抗生素效价测定
项目２青霉素效价测定
一、知识连接
(一)抗生素效价表示方法
效价就是评价抗生素效能得标准,也就是衡量抗生素活性成分含量得尺度。效价一般指得就是生物活性得大小或者高低,生物活性得大小与高低就是与效价成正比得。实际应用中,合理使用抗生素得剂量十分重要。抗生素应用时剂量小,因此除重量外,常用特定得效价单位(unit)表示,效价单位也称抗菌活性单位。
最初,由于抗生素无法制得纯品,用其生物活性得大小来表示其剂量、
一个青霉素得效价单位(Ｕ):能在5０mL肉汤培养基中完全抑制金黄色葡萄球菌标准菌株得发育得最小青霉素剂量。
一个链霉素效价单位(U):能在1mＬ肉汤培养基中完全抑制大肠杆菌(ATCC9６3７)发育得最小剂量。
重量单位(μg):以抗生素得有效成分(生理活性成分)得重量作为抗生素得基准单位(大多数使用)。
(二)抗生素效价测定
抗生素微生物检定法可分为稀释法、比浊法与琼脂扩散法(管碟法与打孔法)。各国药典通常采用后两种方法测定抗生素得效价。
管碟法就是利用抗生素在琼脂培养基得扩散渗透作用,在含有高度敏感性试验菌得琼脂平板上放置小钢管(内径6、0±0。l mm,外径8、0±０。l mm,高1０±０.lmm),管内放入标准品与检品得溶液,经16～1８小时恒温培养,当抗生素在菌层培养基中扩散时,会形成抗生素浓度由高到低得自然梯度,即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此,当抗生素浓度达到或高于MIC(最低抑制浓度)时,试验菌就被抑制而不能繁殖,从而呈现透明得无菌生长得区域,常呈圆形,称为抑菌圈。抑菌圈得大小代表药剂抗菌力得高低。在一定得药剂浓度范围内,药剂得浓度越高则抑菌圈得直径越大。目前最常用得就是游标卡尺与直尺直接测量抑菌圈直径、根据扩散定律得推导,抗生素总量得对数值与抑菌圈直径得平方成线性关系,即通过检测抗生素对微生物得抑制作用,比较标准品与供试品产生抑菌圈得大小,计算出供试品得效价。
管碟法得基本操作与设计适用于各种抗生素,试验结果较稳定;样品用量少,灵敏度高;适合于大批样品得测定。然而凡具有抗菌活性得物质都会干扰测定结果;试验过程长,得出结果慢;操作手工化,需熟练人员才能得到较正确得结果;受扩散因素得影响,如培养基原材料得质量,一般琼脂中得杂质可能影响扩散速度及效价强度。尽管如此,由于它有上述得独特优点而被世界各国所公认,成为国际通用得方法被列入各国药典法规内、
二、制订方案
根据情境导入中得问题,制订抗生素生物效价得测定方案表,如表5—2-1所示。
表5－2—1 抗生素生物效价得测定方案
教师对学生进行分组,每组选出一个小组长,小组长根据小组成员任务分工不同,确定不同任务得责任人、小组成员任务得划分可以参考下面得小组任务分配表,如表5—2-2所示。
表5—2-2 小组任务分配表
三、实施
依据制订方案实施,并填写实验记录表,如表5－2-3所示。
四、作业
１、通过实训后完善本次任务得实训方案
２、抗生素效价测定中,为什么常用管碟法?
３、管碟法测定时需要注意哪些问题?
来自:发酵生产原理及实训技术,主编韩文清程立坤孙霞,内蒙古大学出版社,出版日期２01６.12,IＳBN 9７８－7－５665—1112－6
定价:5５元Eｍail
抗生素效价测定操作规程
QCA/QC-SOP-006 1.主题内容和适用范围 本规程规定了公司外购原料药品及生产成品中抗生素的效价测定方法及要求。 本规程适用于公司外购原料药品及生产成品中抗生素的效价测定。 2.引用标准 《中国药典》2010年版二部。 3.术语 抗生素微生物检定法：在适宜的条件下，根据量反应平行原理设计，通过检测抗生 素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）方法。 抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。本法采用的是管碟法。 4.操作技术（仪器与用具） 4.1操作室：光线明亮，操作间分a.一般操作间b半无菌操作间。室温控制20-25℃。注 意抗生素的污染。 4.2双蝶：内径90mm高16-17mm.用后经高压灭菌倒出培养基后，置专用洗液或清洁液 中浸泡过夜，冲洗，沥干150-160℃干热灭菌2小时或高压灭菌121℃30min,备用。 4.3陶瓦盖：内径103mm,外经108mm,吸水性强，定期清洗、干燥或干热灭菌。 4.4钢管：内径6.0±0.1mm高7.8±0.1mm或8.0±0.1mm,10.0±0.1mm.重量差异不超±0.05g. 用后置1:1000苯扎溴铵溶液内浸泡2h以上,再灭菌洗涤,先用水洗,超声波30min或 用去污粉的沙布条串擦内外壁,水冲洗,淋干,PW冲洗3次150-160℃干热灭菌2小时 备用. 4.5钢管放置器 4.6恒温培养箱:隔水式为宜35-37℃ 4.7灭菌刻度吸管:用于吸取菌液及培养基（5ml、20ml），用后立即置5%石碳酸或1:1000 苯扎溴铵溶液中消毒后再常规洗涤.150-160℃干热灭菌2小时备用. 4.8玻璃容器:滴定管、移液管、刻度吸管、容量瓶.符合一等品规定用前用清洁液浸泡, 水 洗、PW冲3次
管碟法测定抗生素效价中的影响因素分析及对策.
