葡萄糖转运载体测定方法

一.刷状缘膜囊的制备：（方法参照Kessler(1978),Shirazi-Beechey(1991)和Bauer （2001b）修正）

所有操作过程需在冰上或者4℃下进行。将冷冻样品进行称重，并在冷烧杯中用缓冲剂（100mM 甘露醇，2mM HEPES/Tris 缓冲剂，pH7.1）解冻。解冻后，在冷的有盖培养皿中用剪刀和镊子将组织样剪为1cm小块，将小块组织样重放入冷烧杯，然后将组织块悬液振动2次(设定为No.80)，每次一分钟。用布氏漏斗过滤振动后溶液，溶液转入250mL量筒，记录滤液体积后转移至400mL烧杯中。将烧杯放置冰上，搅拌溶液。制作多个平行样以备进一步分析，这些处理后样品为匀浆液。已知浓度的氯化镁溶液加入到匀浆液中以达到10mM的终浓度，温和搅拌溶液20分钟，然后进行两种离心：5min，3000*g；30min，30000*g。利用20-G型检测针对剩余的颗粒进行再悬浮，缓冲液为100mM甘露醇+20mM HEPES/Tris，pH7.5。悬浮颗粒在组织研磨机（Potter-Elvehjam; Teflon/glass）中均匀搅拌十次后在30000*g离心30min。最终颗粒用23-G型检测针在500μL缓冲液中（300mM甘露醇，0.1mM硫酸镁，20mM HEPES/Tris，pH7.5）再次悬浮。悬浮颗粒（囊泡）由反复流过27-G型检测针10次的溶液制备均匀，避免出现气泡。将试样等分入冷冻管后-80℃保存。

二.检测

利用BSA(牛血清白蛋白)作为匀浆蛋白浓度和囊泡浓度的标准。麦芽糖酶是刷状缘膜富集度的标记酶，Truner 和Moran（1982）的方法测定麦芽糖酶活，使用25mM磷酸盐缓冲液（pH6.3）和30mM麦芽糖。释放的葡萄糖通过COBAS FaraⅡ（全自动生化仪）（Roche，Montclair，NJ）测定麦芽糖酶活表达为μmol product/min*mg of protein。囊泡中麦芽糖酶活的富集（enrichment）表示为囊泡麦芽糖酶活/匀浆麦芽糖酶活。

37℃下将5μL（50μg of protein）的小囊泡置于预热的微量离心管中，预热的培养基中包含100mM硫氰酸钠或硫氰酸钾、99.8mM甘露醇、20mM HEPES/Tris （pH7.5），再加入200μM葡萄糖（1.0μCi【U-14C】-D-glucose）。加入1mL冰冻终止溶液（150mL氯化钠，250μM根皮苷）3s后葡萄糖吸收被终止。移取0.9mL上述溶液，迅速通过0.45μm圆形纤维素薄膜。整个薄膜用终止溶液（5*1mL）清洗。将薄膜置于20mL 闪烁计数瓶中，瓶中加入12mL scintillation cocktail（Scintisafe Plus 50%LSC Cocktail）。样品通过Quantasmart软件用于放射性测定（闪仪Tri-Carb 2900TR/SL）。在Na+和K+存在的前提下，葡萄糖吸收的测定重复五次。钠依赖性葡萄糖的吸收通过硫氰酸钠孵化值减去硫氰酸钾孵化值得到。

