抗生素生物效价测定(详细参考)
实验一抗生素生物效价测定
【实验目的】
1. 掌握抗生素生物效价测定的原理和方法；
2. 掌握管碟法测定抗生素生物效价相关的操作方法。
【实验原理】
抗生素的效价常采用微生物学方法测定，它是利用抗生素对特定的微生物具有抗菌活性的原理来测定抗生素效价的方法，如管碟法。管碟法是目前抗生素效价测定的国际通用方法，我国药典也采用此法。管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价。管碟法的基本原理是在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管（内径6.0±0.l mm，外径8.0±0.l mm，高10±0. lmm），管内放人标准品和检品的溶液，经16~18小时恒温培养，当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈。根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系，比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价。
常用的管碟法有：一剂量法、二剂量法、三剂量法。后二法已经列入药典。二剂量法系将抗生素标准品和供试品各稀释成一定浓度比例（2:1或4:1）的两种溶液，在同一平板上比较其抗药活性，再根据抗生素浓度对数和抑菌圈直径成直线关系的原理来计算供试品效价。取含菌层的双层平板培养基，每个平板表面放置4个小钢管，管内分别放入供试品高、低剂量和标准品高、低剂量溶液。先测量出四点的抑菌圈直径，按下列公式计算出检品的效价。
（1）求出W和V：W=（SH+UH）-（SL+UL）(式 2.10-1)
V=（UH+UL）-（SH+SL）(式2.10-2)式中：UH：供试品高剂量之抑菌圈直径；
UL：供试品低剂量之抑菌圈直径；
SH：标准品高剂量之抑菌圈直径；
SL：标准品低剂量之抑菌圈直径；
（2）求出θ：θ=D·antilog（IV/W）(式2.10-3)式中：θ：供试品和标准品的效价比；
D：标准品高剂量与供试品高剂量之比，一般为1；
I：高低剂量之比的对数，即log2或log4。
（3）求出Pr ：Pr = Ar×θ(式2.10-4)式中：Pr：供试品实际单位数；
Ar：供试品标示量或估计单位。
【实验材料和仪器】
1.实验材料
（1）菌种：大肠杆菌（Escherichia coli），菌液浓度约为106个/mL。菌株保存的时间过久，影响其对抗生素的敏感度，导致抑菌圈变大、模糊或者出现双圈。如若菌株不纯，也会造成这样的结果。因此，菌液在使用一段时间后，可以重新配制纯化或者减小原来菌液在使用中的稀释倍数。
（2）抗生素标准品和供试品：头孢拉定标准品和供试品。
（3）培养基：效价检定用培养基1号。
（4）无菌缓冲液：称取磷酸氢二钾5.59g，磷酸二氢钾0.41g，加水1000mL，即为pH 7.8的磷酸盐缓冲液。制备缓冲液的试剂应为分析纯，配制后的缓冲液应澄清，分装于玻璃容器内，经121℃蒸气灭菌30 min备用。
2. 实验仪器
无菌室、培养皿（直径9 cm）、陶瓦盖、钢管、钢管放置器、恒温培养室、灭菌刻度吸管、玻璃容器、称量管、毛细滴管、天平、直尺或游标卡尺、超净工作台等。
【实验步骤】
1. 称量
称量前，将抗生素标准品和供试品从冰箱取出，使与室温平衡，供试品应放于干燥器内至少30 min方可称取。供试品与标准品应用同一天平；吸湿性较强的抗生素在称量前1~2小时更换天平内干燥剂。标准品称量不可少于20 mg，取样后立即将称量瓶或适宜的容器及被称物盖好，以免吸水。
称样量的计算：W=V*C/P (式2.10-4)
式中：W：需称取标准品或供试品的重量（mg）
V：溶解标准品或供试品制成浓溶液时用容量瓶的体积量（mL）
C：标准品或供试品高剂量的浓度（U/mL，μg/mL）
P：标准品的纯度或供试品的估计效价（U/mg，μg/mg）
2. 稀释
从冰箱中取出的标准品溶液，必须先在室温放置，使其温度达到室温后，方可量取。标准品或供试品溶液的稀释应采用容量瓶，每步稀释，取样量不得少于2 mL，稀释步骤一般不超过3步。每次吸取溶液用胖肚吸管或密刻度玻璃吸管，量取溶液前要用被量液流洗吸管2~3次，吸取样品溶液后，用滤纸将外壁多余液体擦去，从起始刻度开始放溶液。稀释标准品与供试品用的缓冲液应同一批和同瓶，（预计不够时，应事先与另一瓶混匀后再用），以免因pH或浓度不同影响预定结果。稀释时，每次加液至容量瓶近刻度前，稍放置片刻，待瓶壁的液体完全流下，再准确补加至刻度。标准品与供试品高低浓度之比为2:1或4:1，但所选用的浓度必须在剂量反应直线范围内。
3. 双碟制备
在超净工作台上，用灭菌大口吸管（20 mL），吸取已融化的培养基20 mL注入双碟内，作为培养基的底层，等凝固后更换干燥的陶瓦盖覆盖，放置20~30 min，备用。取出试验用菌悬液，按已试验适当的菌量（高浓度所致的抑菌圈直径18~22 mm），用灭菌吸管吸取菌悬液加入已融化并保温在水浴中（一般细菌48~50℃，芽孢可至60℃）的培养基内，摇匀作为菌层用。用灭菌大口5mL吸管，吸取菌层培养基5 mL，使均匀摊布在底层培养基上，置水平台上待凝固，用陶瓦盖覆盖，放置20~30 min，备用。
4. 放置钢管
用钢管放置器，或其他方法将钢管一致、平稳地放入培养基上，钢管放妥后，应使双碟静置5~10 min，使钢管在琼脂内稍下沉稳定后，再开始滴加抗生素溶液。
5. 滴加抗生素溶液
每批供试品取5~10个双碟，滴加溶液用毛细滴管或定量加样器，在滴加之前须用滴加液洗2~3次。在双碟的4个钢管中以对角线滴加标准品与供试品溶液的高、低二种浓度的溶液，滴加顺序为SH→TH→SL→TL，也可用SL→TL→TH→SH。（S代表标准品，T代表供试品，H代表高浓度，L代表低浓度），滴加溶液至钢管口平满，注意滴加溶液间隔不可过长，因溶液的扩散时间不同影响测定结果。滴加完毕，用陶瓦盖覆盖双碟，平稳置于双碟托盘内，双碟叠放不可超过3个，避免受热不均，影响抑菌圈大小，以水平位置平稳移入35~37℃恒温培养室，培养至所需时间。
6. 抑菌圈测量
用直尺或游标卡尺测量抑菌圈的直径，以毫米为单位，误差不超过0.1mm。
【结果与计算】
根据实验测量的抑菌圈大小，计算抗生素供试品的效价单位。
【注意事项】