管碟法测定抗生素效价中的影响因素分析及对策 关键字: 管碟法；抗生素；效价；抑菌圈 摘要: 目的提高管碟法测定抗生素效价的准确性。方法按操作步骤逐步分析，并提出合理的解决方案。结果减少外界因素与人为因素给试验带来的误差。结论可以提高测定结果的准确性。 Abstract: OBJECTIVE To improve the veracity of antibiotics titer evaluation by cylinder- plate method. METHOD According to the process of test, ana lyze the test and offer a proper measure to avoid influenci ng factors. RESULTS Reduce the errors caused by environment al and artificial factors. CONCLUSION This can improve the veracity of test results. Key words: cylinder- plate method; antibiotics; titer; bacterial inhibition ring 管碟法是国内外常用的抗生素微生物检定法[1]，利用管碟法测定抗生素效价，具有准确、直观、重复性好等优点，因而被广泛采用。但是整个试验过程中影响结果的因素很多，任何一个环节操作不当或者忽略就会造成很大误差，导致整组试验失败。根据实际操作中的积累经验，对管碟法中影响试验结果的因素进行如下分析及提出解决的方法。 1. 实验器材的准备 1.1 实验器材的选择 试验应该选择底面平整的玻璃双碟，避免底面的凹凸影响琼脂层的厚度。可将双碟放置在水平台上，下垫一层白纸，加入3mL水，再滴加蓝墨水，根据蓝色是否深浅一致来判断双碟底面平整程度。小钢管则应该选择加工精细的同一批产品，这样才能保证管壁厚薄与重量均匀一致，使得小钢管在培养基中下陷相同的深度，抗生素溶液扩散均匀有可比性。如果小钢管两端不够平，就应予剔除，否则会使抗生素溶液漏出，破坏均匀扩散现象。 1.2 实验器材的清洗 抗生素试验中，玻璃双碟、小钢管往往会连续使用。由于清洗方面的原因，它们还是容易残留上次试验中的抗生素（庆大霉素、争光霉素、链霉素等）或者被清洗用的杀菌剂（如新洁而灭、洗洁精、去污粉等）污染，以至于在下次试验中造成抑菌圈不正常的现象。因此，在清洗时要尤为注意多用流水冲洗。160℃干热灭菌2h后备用。 2. 配制试验所需的样品、标准品、缓冲液与培养基
管碟法测定抗生素效价中的影响因素分析及对策讲解
管碟法测定抗生素效价中的影响因素分析及对策摘要: 目的提高管碟法测定抗生素效价的准确性。方法按操作步骤逐步分析，并提出合理的解决方案。结果减少外界因素与人为因素给试验带来的误差。结论可以提高测定结果的准确性。 Abstract: OBJECTIVE To improve the veracity of antibiotics titer evaluation by cylinder-plate method. METHOD According to the process of test, analyze the test and offer a proper measure to avoid influencing factors. RESULTS Reduce the errors caused by environmental and artificial factors. CONCLUSION This can improve the veracity of test results. Key words: cylinder-plate method; antibiotics; titer; bacterial inhibition ring 管碟法是国内外常用的抗生素微生物检定法[1]，利用管碟法测定抗生素效价，具有准确、直观、重复性好等优点，因而被广泛采用。但是整个试验过程中影响结果的因素很多，任何一个环节操作不当或者忽略就会造成很大误差，导致整组试验失败。根据实际操作中的积累经验，对管碟法中影响试验结果的因素进行如下分析及提出解决的方法。 1. 实验器材的准备 1.1 实验器材的选择 试验应该选择底面平整的玻璃双碟，避免底面的凹凸影响琼脂层的厚度。可将双碟放置在水平台上，下垫一层白纸，加入3mL水，再滴加蓝墨水，根据蓝色是否深浅一致来判断双碟底面平整程度。小钢管则应该选择加工精细的同一批产品，这样才能保证管壁厚薄与重量均匀一致，使得小钢管在培养基中下陷相同的深度，抗生素溶液扩散均匀有可比性。如果小钢管两端不够平，就应予剔除，否则会使抗生素溶液漏出，破坏均匀扩散现象。 1.2 实验器材的清洗
抗生素的生物效价测定法(管碟法)
抗生素的生物效价测定法 测定抗生素效价的方法比较多，一般可以分为物理学方法、化学方法、生物学方法、和两种方法配合等四大类，可根据具体情况选择使用。 生物学方法以抗生素的杀菌力作为衡量效价的标准，其原理恰好和临床应用于的要求一致这是它的优点；又其灵敏度较高，需用检品的量较小，也是其它方法所不及的。 抗生素的生物效价测定法，常用的有稀释法、比浊法和扩散法（或称渗透法）。 稀释法这一方法是用培养基将检品抗生素稀释到各种浓度，并依次分装到一系列的容器内，再加入等量“试验菌种”菌种菌液，并放在37 ℃保温箱内培养一定时间，观察何种稀释度适能抑制细菌的生长，该稀释度即为测定终点（或以细菌生长所引起的PH改变及溶血现象等生化反应作为测定终点），再与同样处理的标准抗生素的终点作比较，即可求得检品的效价。这种方法可以使用液体培养基，也可以使用固体培养基。所用的材料及培养基都必须严格无菌，并要注意无菌操作。由于测定终点是以有无细菌生长来判断的，因此所得结果公是一个范围。 比浊法原理及操作大致与稀释法相同。比浊法也是将不同量的检品及标准品分别加入培养基中，观察其对“试验菌种”的效应——即细菌生长所引起的混浊。这一方法和稀释法的区别有二：a.比浊法的稀释间隔的密度比较近，准确度高一些；b.