三.免疫印迹

囊泡和匀浆液（40μg蛋白/道）在60℃下孵育，然后用7.5%的SDSPAGE分离。蛋白通过电转移至0.45μm的硝化纤维膜上，用固绿染色法（固绿染色液）使其显现出来（Fisher Scientific, Pittsburgh,PA）。为了指示刷状缘膜的纯度，连续用探针检测SGLT1，GLUT2和碱性磷酸酶。薄膜在封闭溶液中（2.3%康乃馨脱脂奶粉溶于30mM Tris碱，300mM NaCl，0.1%（vol/vol）吐温20，pH7.5）封闭1.5h。将薄膜置于迷你转迹机中，每个样品道的封闭液中放置50μL抗-SGLT1抗体（兔抗兔SGLT1；1：325稀释度；100μg/μL初始浓度），然后在摇床中室温杂交1h（摇床）。将薄膜浸在含有150μL封闭液迷你转迹机中，再将薄膜从迷你转迹机中取出，在封闭液中继续浸泡5min。辣根过氧化物酶共轭二抗（驴抗兔免疫球蛋白；1：5000稀释度）作用于每个薄膜样品各1h。将薄膜在封闭液中浸泡5次，每次5min，再在TBS/Tween20（30mM Tris base，300mM Nacl，0.1%【vol/vol】Tween20，pH7.5）中浸泡10分钟。对薄膜轻轻点样以除去多余水分，发光底物也通过blotted 处理5分钟。薄膜轻轻blotted，包在塑料包中，进行曝光，洗照片。准备下一个探针时，将薄膜在60℃溶液中进行水浴分带（69mM SDS，62mM Tris Base，7.8μL/mL β-巯基乙醇）。在探测GLUT2之前，需将样品在封闭液中封闭2h（2.5%康乃馨脱脂牛奶混于30mM Tris Base，150mM Nacl，pH7.5）。薄膜在含有50μL anti-GLUT2抗体（兔抗鼠GLUT2；1:165稀释度；100μg/μL初始浓度）的样品道中杂交1.5h。杂交完成后，每个薄膜浸泡于迷你转迹机中的240mL封闭液中。从迷你转迹机中取出后，薄膜在封闭液中浸泡3次，每次5分钟。辣根过氧化物酶共轭二抗（驴抗兔免疫球蛋白；1:5000稀释度）作用于每个样品各1.2h。剩余的清洗液和化学发光显影部分和SGLT1探测处理方法一样。显影后，将薄膜再次分条带。

探测碱性磷酸酶前将样品在封闭液中（2.0%脱脂牛奶混于10mM Tris Base，200mM Nacl，pH7.5）孵育1.5h。在不同管中薄膜与碱性磷酸酶抗体（小牛抗兔碱性磷酸酶，calf antirabbit；1:10000；10mg/mL初始浓度）杂交1h。杂交后，将薄膜在封闭液中浸泡5次，每次5min。辣根过氧化物酶共轭二抗（驴抗兔免疫球蛋白；1:5000稀释度）作用于每个样品各1h。剩余的清洗液和化学发光显影处理同SGLT1探测相同。

四.相关蛋白丰度及分子大小的测定：

扫描放射自显影的数字成像，并利用UN-SCANIT软件程序对光密度进行扫描和评估（方法参照Swanson，2000）。光密度值作为任意单位被报道，并用信号值减去放射自显影照片的一个平均背景值作为实际值。用每段肠道的匀浆信号值减去囊泡信号值，就可以得到SGLT1，GLUT2和碱性磷酸酶的富集值。通过利用十二指肠的光密度值减去各个肠段的光密度值，把用于评估整个肠道SGLT1丰度的光密度值标准化至十二指肠样品。SGLT1和GLUT2的表观位移权重通过对移动距离和已知Marker的位移进行回归得到，范围为184.5-9.1kDa（用标准点预染的蛋白梯）。

五.数据分析

囊泡和匀浆麦芽糖酶活性，麦芽糖酶丰度，SGLT1丰度，葡萄糖吸收值通过利用SAS的GLM程序进行裂区设计得到。整体设计模型是block（嵌段）和treatment（处理），整个设计的误差是block×treatment。裂区模型包括肠段和处理×肠段，用残差平方和作为误差。将肠道样品位置的一次和二次效应进行对照。肠道长度和重量通过嵌段和处理模型进行分析，模型用残差作为误差值。

SC-9117;SC-2317，wanghcang@https://www.sodocs.net/doc/491238586.html,

闪烁计数瓶：

液体闪烁计数所用的闪烁体是液态，即将闪烁体溶解在适当的溶液中，配制成为闪烁液，并将待测放射性物质放在闪烁液中进行测量。应用液体闪烁计数可达到4π立体角的优越几何测量条件，而且源的自吸收也可以忽略，对于能量低，射程短、易被空气和其它物质吸收的α射线和低能β射线（如3H和14C），有较高的探测效率，液体闪烁计数器是α射线和低能β射线的首选测量仪器。

1.探测机理

闪烁液产生光子的过程是，从放射源发出的射线能理，首先被溶剂分子吸收，使溶剂分子激发。这种激发能量在溶剂内传播时，即传递给闪烁体（溶质），引起闪烁体分子的激发，当闪烁体分子回到基态时就发射出光子，该光子透过透明的闪闪烁液及样品的瓶壁，被光电倍增管的光阴极接收，继而产生光电子并通过光电倍增管的倍增管的位增极放大，然后被阳极接收形成电脉冲，完成了放射能→光能→电能的转换。

