细胞膜蛋白及其功能
细胞膜蛋白质
膜结构中含有蛋白质早已证实，但有兴趣的问题是膜中蛋白质究以何种形式存在。70年代以前，多数人主张蛋白质是平铺在脂质双分子层的内外两侧，后来证明，蛋白质分子是以а-螺旋或球形结构分散镶嵌在膜的脂质双分子层中。膜蛋白质主要以两种形式同膜脂质相结合：有些蛋白质以其肽链中带电的氨基酸或基团，与两侧的脂质极性基团相互吸引，使蛋白质分子像是附着在膜的表面。这称为表面蛋白质；有些蛋白质分子的肽链则可以一次或反复多次贯穿整个脂质双分子层，两端露出在膜的两侧，这称为结合蛋白质。在用分子生物学技术确定了一个蛋白质分子或其中亚单位的一级结构、即肽链中不同氨基酸的排列顺序后，发现所有结合蛋白质的肽链中都有一个或数个主要由20-30个疏水性氨基酸组成的片段。这些氨基酸又由于所含基团之间的吸引而形成а-螺旋，即这段肽链沿一条轴线盘旋，形成每一圈约含3.6个氨基酸残基的螺旋，螺旋的长度大致相当于膜的厚度，因而推测这些疏水的а螺旋可能就是肽链贯穿膜的部分，它的疏水性正好同膜内疏水性烃基相吸引。这样，肽链中有几个疏水性а-螺旋，就可能几次贯穿膜结构；相邻的а-螺旋则以位于膜外侧和内侧的不同长度的直肽链连接。膜结构中的蛋白质，具有不同的分子结构和功能。生物膜所具有的各种功能，在很大程度上决定于膜所含的蛋白质；细胞和周围环境之间的物质、能量和信息交换，大都与细胞膜上的蛋白质分子有关。由于脂质分子层是液态的，镶嵌在脂质层中的蛋白质是可移动的，即蛋白质分子可以在膜脂分子间横向漂浮移位；不同细胞膜中的不同蛋白质分子的移动和所在位置，存在着精细的调控机制。例如，骨骼肌细胞膜中与神经肌肉间信息传递有关的通道蛋白质分子，通常都集中在肌细胞膜与神经未梢分布相对应的那些部分；而在肾小管和消化管上皮细胞，与管腔相对的膜和其余部分的膜中所含的蛋白质种类大不相同，说明各种功能蛋白质分子并不都能在所在的细胞膜中自由移动和随机分布，而实际存在着的有区域特性的分布，显然同蛋白质完成其特殊功能有关。膜内侧的细胞骨架可能对某种蛋白质分子局限在膜的某一特殊部分起着重要作用。
膜蛋白提取
1分离组织膜蛋白的方法： 1、取组织，加入10ml Buffer A 于冰上充分匀浆。 2、J6-HC离心机800rpm，4℃离心10min后，所得上清液转入超速离心管。 3、100000g，4℃离心1hr。弃去上清，沉淀用适量的Buffer B重悬，冰上孵育2hr后分装至EP管，Eppendorf台式离心机10000rpm，4℃离心30min。 4、收集所得上清液即为膜组份。 Buffer A：0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。Buffer B：20mM HEPES（PH 7.5），10%甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。 2 取约0.1g肝组织，加入2ml粉碎缓冲液，冰浴中超声粉碎，每次20秒，间隔30秒，共3次，4°c 105xg条件下离心2小时，上清液为胞浆蛋白，沉淀部分加入1ml胞膜蛋白提取液，超声粉碎，4°c 105xg条件下离心2小时，上清液为胞膜蛋白。样品蛋白含量测定采用酚试剂法。 3 我们实验室提取膜蛋白的方法如下： 1．将细胞种于T75 或T175的培养瓶中培养数天，细胞铺满瓶底后，吸去培养液。将PBS/EDTA 溶液(NaCl:0.1M,NaH2PO4:0.01M,EDTA:0.04%)加入量以覆盖细胞为止，置于培养箱或在超净台内消化3～5分钟，如仍未脱落瓶底，用吸管吹打，使细胞完全脱落。2．收集细胞悬液于10毫升或50毫升的离心管中，1000rpm离心10分钟，去上清液。3．按 2.5毫升（T75）/每瓶或5毫升（T175/ 每瓶加入冰冷的匀浆液（HEPES:50mM,PH7.4,MgCl2:3mM,EGTA:1mM）于离心管中，将溶液和沉淀转移到匀浆器中，匀浆。 4．将匀浆液转入离心管中，加入适量的Tris –HCl (50mM, PH7.4) 4oC, 18000rpm (40000g) 10分钟。在沉淀中加入同前量的匀浆液，再匀浆，匀浆后加入适量的tris-HCl buffer. 4度18000rpm(40000g)离心，共离心三次。 5．在最后一次离心得到沉淀中按250微升每瓶（T75）或500微升每瓶（T175）加入tris-HCl buffer，匀浆，取50微升匀浆液测量蛋白浓度。 6．按实验要求，将匀浆分装于1毫升的Eppendoff 管中，其于-80oC 冰箱中待用。 主要基于膜蛋白分子量较大，在40000g时易沉降来分离。 做膜蛋白的免疫荧光，可以用荧光抗体染色，然后用荧光显微镜或共聚焦显微镜观察，具体的protocol可以找到，就不多说了。需要注意的是，要弄清楚你所使用的一抗结合部位是在膜蛋白的胞外结构域还是胞内结构域，如果是胞外，可以直接染色；如果在胞内，则需要用无水甲醇在-20度处理10min，使细胞膜通透，然后再用抗体孵育，这样抗体才能进入细胞内与蛋白结合。
细胞膜及其表面123节答案
第五章细胞膜及其表面 （第1-3节） 一、填空 A-五-1.细胞膜的最显著特性是不对称性和流动性。 A-五-2.生物膜脂在正常生理温度下以液晶态存在，随着温度的上升或下降可发生状态的改变，这种变化称相变。 A-五-3. 生物膜的化学组成主要有膜脂、膜蛋白、膜糖。 A-五-4.动物细胞连接有封闭连接、锚定连接、通讯连接__等几类，其中通讯连接具有细胞通讯作用。 A-五-5.按照膜蛋白与膜脂的结合方式以及膜蛋白存在的位置，可分为膜内在蛋白、膜周边蛋白、脂锚定蛋白三种。 B-五-6.在正常生理温度下，膜脂呈液晶态，具有一定的流动性，影响膜脂流动性的因素中，脂肪酸链的饱和程度越高，膜脂的流动性越小（大或小）。 B-五-7.细胞膜中所含有的主要脂类为磷脂、胆固醇、糖脂，它们都是双亲性分子。 B-五-8. 质膜中磷脂、胆固醇和糖脂等成分是具有双亲性的分子。 C-五-9.真核细胞膜中有四种主要的磷脂分子：磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂。C-五-10.膜脂的分子运动方式包括：旋转运动、侧向扩散运动、 内、外层翻转运动和弯曲运动。