1. 玻璃仪器和其他器具需用专用洗液或其他清洗液中浸泡过夜，冲洗，沥干，置150～160℃
干热灭菌2小时或高压121℃蒸气灭菌30分钟，备用。
2. 实验中样品的称量、稀释、培养基倒平板等操作要严格的无菌操作。
3. 制备平板时，放置培养皿的超净台的台面必须水平。可以将培养皿放在台面上，下垫一
张白纸，皿内加水2～3 浅蓝墨水，观察蓝色深浅是否一致。
4. 为保证双碟放置区域的平整，可在双碟底部预先标记样品的高低浓度区域，在加注培养
基底层的时候，有顺序地按照一致方向排列。接下来加注培养基菌层的时候，仍然按照原来的位置与方向排列。这样，即使桌面不够水平，还是能够保证培养基菌层是在水平的培养基底层上铺开，达到消除误差的目的。
5. 在滴加抗生素到小钢管的时候，由于毛细管内抗生素溶液往往会有气泡或者毛细管开口
端有液体残留，继续滴加容易造成气泡膨胀破裂，使溶液溅落在琼脂培养基表面造成破圈。因此一旦毛细管中出现气泡或者残留，就重新吸取抗生素溶液进行滴加，毛细管口应避免太细，滴加的时候离开小钢管口距离不要太高。滴加中若有溅出，可用滤纸片轻轻吸去，不致造成破圈。在滴加中还有可能出现抗生素溶液滴入小钢管后，没有与琼脂培养基菌层接触，有一段空气被压在溶液与培养基之间，这样是不会产生抑菌圈的。此时可以小心的用滴管吸出小钢管内的抗生素溶液，弃去。换滴管重新滴加。
6. 在称量抗生素样品过程中，操作者的工作服上有可能会沾染抗生素粉末，在配培养基、
加底层培养基、加菌层培养基或滴加抗生素溶液时，会随衣袖的抖动落入培养基，造成破圈或者无抑菌圈。所以配制抗生素溶液应单独使用一套工作服。
7. 滴加了抗生素溶液后的双碟忌震动，要轻拿轻放。在搬运到培养箱的过程中，可以预先
在培养箱中垫上报纸铺平，再把双碟连同垫于桌上的玻璃板小心运至培养箱，缓慢推入箱内。
8. 双碟在37℃下培养约16h。时间太短会造成抑菌圈模糊，太长则会使菌株对抗生素的敏
感性下降，在抑菌圈边缘的菌继续生长，使得抑菌圈变小。
9. 在培养过程中，如果温度不均匀（过于接近热源），会造成同一双碟上细菌生长速率不等，
使抑菌圈变小或者不圆。所以把双碟放入培养箱时，要与箱壁保持一定的距离，双碟叠放也不能超过3个。培养中，箱门不得随意开启，以免影响温度。应经常注意温度，防止意外过冷过热。
10. 用游标卡尺测量抑菌圈直径，可以在双碟底部垫一张黑纸，在灯光下测量。不宜取去小
钢管再测量，因为小钢管中残余的抗生素溶液会流出扩散，使抑菌圈变得模糊。不能把双碟翻转过来测量抑菌圈直径，因为底面玻璃折射会影响抑菌圈测量的准确度。
【思考题】
1. 为什么要用两步稀释，而不直接从1000U/mL稀释到10、20U/mL？
2. 生物效价测定实验室被抗生素粉尘污染会导致什么后果？
中药生物活性测定指导原则
中药生物活性测定指导原则 生物活性测定法是以药物的生物效应为基础，以生物统计为工具，运用特定的实验设计，控制药物有效性的一种方法，从而达到控制药品质量的作用。其测定方法包括生物效价测定法和生物活性限值测定法。 中药的药材来源广泛、多变，制备工艺复杂，使得中药制剂的质量控制相对困难，此外，中药往往含有多种活性成分和具有多种药理作用，因此，仅仅控制少数成分不能完全控制其质量和反映临床疗效。为了使中药的质量标准能更好地保证每批药品的临床使用安全有效，有必要在现有对指标成分“含量测定”的基础上增加生物活性测定，以综合评价其质量的可靠性和可控性。 本指导原则的目的是规范中药生物活性测定研究，为该类实验设计、方法学建立等过程和测定方法的适用范围提供指导性的原则要求。 基本原则 符合药理学研究基本原则 建立的生物活性测定方法应符合药理学研究的随机、对照、重复的基本原则；具备简单、精确的特点；应有明确的判断标准。 体现中医药特点 鼓励应用生物活性测定方法探索中药质量控制，拟建立的方法的测定指标应与该中药的“功能与主治”相一致。 品种选择合理 拟开展生物活性测定研究的中药材或中成药应功能主治明确，其中，优先考虑治疗适应症明确单一的中药注射剂品种，对急重症用药、保护品种应重点进行研究。 方法科学可靠 优先选用生物效价测定法，不能建立生物效价测定的品种可考虑采用生物活性限值测定法，待条件成熟后可进一步研究采用生物效价测定法。 基本内容 1.实验条件 试验系选择 生物活性测定所用的试验系，包括整体动物、离体器官、血清、微生物和组织、细胞、亚细胞器、受体、离子通道和酶等。试验系的选择与试验原理和测定指标密切相关，应选择背景资料清楚、影响因素少、检测指标灵敏和
抗生素效价测定操作规程
QCA/QC-SOP-006 1.主题内容和适用范围 本规程规定了公司外购原料药品及生产成品中抗生素的效价测定方法及要求。 本规程适用于公司外购原料药品及生产成品中抗生素的效价测定。 2.引用标准 《中国药典》2010年版二部。 3.术语 抗生素微生物检定法：在适宜的条件下，根据量反应平行原理设计，通过检测抗生 素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）方法。 抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。本法采用的是管碟法。 4.操作技术（仪器与用具） 4.1操作室：光线明亮，操作间分a.一般操作间b半无菌操作间。室温控制20-25℃。注 意抗生素的污染。 4.2双蝶：内径90mm高16-17mm.用后经高压灭菌倒出培养基后，置专用洗液或清洁液 中浸泡过夜，冲洗，沥干150-160℃干热灭菌2小时或高压灭菌121℃30min,备用。 4.3陶瓦盖：内径103mm,外经108mm,吸水性强，定期清洗、干燥或干热灭菌。 4.4钢管：内径6.0±0.1mm高7.8±0.1mm或8.0±0.1mm,10.0±0.1mm.重量差异不超±0.05g. 用后置1:1000苯扎溴铵溶液内浸泡2h以上,再灭菌洗涤,先用水洗,超声波30min或 用去污粉的沙布条串擦内外壁,水冲洗,淋干,PW冲洗3次150-160℃干热灭菌2小时 备用. 4.5钢管放置器 4.6恒温培养箱:隔水式为宜35-37℃ 4.7灭菌刻度吸管:用于吸取菌液及培养基（5ml、20ml），用后立即置5%石碳酸或1:1000 苯扎溴铵溶液中消毒后再常规洗涤.150-160℃干热灭菌2小时备用. 4.8玻璃容器:滴定管、移液管、刻度吸管、容量瓶.符合一等品规定用前用清洁液浸泡, 水 洗、PW冲3次
管碟法测定抗生素效价中的影响因素分析及对策.