2.闪烁液

液体闪烁计数系统作用的闪烁溶液，是指闪烁瓶中除放射性被测样品之外的其它组分，主要是有机溶剂和溶质（闪烁体），有时为了样品的制备或提高计数效率的需要，还加入其它添加剂。⑴溶剂：从β源放射β射线到发射能被肖阴极接收的光妇的这一系列能量转移环节中，能量转移效率是很低的，只有少部分放射能量被利用来发射光子，其中放射源与溶剂之间，能量转移效率大约为5￣10％。对溶剂的选择，主要视其对闪烁体的溶介度和将放射能转移给闪烁体的效率而定。如果以一定浓度的闪烁体在甲苯溶液中产生的脉冲高度为100％，那么，凡能产生80％以上的脉冲高度的都定为溶剂，能使脉冲高度随其浓度上升而逐渐减小的称为稀释液，而在浓度很低时就能引起脉冲高度显著下降的叫淬灭剂。在液体闪烁计数系统中，一个好的溶剂应满足下列条件：①对闪烁体的溶介度高；②对放射源的转移效率高；③对闪烁发射的光子透明度高；④在无论有无助溶剂的帮助下都可以溶介放射性样品；⑤在计数器的工作

温度下来结冰；⑥能够形成均相的测量溶液。一般认为，烷基苯是最好的溶剂，如甲苯，二甲苯。此外，苯甲醚也是比较好的溶剂。另外，对于含水量较多的样品，采用1，4－二氧不作为溶剂，因为该有机化合物的极性较大，既能很好地溶介闪烁体又可溶介含水量较多的样品，能改善计数效率，缺点是价格昂贵，冰点高，久放后产生淬灭作用很强的过氧化物，必须经纯化才能使用，并应加入 0.001％的二乙基二硫代氨基甲酸钠或丁基氢氧基甲苯（BHT），以抑制纯化的二氧六环变质。溶剂在闪烁溶液中约占99％，因此，它的纯度对闪烁液的品质是很大的影响因素。溶剂中不发光的杂质、氧和水的含量多少，都关系到淬灭程度。原则上讲，溶剂应具有闪烁纯，即不含或很少含有影响闪烁计数的淬灭成分。实际证明，“分析纯”试剂可以不经纯化而直接使用。

⑵闪烁液：在液体闪烁计数系统中，闪烁体又称荧光体，是闪烁液的溶质，它的很多，根据其荧光特性及作用，可分为两类，即第一闪烁和第二闪烁体。

①第一闪烁体：（初级闪烁体）：常用的第一闪烁体：对联三苯（TP）：化学结构它是最早使用的闪烁体之一。它的计数率高，价格比较便宜，但是，在低温或含水溶液介度不高。2,5－二苯恶唑（PPO）：化学结构它是目前普遍使用的闪烁体，能很好地溶介在常用的溶剂中，在含水的情况下也是如此，在甲苯中的溶介度达200克／升以上。它的化学性质稳定，价格也较便宜。但是，它的最大缺点是有明显的浓度淬灭（自身淬灭），即随着PPO在溶剂中的浓度升高，计数效率下降。2-苯基－5－（4-二苯基）－1,3,4恶唑（PBD）：化学结构为它是已知的最有效的闪烁体之一。比PPO能耐受浓度淬灭，但是，它的溶介度低，尤其是在低温和含水样品存在时，溶介度下降更快，而且用量比PPO多两倍，价格昂贵。2-（4-t-丁基苯基）-5-（4-二苯基）－1,3,4,恶二唑（丁基－PBD）：化学结构为它的溶介度比PBD高，其最大优点对化学淬灭和颜色淬灭不敏感，因此，可以获得较高的计数效率。②第二闪烁体（次级闪烁体）：第二闪烁体的主要功能是吸收第一闪烁体发射的光子后，再在较长的波段上重新发射出荧光来，并能增加光子的产额。在高浓度下第二闪烁体起着一部分与第一闪烁体相同的作用（即接受激发溶剂分子的的退激能量，并发出荧光），此外，它还能与淬灭因子竞争，从而减少了第一闪烁被淬灭的程度。在下列一种或一种以上的情况下，必须在闪烁液中加入第二闪烁体：a. 样品中含有直接淬灭第一闪烁体的化合物；b. 第一闪烁体浓度太高而引起强烈的自身淬灭，且发射的光谱范围与光电倍增管光阴及不匹配；c. 计数器的光电倍增管光阴极对于较长波长的光谱响应比较好；d. 测量的样品在近紫外区有明显的吸收。

常用的第二闪烁体有：1,4,双2（5苯基恶唑）苯（POPOP）它的溶介度小，在甲苯系统为1.2克／升，在二氧六环中为1.5克／升。溶介速度慢，通常需加热促其溶介，它是目前普遍使用的第二闪烁体。1,4双2（4－甲基－5－苯基恶唑基）-苯（DMPOPOP）：它的溶介度比POPOP大，在甲苯系列内为