C-五-11.点状桥粒的主要结构包括：①__桥粒斑__； ②____钙黏蛋白___；③__中间丝___。 D-五-12.改变溶液温度或离子强度就可以从细胞膜上分离下来的膜蛋白是膜周边蛋白，用去垢剂处理才能从细胞膜上分离下来的膜蛋白是膜内在蛋白。 二、选择题 （一）单项选择题 A-五-1.生物膜的主要化学成分是（ C ）。 A 蛋白质和水 B 蛋白质和糖类 C 蛋白质和脂类 D 脂类和糖类 A-五-2.膜脂中最多的是（ C ）。 A 脂肪 B 糖脂 C 磷脂 D 胆固醇 ?A-五-3. 下列哪种结构不是单位膜（ C ）。 A 细胞膜 B 内质网膜 C 细胞外被 D 线粒体外膜 A-五-4.细胞膜性结构在电镜下都呈现出较为一致的三层结构，即内外两层电子致密层中夹一层疏松层，称为（ C ）。 A 生物膜 B 质膜 C 单位膜 D 板块模型 A-五-5. 下列关于细胞膜的叙述哪项有误（ D ） A 镶嵌蛋白以各种形式镶嵌于脂质双分子层 B 含胆固醇 C 含糖脂 D外周蛋白在外表面 A-五-6.磷脂分子在细胞膜中的排列规律是（ A ） A 极性头部朝向膜的内、外两侧，疏水尾部朝向膜的中央 B 极性头部朝向膜的外侧，疏水尾部朝向膜的内侧 C 极性头部朝向膜的内侧，疏水尾部朝向膜的外侧 D 极性头部朝向膜的中央，疏水尾部朝向膜的内、外两侧 A-五-7.生物膜是指（ D ） A 单位膜 B 蛋白质和脂质二维排列构成的液晶态膜
细胞膜的研究发展
（1）膜脂 磷脂、胆固醇、糖脂，每个动物细胞质膜上约有109个脂分子，即每平方微米的质膜上约有5x106个脂分子。 （2）膜蛋白 细胞膜蛋白质（包括酶）膜蛋白质主要以两种形式同膜脂质相结合：分内在蛋白和外在蛋白两种。内在蛋白以疏水的部分直接与磷脂的疏水部分共价结合，两端带有极性，贯穿膜的内外；外在蛋白以非共价键结合在固有蛋白的外端上，或结合在磷脂分子的亲水头上。如载体、特异受体、酶、表面抗原。占20%～30%的表面蛋白质（外周蛋白质）以带电的氨基酸或基团——极性基团与膜两侧的脂质结合；占70%～80%的结合蛋白质（内在蛋白质）通过一个或几个疏水的α-螺旋（20～30个疏水氨基酸吸收而形成，每圈3.6个氨基酸残基，相当于膜厚度。相邻的α-螺旋以膜内、外两侧直链肽连接）即膜内疏水羟基与脂质分子结合。理论上，镶嵌在脂质层中的蛋白质是可以横向漂浮移位的，因而该是随机分布的；可实际存在着的有区域性的分布；（这可能与膜内侧的细胞骨架存在对某种蛋白质分子局限作用有关），以实现其特殊的功能：细胞与环境的物质、能量和信息交换等。（Frye和Edidin1970年用发红光的碱性芯香红标记人细胞同用发绿光荧光素标记膜蛋白抗体标记离体培养的小鼠细胞一起培养，然后使它们融合，从各自分布，经过37℃40min后变为均匀分布。光致漂白荧光恢复法，微区监测） 细胞膜上存在两类主要的转运蛋白，即：载体蛋白（carrier protein）和通道蛋白（channel protein）。载体蛋白又称做载体（carrier）、通透酶（permease）和转运器（transporter），能够与特定溶质结合，通过自身构象的变化，将与它结合的溶质转移到膜的另一侧，载体蛋白有的需要能量驱动，如：各类APT驱动的离子泵；有的则不需要能量，以自由扩散的方式运输物质，如：缬氨酶素。通道蛋白与与所转运物质的结合较弱，它能形成亲水的通道，当通道打开时能允许特定的溶质通过，所有通道蛋白均以自由扩散的方式运输溶质。 （3）膜糖 膜糖和糖衣：糖蛋白、糖脂 细胞膜糖类主要是一些寡糖链和多糖链，它们都以共价键的形式和膜脂质或蛋白质结合，形成糖脂和糖蛋白；这些糖链绝大多数是裸露在膜的外面（非细胞质）一侧的。（多糖-蛋白质复合物，细胞外壳cell coat）单糖排序上的特异性作为细胞或蛋白质的“标志、天线”—抗原决定簇（可识别，与递质、激素等结合。ABO血型物质即鞘氨醇上寡糖链不同。131AA+100糖残基）。 细胞膜的基本特征与功能 细胞膜把细胞包裹起来，使细胞能够保持相对的稳定性,维持正常的生命活动。此外，细胞所必需的养分的吸收和代谢产物的排出都要通过细胞膜。所以，细胞膜的这种选择性的让某些分子进入或排出细胞的特性，叫做选择渗透性。这是细胞膜最基本的一种功能。如果细胞丧失了这种功能，细胞就会死亡.。
提取蛋白的常规方法
1、原料的选择 早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。但至目前经 常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料， - 105 - 蛋白质提取与制备Protein Extraction and Preparation 因而对提取要求更复杂一些。 原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成 本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难，或含量 来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属 的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查 制备的难易情况。若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解 蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属 必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但 使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对 动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。 