管碟法测定抗生素效价中的影响因素分析及对策 关键字: 管碟法；抗生素；效价；抑菌圈 摘要: 目的提高管碟法测定抗生素效价的准确性。方法按操作步骤逐步分析，并提出合理的解决方案。结果减少外界因素与人为因素给试验带来的误差。结论可以提高测定结果的准确性。 Abstract: OBJECTIVE To improve the veracity of antibiotics titer evaluation by cylinder- plate method. METHOD According to the process of test, ana lyze the test and offer a proper measure to avoid influenci ng factors. RESULTS Reduce the errors caused by environment al and artificial factors. CONCLUSION This can improve the veracity of test results. Key words: cylinder- plate method; antibiotics; titer; bacterial inhibition ring 管碟法是国内外常用的抗生素微生物检定法[1]，利用管碟法测定抗生素效价，具有准确、直观、重复性好等优点，因而被广泛采用。但是整个试验过程中影响结果的因素很多，任何一个环节操作不当或者忽略就会造成很大误差，导致整组试验失败。根据实际操作中的积累经验，对管碟法中影响试验结果的因素进行如下分析及提出解决的方法。 1. 实验器材的准备 1.1 实验器材的选择 试验应该选择底面平整的玻璃双碟，避免底面的凹凸影响琼脂层的厚度。可将双碟放置在水平台上，下垫一层白纸，加入3mL水，再滴加蓝墨水，根据蓝色是否深浅一致来判断双碟底面平整程度。小钢管则应该选择加工精细的同一批产品，这样才能保证管壁厚薄与重量均匀一致，使得小钢管在培养基中下陷相同的深度，抗生素溶液扩散均匀有可比性。如果小钢管两端不够平，就应予剔除，否则会使抗生素溶液漏出，破坏均匀扩散现象。 1.2 实验器材的清洗 抗生素试验中，玻璃双碟、小钢管往往会连续使用。由于清洗方面的原因，它们还是容易残留上次试验中的抗生素（庆大霉素、争光霉素、链霉素等）或者被清洗用的杀菌剂（如新洁而灭、洗洁精、去污粉等）污染，以至于在下次试验中造成抑菌圈不正常的现象。因此，在清洗时要尤为注意多用流水冲洗。160℃干热灭菌2h后备用。 2. 配制试验所需的样品、标准品、缓冲液与培养基
华农农药生物活性测定实验2014年
实验一 杀虫剂初步毒力测定 1、 实验原理： 初筛试验，又称初步综合杀虫毒力试验。这种试验不涉及毒杀方式和毒杀能力的大小，一般采用较高的浓度，尽量发挥综合毒效（包括胃毒、触杀、薰蒸等作用）。 一般农药初筛毒力测定方法，根据试虫对象不同，多采用浸渍法、喷雾法、喷粉法、饲料混药法等。每处理需试虫15-30头，可以不设重复，每次试验均要设空白对照，施药时要注意各处理用药等量均匀一致。一般液剂在0.1-1%，粉剂1-10%。 2、 实验方法与步骤 1、 药剂配制：将A、B药剂配成0.1%的溶液备用。 2、 试虫移取：取小菜蛾3龄幼虫集中混匀后，用毛笔刷入培养皿， 每处理10头，重复一次。 3、 喷布质量检定：用9cm的白色园纸片来检查喷雾雾滴的大小和喷 布是否均匀一致，如不符合要求，可调节喷头及位置，使喷布质 量达到基本要求。 4、 处理方法：采用喷雾法，选用potter喷雾塔，喷布药液前，用清 水及欲喷洒的药液大量喷布。换药前需将受药盘及雾化室底部用 布充分擦净，然后大量喷布试验的药液。在接有小菜蛾的培养皿 中加入一定新鲜菜叶后，用移液管吸取3ml药液进行喷布，约10 秒后，待药液全部沉降，取出培养皿，做好标记，空白对照只喷 洒清水。待药剂干后，将试虫连同饲料置于恢复室内培养24小时 后检查结果。 3、 实验注意事项： 1、 目标试虫的选择：应选用具有一定的代表性及经济价值，耐药 性较强、生长健壮、自然死亡率底，虫龄虫体大小一致，最好 采用人工饲养的试虫。 2、 环境条件的选择：温度在20-28℃，相对湿度在60%-80%，通气 良好。 3、 处理设计：每处理需试虫15-30头，可以不设重复，每次试验均 要设空白对照，施药时要注意各处理用药等量均匀一致。 4、 实验结果处理： 处理24小时，48小时后，检查死活虫数，计算死亡率及校正死亡率，并比较不同药剂的毒力大小。试虫死活标准，一般以能正常活动或飞翔的或能正常行动的作为活虫，其余中毒的均为死虫。 5、 思考题： 1、 将筛选药剂的毒力试验结果记入杀虫剂初步毒力试验记载表，
管碟法测定抗生素效价中的影响因素分析及对策讲解
管碟法测定抗生素效价中的影响因素分析及对策摘要: 目的提高管碟法测定抗生素效价的准确性。方法按操作步骤逐步分析，并提出合理的解决方案。结果减少外界因素与人为因素给试验带来的误差。结论可以提高测定结果的准确性。 Abstract: OBJECTIVE To improve the veracity of antibiotics titer evaluation by cylinder-plate method. METHOD According to the process of test, analyze the test and offer a proper measure to avoid influencing factors. RESULTS Reduce the errors caused by environmental and artificial factors. CONCLUSION This can improve the veracity of test results. Key words: cylinder-plate method; antibiotics; titer; bacterial inhibition ring 管碟法是国内外常用的抗生素微生物检定法[1]，利用管碟法测定抗生素效价，具有准确、直观、重复性好等优点，因而被广泛采用。但是整个试验过程中影响结果的因素很多，任何一个环节操作不当或者忽略就会造成很大误差，导致整组试验失败。根据实际操作中的积累经验，对管碟法中影响试验结果的因素进行如下分析及提出解决的方法。 1. 实验器材的准备 1.1 实验器材的选择 试验应该选择底面平整的玻璃双碟，避免底面的凹凸影响琼脂层的厚度。可将双碟放置在水平台上，下垫一层白纸，加入3mL水，再滴加蓝墨水，根据蓝色是否深浅一致来判断双碟底面平整程度。小钢管则应该选择加工精细的同一批产品，这样才能保证管壁厚薄与重量均匀一致，使得小钢管在培养基中下陷相同的深度，抗生素溶液扩散均匀有可比性。如果小钢管两端不够平，就应予剔除，否则会使抗生素溶液漏出，破坏均匀扩散现象。 1.2 实验器材的清洗
