根癌农杆菌介导的植物基因转化技术

实验7 根癌农杆菌介导的植物基因转化技术

根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农杆菌中诱导植物产生肿瘤的质粒（Tumor inducing plasmid），简称为Ti质粒。野生型农杆菌的Ti质粒，含有两个与致瘤有关的区域：一个是T－DNA区（transferred DNA region），含致瘤基因；另一个是毒性区（Virulence region），在T－DNA的切割、转移与整合过程中起作用。用于植物基因转化的农杆菌Ti质粒载体系统的构建，是将野生Ti质粒中的致瘤基因删除，并在T－DNA区域内插入适当的选择标记和多克隆位点。图1是植物表达载体pBI121的DNA图谱，以CaMV35S启动子驱动的新霉素磷酸转移酶基因NPTII为卡那霉素抗性选择标记基因，以β－葡萄糖苷酶（β－glucuronidase,Gus）为报告基因，经pBI121转化的获得的转基因细胞、组织或植株，具有抗卡那霉素的特性，经组织化学染色呈蓝色。

图2－1 Ti质粒载体pBI121图谱

实验要求：掌握根癌农杆菌侵染植物获取转基因材料的方法；理解农杆菌介导途径进行基因转化的机理；了解转基因植物筛选的方法。

一、试材与用具

1．植物材料：烟草无菌苗

2．农杆菌与载体：农杆菌LBA4404、质粒PBI121

3．主要仪器：超净工作台、高压灭菌锅、小型离心机、光照培养箱或培养室、恒温摇床等。

二、方法步骤

1．试剂的配制

（1）YEB培养基：牛肉膏（5g/L），酵母抽提物（1g/L），蛋白胨（5g/L），蔗糖（5g/L），MgSO4（2mmol/L） pH7.2。固体培养基含琼脂15g/L。

（2）烟草分化培养基：MS + 2mg/L 6-BA + 0.5mg/L IAA

（3）烟草生根培养基：MS + 0.5mg/L IAA

（4）卡那霉素（Kan）母液：100mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。

（5）羧苄青霉素（cb）母液：50mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。

（6）链霉素（Sm）母液：100mg/ml，过滤除菌，－20℃保存。

（7）X－gluc（5―溴―4―氯―3―吲哚―β―葡萄糖醛酸）溶液（1ml）：称取0.5mg X －gluc，加入1～2滴N，N－二甲酰胺（DMFA）使之完全溶解，再加入980μl磷酸缓冲液（0.1mol/L,pH7.0）、10μl铁氰化钾（5mmol/L）、10μl亚铁氰化钾（5mmol/L），搅拌混匀后加入1μl Triton X - 100、X－gluc溶液应现用现配。

2．农杆菌培养

（1）挑取携带植物表达载体质粒的农杆菌单菌落，接种在20ml含100mg/L Sm和50mg/L Kan的YEB液体培养基中，28℃，180rpm振荡培养过夜。

（2）活化过夜的农杆菌按1:50的比例接种在相同的YEB液体培养基中，继续培养至对数生长期。

（3）5000rpm离心5min，收集菌体，用1/2MS液体培养基悬浮至OD600=0.2～0.5，准备感染用。

3．外植体的侵染及共培养

（1）取烟草无菌叶片，切成4～6mm的叶盘（或用打孔器制取），叶盘外植体浸入农杆菌菌液中，感染10min～20min，取出外植体用无菌滤纸吸去附着的菌液。

（2）将浸染过的外植体接种在分化培养基上，暗培养2d。

4．选择培养

将共培养的外植体转移到含500mg/L Cb和100mg/L Kan分化培养基上，25℃，光照培养。

5．继代培养：每隔2～3周继代一次，并逐渐降低Cb的浓度至200mg/L。

6．生根培养：待培养筛选的抗性芽长至1～1.5cm时，切下并转入含有200mg/L Cb和75mg/L Kan的生根培养基上诱导生根，获得具有卡那霉素抗性的转基因植株。

7．转基因植株的Gus基因检测

（1）从具有卡那霉素抗性的烟草植株上，剪取幼嫩叶片，放入0.25ml的小离心管中，加入适量的X－gluc溶液，叶片全部浸泡在染液中，盖好盖子防止挥发。

（2）37℃保温，染色2h可看到蓝色，染色过夜。

（3）依次用70%、80%、90%和100%的乙醇脱色，直至绿色褪去。

（4）观察转基因植株叶片与未转化植株叶片的颜色。

三、作业和思考题

1．简述农杆菌介导途径进行基因转化的机理及操作步骤。

2．根据实验结果，分析影响基因转化效率的因素。

（刘风珍）

根癌农杆菌介导的真菌转化

根癌农杆菌介导的真菌转化 以下是为大家整理的根癌农杆菌介导的真菌转化的相关范文，本文关键词为根癌,杆菌,介导,真菌,转化,根癌,杆菌,介导,真菌,转化,，您可以从右上方搜索框检索更多相关文章，如果您觉得有用，请继续关注我们并推荐给您的好友，您可以在综合文库中查看更多范文。 根癌农杆菌介导的真菌转化 (一)农杆菌电击感受态制备及电击转化A感受态的制备 1)将农杆菌菌液划线于Yeb平板（50μg/mlkana），28℃，36-48h。

2)挑单菌落至3mlYeb试管（50μg/mlkana）中，28℃，200rpm培养过夜。3)转1ml至50mlYeb中，28℃，200rpm培养至oD600=0.8。 4)于4℃，5000rpm，10min收集菌体。 5)用50mL10%的甘油（去离子水配置，湿热灭菌）洗沉淀3次（4℃，5000rpm，10min），洗涤时一定要把菌体悬浮均匀。 6)重悬于1ml10%甘油中（约1011个细胞/ml），可立即使用，或分装为每管50μl，液氮速冻后，-80℃保存备用。b电击转化 1)将1μl质粒加入到农杆菌感受态细胞中，混匀，转至无菌预冷的电击杯中。2)将电击杯放入电转化仪的电极之间，16kv/cm，5ms。 3)取出电击杯，迅速加入200-300μlYeb（不加抗生素），并将混合液转入ep管中。4)于28℃，220rpm，2-3h。 5)将50-100μl菌液涂布于Yeb平板（50μg/mlcar和50μg/mlkana）上，于28℃培养2-3天后，挑斑鉴定。 (二)农杆菌化学感受态制备及化学法转化https://www.sodocs.net/doc/9a16485998.html,petentcells 1)Inoculateasinglecolonyto5mlLb2)growat28℃tologphage,shakingat250rp m 3)Inoculate2mlofthecultureto50mlLbmediumandgrowtooD600=0.5ca.8h ours4)chillonicefor10minutes 5)spindownthecellsbycentrifugationat3000g(8000rpm)for10minutesat4℃