2、前处理 a、细胞的破碎 材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷 冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先 将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难 易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即 可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。 ⑴机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达 10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两 个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间
细胞膜的主要成分
试题： 细胞膜的主要成分是（）。 a．磷脂、蛋白质、糖类 c．脂质、蛋白质、无机盐 d．磷脂、蛋白质、核酸 答案：a 【相关阅读】 细胞膜(cellmembrane)又称细胞质膜（plasmamembrane），细胞表面的一层薄膜，有时称为细胞外膜或原生质膜。细胞膜位于细胞表面，厚度通常为7～8nm，由脂类和蛋白质组成。细胞膜的化学组成基本相同，主要由脂类、蛋白质和糖类组成。细胞膜是防止细胞外物质自由进入细胞的屏障，它保证了细胞内环境的相对稳定，使各种生化反应能够有序运行。 细胞膜的化学组成基本相同，主要由脂类、蛋白质和糖类组成。各成分含量分别约为50%、40%、2%~10%。其中，脂质的主要成分为磷脂和胆固醇。此外，细胞膜中还内含少量水分、无机盐与金属离子等。但是细胞务必与周围环境发生信息、物质与能量的交换，才能完成特定的生理功能，因此细胞务必具备一套物质转运体系，用来获得所需物质和排出代谢废物。据估计细胞膜上与物质转运有关的蛋白占核基因编码蛋白的15~30%，细胞用在物质转运方面的能量达细胞总消耗能量的三分之二。 原始生命向细胞进化所获得的重要形态特征之一，是生命物质外面出现了一层膜性结构，即细胞膜。它最重要的特性是半透性，或称选取透过性，对进出入细胞的物质有很强的选取透过性。细胞膜和细胞内膜系统总称为生物膜（biomembrane），具有相同的基本结构特征。 细胞膜又称质膜（plasmalemma），是位于原生质体外围、紧贴细胞壁的膜结构，作
用是保护内部。组成质膜的主要物质是蛋白质和脂类，以及少量的多糖、微量的核酸、金属离子和水。在电子显微镜下，用四氧化锇固定的细胞膜具有明显的暗-明-暗三条平行的带，其内、外两层暗带由蛋白质分子组成，中间一层明带由双层脂类分子组成，三者的厚度分别约为2。5nm、3。5nm和2。5nm，这样的膜称为单位膜（unitmembrane）或生物膜（biomembrane）。
P0033 细胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒
细胞膜蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒 产品简介： 碧云天的细胞膜蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(Membrane and Cytosol Protein Extraction Kit)提供了一种比较简单、方便地从培养细胞或组织中抽提细胞膜蛋白和细胞浆蛋白的方法。抽提的膜蛋白不仅包括质膜上的膜蛋白，也包括线粒体膜、内质网膜和高尔基体膜等上的膜蛋白。 本试剂盒通过匀浆适度破碎细胞，经低速离心去除细胞核和少数未破碎的细胞产生的沉淀，随后取上清高速离心获得细胞膜沉淀和含有细胞浆蛋白的上清，然后通过优化的膜蛋白抽提试剂从沉淀中抽提获取膜蛋白。 约90分钟即可完成培养细胞或组织的细胞膜蛋白与细胞浆蛋白的分离和抽提。抽提得到的蛋白可以用于SDS-PAGE，Western、酶活性测定等后续实验。 膜蛋白抽提试剂中含有蛋白酶抑制剂、磷酸酯酶抑制剂和EDTA等，后续不适合用于蛋白酶、磷酸酯酶等受这些抑制剂影响的酶的活性测定，但抽提获得的膜蛋白或细胞浆蛋白适合用于检测蛋白的磷酸化水平。 本试剂盒按照本说明书的操作步骤可以抽提100个细胞或组织样品。 保存条件： -20℃保存，一年有效。 注意事项： 需自备PMSF。PMSF一定要在抽提试剂加入到样品中前2-3分钟内加入，以免PMSF在水溶液中很快失效。 PMSF(ST506)可以向碧云天订购。 使用本试剂盒抽提到的细胞膜蛋白与细胞浆蛋白均可直接用碧云天生产的BCA法蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)测定蛋白浓度。抽提获得的细胞膜蛋白不适合用Bradford法测定蛋白浓度。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 使用说明： 1.准备试剂：室温融解并混匀膜蛋白抽提试剂A和B，融解后立即置于冰浴上。取适量的膜蛋白抽提试剂A和B备用，在 使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。 2.准备细胞或组织样品： a. 对于细胞 (1) 收集细胞 对于贴壁细胞：培养约2000-5000万细胞，用PBS洗一遍，用细胞刮子刮下细胞或用含有EDTA但不含胰酶的细胞消化液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞，吸除上清，留下细胞沉淀备用。尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的膜蛋白。 对于悬浮细胞：培养约2000-5000万细胞，直接离心收集细胞，吸除上清，留下细胞沉淀备用。 (2) 洗涤细胞：用适量冰浴预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀，取少量细胞用于计数，剩余细胞4℃，600g离心5分钟沉淀 细胞。弃上清，随后4℃，600g离心1分钟，以沉淀离心管管壁上的残留液体并进一步沉淀细胞，尽最大努力吸尽残留液体。 (3) 细胞预处理：把1毫升临用前添加了PMSF的膜蛋白抽提试剂A加入至2000-5000万细胞中，轻轻并充分悬浮细胞， 冰浴放置10-15分钟。 b. 对于组织： 取约100毫克组织，用剪刀尽量小心剪切成细小的组织碎片。加入1毫升临用前添加了PMSF的膜蛋白抽提试剂A，轻轻悬浮组织碎片，冰浴放置10-15分钟。注：如果组织样品比较少，也可以使用更少的组织量，例如30-50mg，后续试剂的用量及操作步骤不变；组织用量较少时，最后获得的膜蛋白也较少。
第二章细胞膜 蛋白质 知识点
3月10日复习题 1、细胞膜的三大主要成分？（脂质、蛋白质、糖类） 2、三大物质谁占的比重最多？（蛋白质） 解析：在细胞膜内蛋白质占比55%，磷脂战脂质的70%。 3、蛋白质功能？（传递物质、传递信息、能量转化） 4、细胞膜外表面糖链可作为 A、离子通道 B、抗原决定簇 C、膜受体可识别部分 D、糖跨膜转运载体 5、氧气肺泡进入血液的方式？ A、易化扩散 B、主动转运 C、两者都是 D、两者都不是 6、氧气和氨气在体内跨细胞膜转运的方式？ A、单纯扩散 B、易化扩散 C、胞吞或胞吐 D、原发性主动转运 E、继发性主动转运 7、肾小管上皮细胞分泌氨需要？ A、钠泵 B、载体 C、两者皆是 D、两者皆不是 8、什么分子可以单纯扩散？（水、乙醇、尿素、气体、脂溶性物质等） 9、什么物质通过通道扩散？（带电离子） 10、钠离子的转运方式？（易化扩散和主动转运） 11、葡萄糖从血液进入脑细胞是那种方式？（易化扩散） 12、葡萄糖跨肠上皮刷状缘进入细胞的模式？ A、单纯扩散 B、易化扩散 C、原发性主动运输 D、继发性主动运输 解析：一般的葡萄糖从血液、或者细胞外液进入细胞都是顺浓度，故是易化扩散，从肠腔进入上皮细胞则是逆浓度，故是继发性主动运输。上皮细胞常常是逆浓度的。 14、饱和现象会出现在具有载体也就是蛋白质存在的转运中，但通道的易化扩散不会有饱和现象出现。 15、钠钾泵是3个钠离子出，2个钾离子进。意义是？ 1）、细胞内高钾，维持生理 2）、细胞外高钠，维持体积 3）、形成电势差
16、细胞膜内外钠离子和钾离子浓度差的形成和维持是由于？ A、膜在安静时钾离子通透性大 B、膜在兴奋时钠离子通透性增加 C、钠离子和钾离子易化扩散的结果 D、膜上钠钾泵的作用 E、膜上ATP的作用
第四章 细胞膜与细胞表面
第四章细胞膜与细胞表面 填空题 1.生物膜上的磷脂主要包括。 2.膜蛋白可以分为和。 3.生物膜的基本特征是。 4.内在蛋白与膜结合的主要方式、离子键作用和共价键结合。 5.真核细胞的鞭毛由蛋白组成，而细菌鞭毛主要由蛋白组成。 6.细胞连接可分为、、。 7.锚定连接的主要方式有和。 8.锚定连接中桥粒连接的是骨架系统中的，而粘着带连接的是。 9.组成氨基聚糖的重复二糖单位是。 10.细胞外基质的基本成分主要有、、和、和等。 11.植物细胞壁的主要成分是、、、和等。 12.植物细胞之间通过相互连接，完成细胞间的通讯联络。 13.通讯连接的主要方式有、、。 14.细胞表面形成的特化结构有、、、、等。 15.统成为生物膜，他们具有共同的结构特征，又称为质膜。 16.流动镶嵌模型强调生物膜的主要基本特征是。 17.膜脂主要的3种类型是、、。 18.根据膜蛋白分离的难易及其与脂分子的结合方式分 为、两种。 1.瞄定连接中，桥粒与半桥粒与细胞骨架系统中的连接，而粘着带 与粘着斑与连接。 2.通信连接的主要方式、、。 3.在蛋白质的肽序列中有三种信号：。 4.紧密连接除了其连接作用外，还具有另外两个功 能： 。 5.连接子的功能除了有机械连接作用外，还有、。 6.蛋白聚糖由的主干和的侧链所组成。 7.原胶原的一级结构中具有的短肽重复序列。 8.纤连蛋白有与和连接的位点，其作用是介导细胞外基质骨 架与膜受体相连。
9.前原胶原是在上合成的，靠N端的信号肽进行转运。 10.在细胞外基质中，透明质酸具有的能力，而胶原纤维使组织具有的 能力。 11.构成胶原亚单位的是，有三条а肽链所组成。 12.在细胞外基质中，透明质酸既能参与蛋白聚糖的形成，又能游离存在。在 软骨组织的细胞外基质中，透明质酸与糖胺聚糖和核心蛋白组成软骨组织的蛋白聚糖复合物，称为。在这种复合物中，透明质酸作为一个长轴，将连接在一起，形成更大的更复杂的蛋白聚糖，使细胞外基质具有更大的抗压性。透明质酸是一种重要的，是增值细胞和迁移细胞的细胞外基质的主要成分，一旦细胞外基质细胞停止移动，透明质酸就会从中消失，此时细胞间开始接触。 选择题 1.由微管组成的细胞表面特化结构是 a 鞭毛 b 微绒毛 c 伪足 1.由微丝组成的细胞表面特化结构是 a 鞭毛 b 纤毛 c 伪足 1.植物的胞间连丝属于哪一种细胞连接方式 a 封闭连接 b 锚定连接 c通讯连接 d都不是 1.细胞粘附分子 A.都是跨膜糖蛋白 B.多为单次跨膜蛋白 C.都依赖钙离子 D.胞外区为肽链的N端部分，带有糖链，负责与配体的识别 E.胞质区为肽链的C端部分，与质膜下的骨架成分直接相连 2.紧密连接存在于 A.神经细胞间 B.肌肉细胞间 C.上皮细胞间 3.跨膜蛋白属于 A.整合蛋白（integral protein） B.外周蛋白（peripheral protein） C.脂锚定蛋白（lipid-anchored protein）