2.3克／升，在二氧六环内是0.8克／升，溶介速度也快，但没有POPOP的计数效率高，且需要较高的使用浓度。此外，还有对－双（0-甲基苯乙稀基）苯，（双－MSB）和2-（4'-二联苯基）－6-苯基苯并恶唑（PBBO），几种常用的初级闪烁体的荧光波长在3460－3800埃之间，而Cs-sb型光阴极的最大光谱响应波长为4000埃左右。因此，对于Cs-Sb材料的光阴极，仅用初级闪烁体不能很好地进行能量转移，计数效率很低，加入次级闪烁体后发射光谱波长增加到4180－4300埃，使其与Cs-Sb型光阴的光谱响应得到改善，能量转移较好，计数效率提高。Cs-K-Sb型是双碱型光电倍增管，它的最大光谱响应波长比Cs-Sb型短。因此，不用次级闪烁体也可以有较好的计数效率。但是，考虑到次级体和其它功用，通常在实际工作中，往往都要使用次级闪烁体。

闪烁液中除了溶剂，闪烁体之外，有时还添加一些其它成分。为了增加闪烁液对含水样品的溶解能力，需加入助溶剂；为了改善计数效率，则加入抗淬灭剂。甲苯、二甲苯等有机溶剂极性很小，对水的溶介能力较差。当样品含水较多时，即使样品体积不大，也很难和甲苯中二甲苯互溶为透明的均相学府。有时样品的含水量虽然不大，但它的放射性水平很低，为了在较短的测量时间获得符合统计误差要求的计数往往需要增加样品的体积，这就等于增加了含水量，这样的样品也不能很好地和甲苯或二甲苯互溶，为此，要加入一定量的极性较大的有机溶剂，如甲醇，乙醇，乙二醇乙醚等，这些溶剂在非极性溶剂和水分子之间起着桥梁作用，既能和甲苯、二甲苯互溶，又能和水互溶，达到增加含水样品在闪烁液内的溶解度的目的，所以称之为助溶剂。\par 助溶剂的淬灭作用较大要限制其用量，因而，可容纳的含水量也是有限的。其中乙二醇乙醚的极性大且学淬灭作用小，是常用的助溶剂。抗淬灭剂通常用在对含水量很大的样品测量或采用二氧六环作溶剂时，因为这种闪烁液淬灭作用大，为改善计数效率，加入抗淬灭剂萘是十分重要的。萘也是一种荧光物质，它可以抵消一部分淬灭作用，但是萘不能和对联三苯合用，尤其是在甲苯、二甲苯溶剂中，否则计数效率很低。液体闪烁计数器中，闪烁液的最佳体积可以在一定范围内有所变化，吸要能获得较高的计数效率，就应该采用较少的体积，尤其对于3H样品来说，较小体积的闪烁液还可以减少本底计数（大约0.5cpm／ml闪烁液），减少样品的自吸收。如果当样品中含有淬灭剂成分时，增加闪烁液的体积，可以经稀释作用来减少淬灭。

3.探测装置

在液体闪烁计数中引用非常灵敏的光电倍增管，对于探测穿透力低的α射线和低能量的β射线（如3H，14C等）是极为重要的。使用一个光电倍增管的单光电倍增管液体闪烁计数器，由于电倍增管的热噪声及样品受光照射后发出的磷光，会有较高的本底计数，探测效率也较低。使用两个性能指标大致相同的光电倍增管，并和符合电路相连接，做成双管符合型液体闪烁计数器，符合电路只能通过由两只倍增管同时产生的信号，因而只有当两只光电倍增管在符合电路分辩时间内同时观察到的信号才被记录下来，而由热噪声或磷光产生

的随机脉冲则被扣除掉，有效地降低仪器本底，提高了探测效率，系统探测效率可在50％以上。在液体闪烁计数系统中，光电倍增管阳极形成脉冲电压的大小，与阳极一次收集的电子数成线性关系。在光电倍增管放大倍数不变的情况下（取决于高压的稳定性），光阴极产生的光电子越多，最后到达阳极的电子数也越多，而光电子数取决于光子数。在正常情况下，闪烁剂分子释放的光子数与放射性同位素衰变时产生的β射线能量成正比关系。由于放射能在传递和能量转换途中，或多或少地要发生能量消耗，因此，放射能和发射的光子数之间近似地成线性关系。这说明液体闪烁计能够作能谱研究，以分析不同能量的放射性同位素，达到定性目的。例如，3H、14C