植物基因转化常用方法

一. 植物遗传转化的方法 植物遗传转化技术可分为两大类：一类是直接基因转移技术，包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等，其中基因枪转化法是代表。另一类是生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。 二.农杆菌介导的基因转化方法 （一）农杆菌的Ti质粒与T-DNA的整合机制 几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌感染，而产生根瘤。它是一种革兰氏阴性土壤杆菌（A. tumefaciens）。其致瘤特性是由Ti（tumor－inducing）质粒介导的。农杆根瘤菌之所以会感染植物根部是因为植物根部损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁香 酮和羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质可以诱导Vir（Virulence region)基因的启动表达，Vir基因的产物将Ti质粒上的一段T－DNA单链切下，而位于根瘤染色体上的操纵子基因产物则与单链T－DNA结合，形成复合物，转化植物根部细胞。T－DNA上有三套基因，其中两套基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤。第三套基因合成冠瘿碱，冠瘿碱有四种类型：章鱼碱（octopine）、胭脂碱（nopaline）、农杆碱（agropine）、琥珀碱（succinamopine），使农杆菌生长必需的物质。 1. Ti质粒的结构 在发现根瘤农杆菌诱发冠瘿瘤的本质是Ti质粒后，Ti质粒便成为冠瘿瘤形成基因鉴定与分析的主要研究对象。 Ti质粒大约在160～240kB之间。其中T-DNA大约在15kb-30kb。Vir基因区在36kb 左右。除此之外，Ti质粒上还存在Con区（region encoding conjugation)和Ori区（origin of replication)。 T-DNA上共有三套基因和左右两个边界，LB和RB是长为25bp的末端反复重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。 tms由两个基因组成：tms1（iaaM）和tms2（iaaH） tmr由一个基因组成iptz： tmt由若干基因构成，合成稀有氨基酸衍生物，称为opines。它有三个成员： octopine＝精氨酸与丙酮酸的缩合物 Napaline＝精氨酸与－酮戊二酸的缩合物 Agropine＝谷氨酸与二环糖的缩合物 据此可将Ti质粒分为三大类，感染的植物诱导合成这些有机碱，但不能利用它们，其分解酶基因在Ti质粒上，分解产物为氨基酸和糖类，供根癌农杆菌使用作为氮源及碳源。

根癌农杆菌转基因的分子机制

吉林农业科学２００７，３２（１）：１９－２５ＪｏｕｒｎａｌｏｆＪｉｌｉｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ 文章编号：１００３－８７０１（２００７）０１－００１９－０７ 根癌农杆菌转基因的分子机制 周晓航，刘洪章＊ （吉林农业大学园艺学院，长春１３０１１８） 摘要：根癌农杆菌将Ｔ－ＤＮＡ转移并插入寄主细胞的基因组，需要趋化与附着、ｖｉｒ区活化、Ｔ－ＤＮＡ切割及转运、Ｔ－ＤＮＡ整合及表达等步骤。本文对这些步骤分子机制的研究进展进行了综述。 关键词：根癌农杆菌；Ｔ－ＤＮＡ转移 中图分类号：Ｑ８１２文献标识码：Ａ 野生型根癌农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）是一种土壤病原细菌，它通过根部伤口侵入植物体，刺激寄主在侵染部位形成冠瘿瘤，引发根癌病（ｃｒｏｗｎｇａｌｌ）。该病害在世界范围内普遍发生，患病植株株体衰弱，严重时可以整株死亡，因此，在生产上造成极大危害。冠瘿瘤的生成，是由于根癌农杆菌染色体外遗传物质—— —Ｔｉ质粒上的一段ＤＮＡ（Ｔ－ＤＮＡ）转移到植物细胞，整合进染色体组并进行表达的结果。这种具有天然转基因功能的质粒，经过改造，在基因工程中可以用作基因转移的载体［１］。农杆菌介导的转化方法（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ＡＴＭＴ）是研究植物和真菌反向遗传学的常用技术。基于上述原因，近几年来，Ｔ－ＤＮＡ的转运，以及随后在植物（或者真菌）细胞中的整合，表达乃至遗传等问题，一直受到植物病理学家和遗传工程学家的广泛关注，参与这些步骤的相关基因表达调控及其编码产物的功能研究方面多有报道，现就Ｔ－ＤＮＡ外运的分子机理作如下概述。１Ｔ－ＤＮＡ转移概述 Ｔ－ＤＮＡ的转运及整合存在如下模式： Ａ．根癌农杆菌由于趋化性而游向并附着到植物细胞表面。 Ｂ．农杆菌Ｔｉ质粒上的ｖｉｒ区基因活化表达，其中ＶｉｒＤ２将Ｔ－ＤＮＡ切割下来，并生成ＶｉｒＤ２－Ｔ链结合物（ＶｉｒＤ２－Ｔｓｔｒａｎｄｃｏｍｐｌｅｘ）；而ＶｉｒＢ各蛋白参与转运通道装配。 Ｃ．ＶｉｒＤ２－Ｔ链结合物穿越ＶｉｒＢ通道，进入植物细胞；ＶｉｒＥ２与ＶｉｒＥ１形成复合体，自同一通道穿过。 Ｄ．在植物细胞质，ＶｉｒＥ２与ＶｉｒＥ１解离，前者结合到Ｔ链（结合有ＶｉｒＤ２）上形成Ｔ复合体。 Ｅ．Ｔ复合体与植物细胞因子结合：ＶｉｒＤ２与ＡｔＫＡＰα、亲环蛋白相结合；ＶｉｒＥ２与ＶＩＰ１和（或者）ＶＩＰ２相结合；ＶｉｒＤ２核定位序列区磷酸化；ＡｔＫＡＰα可能与推测的ＡｔＫＡＰβ相互作用。 Ｆ．Ｔ复合体经核孔进入细胞核。在ＶＩＰ１和（或者）ＶＩＰ２的作用下，Ｔ复合体靶向染色体。然后整合进植物基因组［２］。 ２趋化及附着 与活植物组织临近或接触，菌体形态受诱导向线形转变［３］，然后一端附着到植物体上。根癌农杆菌具有两个系统，控制对植物细胞的附着：一个依赖于ＡｔｔＲ，为所有供试植物的发病以及侵染非豆科植物根系所必需。另一系统调控根癌农杆菌结合到豆科植物根系上［４］。以胡萝卜、拟南芥细胞为试材收稿日期：２００６－０５－１２ 作者简介：周晓航（１９７５－），硕士，研究方向：果树生物技术。 通讯作者：刘洪章，博士生导师