比浊法不以细菌有无生长的区分为终点，而是将标准品浓度和细菌生长所引起的混浊度求得一定的比例，再由检品的细菌生长混浊度推算检品的效价。这一方法易受杂质的影响，并且不适用于有色或混浊的检品。 扩散法使用固体培养基，在培养基凝固以前将“试验菌种”混合进去，在这样备妥的培养表面，可以用种种设计使检品液或含有抗生素的物质与有菌种的培养基接触。经过培育后，由于抗生素向培养基中扩散，凡抑菌浓度所能达到之下细菌不能生长因而形成透明的抑菌范围，此种范围一般都呈圆形，称为“抑菌圈”。扩散法有几种，或中一种叫管碟扩散法（筒称管碟法）为国际上常用的方法，在我国也作为法定的抗生素检定法。 下面我们将详细地讨论管碟法的原理和实验方法。 一、管碟法测定的设计原理及计算方法 管碟法所用的管子系用瓷、铝或玻璃制成，较好的用不锈钢制成，它是内径为6+0.1毫米、外径为8+0.1毫米、高10+0.1毫米的圆筒形管子，管子的重量尽可能相等。 摊布固体培养基的容器可用双碟，亦可用平底下班盘。管子放在混有菌种的固体培养基上时，可用人工放臵，也可用特定的管子放臵器放臵。
抗生素效价计算过程
USP Cylinder-plate assay 美国药典 管碟法---（标准曲线法） 1、 美国药典规定的管碟法抗生素效价方法简述： 首先制备5个标准溶液浓度（U/ml ），分别为S1、S2、S3、S4和S5，其中S3为中间浓度。除S3外的每个浓度准备3个碟子，每个碟子放置6个牛津杯，其中不相连的三个分别加入Si （i 为1、2、4或5），另外三个不相连的加入S3。待检样品（Unknown ）加样方式如Si ，具体放置方法如下图1： 图1：标准及样品管碟放置方式图例 2、在以上方法的基础上以具体数据进行计算举例： 下表2为按以上方法进行抗生素效价检测的一组测量结果： 表2：抗生素效价检测测量结果表 Replicate1 Replicate2 Replicate3 Set S1 Set S2 Set S4 Set S5 Sample U1
备注：Zone1、3、5表示每个平皿中不相连的三个S3的直径值； Zone2、4、6表示每个平皿中不相连的三个Si的直径值； U1表示待测样品1。 2.1 进行初始计算： 对于每种浓度的三个平板，分别求出得到的9个中间浓度标准品的平均值以及9 个Si和U1直径的平均值。 例如： 15.867=（16.1,15.6,15.8,16.0……15.8）9个数据的平均值 14.167=（14.6,14.1,13.5,14.5……14.1）9个数据的平均值 2.2 变异性的适用性检查： 然后求出每三个平板得到的9个数值的标准偏差（包括标准对照和样品的），进而计算出其相对标准偏差值（RSD，该值应不超过10%）。 例如： 标准偏差0.200 = s(16.1, . . ., 15.8) 相对标准偏差1.3% = (0.200/15.867) *100 2.3 进行平板间的差异校正： 计算公式如下。 X C = X S– (X R– P)
抗生素效价测定操作规程
抗生素效价测定操作规 程
1. 主题内容和适用范围 本规程规定了公司外购原料药品及生产成品中抗生素的效价测定方法及要求。 本规程适用于公司外购原料药品及生产成品中抗生素的效价测定。 2. 引用标准 《中国药典》2010年版二部。 3. 术语 抗生素微生物检定法：在适宜的条件下，根据量反应平行原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）方法。 抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。本法采用的是管碟法。 4. 操作技术（仪器与用具） 4.1 操作室：光线明亮，操作间分 a.一般操作间b 半无菌操作间。室温控制20-25℃。注意抗生素的污染。 4.2 双蝶：内径90mm 高16-17mm.用后经高压灭菌倒出培养基后，置专用洗液或清洁 液中浸泡过夜，冲洗，沥干150-160℃干热灭菌2小时或高压灭菌121℃30min,备用。 4.3 陶瓦盖：内径103mm,外经108mm,吸水性强，定期清洗、干燥或干热灭菌。 4.4 钢管：内径 6.0±0.1mm 高7.8±0.1mm 或8.0±0.1mm,10.0±0.1mm.重量差异不超 ±0.05g.用后置1:1000苯扎溴铵溶液内浸泡2h 以上,再灭菌洗涤,先用水洗,超声波30min 或用去污粉的沙布条串擦内外壁,水冲洗,淋干,PW 冲洗3次150-160℃干热灭菌2小时备用. 4.5 钢管放置器 4.6 恒温培养箱:隔水式为宜35-37℃ 4.7 灭菌刻度吸管:用于吸取菌液及培养基（5ml 、20ml ），用后立即置5%石碳酸或 QCA/QC-SOP-006 山东良福制药有限公司 起草人 日 期 抗生素效价测定操作规程 审核人 日 期 批准人 日 期 第五版 实施日期 总页数 共5页
实验三 抗生素效价的测定
实验三抗生素效价的生物测定 一、实验目的 1．熟悉抗生素效价测定的原理 2．掌握培养基的配制、灭菌 3、掌握接种技术 二、实验原理 抗生素的医疗价值决定于它的抗菌特性，因此利用它们各自的抗菌活性来测定其效价有着特殊的意义。效价的测定法有：液体稀释法，比浊法和扩散法等。本实验采用国际上最为常用的杯碟扩散法来定量测定洁霉素的效价。测定时，将规格完全一致的不锈钢小管（即牛津小杯）置于含敏感菌的琼脂平板上，并在牛津小杯中加入己知浓度的标准青霉素溶液和未知浓度的青霉素发酵液。于是，抗生素就自牛津小杯处向平板四周扩散，在抑菌浓度所达范围内敏感菌的生长被抑制而出现抑菌圈。在一定的范围内，抗生素浓度的对数值与抑菌圈直径呈线性关系。因此，只要将被测样品与标准样品抑菌圈直径进行比较，就可在标准曲线上查得未知样品的抗生素效价。 三、材料和器皿 1 菌种：大肠杆菌（E.coli）。 2培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（作生物测定用时，平板应分上下两层，上层须另加25％葡萄糖）。 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基配方： 牛肉膏3g 蛋白胨10g Nacl 5g 琼脂15-20g 1000ml 水pH 7.4-7.6 3试剂 （1）l％pH6磷酸缓冲液：K2HPO4 0.2g（或K2HPO4·3H20 0.253g）KH2P040.8g，蒸馏水100ml。 （2）25% 葡萄糖溶液100ml。 （3）苄青霉素钠盐：1667U／mg（1U即1国际单位，等于0.6ug）。 4其他：牛津小杯（不锈钢小管，内径6土0.lmm，外径8土0.lmm，高10土0.1mm），培养皿（直径90mm，深20mm；大小一致，皿底平坦），试管、滴管、移液管（5ml）、移液枪（1ml）、枪头、镊子、涂布棒等。 四、方法和步骤 1标准曲线的测绘 (1）倒底层培养基：取无菌培养皿5套，每皿移入20ml牛肉膏蛋白陈底层琼脂培养基，置水平待凝，备用。