植物膜蛋白提取方法的研究(2D电泳用)
植物膜蛋白提取试剂盒（2D电泳用） 货号：BB-31841 V2.16 试剂盒组成： 产品组成 BB-31841-1 BB-31841-2 组份编号 规格 50T 100T 试剂A：植物膜蛋白提取液A 25ml 50ml 31841A 试剂B：植物膜蛋白提取液B 250ul 500ul 31841B 试剂C：膜蛋白溶解液C 10ml 20ml 31841C 试剂D：蛋白酶抑制剂混合物 100ul 200ul 31841D 使用说明书 1 1 知识产权： 贝博TM BBproExtra TM试剂盒及其使用方法包含专有技术。 产品简介： 膜蛋白承担各种生物功能，扮演重要角色。膜蛋白样品的制备需要充分考虑到与下游的胶分析及质谱分析等应用配套，因此膜蛋白样本制备成为一个难以逾越的挑战。传统制备膜蛋白样品的方法是使用去污剂和表面活性剂增溶。去污剂处理会使膜蛋白丧失其天然结构，因而妨碍了膜蛋白的功能研究。 贝博TM BBproExtra TM植物膜蛋白提取试剂盒（二维电泳用）是一种基于化学方法的高产膜蛋白提取试剂盒。植物膜蛋白提取试剂盒可以从各种植物中提取膜蛋白，可用于纯化膜蛋白的粗品制备及膜蛋白制备。提取过程简单方便。该试剂盒含有蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高质量的蛋白提供了保证。 本试剂盒提取的蛋白用于双向电泳。如需要用于报告基因检测、SDS-PAGE电泳检测、Western blotting、凝胶阻滞实验、免疫共沉淀、酶活分析等下游实验的试剂盒，请联系贝博，选用其它产品号的产品。 使用方法： 1、试剂准备： 每500ul膜提取液A中加入2ul蛋白酶抑制剂混合物，充分混匀后置冰上备用。 2、取洗净擦干后并去除叶梗和粗脉的200mg植物组织样本用手术剪刀尽可能剪碎，加 入500ul提取液A，用组织匀浆机/匀浆器充分匀浆。 3、匀浆或研磨后加入500ul提取液A，混匀后于一个干净离心管中在2-8℃振荡1小时。 4、将提取液在2-8℃条件下12000g离心5分钟，取上清。 5、在上清中加入5ul提取液B，充分混匀。 6、在37℃水浴10分钟。 7、在37℃ 1000g离心3分钟。 8、此时液体分为2层，小心移除上层部分，吸取下层管底部大约50ul液体。 9、用50-150μl冷的膜蛋白溶解液C溶解下层溶液，即得膜蛋白样品。
细胞膜的结构和功能
一、细胞膜的结构和功能 （一）基础扫描 1、生物体结构和功能的基本单位是，阐明细胞是一切动植物生命活动的基本单位的理论观点是。判断：细胞是生物体结构和功能的基本单位（） 细胞是一切生物体结构和功能的基本单位（）细胞是一切动植物结构和功能的基本单位（）2、细胞的原核细胞：没有，如、细菌、蓝藻、放线菌 类型真核细胞：有，如绝大多数生物（酵母菌、衣藻、草履虫、变形虫）判断：①成熟的哺乳动物的红细胞，因为没有细胞核，所以是原核细胞（） ②生物界可能存在这样的生物：体内既有原核细胞，又有真核细胞（） 3、细胞膜的成分：含有、和，其中，和是主要成分 4、细胞膜的分子结构：层磷脂分子形成磷脂双分子层，是细胞膜的基本支架（磷脂分子的头部是的，因此在表面；尾部是的，因此在中间）；蛋白质以不同深度结合在磷脂双分子层上。 5、细胞膜的膜外结构：糖被（由组成），消化道和呼吸道上皮细胞表面的糖被有 和作用；糖被还与有关。（请课后试绘：细胞膜结构模式图）结构特点是：构成细胞膜的磷脂和蛋白质分子不是静止的，而是流动的6、细胞膜生理特性是：即水分子能自由通过（自由扩散）、细胞要选择吸收的离 的特点子（主动运输）、小分子（O2、CO2、甘油、乙醇、苯是自由扩散，葡萄糖除 进入红细胞以外是主动运输，氨基酸是主动运输）也可以通过，而其他的 离子、小分子、大分子则不能通过（指细胞膜总量不变的情况下） 7、细胞壁：在植物细胞外表面有一层细胞壁，主要成分是和，起支持和保护作用，是全透性结构；一般的原核细胞的表面也有一层细胞壁，主要成分是。 判断：在由细胞构成的生物中，只有人和动物的细胞外面才没有细胞壁（） 8、细菌细胞的基本结构有：、、、 细菌细胞的特殊结构有：、、
膜蛋白的提取方法-全攻略
https://www.sodocs.net/doc/9a1560904.html, 膜蛋白的提取方法-全攻略 一、膜蛋白简介 膜蛋白在细胞中扮演着重要的角色：例如被熟知的识别、信号转导、运输等功能，也是用药的理想的靶点，虽动物细胞主要有9种膜脂，而膜蛋白的种类繁多，多数膜蛋白分子数目较少，但却赋予细胞膜非常重要的生物学功能。 根据膜蛋白分离的难易及其与脂分子的结合方式，膜蛋白可分为两大类型：外在膜蛋白、内在膜蛋白。 (1) 外在膜蛋白为水溶性蛋白，靠离子键或其它较弱的键与膜表面的蛋白质分子或脂分子结合，因此只要改变溶液的离子强度甚至提高温度就可以从膜上分离下来，膜结构并不被破坏。 (2) 内在膜蛋白与膜结合非常紧密，一般只有用去垢剂(detergent)使其膜解后才可分离出来。 附注：使用分级抽提方法获得的“膜蛋白”中只有很少一部分是具备多跨膜区的整合膜蛋白。 二、膜蛋白的提取方法 谈及蛋白分离，我们想到：超速离心，盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法……有时这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化。由于蛋白质种类繁多，不同的蛋白质由于结构和组成的差异，其溶解