植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定

植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定 〖实验目的〗 1．了解创建烟草突变体库的方法； 2．理解每种方法的基本原理； 3．掌握农杆菌介导的转基因方法以及转基因产物筛选和鉴定的基本过程。 〖实验原理〗 随着越来越多植物的全基因组测序工作的完成，在此基础上开展功能基因组的研究是目前的核心研究内容之一。植物插入突变体库的建立是功能基因组研究的一个重要内容，在此基础上也能进行正向遗传学及反向遗传学的研究。在创制突变体的策略上，传统方法是使用物理或化学诱变方法获得，其优点是可在尽可能短的时间内获得饱和突变体。与传统的物理和化学诱变方法相比，生物诱变(T-DNA和转座子插人诱变)通常可标记突变基因，从而较为容易地分离鉴定靶基因。最近数年，通过农杆菌介导的T-DNA插入突变已成为国际公认的植物功能基因组学的主要研究方法之一。 烟草是植物基因组研究的一种模式植物，其突变体库的创建是烟草功能基因组学研究中的重要内容，其目的是通过大规模的突变体库平台快速全方位的了解基因组中各个基因的功能。突变体的创制是遗传学研究的基础，也是分离基因和基因功能鉴定的最要途径。通过诱导培养，使烟草产生愈伤组织，利用土壤农杆菌感染愈伤组织，实现T-DNA标签在烟草愈伤组织基因组中大量随机插人，利用植物细胞的全能性，经过抗性筛选，诱导分化，从抗性愈伤组织获得烟草突变体再生植株，获得各突变体的纯合材料，从而建立烟草突变体的数据库，然后分析突变性状与T-DNA的共分离关系，存在共分离的材料用适当的Tail-PCR克隆技术获得T-DNA的侧翼基因组序列，用其作探针筛选基因文库，获取目标基因或克隆，再进行下一步的分析（图实验4-1）。 T-DNA 载体构建 转化植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子

农杆菌转化法原理

农杆菌转化法原理 This manuscript was revised on November 28, 2020

农杆菌转化法原理： 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位(受伤处的细胞会分泌大量酚类化合物,从而使农杆菌移向这些细胞)，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。 根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中,并且可以通过减速分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。 人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。 农杆菌转化植物细胞涉及一系列复杂的反应，主要包括：①受伤的植物细胞为修复创伤部位，释放一些糖类、酚类等信号分子。②在信号分子的诱导下，农杆菌向受伤组织集中，并吸附在细胞表面。③转移DNA上的毒粒基因被激活并表达，同时形成转移DNA的中间体。④转移DNA进入植物细胞，并整合到植物细胞基因组中。 方法：（根据不同受体环境基因要求而不同） 1．农杆菌准备 2．外植体的准备（愈伤组织、悬浮细胞系、幼嫩茎段或叶片）; 3．用 MS-AS液体培养基稀释原菌液15倍（1.5ml / 20ml）或离心后稀释3倍; 4．外植体与菌液共培养20 分钟; 5．放置在带滤纸的培养皿上（注意充分吸干多余的菌液）; 6．将外植体接种到MS-AS固体诱导培养基，培养2－3天 ; 7．移至含卡那霉素（Kan）300mg/L和羧苄青霉素（Cb 300mg/L）的固体筛选培养基上进行Kan抗性愈伤组织的筛选; 8．隔20天，进行第二次筛选； 9．抗性愈伤组织在固体筛选培养基上分化成苗； 10 在生根培养基上生根，获得完整的再分化植株。

农杆菌介导法

实验九植物遗传转化——农杆菌介导法 一、目的 了解农杆菌转化的机理；掌握农杆菌介导转化水稻的技术 二、原理 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)具有跨界转移DNA的能力。下列因子与转化过程有关： 1. Ti 质粒(tumor-inducing plasmid)上的T-DNA (transferred DNA) T-DNA是农杆菌Ti质粒上能够转移到植物基因组的一段DNA序列。T-DNA含有RB和LB两个边界，它们是25bp的正向重复序列，是T-DNA 转移的顺式作用元件。不同类型的农杆菌其边界序列有所不同，但划线部分为完全保守序列。置于该边界内的任何外源基因均可被转化。LB缺失突变后农杆菌仍能致瘤，但RB缺失会导致致瘤能力丧失，这时几乎完全没有T-DNA的转移。 LB（－链）5’GT TTACACCACAA TA TATCCTG CCA 3’ RB（＋链）5’TGA CAGGA TA TA TTGGCGGGTAA AC 3’ 2. Ti质粒上的Vir区（virulence region）操纵子 转化所必需的基因有vir A、B、C、D、E、G。其中蛋白VirD1/D2识别T-DNA边界RB和LB；VirC识别T-DNA右边界的超驱增强子；VirD2在T-DNA底链起内切酶作用造成切刻，并与T－链5’ 共价结合，带有1个核定位信号NLS；VirB形成转移复合通道；VirE2为单链DNA 结合蛋白，有2个NLS。该操纵子的表达顺序如下： vir A和vir G组成型表达形成VirA和VirG蛋白→VirA被植物创伤信号分子激活→激活的VirA使VirG激活→激活的VirG 诱导vir C、D、E、B、F、H表达。 3. 农杆菌染色体基因组相关基因：chv A、chv B（农杆菌运动、附着）、chv D、chv E（编码单糖结合蛋白、趋化性）、psc A、att、cel（合成纤维素丝，附着）。它们与农杆菌的趋化性和识别附着植物细胞有关。 4. 寄主细胞表面受体 5.诱导条件: 小分子酚类化合物：如乙酰丁香酮（AS，acetosyringone）、羟基乙酰丁香酮（OH-AS，hydroxyacetosyringone）；它们是植物细胞创伤反应的一部分，或创伤细胞合成木质素的一部分，是莽草酸合成途径的产物。植物细胞必须在创伤和活跃的代谢状态下才能产生AS及OH-AS。农杆菌对一系列植物酚类化合物具有趋化性，同时高浓度的AS又可使农杆菌的vir 基因活化表达。这些化合物是双子叶植物细胞壁合成的前体，通常不存在于单子叶植物中，这正说明了为什么根癌农杆菌不易感染单子叶植物。若要实现农杆菌对水稻的转化，必须添加这类诱导物。 糖类：如D-葡萄糖、D-木糖等。它们在Vir区基因诱导和农杆菌毒力上起一定作用。 高浓度的肌醇可促进vir基因的表达。 低pH：pH 5.1－5.8 时Vir区基因的诱导达到最高水平。