抗生素效价测定操作规程
QCA/QC-SOP-??? 1.主题内容和适用范围 本规程规定了公司外购原料药品及生产成品中抗生素的效价测定方法及要求。 本规程适用于公司外购原料药品及生产成品中抗生素的效价测定。 2.引用标准 《中国药典》2010年版二部。 3.术语 抗生素微生物检定法：在适宜的条件下，根据量反应平行原理设计，通过检测抗生 素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）方法。 抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。本法采用的是管碟法。 4.操作技术（仪器与用具） 4.1操作室：光线明亮，操作间分a.一般操作间b半无菌操作间。室温控制20-25℃。注 意抗生素的污染。 4.2双蝶：内径90mm高16-17mm.用后经高压灭菌倒出培养基后，置专用洗液或清洁液 中浸泡过夜，冲洗，沥干150-160℃干热灭菌2小时或高压灭菌121℃30min,备用。 4.3陶瓦盖：内径103mm,外经108mm,吸水性强，定期清洗、干燥或干热灭菌。 4.4钢管：内径6.0±0.1mm高7.8±0.1mm或8.0±0.1mm,10.0±0.1mm.重量差异不超±0.05g. 用后置1:1000苯扎溴铵溶液内浸泡2h以上,再灭菌洗涤,先用水洗,超声波30min或 用去污粉的沙布条串擦内外壁,水冲洗,淋干,PW冲洗3次150-160℃干热灭菌2小时备用. 4.5钢管放置器 4.6恒温培养箱:隔水式为宜35-37℃ 4.7灭菌刻度吸管:用于吸取菌液及培养基（5ml、20ml），用后立即置5%石碳酸或1:1000 苯扎溴铵溶液中消毒后再常规洗涤.150-160℃干热灭菌2小时备用. 4.8玻璃容器:滴定管、移液管、刻度吸管、容量瓶.符合一等品规定用前用清洁液浸泡, 水 洗、PW冲3次
抗生素效价测定操作规程
1.主题内容和适用范围 本规程规定了公司外购原料药品及生产成品中抗生素的效价测定方法及要求。 本规程适用于公司外购原料药品及生产成品中抗生素的效价测定。 2.引用标准 《中国药典》2015年版四部。 3.术语 抗生素微生物检定法：在适宜的条件下，根据量反应平行原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）方法。 抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。本法采用的是管碟法。 4.操作技术（仪器与用具） 4.1操作室：光线明亮，操作间分a.一般操作间b半无菌操作间。室温控制20-25℃。注 意抗生素的污染。 4.2双蝶：内径90mm高16-17mm.用后经高压灭菌倒出培养基后，置专用洗液或清洁液 中浸泡过夜，冲洗，沥干150-160℃干热灭菌2小时或高压灭菌121℃30min,备用。 4.3陶瓦盖：内径103mm,外经108mm,吸水性强，定期清洗、干燥或干热灭菌。 4.4钢管：内径6.0±0.1mm高7.8±0.1mm或8.0±0.1mm,10.0±0.1mm.重量差异不超±0.05g. 用后置1:1000苯扎溴铵溶液内浸泡2h以上,再灭菌洗涤,先用水洗,超声波30min或用去污粉的沙布条串擦内外壁,水冲洗,淋干,PW冲洗3次150-160℃干热灭菌2小时备用. 4.5钢管放置器 4.6恒温培养箱:隔水式为宜35-37℃ 4.7灭菌刻度吸管:用于吸取菌液及培养基（5ml、20ml），用后立即置5%石碳酸或1:1000 苯扎溴铵溶液中消毒后再常规洗涤.150-160℃干热灭菌2小时备用. 4.8玻璃容器:滴定管、移液管、刻度吸管、容量瓶.符合一等品规定用前用清洁液浸泡, 水 洗、PW冲3次
管碟法测定抗生素效价中的影响因素分析及对策解析
管碟法测定抗生素效价中的影响因素分析及对策(1) 关键字: 管碟法；抗生素；效价；抑菌圈 摘要: 目的提高管碟法测定抗生素效价的准确性。方法按操作步骤逐步分析，并提出合理的解决方案。结果减少外界因素与人为因素给试验带来的误差。结论可以提高测定结果的准确性。 Abstract: OBJECTIVE To improve the veracity of antibiotics titer evaluation by cylinder-plate method. METHOD According to the process of test, analyze the test and offer a proper measure to avoid influencing factors. RESULTS Reduce the errors caused by environmental and artificial factors. CONCLUSION This can improve the veracity of test results. Key words: cylinder-plate method; antibiotics; titer; bacterial inhibition ring 管碟法是国内外常用的抗生素微生物检定法[1]，利用管碟法测定抗生素效价，具有准确、直观、重复性好等优点，因而被广泛采用。但是整个试验过程中影响结果的因素很多，任何一个环节操作不当或者忽略就会造成很大误差，导致整组试验失败。根据实际操作中的积累经验，对管碟法中影响试验结果的因素进行如下分析及提出解决的方法。 1. 实验器材的准备 1.1 实验器材的选择 试验应该选择底面平整的玻璃双碟，避免底面的凹凸影响琼脂层的厚度。可将双碟放置在水平台上，下垫一层白纸，加入3mL水，再滴加蓝墨水，根据蓝色是否深浅一致来判断双碟底面平整程度。小钢管则应该选择加工精细的同一批产品，这样才能保证管壁厚薄与重量均匀一致，使得小钢管在培养基中下陷相同的深度，抗生素溶液扩散均匀有可比性。如果小钢管两端不够平，就应予剔除，否则会使抗生素溶液漏出，破坏均匀扩散现象。 1.2 实验器材的清洗