双标记样品，可通过双道液体闪烁计数器同时测定。阳极在单位时间内产生脉冲电压的数量，与闪烁瓶内放射性同位素的多少以及同位素衰变率成线性关系，与样品内的放射性强度成正比，这是液体闪烁测量的定量基础。例如，在知道液体闪烁计数器探测效率的前提下，通过对某种放射性样品进行测定，可以求得该样品中的放射性强度为多少微居里或多少贝柯勒尔。

4.双标记同位素测量的应用

液体闪烁计数器特点之一是能作双同位素分析，配备两个或三个以上独立的脉冲高度分析器的多道装置，并具有脉冲相加和线性门装置，在每种同位素的最佳计数条件下同时测量它们，就能区分发射不同能量的同位素，假定有一个含有3H和14C的样品，我们将仪器中脉冲高度分析器多道装置中的道1调3H的平衡点（最佳工作条件），道2调在14c的平衡点。3H和14C标准样品溶解的在同样的溶剂中，并采用与实验样品相同的闪烁体，首先测量空白样品，然后对实验样品和标准样品进行计数。

为了使双标记测量获得成功，两种放射性同位素的β谱必须要有足够的差异来满足脉冲高度分析所要求的分离。在两种同位素能谱过于接近的情况下，例如14C和35S，必须首先对它们进行同位素的化学分离，然后再分别计数。在双标记测量中，较常用的成对同位素有3H和14C、3H和35S、3H和32P 及14C和32P等。总之，在双同位素标记的测量中，要满足下述两个条件：第一，较高能量的同位素尽量能够在不受较低能量同位素干扰的条件下进行计数；第二，选择一个最佳条件，以对双标记样品中较低能量的同位素能进行计数。

5.液体闪烁计数样品的制备

流体闪烁测量的榈制备是很重要的操作，操作的成功与否，直接影响到计数效率。样品制备方法的选择要考虑以下四个因素：⑴所测样品的物理和化学特性，决定所用闪烁液类型和决定是否需要将样品转化为更适于测量的形式；⑵样品所含的同位素的种类，对于含3H的样品要更加注意；⑶预计的放射性水平，在样品的放射性强度低时，要求的制备方法比较严格；⑷制备过程

的经济和方便，尤其在样品数量多的更为重要。其一般原则是必须使所制备的样品的放射性，能在一个短的测量时间达到适当的统计学准度，最关键的是要求样品制备过程中，尽可能地减少“淬灭”因素。

⑴均相样品的制备

脂溶性样品可直接加入甲苯、二甲苯系统的闪烁液，含水量小于3％的样品，仍应用甲苯、二甲苯系统的闪烁液，但需加入乙醇或甲醇或乙二醇乙醚等极性溶剂助溶，助溶剂与甲苯的比例通常为3:7。必需时加抵消部分淬灭作用，提高计数效率，含水量再大时，最好采用100毫升乙二醇乙醚。20毫升乙二醇，8克PPO,500毫克POPOP，150克萘，最后用二氧六环加到1升的闪烁液配方，此配方容纳水量大，效率好相当高，但需注意二氧六环易形成过氧化物，会导致化学发光的进行，所以应在避光条件下贮存，或者在贮存期间加入锌粒或其它抗氧化剂以清除过氧化物。

⑵非均相样品的制备

①乳状液计数：表面活化合物Triton X-100是广泛应用的乳化剂，其化学结构式：它的亲水端吸引水和其它极性分子，疏水端吸引甲苯等非极性分子。乳状液的物理性能随着水分的增加而改变。当甲苯闪烁液与Triton X-100按2:1（v／v）组成的配方时，样品水分在15％以下的乳状液是透明的；随着水分的增加，就会出现两个不同的相，分相的乳状液不稳定，不能用于测量；水分继续增加，就形成稳定的乳状液，此时液体是透明的或不透明的。乳状液的分相与温度有关，在温度由17℃开始下降时，计数效率线性地增加约10％，到4－0℃之间为最大值，温度再低，计数效率不再增加，通常把乳状液首先加热到40℃，然后在无振荡的情况下冷却，在4℃保持2－4小时。溶质在有机相和水相之间的不同分布是决定乳状测量计数效率的关键，乳状液测量的效率有时会比均相测量更高，这是因为淬灭物质主要保留在水相中而不影响在有机相中发生的能量转移过程。在均相溶液中，系统中所有的成人的成份都密切地相互接触，所以任何一个淬灭作用都能表现出来。