农杆菌介导转基因的原理

农杆菌介导转基因的原理？ 转基因技术的飞速发展为生物定向改良和分子育种提供了一种较佳的方法，并使其成为基因工程和育种的最有效途径，目前应用较广泛的转基因技术有农杆菌介导法、花粉通道法、显微注射法、基因枪法、离子束介导法等等，其中农杆菌介导法以其费用低、拷贝数低、重复性好、基因沉默现象少、转育周期短及能转化较大片段等独特优点而备受科学工作者的青睐。农杆菌介导法主要以植物的分生组织和生殖器官作为外源基因导入的受体，通过真空渗透法、浸蘸法及注射法等方法使农杆菌与受体材料接触，以完成可遗传细胞的转化，然后利用组织培养的方法培育出转基因植株，并通过抗生素筛选和分子检测鉴定转基因植株后代。 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 农杆菌转化的详细机理已有大量综述, 并介绍新进展. 野生型根癌农杆菌能够将自身的一段DNA转入植物细胞. 因为转入的这一段DNA含有一些激素合成基因, 因而导致转化细胞自身激素的不平衡从而产生冠瘿瘤. 这些致瘤菌株都含有一个约200 kb的环状质粒, 被称为Ti(tumor inducing)质粒, 包括毒性区(Vir 区)、接合转移区(Con区)、复制起始区(Ori区)和T-DNA区4部分. 其中与冠瘿瘤生成有关的是Vir区和T-DNA区. 前者大小为30 kb, 分virA～J等至少10个操纵子, 决定了T-DNA的加工和转移过程. T-DNA可以将携带的任何基因整合到植物基因组中, 但这些基因本身与T-DNA的转移与整合无关, 仅左右两端各25 bp的同向重复序列为其加工所必需, 其中14 bp是完全保守的, 分10和4 bp不连续的两组. 两边界中以右边界更为重要. VirA作为受体蛋白接受损伤植物细胞分泌物的诱导, 自身磷酸化后进一步磷酸化激活VirG蛋白; 后者是一种DNA 转录活化因子, 被激活后可以特异性结合到其他vir基因启动子区上游的一个叫vir框(vir box)的序列, 启动这些基因的转录. 其中, virD基因产物对T-DNA进行剪切, 产生T-DNA单链. 然后以类似于细菌接合转移过程的方式将T-DNA与VirD2组成的复合物转入植物细胞], 在那里与许多VirE2蛋白分子(为DNA单链结合蛋白)相结合, 形成T链复合物(T-complex). 在此过程中VirE1作为VirE2的一个特殊的分子伴侣具有协助VirE2转运和阻止它与T-DNA链结合的功能. 实验表明, 转基因植物产生的VirE2蛋白分子也能在植物细胞内与VirD2-T-DNA形成T链复合物. 之后, 这一复合物在VirD2和VirE2核定位信号(NLS)引导下以VirD2为先导被转运进入细胞核. 转入细胞核的T-DNA以单或多拷贝的形式随机整合到植物染色体上. 研究表明T-DNA优先整合到转录活跃区, 而且在T-DNA的同源区与DNA的高度重复区T-DNA的整合频率也比较高. 整合进植物基因组的T-DNA也有一定程度的缺失、重复、填充和超界等现象发生, 例如在用真空渗透法转化的拟南芥中有66%出现超界现象, 甚至有整个Ti质粒整合进植物基因组的报道, T-DNA超界转移现象的机理尚不完全清楚, 可能与其左边界周边序列有关. 现在, 对农杆菌感染过程中其本身因子的转录与调控已研究得相当深入, 但

农杆菌介导法

农杆菌介导的高效水稻遗传转化体系的研究A Highly Efficient Agrobacterium - mediated Rice Transformation Method 水稻是基因组研究的模式植物 ,近年来水稻基因组研究取得了很大进展 ,构建了遗传图谱和物理图 谱 ,完成了籼稻和粳稻的全基因组草图测2 - 3序 ,以及第 1 号和第 4 号染色体的精细测4 - 5序 ,并对第 10 号染色体的结构进行了详细分析。在此基础上 ,各实验室大规模地 ,系统地进行水稻功能基因研究 ,普遍采用的研究手段是基因标签技术。基因标签技术包括 T - DNA 和转座子标签 ,创建大量的基因标签体是功能基因研究的材料平台。而根癌农杆菌介导的水稻遗传转化是水稻基因标签技术中的重要步骤之一。本研究完善了根癌农杆菌介导的水稻转化方法 ,以期为水稻功能基因研究提供丰富材料 , 为水稻重要农艺性状的改良开辟途径。 1材料 以水稻品种日本晴(Oryza sativa L. ssp.japonica)为试验材料。菌株类型为 EHA105 超毒力菌株 ,载体为增强子捕获载体 pFX- E24. 2 - 15R(见图 1) ,载体上带有 GUS报告基因、35 S的 CaMV 启动子序列和潮霉素选择标记基因(HYG) 。农杆菌菌株为EHA105。 2方法 2.1水稻愈伤组织的诱导诱导方法参照 HIEI7等。将日本晴水稻种子去壳 ,用 75 %乙醇灭菌 5min ,再用2. 5 %的次氯酸钠灭菌处理不同时间(40min ,37 min ,30 min 和 25 min) ,以确定最佳灭菌时间 ,灭菌后用无菌水冲洗 6～8 次 ,于 MS 固体培养基上28 ℃避光培养 ,30 d 后 ,将愈伤组织进行继代培 养 ,得到胚性愈伤组织。 2.2农杆菌转化愈伤组织用 AB 固体培养基+氯霉素 25 mg/L + 利福平 20 mg/L + AS 20 mg/L培养农杆菌 ,在20 ℃下培养5～6 d。用无菌勺子轻轻刮下培养的农杆菌 ,放入 AAM液体培养基中(加有2 mg/L 2 ,4