抗生素的生物效价测定法(管碟法)
抗生素的生物效价测定法 测定抗生素效价的方法比较多，一般可以分为物理学方法、化学方法、生物学方法、和两种方法配合等四大类，可根据具体情况选择使用。 生物学方法以抗生素的杀菌力作为衡量效价的标准，其原理恰好和临床应用于的要求一致这是它的优点；又其灵敏度较高，需用检品的量较小，也是其它方法所不及的。 抗生素的生物效价测定法，常用的有稀释法、比浊法和扩散法（或称渗透法）。 稀释法这一方法是用培养基将检品抗生素稀释到各种浓度，并依次分装到一系列的容器内，再加入等量“试验菌种”菌种菌液，并放在37 ℃保温箱内培养一定时间，观察何种稀释度适能抑制细菌的生长，该稀释度即为测定终点（或以细菌生长所引起的PH改变及溶血现象等生化反应作为测定终点），再与同样处理的标准抗生素的终点作比较，即可求得检品的效价。这种方法可以使用液体培养基，也可以使用固体培养基。所用的材料及培养基都必须严格无菌，并要注意无菌操作。由于测定终点是以有无细菌生长来判断的，因此所得结果公是一个范围。 比浊法原理及操作大致与稀释法相同。比浊法也是将不同量的检品及标准品分别加入培养基中，观察其对“试验菌种”的效应——即细菌生长所引起的混浊。这一方法和稀释法的区别有二：a.比浊法的稀释间隔的密度比较近，准确度高一些；b.比浊法不以细菌有无生长的区分为终点，而是将标准品浓度和细菌生长所引起的混浊度求得一定的比例，再由检品的细菌生长混浊度推算检品的效价。这一方法易受杂质的影响，并且不适用于有色或混浊的检品。 扩散法使用固体培养基，在培养基凝固以前将“试验菌种”混合进去，在这样备妥的培养表面，可以用种种设计使检品液或含有抗生素的物质与有菌种的培养基接触。经过培育后，由于抗生素向培养基中扩散，凡抑菌浓度所能达到之下细菌不能生长因而形成透明的抑菌范围，此种范围一般都呈圆形，称为“抑菌圈”。扩散法有几种，或中一种叫管碟扩散法（筒称管碟法）为国际上常用的方法，在我国也作为法定的抗生素检定法。 下面我们将详细地讨论管碟法的原理和实验方法。 一、管碟法测定的设计原理及计算方法 管碟法所用的管子系用瓷、铝或玻璃制成，较好的用不锈钢制成，它是内径为6+0.1毫米、外径为8+0.1毫米、高10+0.1毫米的圆筒形管子，管子的重量尽可能相等。 摊布固体培养基的容器可用双碟，亦可用平底下班盘。管子放在混有菌种的固体培养基上时，可用人工放臵，也可用特定的管子放臵器放臵。
生物药物分析与检验
生物药物分析与检验 生物药物分析与检验的特点： 1.需要进行相对分子质量的测定、 2.需要检查生物活性 3.需做安全性检查 4.需做效价测定 5.要用生化法确证结构 终点测定法的条件： 1.必须有专一地作用该被测物质的酶，并能得到它的制品； 2.能够确定使这种酶反应接近进行完全的条件； 3.反应中底物的减少、产物的增加、辅酶物质的改变等可以借助简便的方法进行测定 高效液相色谱法的定性分析 1.利用已知物质定性的方法 ①利用保留特性 ②利用不同柱比较 2.色谱法与其他方法结合定性 ①利用化学反应定性 ②利用选择性检测器定性 ③液相色谱-质谱联用技术、液相色谱-核磁共振联用技术 生物检定的范围: 1.药物的效价测定 2.体内微量生物活性物质的测定 3.中药质量的控制 4.某些有害杂质的限度检查 基因工程药物的特点： 1.分泌量极低而生理、药理活性极高 2.具有细胞和组织特异性 3.多数细胞生长因子具有多功能性 4.细胞因子间存在复杂的相互作用 5.具有低免疫原性 特殊杂质检查方法：物理化学区分方法 一、物理法“1. 臭味及挥发性的差异 2. 颜色上的差异 3. 溶解行为上的差异 二、化学分析法 1. 酸碱反应 2. 呈色或沉淀反应 3. 产生气体 4.氧化还原反应
免疫电泳技术：将琼脂电泳与免疫扩散结合起来，即利用电场作用下带电蛋白质在琼脂凝胶中具有不同的迁移率，以及相同的蛋白质具有完整的抗原性的特点，用于分析抗原或抗体性质的一种技术。 电泳：带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。 终点测定法：先借助酶反应（单独的反应或几种酶构成的偶数酶反应）使被测物质定量地进行转变，然后在转化完成后，测定底物、产物或辅酶物质（第二底物）等的变化量 生物检定：利用生物体（整体动物、离体组织/器官、细胞和微生物等）的作用以测定其效价或生物活性的一种方法。 质反应：当一定剂量的药物注入动物体内后，观察某一反应或反应的某一程度出现与否，只有质的变化。 量反应：药物对生物体所引起的反应随着药物剂量的增加产生的量变可以测量者。 杂志：指药物中存在的无治疗作用、或影响药物稳定性和疗效、甚至对人体健康有害的物质 药典主要包括凡例、正文、附录和索引四部分组成 生物药物常用的定量分析法：酶法、电泳法、免疫分析法、理化测定法、生物检定法 酶分析法包括酶法分析和酶活力测定 酶联免疫吸附分析法包括直接法和夹心法 电泳法分为自由界面电泳、区带电泳和高效毛细管电泳。 指示液：溴酚蓝用于指示电泳终点；甘油比重大，使样品下沉 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种效应：分子筛效应、浓缩效应、电荷效应 高效液相色谱法的优点：速度快、分辨率高、灵敏度高、柱子可反复使用、样品容易回收 要获得较好色谱分离有两个途径：一是最大峰间的距离要大，二是色谱峰要窄 常用的脱气方法：真空脱气法、煮沸脱气法、溶剂的滤过 微生物检定法测定抗生素效价：稀释法，浊度法，管碟法。其中我国是管碟法。 氯化物检查法：用硝酸，硝酸银 硫酸盐检查法：用盐酸，氯化钡，标准对照液：标准硫酸钾溶液 铁盐检查法：中国药典和美国药典采用硫氰酸盐，英国药典采用巯基醋酸法 重金属检查常用的显色剂：硫代乙酰胺、硫化钠 澄清：不超过0.5号浊度标准液的浊度时；几乎澄清：介于0.5号至1号浊度标准液之间
标准血清效价测定
标准血清效价测定 （一）凝集效价的测定 1．取小试管20 支，分两排放置于试管架上，前排标明 A ，后排标明 B ，再将各排由左而右注明号码。 2．各管均加生理盐水0．2 ml 。 3．吸取A 型被测血清0．2 ml ，加入A 排第1 管中，混匀，从第一管 中吸出0．2 ml 加入第2 管中，依次稀释至第10 管，从第10 管吸出 的0．2ml 弃掉，用同样的方法取B 型被测血清在B 排中稀释，最后两 排管的血清稀释倍数分别为1∶2 、1∶4 、1∶8 、1∶16 、1∶32 、1∶ 64 、1∶128 、1∶256 、1∶512 、1∶1024 。 4．A 排管各加B 型2 ％红细胞生理盐水悬液0．2ml；B 排管各加A 型 2 ％红细胞生理盐水悬液0．2ml，混匀。 5．放置室温（18 ～22 ℃）1 ～2 小时观察结果，以稀释倍数最高而 又显凝集者为其凝集效价。上述操作过程见下表。 表 A 型标准血清(抗B)效价测定