管碟法抗生素效价测量实验
管碟法抗生素效价测量实验 抗生素的生物检定是以抗生素对微生物的抗菌效力作为效价的衡量标准，具有与应用原理相一致、用量少和灵敏度高等优点。管碟法是琼脂扩散法中的一种，已被各国药典广泛采用，作为法定的抗生素生物检定方法。 当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此，当抗生素浓度达到或高于mic（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的抑菌圈。根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系。 实验简介 在管碟法抗生素效价测量实验中需要注意的影响因素分析及对策如下: 管碟法是国内外常用的抗生素微生物检定法[1]，利用管碟法测定抗生素效价，具有准确、直观、重复性好等优点，因而被广泛采用。但是整个试验过程中影响结果的因素很多，任何一个环节操作不当或者忽略就会造成很大误差，导致整组试验失败。根据实际操作中的积累经验，对管碟法中影响试验结果的因素进行如下分析及提出解决的方法。 实验器材的准备 1.1 实验器材的选择 试验应该选择底面平整的玻璃双碟，避免底面的凹凸影响琼脂层的厚度。可将双碟放置在水平台上，下垫一层白纸，加入3mL水，再滴加蓝墨水，根据蓝色是否深浅一致来判断双碟底面平整程度。小钢管则应该选择加工精细的同一批产品，这样才能保证管壁厚薄与重量均匀一致，使得小钢管在培养基中下陷相同的深度，抗生素溶液扩散均匀有可比性。如果小钢管两端不够平，就应予剔除，否则会使抗生素溶液漏出，破坏均匀扩散现象。
1.2 实验器材的清洗 抗生素试验中，玻璃双碟、小钢管往往会连续使用。由于清洗方面的原因，它们还是容易残留上次试验中的抗生素(庆大霉素、争光霉素、链霉素等)或者被清洗用的杀菌剂(如新洁而灭、洗洁精、去污粉等)污染，以至于在下次试验中造成抑菌圈不正常的现象。因此，在清洗时要尤为注意多用流水冲洗。160℃干热灭菌2h后备用。 配制试验所需的样品及药品 2.1 样品与标准品溶液的配制 标准品与样品从冰箱取出后，使与室温平衡。供试品应放于干燥器内至少 30min方可称取。称量最好为一次取样称量，动作迅速，不得反复称取，取样后立即将称量瓶瓶盖盖好，以免吸水。标准品的称量最好用1/100,000克的分析天平，样品称量不得低于1/10,000克的分析天平。天平中的干燥剂应保持经常注意更换。称量结束后，加入超声波处理后的磷酸缓冲液，定容至刻度，过滤并稀释。稀释时，都应采用容量瓶，每一步稀释取样量不得少于2mL。用刻度吸管吸取溶液前，要用待稀释液冲洗吸管2,3次，吸取溶液后，要用滤纸把刻度吸管外壁多余液体擦去，再从起始刻度开始放溶液。把稀释后的抗生素溶液分装至干燥灭菌试管待用。在称量抗生素样品过程中，操作者的工作服上有可能会沾染抗生素粉末，在配培养基、加底层培养基、加菌层培养基或滴加抗生素溶液时，会随衣袖的抖动落入培养基，造成破圈或者无抑菌圈。所以配制抗生素溶液应单独使用一套工作服。 2.2 培养基与缓冲液的配制 配制培养基与缓冲液时要按照文献的配比用量，配制后调节其pH值。因为在pH值、盐浓度的影响下，即使琼脂培养基上的两个相邻的小管距离足够，还是可能会出现卵圆形抑菌圈。例如四环素易受pH值影响，链霉素易受盐浓度影响[2]。
抗生素效价测定
项目２青霉素效价测定 一、知识连接 (一)抗生素效价表示方法 效价就是评价抗生素效能得标准,也就是衡量抗生素活性成分含量得尺度。效价一般指得就是生物活性得大小或者高低,生物活性得大小与高低就是与效价成正比得。实际应用中,合理使用抗生素得剂量十分重要。抗生素应用时剂量小,因此除重量外,常用特定得效价单位(unit)表示,效价单位也称抗菌活性单位。 最初,由于抗生素无法制得纯品,用其生物活性得大小来表示其剂量、 一个青霉素得效价单位(Ｕ):能在5０mL肉汤培养基中完全抑制金黄色葡萄球菌标准菌株得发育得最小青霉素剂量。 一个链霉素效价单位(U):能在1mＬ肉汤培养基中完全抑制大肠杆菌(ATCC9６3７)发育得最小剂量。 重量单位(μg):以抗生素得有效成分(生理活性成分)得重量作为抗生素得基准单位(大多数使用)。 (二)抗生素效价测定 抗生素微生物检定法可分为稀释法、比浊法与琼脂扩散法(管碟法与打孔法)。各国药典通常采用后两种方法测定抗生素得效价。 管碟法就是利用抗生素在琼脂培养基得扩散渗透作用,在含有高度敏感性试验菌得琼脂平板上放置小钢管(内径6、0±0。l mm,外径8、0±０。l mm,高1０±０.lmm),管内放入标准品与检品得溶液,经16～1８小时恒温培养,当抗生素在菌层培养基中扩散时,会形成抗生素浓度由高到低得自然梯度,即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此,当抗生素浓度达到或高于MIC(最低抑制浓度)时,试验菌就被抑制而不能繁殖,从而呈现透明得无菌生长得区域,常呈圆形,称为抑菌圈。抑菌圈得大小代表药剂抗菌力得高低。在一定得药剂浓度范围内,药剂得浓度越高则抑菌圈得直径越大。目前最常用得就是游标卡尺与直尺直接测量抑菌圈直径、根据扩散定律得推导,抗生素总量得对数值与抑菌圈直径得平方成线性关系,即通过检测抗生素对微生物得抑制作用,比较标准品与供试品产生抑菌圈得大小,计算出供试品得效价。 管碟法得基本操作与设计适用于各种抗生素,试验结果较稳定;样品用量少,灵敏度高;适合于大批样品得测定。然而凡具有抗菌活性得物质都会干扰测定结果;试验过程长,得出结果慢;操作手工化,需熟练人员才能得到较正确得结果;受扩散因素得影响,如培养基原材料得质量,一般琼脂中得杂质可能影响扩散速度及效价强度。尽管如此,由于它有上述得独特优点而被世界各国所公认,成为国际通用得方法被列入各国药典法规内、 二、制订方案 根据情境导入中得问题,制订抗生素生物效价得测定方案表,如表5—2-1所示。