农杆菌

农杆菌 农杆菌（Agrobacterium）是生活在植物根的表面依靠由根组织渗透出来的营养物质生存的一类普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌。 分类 冠瘿瘤 农杆菌主要有两种：根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）。根癌农杆菌能在自然条件下趋化性地感染140多种双子叶植物或裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。引发冠瘿瘤的原因是，Ti质粒上的T-DNA上有8个左右的基因在植物细胞内表达，指导合成一种非常寻常的化合物冠瘿碱，进而引起转化细胞癌变。而发根农杆菌则诱导产生发状根，其特征是大量增生高度分支的根系。根癌农杆菌的Ti质粒和发根农杆菌的Ri质粒上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA 插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系，被誉为“自然界最小的遗传工程师”[1]。可以通过将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移和整合，然后通过细胞和组织培养技术，得到转基因植物。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近几年来，农杆菌的介导转化在一些单子叶植物(尤其是水稻)中也得到了广泛应用。此外，生物技术学家还可以通过发根农杆菌转化，在液体培养基中培养高密度的根，作为一种在转基因植物中获得大量蛋白质的方法。 生存与形状 根癌农杆菌生活在土壤——特别是耕种过的田地里，因为经过耕种的土壤疏松，适宜根癌农杆菌生长。根癌农杆菌的身体为棒状，有两三个微米长，靠几根鞭毛运动，鞭毛一般生在侧边。用显微镜放大到1000倍时，人们就能把它看得很清楚了。根癌农杆菌虽小，也有细胞壁，按以前的生物两界分类法，它当然属于植物界，就是说，它曾被当作是一种低等植物。在许多双子叶植物靠近地面的根茎交界处，根癌农杆菌能诱发一种帽状肿瘤，人们称之为冠瘿瘤病。这种病曾在法国、东欧和澳大利亚的葡萄等果树上大面积发生，造成很大的危害。在其他地方，甚至城市园林绿化中，也有不少植物患上此病。人们发现，根癌农杆菌所产生的冠瘿瘤病，与豆科植物根部的固氮根瘤细菌所产生的根瘤相似；然而，事实上，两者的作用方式并不一样。豆科植物的固氮根瘤菌会钻到植物细胞内部，与植物细胞共生，根瘤细菌为豆科植物提供氮肥，植物细胞则供给根瘤细胞其他各种营养。

农杆菌介导转化法的概述

农杆菌介导转化法的概述 自从1983年转基因植物诞生以来，植物基因工程成为发展最快、应用潜力最大的生物技术领域之一。植物转基因技术是指把从动物、植物或微生物中分离到的目的基因，通过各种方法转移到植物的基因组中，使之稳定遗传并赋予植物新的农艺性状，如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等。[1] 目前，应用于植物转基因较多的方法有基因枪轰击法和农杆菌介导法。由于基因枪轰击的随机性，容易出现突变、丢失和引起基因沉默等不利于外源基因在宿主植物的稳定表达的缺点，而农杆菌介导法是一种天然的植物遗传转化系统,外源基因在转基因植物中的拷贝数低、遗传稳定，是最常用的转基因技术[2]。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化法在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。本文对农杆菌介导转化法进行综述。 1 关于农杆菌 农杆菌[3-5]是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性的感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。与植物基因转化有关的有根瘤农杆菌和发根农杆菌这两种类型。 1.1根癌农杆菌 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)含有Ti质粒，能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤，即诱发冠瘿瘤；Ti质粒是农杆菌染色体外的遗传物质，为双链共价闭合环状DNA分子，大小约200-250kb。 依据Ti质粒诱导的植物细胞产生的冠瘿碱的种类不同，根癌农杆菌可分为4种类型：章鱼碱型（Octopine）、胭脂碱型（Nopaline）、农杆碱型（Agropine）和琥珀碱型（Succinamopine）。 原始的Ti质粒根据其功能的不同可分为4个区： 1.1.1T-DNA区(Transfer—DNA region)：不同来源的菌株，T-DNA的长度在12~24 kb，它是在农杆菌侵染细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA，其携带的基因与肿瘤的形成有关，但与T-DNA本身的转移与整合无关．T-DNA上最重要的是T-DNA区两端的边界各为25 bp的重复序列．其中14 bp 是完全保守的，分10 bp(CAGGAATATAT)和4 bp(GTAA)不连续的2组．左右2个