表 B 型标准血清(抗A)凝集效价测定 如被测血清在第七管仍显凝集，则其凝集效价为1∶128 。如第八管仍显凝集则其凝集效价为1∶256 。O 型标准血清抗A 、抗B 的凝集效价测定，可参照上述 （二）标准血清的质量要求 A 型（抗B）效价应在1∶64 以上， B 型（抗A）效价应在1∶128 以上，如果低于上述标准，不能使用。并要检查效价低的原因，重新制备，如果效价太高，可按效价规定加适量等渗盐水稀释。且不含其它血型抗体，不形成缗钱状的假凝集，冷凝集素效价＜1∶4 。 （三）亲和力的测定 所谓亲和力是指标准血清与相对应的红细胞混合后出现的凝集速度及凝集块的大小而言。测定方法如下： 取待测血清0．1ml 放于玻片或瓷板上，取对应的10 ％红细胞生理盐水悬液0．05 ml ，加于血清中混匀并涂成直径约1cm 的圆形，立即记时。观察出现凝集的时间。并继续转动玻片或瓷板，至3 分钟时观察凝集块的大小。标准血清亲和力的质量要求，在15 ～30 秒以内应出现凝集，3 分钟时凝集块应在1m- m2 以上，标准血清中不应含脂肪（脂肪可使效价迅速降低），不可污染细菌。
效价测定方法
沈阳药科大学 硕士学位论文 诺西肤发酵工艺的研究 姓名:韩果红 专业:微生物与生化药学 导师:何建勇教授 二00四年五月 P24 诺西肚的定性与定量测定 2.2，2.1生物效价测定法 1.检定菌菌悬液的制备 加40一5Oml无菌水到培养好的枯草芽抱杆菌茄形瓶斜面上[枯草芽抱杆菌斜面培养基(%):蛋白陈1.0·NaCI0.5,牛肉膏0.5,琼脂粉1.5.,pH7.8(灭菌前)蒸馏水配制].用接种环刮下芽抱和菌体，摇匀，65℃水浴保温3Om加，杀死营养细胞，保留芽抱，即为检定菌菌悬液。 2.生测平板的制备 将生物检定培养基[生物检定培养基(%):牛肉膏0.3蛋白陈0.5,K2HPO4 0.3,琼脂粉1.5， pH8.0-8.2(灭菌前)蒸馏水配制] 2OOml灭菌后自然冷却到50一60℃后，倒入20x3Ocm的生物检定盘中，自然凝固，作为生测平板的下层。 将生物检定培养基100ml灭菌后自然冷却到50一60℃，向培养基中加入一定量的检定菌(枯草芽抱杆菌)菌悬液，混匀，然后倒入检定盘内己凝固的下层培养基上，自然凝固。 3.点样 用无菌小镊子取中Sunll的无菌圆滤纸片，按一定规律摆放在上层培养基的表面。每个待测样品应点样2一3个滤纸片，以其抑菌圈的平均值进行计算。盘内同时摆放加有不同剂量诺西肤标准溶液(IO00u/m)l的圆滤纸片，每个剂量点2一3个滤纸片，以其抑菌圈的平均值进行计算。每个纸片上的加样量不超过5ul。 4.培养 将点好样的检定盘倒置于4℃冰箱中扩散10小时左右，然后于37℃恒温箱中培养16一18小时，不同点样量的诺西肤在检定盘中产生的抑菌圈大小不同，根据标准品的剂量及相应抑菌圈直径之间的对应关系得标准曲线方程，根据样品的抑菌圈直径通过标准曲线方程计算出对应的效价。 P35 高产菌株选育方法的建立 由于出发菌株的产量极低，为了加快高产菌株的筛选进度，为以后的菌种选育打下基础，需要建立一种简便、快捷的菌种选育方法。为此，用琼脂块初筛的方法进行试验。将经过自然分离(或诱变)后在分离平板上生长好的单菌落先目测筛选，挑选菌落丰满抱子量大的菌株用牙签点种至准备好的琼脂块上，28℃保湿培养5一6天，待菌落长好后用扩散法测定各个琼脂块的抑菌活性，根据抑菌圈的大小初步确定菌株的生产能力，挑选抑菌圈大的菌株，再通过摇瓶液体复筛初步确定高产菌株。因为诺西肤属于脂溶性抗生素，在检定培养基中的扩散速度较慢，加上出发菌株的产量较低，所以37℃培养16一18小时后看不到抑菌圈。 为了解决这一问题，将待测活性的固体琼脂块在生测培养基上先扩散一段时间(4℃，12一16小时，该条件下对链霉菌本身无影响)，此时检定菌不能生长，诺西肤在此期间逐渐扩散到检定培养基中。之后再将检定盘置于37℃培养16一18小时，则可以看到清晰的抑菌圈，从而建立了一种快速的高产菌株筛选方法(如图3一3所示)，并利用此方法挑选出了出发菌株YM4一2(发酵单位为61ou/ml)。
抗生素效价测定操作规程
抗生素效价测定操作规 程
1. 主题内容和适用范围 本规程规定了公司外购原料药品及生产成品中抗生素的效价测定方法及要求。 本规程适用于公司外购原料药品及生产成品中抗生素的效价测定。 2. 引用标准 《中国药典》2010年版二部。 3. 术语 抗生素微生物检定法：在适宜的条件下，根据量反应平行原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）方法。 抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。本法采用的是管碟法。 4. 操作技术（仪器与用具） 4.1 操作室：光线明亮，操作间分 a.一般操作间b 半无菌操作间。室温控制20-25℃。注意抗生素的污染。 4.2 双蝶：内径90mm 高16-17mm.用后经高压灭菌倒出培养基后，置专用洗液或清洁 液中浸泡过夜，冲洗，沥干150-160℃干热灭菌2小时或高压灭菌121℃30min,备用。 4.3 陶瓦盖：内径103mm,外经108mm,吸水性强，定期清洗、干燥或干热灭菌。 4.4 钢管：内径 6.0±0.1mm 高7.8±0.1mm 或8.0±0.1mm,10.0±0.1mm.重量差异不超 ±0.05g.用后置1:1000苯扎溴铵溶液内浸泡2h 以上,再灭菌洗涤,先用水洗,超声波30min 或用去污粉的沙布条串擦内外壁,水冲洗,淋干,PW 冲洗3次150-160℃干热灭菌2小时备用. 4.5 钢管放置器 4.6 恒温培养箱:隔水式为宜35-37℃ 4.7 灭菌刻度吸管:用于吸取菌液及培养基（5ml 、20ml ），用后立即置5%石碳酸或 QCA/QC-SOP-006 山东良福制药有限公司 起草人 日 期 抗生素效价测定操作规程 审核人 日 期 批准人 日 期 第五版 实施日期 总页数 共5页
实验三 抗生素效价的测定