②悬浮液测量：对于在甲苯等为基础的闪烁液中溶解度极低的无机盐等样品，可采用凝胶技术成悬浮测量液。样品经初步处理后，制成相同大小的颗粒，然后在含有凝胶剂的系统中做成悬浮液。对于悬浮液测量，下列要求是必须的：①固体物质要很好地粉碎，并要求是白色或无色的均匀粉状颗粒，以避免光的吸收；②要求样品确实不溶于闪烁液，否则溶解的与不溶解的部分有不同的计数效率，造成计数不稳定，结果不易重复。悬浮液测量的优点是样品不溶解在溶剂中，所以样品淬灭极小。在悬浮测量中作为聚胶剂的物质有硬脂酸铝、蓖麻油的衍生物（thixin）

及二氧化硅的细颗粒（Cab-o-sil）。含3.5￣4.0％ Cab-o-sil的悬浮液，要以得到很高计数效率，Cab-o-sil还可以减少计数瓶壁对放射性吸附作用，一般

制样时，往往先加Cab-o-sil，再加入放射性样品，使放射性更多地吸附在悬浮颗粒上而提高计数效率。悬浮液测量法除应用于固体无机盐的测定外，也可用于水溶液和组织匀浆，还可用来测量薄层层析的放射性，应用时只要将层析物粉碎，简单地与凝胶混合即可，如果待测物能部分地从层析支持物上被洗脱而溶于闪烁液，则此法不可使用。

③支持物测量：与悬浮液测量相似，凡不溶于闪烁液的样品，可将它放置在支持物上再浸入闪烁液中进行计数。支持物的种类很多，如纸条、滤纸、玻璃纤维滤纸及醋酸纤维素膜片等。支持物在计数瓶内的位置对计数有直接影响，通常都采用平放瓶底测量，且膜片不超出闪烁液面，保持支持物和测量杯的干燥，都能获得较高的计数效率和测量重复性。支持物测量除淬灭作用小外，还有一个突出的优越性，即一次测量可以党纲较多的样品。因在同一测量瓶内，随膜片叠加数目的增加（10片之内），计数率线性增加而计数效率保持不变，这对于放射性水平低的含水样品测量非常适用。\par 在上述几种支持物中，以醋酸纤维素薄膜、玻璃纤维滤纸的效果优于普通滤纸，因为普通滤纸对光子传播几乎是不透明的，所以计数效率很低。

6.液体闪烁计数中的淬灭作用

放射能量在测量瓶内的传递和转换过程越顺利，测量效率越高。但事实上，影响能量传递过程顺序进行的因素很多，它的每一环节都存在着对能量的争夺过程，使得放射能减少，甚至发生能量传递的中断，导致测量效率下降，这种现象称为液体闪烁计数的淬灭。造成淬灭的因素很多，按淬灭性质归纳起来，有下列三种类型。

⑴化学淬灭

化学淬灭的产生，是由于被放射能激发的少量溶剂分子在分子运动中，与非激发的杂质、溶剂、溶质分子碰撞而将激发能发热能形式消耗。化学淬灭的严重程度取决于淬灭物质的化学结构和浓度。化学淬灭与淬灭物浓度的关系是淬灭物质的浓度越大，淬灭作用越严重。例如，氧和水都是强淬灭剂，在常温压下，闪烁液都能溶介空气中的氧，当氧的溶解量达到2×10-3M时，淬灭作用比无氧情况下大20％，而且闪烁液中的含水量（来自含水样品和溶剂中的少量水分以及其它的添加剂）在可能的条件下，应越少越好，闪烁液不能放在冰箱中。

⑵颜色淬灭

由于颜色对光量子的吸收作用，使得带颜色的闪烁液削弱了光子的亮度，也缩短了光量子的自由程，导致到达光阴极的光子数减少，造成计数效率下降。不同的颜色，淬灭作用程度不同，闪烁液荧光波长接近于紫外光，所以，颜色淬灭程度的顺序为：兰色〉黄色〉红色。一些生物样品，如血、尿等在制样过程中，要进行脱色处理，如果支持物测量中，滤膜干燥时被烤黄，也会造成计数效率的严重下降。

⑶光子淬灭（又称局部淬灭）

在非均相测量中，由于样品本身的自吸收而使β射线能量在没有传递给溶剂分子之前就消耗掉了，这种淬灭在均相测定中，因样品处理不好，也会发生，谓之光子淬灭。前已述及，不同能量的放射性核素，在液体闪烁计数时，闪烁体给出的光子数不同，产生的电脉冲高度亦不同。如果由接近平均能量的14C1的β粒子产生400个光子，在一个符合型液体闪烁器中，每个光电倍管将接收200个光子，又因为光电倍增管的最子效率大约是25％，因此200个光子打到光阴极上产生大约50个光子，而淬灭作用使得到达光阴极光子数减少，这种减少只要能让每次衰变记录下来，否则就被计数器漏记，因此，将这些考虑应用到能量较低的3H时，如果按平均能量（0.018MeV）计算，3H的β粒子在甲苯闪烁液中，大约产生40个光子，按25％的量子效率计算，则每个光电倍增管光阴极大约产生5个光子，与14C相比，光电子产额为1:10，所以，在3H测定中，中等程度的淬灭就会产生不能挽回的计数损失。