根癌农杆菌Ti质粒的提取和ipt基因的重组与转化

根癌农杆菌Ti质粒的提取和ipt基因的重组与转化 韩烁王佳许鹤煊刘楠李波王宜欣 【实验目的及原理】 本实验是提取根癌农杆菌天然Ti质粒上的ipt基因，并将它转入大肠杆菌中进行表达。ipt 基因位于根癌农杆菌Ti质粒上T-DNA区域，是编码异戊烯基转移酶的基因。此酶是细胞分裂素合成中最重要的限速反应酶。首先设计引物，利用PCR技术以Ti质粒为模板，扩增ipt基因。之后将其与表达载体PET-21连接，转入大肠杆菌中进行诱导表达。SDS-PAGE检测表达蛋白，生物鉴定法检测细胞分裂素活性。 【仪器、材料与试剂】 （一）仪器 1．超净工作台 2．漩涡震荡器 3．低温离心机 4．台式离心机 5．PCR热循环仪 6．超声破碎仪 7．恒温水浴器 8．恒温摇床 9．恒温箱 10．琼脂糖凝胶电泳系统 11．平板电泳槽及配套的玻璃板，胶条，梳子，恒压恒流电泳仪 （二）材料 1．根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens str c58） 2．无水乙醇 3．氯仿 4．琼脂糖 5．TAE电泳缓冲液 6．上样缓冲液及SYBR 7．DNA回收试剂 8．TE溶液 9．PET-21质粒 10．大肠杆菌DH5α 11．L B液体培养基 12．十二烷基硫酸钠（SDS） 13．N aOH 14．T ris碱

15．E DTA 16．N aAc （三）试剂 1．10%Aps 2．TEMED 3．Acr/Bis(30%) 4．10% (W/V) SDS 5．1.5 mol/l Tris?HCl (PH=8.8) 6．1mol/L IPTG 7．0.1 mol/L CaCl2 8．氨苄（100μg /ml） 9．10×ligase buffer 10．T4 DNA ligase 11．3mol/L KAc（PH5.2） 12．70%乙醇 13．5mmol/L dNTP Mixture 14．10×PCR buffer (含Mg) 15．Taq 酶 16．BamHⅠ, EcoR I 17．MG/L液体培养基 18．1 mg/ml溶菌酶溶液：溶于TE缓冲液 19．LS裂解液：3% SDS ，0.2mol/L NaOH 20．Ts溶液:1mol/L Tris, 4mol/L NaOH (PH 7.0) 21．TES 溶液：50mmol/L Tris, 5mmol/L EDTA, 50mmol/L NaOH (PH 8.0) 22．20× E缓冲液：0.8mol/L Tris, 20mmol/L EDTA, 0.1 mol/L NaAc 23．BCP染料：0.25% 溴甲酚紫，50%甘油， 50mmol/L Tris-乙酸（PH=7.9） 17．考马斯亮蓝染色液 18．脱色液 19．保存液 【实验步骤】 （一）质粒提取 1．取单菌落接种于40mlMG/L液体培养基中，26℃慢摇培养过夜。 2．将2ml菌液取出至于离心管中，室温，5000rpm离心10分钟弃上清。 3．加0.5ml溶菌酶溶液，漩涡混匀，置冰浴中30分钟。 4．加1ml LS裂解液，快速颠倒离心管10次，混合均匀，室温下放置10分钟，得清亮粘稠裂解液。 5．加0.5ml的Ts溶液，快速颠倒离心管10余次，置冰浴中1小时，生成絮状沉淀。 6．于20℃，12000rpm离心15分钟。

五种常用的植物转基因技术

五种常用的植物转基因技术 杂粮作物2010 . 30(3):186～189RainFedCrops''…… 文章编号:1003—4803(2010)03—0186—04 五种常用的植物转基因技术 汪由,吴禹,王岩,李兆渡,王光霞 (1.辽宁省农业科学院创新中心,辽宁沈阳110161;2.沈阳市东陵区白塔街道办事处,辽宁沈阳110167) 摘要:从原理,基本步骤和优缺点等几个方面对农杆茵介导法,基因枪法,超声波介导法,子房注射法和花粉管 通道法等5种常用的植物转基因技术进行了简要介绍. 关键词:农杆菌介导法;基因枪法;超声波介导法;子房注射法;花粉管通道法;原理;基本步骤;优缺点 中图分类号:$336文献标识码:B 植物转基因技术是通过各种物理的,化学的和生物的 方法将从动物,植物及微生物中分离的目的基因整合到植 物基因组中,使之正确表达和稳定遗传并且赋予受体植物 预期性状的一种生物技术方法.1983年,首例抗病毒转 基因烟草的成功培育标志着人类开始尝试利用转基因技 术改良农作物.目前,植物转基因技术已在作物改良和育 种领域发挥了重要作用.通过植物转基因技术,一些来自 于动物,植物及微生物的有益基因如抗病/虫基因,抗非生 物胁迫性状基因及特殊蛋白基因已被转化到农作物中以 改良现有的农作物和培育新的农作物品种.以DNA重组 技术为基础的植物转基因技术极大地扩展了基因信息的 来源,打破了远缘物种间自身保持遗传稳定性的屏障.植

物转基因技术已应用到玉米,水稻,小麦,大豆和棉花等许多农作物.同时,该技术也正在被尝试用于茄子和草莓等其它的作物中"J.目前,根据转基因植物的受体类型, 植物转基因方法可以分为3大类:以外植体为受体的基因转化方法,如农杆菌介导法,基因枪法和超声波介导法;以原生质体为受体的基因转化方法,如聚乙二醇法,电击法, 脂质体法及磷酸钙?DNA共沉淀法;以种质系统为受体的基因转化方法,如子房注射法和花粉管通道法j.由于以 原生质体为受体的基因转化方法有原生质体培养难度大, 培养过程繁杂,培养工作量大且培养技术不易掌握;原生质体再生植株的遗传稳定性差,再生频率低并且再生周期长;相关的转化方法的转化率低,效果不理想等缺点,所以该类基因转化方法未被作为植物转基因的常规方法广泛使用.本文将对农杆菌介导法,基因枪法,超声波介导 法,子房注射法和花粉管通道法的原理,基本步骤和优缺点作以简要介绍. 1以外植体为受体的基因转化方法 1.1农杆菌介导法 农杆菌介导法是最早应用,最实用有效并且具有最多 成功实例的一种植物转基因方法J.农杆菌是一类普遍 存在于土壤中的革兰氏阴性细菌.目前,用于植物转基 因介导的农杆菌是根癌农杆菌和发根农杆菌.某些根癌 农杆菌和发根农杆菌分别含有大小为200—800bp的结构和功能相似的质粒和Ri质粒J.Ti质粒和Ri质粒含 有3个功能区:参与农杆菌侵染植物过程的vir区,参与农杆菌基因整合到宿主植物基因组过程的T-DNA区,在农杆菌中启动质粒复制的orj区.在vir区上的vir操纵子群作用下,rrj质粒和Ri质粒能将自身的T-DNA转入宿主植物细胞内,而后将T—DNA整合到植物基因组中J.T-