https://www.sodocs.net/doc/9a1560904.html, 度也各不相同.根据蛋白质的溶解特性，同时可选择不同的溶剂提取，分为水溶液提取和有机溶剂提取. 但是与胞质蛋白，核蛋白提取不同之处在于膜蛋白是嵌在膜中的，水溶性不好，基本方法就是用不同的离心速度去掉胞质蛋白等，然后用去污剂把蛋白从膜中释放出来。膜蛋白分离纯化的重要步骤是选择适当的增溶用表面活性剂，一般常用的有胆酸盐，CHAPS(一种离子去污剂），Emulgen和Lubrol等表面活性剂。 1）先分离膜，然后提取；如选用冷热交替法、反复冻融法、超声破碎法、玻璃匀浆法、自溶法和酶处理法使得细胞破碎，然后通过梯度离心得到含有膜蛋白的粗组分。（例如：用液氮研磨组织，加入匀浆缓冲液及蛋白酶抑制剂，然后差速离心、蔗糖密度梯度离心。收集37%与41%间的成分，即为质膜部分。裂解即可收集膜蛋白） 2）用特殊的去污剂选择性的分离。从膜上提取蛋白有许多困难。在多数情况下，都是采用去垢剂将疏水蛋白从其膜结构中溶解下来，然后将蛋白质稳定。去垢剂的选择通常是依据他对所需要蛋白质的提取效率来确定，但在某些情况下，还要考虑到以后的纯化步骤。虽然许多膜蛋白必须在去垢剂存在的情况下进行纯化，但最终仍可能需要除去去垢剂。这常常会引起蛋白质失活，但如果蛋白质是用于测序的，他将不是一个问题。如果不是用于测序的，可考虑使用能够黏附去垢剂的疏水珠.许多文献和生化试剂供应商的产品目录中，都介绍有许多种不同的可用来溶解膜蛋白的去垢剂.然而，他们并不是普遍适用的.在设计膜蛋白溶解方案时，必须考虑某一去垢剂的特殊性质.如 triton X-100在280nm处有吸收，如果某蛋白质的测试与280nm 处的吸收有关，就应避免使用这类去垢剂. 将膜制剂与胞质蛋白及细胞核分离后，再进一步从细胞膜制剂中将所需的膜蛋白增溶下来.这种做法的好处是可以用强烈的去垢剂提取细胞骨架的相关蛋白，而无需考虑胞质蛋白、细胞核成分或染色质成分的混入.使用这种方法所获得的膜蛋白，无论在种类上还是数量上，都比酸溶解法所得到的蛋白（<5000Da）要多.一般提取的膜蛋白量往往只占膜蛋白总量的不足0.1%，所以充分的膜蛋白的提取，无疑对于研究膜蛋白的结构和功能都是非常重要的. 酸溶解法简单，可靠，但有时含有其他蛋白。一般的都是利用4℃时所有的蛋白质原则上都溶于Triton X-114水溶液，在温度超过20℃时，此溶液分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中。利用此性质可提取膜蛋白。 3 )膜蛋白色谱(Chromatography of Membrane Protein,CMP)：CMP分离强疏水性蛋白、多肽混合物的层析系统，一般有去垢剂（如SDS）溶解膜蛋白后形成SDS-融膜蛋白，并由羟基磷灰石为固定相的柱子分离纯化。羟基磷灰石柱具有阴离子磷酸基团（P-端），又具有阳离子钙（C-端），与固定相结合主要决定于膜蛋白的大小、SDS结合量。利用原子散射法研究cAMP的
western膜蛋白的提取
分离膜蛋白的方法有两种：1先分离膜，然后提取；2用特殊的去污剂选择性的分离。第二种方法简单，可靠，但有时含有其他蛋白。 原理：4度时所有的蛋白质原则上都溶于TritonX114水溶液，但在37度时，此溶液分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中。 方案 1）放射性标记受试细胞 2）将标记的细胞放在冰上 3）去除上清，用pH7。4的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞两次 4）加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min 5)刮下单层细胞，4度下10 000g 5min离心 6）溶液37度水浴10min以分离水相和去污剂相，然后37度下2 000g离心5min 7)收集水相留作分析 8）用500ul冰冷的buffer C溶解去污剂相沉淀，冰浴2min后加温，在按步骤6再次离心 9）按步骤8再次抽提去污剂相，用buffer C将洗涤后的去污剂相稀释到初始体积 10）用等量的buffer A分别稀释水相与去污相，并进行免疫沉淀实验 试剂： 1）2%tritonX114:2%TritonX114、50mmol/L Tris HCl（pH7。5）、蛋白酶抑制剂 2）缓冲液A（含0。5mol/LNaCl的RIPA buffer) 3)buffer C 10mmol/L Tris HCl(pH7.5) 150mmol/L NaCl 5mmol/L EDTA(PH7.5) 这是我在nwfsc上求助膜蛋白提取时别人发给我的email，其实膜蛋白的提取的方法依据膜蛋白的不同类型方法也不一样。是组织还是细胞，细胞膜膜结合蛋白还是细胞器结构膜蛋白，如果是细胞的话建议你买个膜蛋白抽提试剂盒吧。 I'll give you these protocols that I use. The first is for isolation of mitochondria from liver and the other is for the isolation of membrane proteins. Both of these are specific to my needs and you will want to optimise them for your own needs. For the isolation of membrane proteins you will need to find references for your specific protein. The buffers and conditions that I use will not be suitable for all proteins. Isolation of mitochondria (adapted from O'Gorman et al. FEBS Lett. 414 (1997) 253-257) Isolation buffer: Mannitol 200mM Sucrose 70mM HEPES 2mM EDTA 0.5mM BSA 0.5mM pH 7.4 Wash buffer: Mannitol 200mM Sucrose 70mM HEPES 2mM pH 7 All experimental work is carried out at 4degC and in the presence of 500uM PMSF. (the PMSF can be substituted for AEBSF but one or the other must be used)Liver is removed from Wistar rat and placed in cold isolation buffer. the liver is cut up into 4x2g pieces. Each piece is placed in