固绿

固绿是酸性染料，能溶于水（溶解度为4%）和酒精（溶解度为9%）。固绿是一种染含有浆质的纤维素细胞组织的染色剂，在染细胞和植物组织上应用极广。他和苏木精、番红并列为植物组织学上三中最常用的染料。

配方：(1)固绿酒精液固绿1 g； 95％酒精100 ml

(2)苯胺固绿酒精液固绿 1 g, 95％酒精40 ml,苯胺10 ml

配后充分摇匀，过滤后使用。

葡萄糖转运蛋白与肺癌

!!作者单位" #,"""#杭州#浙江大学医学院附属第一医院呼吸科葡萄糖转运蛋白与肺癌 钟秀君!周建英 !!肿瘤细胞无法调控的增殖是肿瘤细胞最主要特征#而细胞数的增多导致细胞耗氧量不断增加#造成肿瘤缺氧#这在人实体瘤中表现尤其明显’肿瘤在适应缺氧时#葡萄糖摄入增多以提供所需的能量#此方式通过葡萄糖转运蛋白%@?I 9<;237/:;T <7327#[?I 3&合成增加来实现’[?I 3是介导细胞葡萄糖摄取的主要载体#与正常细胞$组织及良性病变相比#恶性肿瘤细胞对葡萄糖的代谢率增加’而糖代谢的增高与[?I 3及基因的异常表达有关’本文就[?I 3及其同肿瘤的关系作一综述’ !!H ;<9的分类和在组织中的分布细胞不能通过简单的弥散方式吸收葡萄糖#它必须借助一种特殊蛋白质#即葡萄糖转运蛋白’由于不同组织对葡萄糖需求不同#故可能有不同的葡萄糖转运蛋白’目前用基因探针方法# 已发现了’种不同的葡萄糖转运蛋白%[?I 3,\-$[?I 3*\0& ’[?I 3,在人类所有组织中均存在#它对葡萄糖具有很高的亲和力#可调节葡萄糖摄取’[?I 3!出现在能释放葡萄糖入血的器官中#如肠$肝$肾$及胰腺的/细胞#对葡萄糖亲和力极低#似乎仅在血浆葡萄糖水平相对较高时才作为转运体发挥载体功能’[?I 3#在脑神经元中被发现# 存在于人类所有组织中’对葡萄糖分子也有高亲和性’[?I 3(是肌肉和脂肪细胞主要的转运蛋白# 一般情况下#不能起转运葡萄糖的作用#仅在胰岛素的信号刺激下#能促进饭后葡萄糖进入上述组织中储存起来’[?I 3-主要存在于小肠及肾脏#主要作为果糖转运体’[?I 3.基因是一个假基因#不在蛋白水平表达’[?I 3*是肝微粒体[?I 3#与[?I 3!有.’)序列一致性’[?I 3’是主要表达于睾丸及受胰岛素调控的组织中’[?I 30在脾$外周白细胞$脑组织中表达’这’种葡萄糖转运蛋白转运葡萄糖都是按浓度梯度进行的’还有一种是钠离子依赖的协同转运蛋白%$[&H &#它逆浓度主动转运葡萄糖#是耗能过程#有$[&H ,%在小肠中表达明显#肾$肝$肺中少量表达&和$[&H !%肾中表达高#小肠中少&两种’ -!H ;<9与肿瘤 -"!![?I 3表达与肿瘤的生物学行为!各种葡萄糖转运蛋白在不同类型肿瘤中作用可能各不相同#[?I 3,可能是大多数肿瘤中表达的主要角色’其在 各部位肿瘤中表达(, )大致如下’头颈部"见于基底上皮细胞癌和口腔癌*胰腺"和G Q [%!\脱氧氟代\Q \葡萄糖&表达正相关*结肠"增强的表达与不良的预后有关*阴茎"在增生的病变处表达增强*胃食道"胃中高度表达#与M /77233食管有关*肾$膀胱"高度表达但与肿瘤分级无关*甲状腺"仅在恶性肿瘤中表达*肺"仅在恶性肿瘤中表达#在肿瘤中心表达更高#是非小细胞肺癌的预兆*乳腺"过度表达但与肿瘤大小$受体$淋巴结状态无关*脑"[?I 3,比[?I 3#表达低#且与星形细胞瘤分级相关*卵巢"过度表达#且与 肿瘤分级有关*皮肤"表达提示增生性病变’国外( !)亦有报道[?I 3,在肺癌$结直肠癌$乳腺癌等多种肿瘤中均有过度表达#而且其表达水平与肺癌及结直肠癌的临床分期$ 转移和预后密切相关’-"!"!![?I 3表达与癌发生的关系!在一些恶性肿 瘤中[?I 3表达与癌的形成无关#如在胃癌(# )中用免疫组织化学方法检测发现胃腺瘤$ 癌前病变$早期胃癌中检测不到[?I 3,表达#而只在易浸润$发生转移的胃癌中检测到#[?I 3,表达并不随着胃癌的发展而 逐渐增高’而对胆囊癌(()的免疫组织化学实验发 现#[?I 3,的表达与胆囊癌的形成及进展高度相关’-"!"-![?I 3异常表达与癌分化程度的关系! Y

