂带
1.目的带以外的信号条带为杂带，一般由于一抗的特异性不好所导致，如果目
的带比杂带信号强，可通过减低一抗的稀释比例，并缩短杂交时间解决；如果目的带比杂带信号弱，在不减低一抗的稀释比例的前提下，缩短杂交时间；
并提高TBST缓冲液的NaCl的浓度提高到500 nM；
2.杂带如果与目的带的位置相距较远，可以不优化实验，直接裁剪即可，杂带
如果与目的带的位置相距较进，应调整胶浓度，并延长电泳时间，已经采取上述解决方法；
四、目的带弱
1.一抗效价低：提高一抗稀释比例，提高杂交时间，减少洗膜次数，提高曝光
时间，提高上样量；
2.转膜效率低：检测转膜试剂和耗材，优化转膜条件；
五、复合问题
上述问题往往同时出现，首先客观冷静分析问题所在，针对问题采取相应策略，有些策略可能互相矛盾，应以解决主要问题为主；