根癌农杆菌介导的真菌转化

根癌农杆菌介导的真菌转化

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根癌农杆菌介导的真菌转化

(一)农杆菌电击感受态制备及电击转化A感受态的制备

1)将农杆菌菌液划线于Yeb平板（50μg/mlkana），28℃，36-48h。

2)挑单菌落至3mlYeb试管（50μg/mlkana）中，28℃，200rpm培养过夜。3)转1ml至50mlYeb中，28℃，200rpm培养至oD600=0.8。

4)于4℃，5000rpm，10min收集菌体。

5)用50mL10%的甘油（去离子水配置，湿热灭菌）洗沉淀3次（4℃，5000rpm，10min），洗涤时一定要把菌体悬浮均匀。

6)重悬于1ml10%甘油中（约1011个细胞/ml），可立即使用，或分装为每管50μl，液氮速冻后，-80℃保存备用。b电击转化

1)将1μl质粒加入到农杆菌感受态细胞中，混匀，转至无菌预冷的电击杯中。2)将电击杯放入电转化仪的电极之间，16kv/cm，5ms。

3)取出电击杯，迅速加入200-300μlYeb（不加抗生素），并将混合液转入ep管中。4)于28℃，220rpm，2-3h。

5)将50-100μl菌液涂布于Yeb平板（50μg/mlcar和50μg/mlkana）上，于28℃培养2-3天后，挑斑鉴定。

(二)农杆菌化学感受态制备及化学法转化https://www.sodocs.net/doc/115599618.html,petentcells

1)Inoculateasinglecolonyto5mlLb2)growat28℃tologphage,shakingat250rp m

3)Inoculate2mlofthecultureto50mlLbmediumandgrowtooD600=0.5ca.8h ours4)chillonicefor10minutes

5)spindownthecellsbycentrifugationat3000g(8000rpm)for10minutesat4℃