农杆菌转化法原理

农杆菌转化法原理： 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位(受伤处的细胞会分泌大量酚类化合物,从而使农杆菌移向这些细胞)，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。 根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中,并且可以通过减速分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。 人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。 农杆菌转化植物细胞涉及一系列复杂的反应，主要包括：①受伤的植物细胞为修复创伤部位，释放一些糖类、酚类等信号分子。②在信号分子的诱导下，农杆菌向受伤组织集中，并吸附在细胞表面。③转移DNA上的毒粒基因被激活并表达，同时形成转移DNA的中间体。④转移DNA进入植物细胞，并整合到植物细胞基因组中。 方法：（根据不同受体环境基因要求而不同） 1．农杆菌准备 2．外植体的准备（愈伤组织、悬浮细胞系、幼嫩茎段或叶片）; 3．用MS-AS液体培养基稀释原菌液15倍（1.5ml / 20ml）或离心后稀释3倍; 4．外植体与菌液共培养20 分钟; 5．放置在带滤纸的培养皿上（注意充分吸干多余的菌液）; 6．将外植体接种到MS-AS固体诱导培养基，培养2－3天; 7．移至含卡那霉素（Kan）300mg/L和羧苄青霉素（Cb 300mg/L）的固体筛选培养基上进行Kan抗性愈伤组织的筛选; 8．隔20天，进行第二次筛选； 9．抗性愈伤组织在固体筛选培养基上分化成苗； 10 在生根培养基上生根，获得完整的再分化植株。

根癌农杆菌介导的植物基因转化技术

实验7 根癌农杆菌介导的植物基因转化技术 根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农杆菌中诱导植物产生肿瘤的质粒（Tumor inducing plasmid），简称为Ti质粒。野生型农杆菌的Ti质粒，含有两个与致瘤有关的区域：一个是T－DNA区（transferred DNA region），含致瘤基因；另一个是毒性区（Virulence region），在T－DNA的切割、转移与整合过程中起作用。用于植物基因转化的农杆菌Ti质粒载体系统的构建，是将野生Ti质粒中的致瘤基因删除，并在T－DNA区域内插入适当的选择标记和多克隆位点。图1是植物表达载体pBI121的DNA图谱，以CaMV35S启动子驱动的新霉素磷酸转移酶基因NPTII为卡那霉素抗性选择标记基因，以β－葡萄糖苷酶（β－glucuronidase,Gus）为报告基因，经pBI121转化的获得的转基因细胞、组织或植株，具有抗卡那霉素的特性，经组织化学染色呈蓝色。 图2－1 Ti质粒载体pBI121图谱 实验要求：掌握根癌农杆菌侵染植物获取转基因材料的方法；理解农杆菌介导途径进行基因转化的机理；了解转基因植物筛选的方法。 一、试材与用具 1．植物材料：烟草无菌苗 2．农杆菌与载体：农杆菌LBA4404、质粒PBI121 3．主要仪器：超净工作台、高压灭菌锅、小型离心机、光照培养箱或培养室、恒温摇床等。 二、方法步骤 1．试剂的配制 （1）YEB培养基：牛肉膏（5g/L），酵母抽提物（1g/L），蛋白胨（5g/L），蔗糖（5g/L），MgSO4（2mmol/L） pH7.2。固体培养基含琼脂15g/L。 （2）烟草分化培养基：MS + 2mg/L 6-BA + 0.5mg/L IAA （3）烟草生根培养基：MS + 0.5mg/L IAA （4）卡那霉素（Kan）母液：100mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。 （5）羧苄青霉素（cb）母液：50mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。 （6）链霉素（Sm）母液：100mg/ml，过滤除菌，－20℃保存。

根癌农杆菌介导的基因转移

三、根癌农杆菌介导的基因转移 一、实验目的： 1、理解根癌农杆菌介导的基因转移的基本原理； 2、掌握根癌农杆菌介导的遗传转化技术流程。 二、实验原理： 根癌农杆菌是土壤菌属的一种革兰氏阴性细菌，能浸染大多数的双子叶植物和少数的单子叶植物。根癌农杆菌介导的基因转移是利用根癌农杆菌的Ti质粒将外源基因转入到植物细胞核基因组中，并进行整合表达的转化，这是一种天然的生物转化系统。 根癌农杆菌含有Ti质粒，它是根癌农杆菌所特有的位于染色体外独立的基因组，为双链闭合环状的DNA分子，Ti质粒上含有一段特殊的DNA----T-DNA。当植物受到伤害后，植物的细胞就会分泌如乙酰酊香酮等类的酚类化合物，这些酚类化合物能诱导根癌农杆菌染色体毒性基因的表达，促使农杆菌附着到受伤植物细胞表面。根癌农杆菌侵染植物后，其Ti质粒上的T-DNA部分转化并整合进入植物宿主细胞内，可以诱导植物细胞形成冠瘿瘤。经一系列复杂的变化过程，T-DNA 以单拷贝或低拷贝的形式随机整合到植物染色体上。因此，只要将外源基因插入到T-DNA ，Ti 质粒就可以作为天然载体，将外源基因导入到植物细胞中。 三、实验材料： （一）根癌农杆菌（含有外源基因） 烟草叶片 （二）溶液与缓冲液 1、MS基本培养基（PH=5.8） 2、烟草愈伤组织诱导或分化培养基（MSH）：MS +NAA 0.1 mg/L +6-BA 2.0mg/L 3、烟草脱菌培养基：MSH+300 mg/L Cef 4、烟草筛选培养基：MS+300 mg/L Cef+20 mg/L Hpt 5、烟草生根培养基：1/2 MS 6、LB液体培养基：酵母提取物5 g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L（PH=7.0） 7、无菌蒸馏水、10% NaClO、75%乙醇、Kan、Cef、Hpt母液 四、仪器设备及耗材： 无菌培养皿、封口膜、剪刀、镊子、手术刀、三角瓶、无菌滤纸、恒温摇床、微量移液器、吸头、超净工作台等等 五、实验方法与步骤： （一）、实验准备工作： 1、培养基的制备：MS基本培养基（PH=5.8）、烟草愈伤组织诱导或分化培养基（MSH）、烟草脱菌培养基、烟草筛选培养基、烟草生根培养基、LB液体培养基（PH=7.0） 高压灭菌锅中121℃，灭菌20min。 2、10% NaClO、75%乙醇、Kan、Cef、Hpt等母液制备。 （二）、无菌受体材料的准备： 1、无菌试管苗培养：将烟草种子放入1.5ml的离心管中，加入75%乙醇浸泡2min，用无菌蒸馏水冲洗3-5次，然后用10% NaClO 浸泡20min，无菌蒸馏水冲洗3-5次，播种至MS基本培养基中，于16h、12000lx光照和8h 黑暗25℃、70%相对