实验三抗生素效价的生物测定 一、实验目的 1．熟悉抗生素效价测定的原理 2．掌握培养基的配制、灭菌 3、掌握接种技术 二、实验原理 抗生素的医疗价值决定于它的抗菌特性，因此利用它们各自的抗菌活性来测定其效价有着特殊的意义。效价的测定法有：液体稀释法，比浊法和扩散法等。本实验采用国际上最为常用的杯碟扩散法来定量测定洁霉素的效价。测定时，将规格完全一致的不锈钢小管（即牛津小杯）置于含敏感菌的琼脂平板上，并在牛津小杯中加入己知浓度的标准青霉素溶液和未知浓度的青霉素发酵液。于是，抗生素就自牛津小杯处向平板四周扩散，在抑菌浓度所达范围内敏感菌的生长被抑制而出现抑菌圈。在一定的范围内，抗生素浓度的对数值与抑菌圈直径呈线性关系。因此，只要将被测样品与标准样品抑菌圈直径进行比较，就可在标准曲线上查得未知样品的抗生素效价。 三、材料和器皿 1 菌种：大肠杆菌（E.coli）。 2培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（作生物测定用时，平板应分上下两层，上层须另加25％葡萄糖）。 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基配方： 牛肉膏3g 蛋白胨10g Nacl 5g 琼脂15-20g 1000ml 水pH 7.4-7.6 3试剂 （1）l％pH6磷酸缓冲液：K2HPO4 0.2g（或K2HPO4·3H20 0.253g）KH2P040.8g，蒸馏水100ml。 （2）25% 葡萄糖溶液100ml。 （3）苄青霉素钠盐：1667U／mg（1U即1国际单位，等于0.6ug）。 4其他：牛津小杯（不锈钢小管，内径6土0.lmm，外径8土0.lmm，高10土0.1mm），培养皿（直径90mm，深20mm；大小一致，皿底平坦），试管、滴管、移液管（5ml）、移液枪（1ml）、枪头、镊子、涂布棒等。 四、方法和步骤 1标准曲线的测绘 (1）倒底层培养基：取无菌培养皿5套，每皿移入20ml牛肉膏蛋白陈底层琼脂培养基，置水平待凝，备用。
2020智慧树,知到《生物药物分析与检验》章节测试完整答案
2020智慧树，知到《生物药物分析与检验》 章节测试完整答案 智慧树知到《生物药物分析与检验》（山东联盟）章节测试答案第一章 1、生物药物分析是药物分析的一个分支，是运用运用化学、物理化学或生物化学的方法和技术研究生物药物及其制剂质量控制方法的学科。 答案: 对 2、药典是国家对药物质量标准及其检验方法所做的技术规定，是药物生产、监控、供应、使用及管理部门共同遵循的法令。 答案: 对 3、2015版《中国药典》分为三部，首次将通则、药用辅料单独作为《中国药典》第三部。 答案: 错 4、为了保证药品临床试验资料的科学性、可靠性和重现性，涉及新药临床研究的所有人员都必须执行哪一项规定? A:GMP B:GCP C:GSP
D:GLP 答案: GCP 5、天然生化药物指的是从生物体中获得的天然存在的生化活性物质。 答案: 对 6、抗生素属于哪一类药物? A:天然生化药物 B:微生物药物 C:核酸类药物 D:多糖类药物 答案: 微生物药物 7、生物药物检验工作的基本程序一般为取样、鉴别、检查、含量测定，最后完成检验报告。 答案: 对 8、分析任何药品，首先是取样，要从大量的样品中取出少量样品进行分析，可以由检验人员随意抽取。 答案: 错 9、药品检验过程及结果必须要有完整的原始记录，实验数据也必须真实，不得涂改。
答案: 对 10、生物药物对酸、碱、重金属、热等理化因素的变化较为敏感，各种理化因素的变化容易对其生物活性产生影响。 答案: 对 第二章 1、酶分析法包括酶法分析和酶活力测定两种类型。 答案: 对 2、在通常的酶活力测定时总要先制备酶反应进程曲线和酶浓度曲线两条曲线。 答案: 对 3、在实际酶活测定中一般以测定底物的减少量为准。 答案: 错 4、酶活力测定过程中，检验酶反应和测定系统是否正确的标准是测得的反应速度必须和反应时间有线性的比例关系。 答案: 错 5、酶活力的测定方法有单酶定量反应法和指示酶反应偶联的定
抗生素效价测定操作规程
QCA/QC-SOP-??? 1.主题内容和适用范围 本规程规定了公司外购原料药品及生产成品中抗生素的效价测定方法及要求。 本规程适用于公司外购原料药品及生产成品中抗生素的效价测定。 2.引用标准 《中国药典》2010年版二部。 3.术语 抗生素微生物检定法：在适宜的条件下，根据量反应平行原理设计，通过检测抗生 素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）方法。 抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。本法采用的是管碟法。 4.操作技术（仪器与用具） 4.1操作室：光线明亮，操作间分a.一般操作间b半无菌操作间。室温控制20-25℃。注 意抗生素的污染。 4.2双蝶：内径90mm高16-17mm.用后经高压灭菌倒出培养基后，置专用洗液或清洁液 中浸泡过夜，冲洗，沥干150-160℃干热灭菌2小时或高压灭菌121℃30min,备用。 4.3陶瓦盖：内径103mm,外经108mm,吸水性强，定期清洗、干燥或干热灭菌。 4.4钢管：内径6.0±0.1mm高7.8±0.1mm或8.0±0.1mm,10.0±0.1mm.重量差异不超±0.05g. 用后置1:1000苯扎溴铵溶液内浸泡2h以上,再灭菌洗涤,先用水洗,超声波30min或 用去污粉的沙布条串擦内外壁,水冲洗,淋干,PW冲洗3次150-160℃干热灭菌2小时备用. 4.5钢管放置器 4.6恒温培养箱:隔水式为宜35-37℃ 4.7灭菌刻度吸管:用于吸取菌液及培养基（5ml、20ml），用后立即置5%石碳酸或1:1000 苯扎溴铵溶液中消毒后再常规洗涤.150-160℃干热灭菌2小时备用. 4.8玻璃容器:滴定管、移液管、刻度吸管、容量瓶.符合一等品规定用前用清洁液浸泡, 水 洗、PW冲3次
抗生素效价测定
项目２青霉素效价测定 一、知识连接 (一)抗生素效价表示方法 效价就是评价抗生素效能得标准,也就是衡量抗生素活性成分含量得尺度。效价一般指得就是生物活性得大小或者高低,生物活性得大小与高低就是与效价成正比得。实际应用中,合理使用抗生素得剂量十分重要。抗生素应用时剂量小,因此除重量外,常用特定得效价单位(unit)表示,效价单位也称抗菌活性单位。 最初,由于抗生素无法制得纯品,用其生物活性得大小来表示其剂量、 一个青霉素得效价单位(Ｕ):能在5０mL肉汤培养基中完全抑制金黄色葡萄球菌标准菌株得发育得最小青霉素剂量。 一个链霉素效价单位(U):能在1mＬ肉汤培养基中完全抑制大肠杆菌(ATCC9６3７)发育得最小剂量。 重量单位(μg):以抗生素得有效成分(生理活性成分)得重量作为抗生素得基准单位(大多数使用)。 (二)抗生素效价测定 抗生素微生物检定法可分为稀释法、比浊法与琼脂扩散法(管碟法与打孔法)。各国药典通常采用后两种方法测定抗生素得效价。 管碟法就是利用抗生素在琼脂培养基得扩散渗透作用,在含有高度敏感性试验菌得琼脂平板上放置小钢管(内径6、0±0。l mm,外径8、0±０。l mm,高1０±０.lmm),管内放入标准品与检品得溶液,经16～1８小时恒温培养,当抗生素在菌层培养基中扩散时,会形成抗生素浓度由高到低得自然梯度,即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此,当抗生素浓度达到或高于MIC(最低抑制浓度)时,试验菌就被抑制而不能繁殖,从而呈现透明得无菌生长得区域,常呈圆形,称为抑菌圈。抑菌圈得大小代表药剂抗菌力得高低。在一定得药剂浓度范围内,药剂得浓度越高则抑菌圈得直径越大。目前最常用得就是游标卡尺与直尺直接测量抑菌圈直径、根据扩散定律得推导,抗生素总量得对数值与抑菌圈直径得平方成线性关系,即通过检测抗生素对微生物得抑制作用,比较标准品与供试品产生抑菌圈得大小,计算出供试品得效价。 管碟法得基本操作与设计适用于各种抗生素,试验结果较稳定;样品用量少,灵敏度高;适合于大批样品得测定。然而凡具有抗菌活性得物质都会干扰测定结果;试验过程长,得出结果慢;操作手工化,需熟练人员才能得到较正确得结果;受扩散因素得影响,如培养基原材料得质量,一般琼脂中得杂质可能影响扩散速度及效价强度。尽管如此,由于它有上述得独特优点而被世界各国所公认,成为国际通用得方法被列入各国药典法规内、 二、制订方案 根据情境导入中得问题,制订抗生素生物效价得测定方案表,如表5—2-1所示。