抗生素生物效价测定
实验一抗生素生物效价测定 【实验目的】 1. 掌握抗生素生物效价测定的原理和方法； 2. 掌握管碟法测定抗生素生物效价相关的操作方法。 【实验原理】 抗生素的效价常采用微生物学方法测定，它是利用抗生素对特定的微生物具有抗菌活性 的原理来测定抗生素效价的方法，如管碟法。管碟法是目前抗生素效价测定的国际通用方法， 我国药典也采用此法。管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价。管碟法的基本原理是在含有高度 敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管(内径6.0 ±).1 mm外径8.0 ±).1 mm高10 ±). Imm)， 管内放人标准品和检品的溶液，经16~18小时恒温培养，当抗生素在菌层培养基中扩散时______ 会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，___ 即扩散中心浓度高而边缘浓度低。_因此，当抗生素 圈直径的平方成线性关系，—比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价。 常用的管碟法有：一剂量法、二剂量法、三剂量法。后二法已经列入药典。二剂量法系将抗生素标准品和供试品各稀释成一定浓度比例( 2:1或4:1 )的两种溶液，在同一平板上 比较其抗药活性，再根据抗生素浓度对数和抑菌圈直径成直线关系的原理来计算供试品效价。取含菌层的双层平板培养基，每个平板表面放置4个小钢管，管内分别放入供试品高、 低剂量和标准品高、低剂量溶液。先测量出四点的抑菌圈直径，按下列公式计算出检品的效价。 (1)求出W和V：W=( SH+UH -( SL+UL ( V= (UH+UL - (SH+SL ( 式中：UH供试品高剂量之抑菌圈直径； UL：供试品低剂量之抑菌圈直径； SH标准品高剂量之抑菌圈直径； SL：标准品低剂量之抑菌圈直径； (2)求出0：匸Dantilog (IV/W) ( 式中：0供试品和标准品的效价比；式 2.10-1) 式 2.10-2) 式 2.10-3)
抗生素效价测定
项目2青霉素效价测定 一、知识连接 （一）抗生素效价表示方法 效价是评价抗生素效能的标准，也是衡量抗生素活性成分含量的尺度。效价一般指的是生物活性的大小或者高低，生物活性的大小和高低是和效价成正比的。实际应用中，合理使用抗生素的剂量十分重要。抗生素应用时剂量小，因此除重量外，常用特定的效价单位（unit）表示，效价单位也称抗菌活性单位。 最初，由于抗生素无法制得纯品，用其生物活性的大小来表示其剂量。 一个青霉素的效价单位（U）：能在50mL肉汤培养基中完全抑制金黄色葡萄球菌标准菌株的发育的最小青霉素剂量。 一个链霉素效价单位（U）：能在1mL肉汤培养基中完全抑制大肠杆菌（ATCC9637）发育的最小剂量。 重量单位（μg）：以抗生素的有效成分（生理活性成分）的重量作为抗生素的基准单位（大多数使用）。 （二）抗生素效价测定 抗生素微生物检定法可分为稀释法、比浊法和琼脂扩散法（管碟法和打孔法）。各国药典通常采用后两种方法测定抗生素的效价。 管碟法是利用抗生素在琼脂培养基的扩散渗透作用，在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管（内径6.0±0.l mm，外径8.0±0.l mm，高10±0.lmm），管内放入标准品和检品的溶液，经16～18小时恒温培养，当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈。抑菌圈的大小代表药剂抗菌力的高低。在一定的药剂浓度范围内，药剂的浓度越高则抑菌圈的直径越大。目前最常用的是游标卡尺和直尺直接测量抑菌圈直径。根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系，即通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。 管碟法的基本操作和设计适用于各种抗生素，试验结果较稳定；样品用量少，灵敏度高；适合于大批样品的测定。然而凡具有抗菌活性的物质都会干扰测定结果；试验过程长，得出结果慢；操作手工化，需熟练人员才能得到较正确的结果；受扩散因素的影响，如培养基原材料的质量，一般琼脂中的杂质可能影响扩散速度及效价强度。尽管如此，由于它有上述的独特优点而被世界各国所公认，成为国际通用的方法被列入各国药典法规内。 二、制订方案
抗生素效价培训大全
抗生素效价培训内容 一、需要干热灭菌的器皿： C 二、以检磷酸泰乐菌素为例配置培养基和缓冲液的准备如下： ㈠①磷酸泰乐菌素原料含量测定标准：精密称取本品适量，加灭菌水定量制成每1ml中约 含1000单位的溶液，照抗生素微生物检定法测定。1000泰乐菌素单位相当于1mg的泰 乐菌素。 成品含量测定标准：精密称取本品适量，置100ml量瓶中，加灭菌磷酸盐缓冲液（pH6.0）40ml，加甲醇40ml，超声15分钟，摇匀，放冷，加灭菌磷酸盐缓冲液（pH6.0）稀释至 刻度，使成每1ml中约含1000单位的溶液，取上清液，照磷酸泰乐菌素项下的方法测定，即得。 ②查《中国兽药典》2005年版附录103页抗生素微生物检定法，可知： 泰乐菌素试验菌——藤黄微球菌（28001）；培养基——Ⅱ，pH值为6.5~6.6或7.8~8.0； 灭菌缓冲液pH值——6.0；抗生素浓度范围2.5~10.0；温度——35~37； 时间——16~18 培养基Ⅱ制备方法： 胨6g；酵母浸出粉6g；琼脂15~20g；牛肉浸出粉 1.5g；葡萄糖1g；水1000ml 磷酸盐缓冲液（6.0）——取磷酸氢二钾2g与磷酸二氢钾8g，加水使成1000ml。 ③缓冲液及培养基配置完成后进行高压121℃湿热灭菌，时间为15~20min。 ㈡①标准品、原料、成品取样量的计算方法： 标准品效价：1034u/mg 原料效价：800u/mg 成品效价：880×104/100g 原料800u/mg×x=1000u×10ml x=0.0125g 成品 100g: 880×104=x:100ml×1000u x=1.13636g 标准品 1034u/mg×x=1000u×10ml x=0.00967g 注意事项：a.称量量必须大于应取的量，多余的量要另加溶液使溶液浓度达到标准；如 标准品取0.00992g,多加溶液量为x, 1034u/mg×9.92mg=1000u×x，x=10.26ml，则 另加溶液0.26ml。另外也要考虑容量瓶的体积，以免称量量过多使之盛不下。b.标准品 应从冰箱拿出后放置室温再进行称量。 ②稀释步骤： 取5ml 1000u/ml 50u/ml 缓冲液6.0定容至100ml 取5ml 50u/ml 5u/ml 缓冲液6.0定容至50ml 取5ml
抗生素生物效价测定
实验一抗生素生物效价测定 【实验目的】 1. 掌握抗生素生物效价测定的原理和方法； 2. 掌握管碟法测定抗生素生物效价相关的操作方法。 【实验原理】 抗生素的效价常采用微生物学方法测定，它是利用抗生素对特定的微生物具有抗菌活性 的原理来测定抗生素效价的方法，如管碟法。管碟法是目前抗生素效价测定的国际通用方法， 我国药典也采用此法。管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价。管碟法的基本原理是在含有高度 敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管（内径6.0 ±.l mm，外径8.0 ±.l mm，高10±0. lmm），管内放人标准品和检品的溶液，经16~18小时恒温培养，当抗生素在菌层培养基中扩散时， 圈直径的平方成线性关系，比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小, 可计算出抗生素的效价。 常用的管碟法有：一剂量法、二剂量法、三剂量法。后二法已经列入药典。二剂量法系 将抗生素标准品和供试品各稀释成一定浓度比例（2:1或4:1）的两种溶液，在同一平板上比 较其抗药活性，再根据抗生素浓度对数和抑菌圈直径成直线关系的原理来计算供试品效价。 取含菌层的双层平板培养基，每个平板表面放置4个小钢管，管内分别放入供试品高、低剂量和标准品高、低剂量溶液。先测量出四点的抑菌圈直径，按下列公式计算出检品的效价。 （1）求出W 和V : W=（SH+UH）-（SL+UL）（式2.10-1） V= （UH+UL）-（SH+SL）（式2.10-2）式中：UH :供试品高剂量之抑菌圈直径； UL :供试品低剂量之抑菌圈直径； SH :标准品高剂量之抑菌圈直径； SL :标准品低剂量之抑菌圈直径； （2）求出0: 0 =D- antilo（IV/W ）（式2.10-3）
抗生素效价
用管碟法（2.2）法，测定链霉素活菌剂的效价，估计效价为1 000 000 u/g，供试品最终浓度为1.4u/ml 及0.7u/ml。 链霉素的效价测定 抗生素微生物检定法 本法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效性）的方法。 抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。 测定结果经计算所得的效价，如低于估计效价的90%或高于估计效价的110%时，应调整其估计效价，重新试验。 除另有规定外，本法的可信限率不得大于5%。 第一法管碟法 本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。 菌悬液的制备 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）悬液 取枯草芽孢杆菌［CMCC（B）63501］的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35～37℃培养7日，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85％以上。用灭菌水将芽孢洗下，在65℃加热30分钟，备用。 短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)悬液 取短小芽孢杆菌［CMCC(B)63202］的营养琼脂斜面培养物，照上述方法制备。 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）悬液 取金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］的营养琼脂斜面培养物,接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水或0.9％灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。 藤黄微球菌（Micrococcus luteus）悬液 取藤黄微球菌［CMCC（B）28001］的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在26～27℃培养24小时，或采用适当方法制备的菌斜面,用培养基Ⅲ或0.9％灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。大肠杆菌（Escherichia coli）悬液 取大肠杆菌［CMCC（B）44103］的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水将菌苔洗下，备用。 啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）悬液 取啤酒酵母菌（ATCC 9763）的Ｖ号培养基琼脂斜面培养物，接种于Ⅳ号培养基琼脂斜面上。在32～35℃培养24小时，用灭菌水将菌苔洗下置含有灭菌玻璃珠的试管中，振摇均匀，备用。 肺炎克雷伯氏菌（Klebosiella Pneumoniae）悬液 取肺炎克雷伯氏菌[CMCC（B）46117]的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水将菌苔洗下，备用。 支气管炎博德特菌（Bordetella Bronchiseptica）悬液 取支气管炎博德特菌［CMCC（B）58 403］的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在32~35℃培养24小时。临用时，用灭菌水将菌苔洗下，备用。 标准品溶液的制备