植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定

植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定 Company number：【WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998】

植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定 〖实验目的〗 1．了解创建烟草突变体库的方法； 2．理解每种方法的基本原理； 3．掌握农杆菌介导的转基因方法以及转基因产物筛选和鉴定的基本过程。〖实验原理〗 随着越来越多植物的全基因组测序工作的完成，在此基础上开展功能基因组的研究是目前的核心研究内容之一。植物插入突变体库的建立是功能基因组研究的一个重要内容，在此基础上也能进行正向遗传学及反向遗传学的研究。在创制突变体的策略上，传统方法是使用物理或化学诱变方法获得，其优点是可在尽可能短的时间内获得饱和突变体。与传统的物理和化学诱变方法相比，生物诱变(T-DNA和转座子插人诱变)通常可标记突变基因，从而较为容易地分离鉴定靶基因。最近数年，通过农杆菌介导的T-DNA插入突变已成为国际公认的植物功能基因组学的主要研究方法之一。 烟草是植物基因组研究的一种模式植物，其突变体库的创建是烟草功能基因组学研究中的重要内容，其目的是通过大规模的突变体库平台快速全方位的了解基因组中各个基因的功能。突变体的创制是遗传学研究的基础，也是分离基因和基因功能鉴定的最要途径。通过诱导培养，使烟草产生愈伤组织，利用土壤农杆菌感染愈伤组织，实现T-DNA标签在烟草愈伤组织基因组中大量随机插人，利用植物细胞的全能性，经过抗性筛选，诱导分化，从抗性愈伤组织获得烟草突变体再生植株，获得各突变体的纯合材料，从而建立烟草突变体的数

据库，然后分析突变性状与T-DNA的共分离关系，存在共分离的材料用适当的Tail-PCR克隆技术获得T-DNA的侧翼基因组序列，用其作探针筛选基因文库，获取目标基因或克隆，再进行下一步的分析（图实验4-1）。 T-DNA 载体构建 转化植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子 筛选T2，获突变子，应为3:1分离 确定T-DNA与突变型共分离的个体 产生纯合后代 克隆T-DNA两侧的植物DNA（Tail PCR) 利用侧翼DNA序列作探针从该植物的cDNA文库中钓取基因 基因功能的验证（遗传互补测验，分离的野生基因转化突变体，回复功能）图实验4-1 T-DNA标签克隆基因的基本流程 TAIL-PCR分离法是利用多个嵌套的T-DNA插入序列特异性引物（根据T-DNA中靠近右边界处的核苷酸序列设计的引物，Tm值57-62℃和一个短的随机简并引物（AD，Tm值44-46℃）组合，以突变体基因组DNA为模板，进行多次PCR反应，采取高温特异性扩增与低温随机扩增相间进行的方法，最后获得T-DNA插入侧翼区特异性扩增片段（实验图4-2），可作为探针，筛选分离基因。 TAIL-PCR分离法可以降低非侧翼区特异产物的背景，同时它可以产生2个以上嵌套的目的片段，与其它方法相比TAIL-PCR方法具有简便、特异、高效、快速和灵敏等特点，已经在拟南芥和水稻等植物中获得了成功及广泛的应用。

根癌农杆菌介导的真菌转化

根癌农杆菌介导的真菌转化 (一) 农杆菌电击感受态制备及电击转化 A 感受态的制备 1) 将农杆菌菌液划线于YEB平板（50 μg/ml kana），28℃，36-48h。 2) 挑单菌落至3ml YEB试管（50 μg/ml kana）中，28℃，200rpm 培养过夜。 3) 转1ml至50ml YEB中，28℃，200rpm培养至OD600=0.8。 4) 于4℃，5000rpm，10min收集菌体。 5) 用50mL 10%的甘油（去离子水配置，湿热灭菌）洗沉淀3次（4℃，5000rpm，10min）， 洗涤时一定要把菌体悬浮均匀。 6) 重悬于1ml 10%甘油中（约1011个细胞/ml），可立即使用，或分装为每管50μl，液氮速 冻后，-80℃保存备用。 B 电击转化 1) 将1μl质粒加入到农杆菌感受态细胞中，混匀，转至无菌预冷的电击杯中。 2) 将电击杯放入电转化仪的电极之间，16kv/cm，5ms。 3) 取出电击杯，迅速加入200-300μl YEB（不加抗生素），并将混合液转入EP管中。 4) 于28℃，220rpm，2-3h。 5) 将50-100μl菌液涂布于YEB平板（50μg/ml car和50 μg/ml kana）上，于28℃培养2-3 天后，挑斑鉴定。 (二) 农杆菌化学感受态制备及化学法转化 A . Competent Cells 1)Inoculate a single colony to 5 ml LB 2)Grow at 28℃ to log phage,shaking at 250rpm 3)Inoculate 2ml of the culture to 50 ml LB medium and grow to OD600=0.5 ca. 8 hours 4)Chill on ice for 10 minutes 5)Spin down the cells by centrifugation at 3000g(8000rpm) for 10 minutes at 4℃ 6)Resuspend cells in 1 ml of 20 mM CaCl2 7)Aliquots into 0.1 ml ,then freeze in liquid nitrogen , and store at -80 ℃ B Plasmid Transformation