抗生素效价测定操作规程
1.主题内容和适用范围 本规程规定了公司外购原料药品及生产成品中抗生素的效价测定方法及要求。 本规程适用于公司外购原料药品及生产成品中抗生素的效价测定。 2.引用标准 《中国药典》2015年版四部。 3.术语 抗生素微生物检定法：在适宜的条件下，根据量反应平行原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）方法。 抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。本法采用的是管碟法。 4.操作技术（仪器与用具） 4.1操作室：光线明亮，操作间分a.一般操作间b半无菌操作间。室温控制20-25℃。注 意抗生素的污染。 4.2双蝶：内径90mm高16-17mm.用后经高压灭菌倒出培养基后，置专用洗液或清洁液 中浸泡过夜，冲洗，沥干150-160℃干热灭菌2小时或高压灭菌121℃30min,备用。 4.3陶瓦盖：内径103mm,外经108mm,吸水性强，定期清洗、干燥或干热灭菌。 4.4钢管：内径6.0±0.1mm高7.8±0.1mm或8.0±0.1mm,10.0±0.1mm.重量差异不超±0.05g. 用后置1:1000苯扎溴铵溶液内浸泡2h以上,再灭菌洗涤,先用水洗,超声波30min或用去污粉的沙布条串擦内外壁,水冲洗,淋干,PW冲洗3次150-160℃干热灭菌2小时备用. 4.5钢管放置器 4.6恒温培养箱:隔水式为宜35-37℃ 4.7灭菌刻度吸管:用于吸取菌液及培养基（5ml、20ml），用后立即置5%石碳酸或1:1000 苯扎溴铵溶液中消毒后再常规洗涤.150-160℃干热灭菌2小时备用. 4.8玻璃容器:滴定管、移液管、刻度吸管、容量瓶.符合一等品规定用前用清洁液浸泡, 水 洗、PW冲3次
管碟法测定抗生素效价中的影响因素分析及对策解析
管碟法测定抗生素效价中的影响因素分析及对策(1) 关键字: 管碟法；抗生素；效价；抑菌圈 摘要: 目的提高管碟法测定抗生素效价的准确性。方法按操作步骤逐步分析，并提出合理的解决方案。结果减少外界因素与人为因素给试验带来的误差。结论可以提高测定结果的准确性。 Abstract: OBJECTIVE To improve the veracity of antibiotics titer evaluation by cylinder-plate method. METHOD According to the process of test, analyze the test and offer a proper measure to avoid influencing factors. RESULTS Reduce the errors caused by environmental and artificial factors. CONCLUSION This can improve the veracity of test results. Key words: cylinder-plate method; antibiotics; titer; bacterial inhibition ring 管碟法是国内外常用的抗生素微生物检定法[1]，利用管碟法测定抗生素效价，具有准确、直观、重复性好等优点，因而被广泛采用。但是整个试验过程中影响结果的因素很多，任何一个环节操作不当或者忽略就会造成很大误差，导致整组试验失败。根据实际操作中的积累经验，对管碟法中影响试验结果的因素进行如下分析及提出解决的方法。 1. 实验器材的准备 1.1 实验器材的选择 试验应该选择底面平整的玻璃双碟，避免底面的凹凸影响琼脂层的厚度。可将双碟放置在水平台上，下垫一层白纸，加入3mL水，再滴加蓝墨水，根据蓝色是否深浅一致来判断双碟底面平整程度。小钢管则应该选择加工精细的同一批产品，这样才能保证管壁厚薄与重量均匀一致，使得小钢管在培养基中下陷相同的深度，抗生素溶液扩散均匀有可比性。如果小钢管两端不够平，就应予剔除，否则会使抗生素溶液漏出，破坏均匀扩散现象。 1.2 实验器材的清洗
抗生素效价测定
项目2青霉素效价测定 一、知识连接 （一）抗生素效价表示方法 效价是评价抗生素效能的标准，也是衡量抗生素活性成分含量的尺度。效价一般指的是生物活性的大小或者高低，生物活性的大小和高低是和效价成正比的。实际应用中，合理使用抗生素的剂量十分重要。抗生素应用时剂量小，因此除重量外，常用特定的效价单位（unit）表示，效价单位也称抗菌活性单位。 最初，由于抗生素无法制得纯品，用其生物活性的大小来表示其剂量。 一个青霉素的效价单位（U）：能在50mL肉汤培养基中完全抑制金黄色葡萄球菌标准菌株的发育的最小青霉素剂量。 一个链霉素效价单位（U）：能在1mL肉汤培养基中完全抑制大肠杆菌（ATCC9637）发育的最小剂量。 重量单位（μg）：以抗生素的有效成分（生理活性成分）的重量作为抗生素的基准单位（大多数使用）。 （二）抗生素效价测定 抗生素微生物检定法可分为稀释法、比浊法和琼脂扩散法（管碟法和打孔法）。各国药典通常采用后两种方法测定抗生素的效价。 管碟法是利用抗生素在琼脂培养基的扩散渗透作用，在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管（内径6.0±0.l mm，外径8.0±0.l mm，高10±0.lmm），管内放入标准品和检品的溶液，经16～18小时恒温培养，当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈。抑菌圈的大小代表药剂抗菌力的高低。在一定的药剂浓度范围内，药剂的浓度越高则抑菌圈的直径越大。目前最常用的是游标卡尺和直尺直接测量抑菌圈直径。根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系，即通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。 管碟法的基本操作和设计适用于各种抗生素，试验结果较稳定；样品用量少，灵敏度高；适合于大批样品的测定。然而凡具有抗菌活性的物质都会干扰测定结果；试验过程长，得出结果慢；操作手工化，需熟练人员才能得到较正确的结果；受扩散因素的影响，如培养基原材料的质量，一般琼脂中的杂质可能影响扩散速度及效价强度。尽管如此，由于它有上述的独特优点而被世界各国所公认，成为国际通用的方法被列入各国药典法规内。 二、制订方案