管碟法测定抗生素效价
管碟法测定抗生素效价（四环素类） 一、目的和要求 1、了解管碟法的原理。 2、掌握二剂量法测定抗生素效价单位的技术和计算方法。 二、原理 抗生素的生物检定是以抗生素对微生物的抗菌效力作为效价的衡量标准，具有与应用原理相一致、用量少和灵敏度高等优点。管碟法是琼脂扩散法中的一种，已被各国药典广泛采用，作为法定的抗生素生物检定方法。 当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的抑菌圈。根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系。 三、实验材料 1、四环素类抗生素的标准品和样品。 2、试验菌：藤黄八叠球菌（Sarcina lutea）。 3、培养基：250ml三角瓶分装150ml LB琼脂，150ml三角瓶分装50ml LB琼脂，50ml三角瓶分装20ml藤黄八叠球菌悬液用培养液。 4、灭菌物品：培养皿，牛津杯（内径：6.0±0.1mm，外径：7.8±0.1mm，高度：10.0±0.1mm），滴管，1ml吸管，pH6.0的磷酸缓冲液，弯头镊子，15×150mm试管，瓦盖。 5、其它：分析天平，容量瓶，玻璃板，水平仪，游标卡尺。 四、实验实施 1、配制标准品溶液 2、配制样品溶液 3、制备菌悬液。 4、制备平板： （1）取6套无菌培养皿，分别加入约20mlLB培养基后，置水平玻璃板上凝固，作为底层。 （2）另取冷却至50℃左右的50ml LB培养基，加入1ml试验菌悬液，
迅速摇匀后，用10ml破口吸管取6ml混菌培养基倒在底层平板上，作为菌层，并放置在水平玻璃板上凝固。 5、在培养基平板底部作好相应标记，用弯头镊子在每个培养皿中等距离放入4个牛津杯。 6、用滴管分别将高、低浓度的标准品和样品溶液加入到牛津杯中，以滴满为度，换上皿盖。 7、将培养皿平稳送入恒温箱，37℃下培养16～18h。 8、用游标卡尺测量抑菌圈直径。 通过测定抗生素效价来判定其质量好坏和有效成分含量的杀菌剂生物测定。 简史福斯特(J．W．Foster，1942)和施密特(W．H．Schmidt，1944)等曾用比浊法和稀释法测定青霉素的效价，因不够精确，现已不使用。阿布拉汉(E．P．Abrahan，1941)首先采用管碟法测定青霉素的效价(见抑菌圈测定法)、戴维斯(B．D．Davis，1945)等进一步发现青霉素浓度对数值与抑菌圈直径成直线函数关系，并发表了效价测定的计算方法。由于管碟法在抗生素效价测定的所有方法中比较精确，现已成为抗生素效价测定的国际标准方法。 效价单位效价是衡量抗菌素抗菌效能的标准，其单位可分为两大类：①稀释单位。牛津大学最早公布牛津单位，即在标准情况下，能在50毫升肉汁培养基内完全抑制金黄色葡萄球菌(牛津标准菌种)生长时，青霉素的最低含量。后来规定将1毫克抗菌素配制成溶液，在一定条件下进行稀释，能抑制某一病菌生长的最高稀释度作为1毫克抗菌素中所具有的单位。例如1毫克制霉素在一定条件下稀释到3600倍，尚能抑制白色念球菌的繁殖，即1毫克含有3600单位。②重量单位。将纯净的抗菌素重量直接作为抗菌效能的标准，即1微克相当于1个单位。例如，纯净的氯霉素1毫克含有1000个单位。由于前一时期青霉素均以稀释单位进行衡量，为避免重新换算数据，1944年国际联盟卫生组织决定，将1个牛津单位相当于0．6微克苄青霉素钠盐所具有的抗菌效能作为1个国际单位，即1毫克苄青霉素钠盐相当于1667个国际单位。
抗生素效价测定操作规程
永年县中医院 1. 主题内容和适用范围 本规程规定了公司外购原料药品及生产成品中抗生素的效价测定方法及要求。 本规程适用于公司外购原料药品及生产成品中抗生素的效价测定。 2. 引用标准 《中国药典》2010年版二部。 3. 术语 抗生素微生物检定法：在适宜的条件下，根据量反应平行原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）方法。 抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。本法采用的是管碟法。 4. 操作技术（仪器与用具） 4.1 操作室：光线明亮，操作间分a.一般操作间b 半无菌操作间。室温控制20-25℃。注意抗生素的污染。 4.2 双蝶：内径90mm 高16-17mm.用后经高压灭菌倒出培养基后，置专用洗 液或清洁液中浸泡过夜，冲洗，沥干150-160℃干热灭菌2小时或高压灭菌121℃30min,备用。 4.3 陶瓦盖：内径103mm,外经108mm,吸水性强，定期清洗、干燥或干热灭 菌。 4.4 钢管：内径6.0±0.1mm 高7.8±0.1mm 或8.0±0.1mm,10.0±0.1mm.重量差异不超±0.05g.用后置1:1000苯扎溴铵溶液内浸泡2h 以上,再灭菌洗涤,先用水洗,超声波30min 或用去污粉的沙布条串擦内外壁,水冲洗,淋干,PW 冲洗3次150-160℃干热灭菌2小时备用. 4.5 钢管放置器 4.6 恒温培养箱:隔水式为宜35-37℃ 4.7 灭菌刻度吸管:用于吸取菌液及培养基（5ml 、20ml ），用后立即置5%石 碳酸或1:1000苯扎溴铵溶液中消毒后再常规洗涤.150-160℃干热灭菌2小时备用. QCA/QC-SOP-006