膜蛋白抽提
二、蛋白抽提 谈及蛋白分离，我们想到：超速离心，盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法……有时这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化。由于蛋白质种类繁多，不同的蛋白质由于结构和组成的差异，其溶解度也各不相同.根据蛋白质的溶解特性，同时可选择不同的溶剂提取，分为水溶液提取和有机溶剂提取. 但是针对膜蛋白的提取与细胞质蛋白，核蛋白提取不同之处在于它是嵌在膜中的，水溶性不好，基本方法就是用不同的离心速度去掉胞质蛋白等，最后用去污剂把蛋白从膜中释放出来。膜蛋白分离纯化的重要步骤是选择适当的增溶用表面活性剂，一般常用的有胆酸盐，CHAPS(一种离子去污剂），Emulgen和Lubrol 等表面活性剂。 1、分离膜蛋白的方法（原则性）： 1）先分离膜，然后提取；如选用冷热交替法、反复冻融法、超声破碎法、玻璃匀浆法、自溶法和酶处理法使得细胞破碎，然后通过剃度离心得到含有膜蛋白的粗组分。（例如：michael11液氮研磨组织，加入匀浆缓冲液及蛋白酶抑制剂。差速离心。蔗糖密度梯度离心。收集37%与41%间的成分，即为质膜部分。裂解即可收集膜蛋白） 2 ）用特殊的去污剂选择性的分离。从膜上提取蛋白有许多困难.在多数情况下，都是采用去垢剂将疏水蛋白从其膜结构中溶解下来，然后将蛋白质稳定.去垢剂的选择通常是依据他对所需要蛋白质的提取效率来确定，但在某些情况下，还要考虑到以后的纯化步骤.虽然许多膜蛋白必须在去垢剂存在的情况下进行纯化，但最终仍可能需要除去去垢剂.这常常会引起蛋白质失活，但如果蛋白质是用于测序的，他将不是一个问题.如果不是用于测序的，可考虑使用能够黏附去垢剂的疏水珠.许多文献和生化试剂供应商的产品目录中，都介绍有许多种不同的可用来溶解膜蛋白的去垢剂.然而，他们并不是普遍适用的.在设计膜蛋白溶解方案时，必须考虑某一去垢剂的特殊性质.如triton X-100在280nm处有吸收，如果某蛋白质的测试与280nm处的吸收有关，就应避免使用这类去垢剂. 将膜制剂与胞质蛋白及细胞核分离后，再进一步从细胞膜制剂中将所需的膜蛋白增溶下来.这种做法的好处是可以用强烈的去垢剂提取细胞骨架的相关蛋白，而无需考虑胞质蛋白、细胞核成分或染色质成分的混入.使用这种方法所获得的膜蛋白，无论在种类上还是数量上，都比酸溶解法所得到的蛋白（<5000Da）要多.一般提取的膜蛋白量往往只占膜蛋白总量的不足0.1%，所以充分的膜蛋白的提取，无疑对于研究膜蛋白的结构和功能都是非常重要的. 第二种方法简单，可靠，但有时含有其他蛋白。一般的都是利用4度时所有的蛋白质原则上都溶于TritonX114水溶液，在温度超过20度时，此溶液分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中。利用此性质可提取膜蛋白。 3 )膜蛋白色谱(Chromatography of Membrane Protein,CMP)CMP+分离强疏水性蛋白、多肽混合物的层析系统，一般有去垢剂（如SDS）溶解膜蛋白后形成SDS-融膜蛋白，并由羟基磷灰石为固定相的柱子分离纯化。羟基磷灰石柱具有阴离子磷酸基团（P-端），又具有阳离子钙（C-端），与固定相结合主要决定于膜蛋白的大小、SDS结合量有关。利用原子散射法研究cAMP的分离机制发现，样品与SDS结合后在离子交换柱上存在SDS分子、带电荷氨基酸与固定相中带电离子间的交换，从而达到分级分离的目的。 层析柱提取https://www.sodocs.net/doc/9a1560904.html,/ （参步骤） 4) 顺序抽提法：根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液进行抽提的方法。用Tris 碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；把未溶解的pellet用标准液溶解提取高疏水性蛋白；最后用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后可以再次抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白。 5)centrifugal protein extraction 原理：高渗的蛋白裂解液让细胞溶涨破裂后，超高速离心 评价：尽管分级(胞浆和胞膜)之间有清洗的步骤,但是可溶蛋白组分和膜蛋白组分之间仍然有不少重复的点.该方法相较MOLLOY MP教授在1998年electrophoresis上发表的分级抽提法减去了第一步(用tris抽提水溶性蛋白)和最后一步(极难溶蛋白),在操作上也作了简化,总而言之是一种不错的方法。（codegreen）
细胞膜的结构和功能 教案