管碟法抗生素效价测量实验
管碟法抗生素效价测量实验 抗生素的生物检定是以抗生素对微生物的抗菌效力作为效价的衡量标准，具有与应用原理相一致、用量少和灵敏度高等优点。管碟法是琼脂扩散法中的一种，已被各国药典广泛采用，作为法定的抗生素生物检定方法。 当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此，当抗生素浓度达到或高于mic（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的抑菌圈。根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系。 实验简介 在管碟法抗生素效价测量实验中需要注意的影响因素分析及对策如下: 管碟法是国内外常用的抗生素微生物检定法[1]，利用管碟法测定抗生素效价，具有准确、直观、重复性好等优点，因而被广泛采用。但是整个试验过程中影响结果的因素很多，任何一个环节操作不当或者忽略就会造成很大误差，导致整组试验失败。根据实际操作中的积累经验，对管碟法中影响试验结果的因素进行如下分析及提出解决的方法。 实验器材的准备 1.1 实验器材的选择 试验应该选择底面平整的玻璃双碟，避免底面的凹凸影响琼脂层的厚度。可将双碟放置在水平台上，下垫一层白纸，加入3mL水，再滴加蓝墨水，根据蓝色是否深浅一致来判断双碟底面平整程度。小钢管则应该选择加工精细的同一批产品，这样才能保证管壁厚薄与重量均匀一致，使得小钢管在培养基中下陷相同的深度，抗生素溶液扩散均匀有可比性。如果小钢管两端不够平，就应予剔除，否则会使抗生素溶液漏出，破坏均匀扩散现象。
1.2 实验器材的清洗 抗生素试验中，玻璃双碟、小钢管往往会连续使用。由于清洗方面的原因，它们还是容易残留上次试验中的抗生素(庆大霉素、争光霉素、链霉素等)或者被清洗用的杀菌剂(如新洁而灭、洗洁精、去污粉等)污染，以至于在下次试验中造成抑菌圈不正常的现象。因此，在清洗时要尤为注意多用流水冲洗。160℃干热灭菌2h后备用。 配制试验所需的样品及药品 2.1 样品与标准品溶液的配制 标准品与样品从冰箱取出后，使与室温平衡。供试品应放于干燥器内至少 30min方可称取。称量最好为一次取样称量，动作迅速，不得反复称取，取样后立即将称量瓶瓶盖盖好，以免吸水。标准品的称量最好用1/100,000克的分析天平，样品称量不得低于1/10,000克的分析天平。天平中的干燥剂应保持经常注意更换。称量结束后，加入超声波处理后的磷酸缓冲液，定容至刻度，过滤并稀释。稀释时，都应采用容量瓶，每一步稀释取样量不得少于2mL。用刻度吸管吸取溶液前，要用待稀释液冲洗吸管2,3次，吸取溶液后，要用滤纸把刻度吸管外壁多余液体擦去，再从起始刻度开始放溶液。把稀释后的抗生素溶液分装至干燥灭菌试管待用。在称量抗生素样品过程中，操作者的工作服上有可能会沾染抗生素粉末，在配培养基、加底层培养基、加菌层培养基或滴加抗生素溶液时，会随衣袖的抖动落入培养基，造成破圈或者无抑菌圈。所以配制抗生素溶液应单独使用一套工作服。 2.2 培养基与缓冲液的配制 配制培养基与缓冲液时要按照文献的配比用量，配制后调节其pH值。因为在pH值、盐浓度的影响下，即使琼脂培养基上的两个相邻的小管距离足够，还是可能会出现卵圆形抑菌圈。例如四环素易受pH值影响，链霉素易受盐浓度影响[2]。
生物药物分析思考题
思考题 *生物药物的特点？ 答：1都为生物大分子，2.组成，结构复杂，具有严格的空间构象，以维持其生理功能 3 近与人体的正常生理物质4 安全毒性小5 更高的生化机制合理性，和特定的治疗有效性 特点：1相对分子质量需测定性2 生物活性检查3 安全性检查 4 效价测定 5 生化发结构测定 *生物制品的质量检定包括哪些方面？ 答：1理化测定 2.安全检定3效力检定 理化检定：外观，真空度和溶解时间，蛋白质，防腐剂，纯度，其他 安全检定：一般安全性检查杀菌，灭活，脱毒外源性污染过敏性检查效力检定：动物保护力活疫苗抗毒素和类毒素血清学实验 *生物药物常用的定量方法有哪些？ 答： 1 酶法 2 电泳法 3 理化测定 4 生物检定法 *什么是电泳？如何对其分类，分别有哪些？ 答：电泳是指带电粒子在电场力的作用下与自身所带相反的电荷方向移动 分类：按支持物可分为：纸电泳，醋酸纤维素薄膜电泳，淀粉凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳 按凝胶形状可分为：水平平板电泳，圆盘柱状电泳，垂直平板电泳 *影响电泳迁移率的因素包括？ 答：1，带电粒子的性质，电子带静电荷越多，越接近球形，电泳速度快 2，电场强度，越强速度越快 3 溶液的ph值，对于蛋白质来说，当ph接近等电点，速度越快，4离子强度，离子强度越小，速度越快5电渗作用，阻碍 *血清蛋白常用什么电泳技术分离？核酸常用什么电泳技术分离？ 答：醋酸纤维素薄膜电泳和琼脂糖电泳 *为什么聚丙烯酰胺凝胶电泳是应用最广泛的凝胶电泳技术？ 答：1 page解离基因量很少，电渗流少，吸附量低，容易制备，2 机械性较好，孔隙可以调节凝胶比重实现可调，具有可拉性分析筛效应3，一定范围对热稳定，无色透明，容易观察，4Acr较纯，可精制，污染小 5 page在280nm 没有吸收利于pro的检测。 *SDS-PAGE电泳用于测定？其中SDS的作用是什么？ 答：sds主要是用来测定蛋白质的分子量，其中sds作用有两个：1，消除不同蛋白表面表面电荷效应，2引起蛋白构象改变，消除蛋白质的结构效应 *核酸在琼脂糖凝胶中的电泳迁移率取决于哪三个因素？ 答：凝胶浓度，核酸的大小，核酸的形状 *DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有什么效应与什么效应？ 答：分子筛效应和电荷效应 *聚丙烯酰胺凝胶电泳包括连续系统和不连续电泳，其定义和区别分别是什么？ 答： 1.连续系统：缓冲液的离子成分、PH、凝胶浓度、电位梯度都相同，带电颗粒电泳时仅具有电荷效应、分子筛效应。 2.不连续系统：缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度、电位梯度不连续，带电颗粒电泳时具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。