细胞膜的结构和功能教案 一、知识结构 二、教学目标 (1)细胞膜的分子结构(D:应用)。 (2)细胞膜的主要功能(D:应用)。 三、重点、难点 (1)重点:①细胞膜的分子结构；②细胞膜的主要功能。 (2)难点:细胞膜内外物质交换的主动运输方式。 四、教学程序 在初中阶段的学习中，我们学习了植物和动物的细胞结构。请同学们回顾一下，植物细胞和动物细胞各有哪些结构?(对这一问题，学生基本上可以回答正确。)现在我们又要学习细胞的结构和功能，高中阶段学习的细胞结构和功能是学习细胞的亚显微结构，亚显微结构是指在电子显微镜下观察到的微小结构，观察到的结构直径在0.2mm以下。这样我们可以看到细胞膜的结构组成，可以看到细胞质和细胞核中还有许多具有一定结构特征的物体，它们都有自己的生理功能。(展示动、植物细胞的亚显微结构示意图像，简单介绍图像中结构。) 从动、植物细胞的亚显微结构可以观察到，动、植物细胞结构不尽相同，它们有哪些不同?(引导学生观察动、植物细胞亚星微结构图，回答问题。) 在植物细胞最外层有一层细胞壁：它的化学成份主要是纤维素和果胶，对于物质的通透属于全透性的；它的主要功能是具有支持和保护的作用。 动、植物细胞外都有一层细胞膜：细胞借以细胞膜和外界环境分开，使细胞内部环境保持相对稳定。细胞膜有什么样的分子结构，它有什么生理功能呢?这是本次课学习的主要内容。 一、细胞膜的分子结构 经科学家研究分析，细胞膜是由蛋白质和磷脂分子组成。磷脂分子具有一个环状的头部和两条长链组成的尾部。(展示一个磷脂分子的结构简图，说明亲水的环状端和疏水的长链端。) 由于一个磷脂分子具有亲水端和疏水端，这样使磷脂分子在水溶液中能形成磷脂双分子层。磷脂双分子层的外侧(上、下或左右)为环状的亲水端，中间为两长链的疏水端。 磷脂双分子层组成细胞膜的中层，形成细胞膜的基本骨架，磷脂双分子层的两侧布满蛋白质分子，有的蛋白质游离表面，有的蛋白质镶嵌在磷脂双分子层之中，有的蛋白质贯穿磷脂分子的双分子层。(展示细胞膜的分子结构示意图像。) 科学家曾经做过一个人体细胞的融合实验：他将人体的某种细胞进行离体培养，再将红色萤光染料和绿色萤光染料分别对两个细胞染色，一个细胞染上红色，另一个细胞染上绿色。再用灭活的病毒(仙台病毒)来影响这两个细胞，使这两个细胞发生融合。在显微镜下观察其融合的过程，发现融合初期，细胞一边为红色，另一边为绿色，40min后观察发现红、绿细胞膜相互渗透，形成红、绿相间斑马状；再过40min后观察，发现细胞膜上红、绿较均匀分布。 这个实验充分说明细胞膜是可以流动的，组成细胞膜的蛋白质分子和磷脂分子都在不断的变化，这是细胞膜的结构特点：具有一定的流动性。 细胞膜的这一结构特点，对完成细胞膜的生理功能有重要作用。 在细胞膜的外表面还有一些多糖分子和细胞膜上蛋白质结合的糖蛋白，称为糖被。 请同学们思考细胞膜有什么生理功能(估计学生会回答具有保护的作用，这时应用过去学习过的知识，例如草履虫皮膜有什么作用，启发学生回答细胞膜具有控制物质交换的作用等。) 二、细胞膜的生理功能 细胞膜是具有许多重要功能的结构，这些功能可以归纳成两个大方面:一具有保护的功能，包括保护、支持、识别、免疫；二是具有控制物质进出细胞的功能，包括吸收、分泌、排泄。
蛋白质的提取
6)detergent- based：提取时先裂解液裂胞膜（选用不同的去污试剂是要害），梯度离心分离细胞器(ER)，然后分级抽提方法。例如，去掉细胞器之后的DEBRIS就是核膜，再裂解得到核膜蛋白。而膜蛋白是裂胞膜时不溶的部分。 总的感受：细胞的量要很充足。之后的定性鉴定常用的方法有双向免疫扩散、免疫电泳及聚丙稀酰胺凝胶电泳等。纯化蛋白质浓度的定量测定可用双缩脲法、酚试剂法或紫外光吸收法定量鉴定膜蛋白，方便迅速。 到目前为止，提取膜蛋白仍然是蛋白学的一个瓶颈。 2、分离膜蛋白的方法（操作） 1）分离细胞膜蛋白的方法： 1 冰上刮下细胞后将细胞溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液A中，于室温与液氮罐中反复冻融2次。 2 5000转4度离心，驱除核及未裂解的细胞。 3 取上清12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液B中。 4 12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液C中提取后测蛋白浓度,SDS-PAGE电泳，分装后-20度保存备用。 buffer A : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4) buffer B : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4) 1mM EGTA buffer C : 0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf,50mMTris-cl(PH=7.0), 2）分离细胞膜蛋白的方法： 1、细胞放在冰上，去除上清，用pH7。4的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞两次 2、加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min 3、刮下单层细胞，4度下10 000g 5min离心 4、溶液37度水浴10min以分离水相和去污剂相，然后37度下2 000g离心5min 5、收集水相留作分析 6、用500ul冰冷的buffer C溶解去污剂相沉淀，冰浴2min后加温，在按步骤6再次离心 7、按步骤8再次抽提去污剂相，用buffer C将洗涤后的去污剂相稀释到初始体积 8、用等量的buffer A分别稀释水相与去污相，并进行免疫沉淀实验 试剂： 1、2%tritonX114:2%TritonX114、50mmol/L Tris HCl（pH7。5）、蛋白酶抑制剂 2、缓冲液A（含0。5mol/LNaCl的RIPA buffer） 3、buffer C 10mmol/L Tris HCl(pH7.5) 150mmol/L NaCl 5mmol/L EDTA(PH7.5) 3）分离细胞膜蛋白的方法： 7M urea 2M thiourea 4%chaps