对葡萄糖转运蛋白的讨论

对葡萄糖转运蛋白的讨论 关键词：葡萄糖转运蛋白糖尿病胰岛素释放障碍胰岛素抵抗 葡萄糖转运蛋白是细胞转运葡萄糖的 载体。研究发现，葡萄糖转运蛋白是一个蛋白家族，包括多种蛋白，它们在体内的公布以及与葡萄糖分子的亲合力差异显着。其中GLUT2和GLUT4尤为重要。GLUT2是胰岛B 细胞膜上的转运蛋白，在血糖浓度升高时，促进GLUT2对葡萄糖的转运功能，继而刺激胰岛素释放。GLUT4在脂肪细胞和肌细胞中表达，胰岛素刺激GLUT4在脂肪细胞和肌细胞或表达，胰岛素刺激GLUT4分子转移到细胞膜上，促进葡萄糖分子的转运过程。GLUT2和GLUT4分子的研究对于糖尿病的胰岛素释放障碍和胰岛素抵抗有重要意义。 1GLUT的分类 除了肾和肠道有能量依赖性的钠-葡萄糖协同转运外，其它大多数细胞都有非能量依赖的转运体存在。它们将葡萄糖分子从高

浓度向低浓度载过细胞膜。现已发现至少存在五种这样的转运蛋白，它们对葡萄糖的转运有各自不同的特点，分为GLUT1、GLUT2、GLUT3、GLUT4和GLUT5。 GLUT1分子在人类所有组织中均存在， 它调节葡萄糖摄取。它对葡萄糖分子有很高的亲合力，因此在相对低浓度葡萄糖的状态下也能转运葡萄糖分子。由于这个原因，GLUT1是一种重要的脑血管系统成分，保证 足够血浆葡萄糖分子转运进入中枢神经系统。 与GLUT1不同，GLUT2分子对葡萄糖亲合力极低，似乎仅在血浆葡萄糖水平相对较高时才作为转运体发挥载体功能。例如饭后，胰岛B细胞和肝细胞中起葡萄糖转运功能的分子就是GLUT2。这种生理功能抑制了正常状态或饥饿条件下肝脏对葡萄糖分子的摄 取和胰岛素不正常分泌。OgawaY等人研究发现，对于Ⅱ型、Ⅰ型早期糖尿病人和胰腺移植失败的病人，在血糖浓度升高时，普通B 细胞中GLUT2分子的表达有所下降。因此他们得出结论：对于上述病人，高血糖通过对

高效液相色谱法测定复方氨基葡萄糖咀嚼片中氨基葡萄糖的含量

高效液相色谱法测定复方氨基葡萄糖咀嚼片中氨基葡萄糖的含量[摘要] 目的建立高效液相色谱法,测定氨基葡萄糖咀嚼片中氨基葡萄糖的 含量。方法以Hypersil C18(50mm×4.6mm,5μm)为色谱柱;以0.05mol·L-1乙酸钠水溶液甲醇(90∶10)为流动相;UV检测波长340nm;流速1.0ml·min-1。结果氨基葡萄糖在200～1600mg·L-l范围内具有良好线性关系(r=0.9996),平均加样回收率为100.4%,(RSD)为1.0%(n=9);3批样品的标示含量分别为99.5%、100.1%、99.4%。结论高效液相色谱法准确、灵敏,重现性好,可用于氨基葡萄糖咀嚼片的含量测定。 [关键词] 氨基葡萄糖;咀嚼片;色谱法,高压液相;含量 氨基葡萄糖[1]是蛋白多糖合成的前体物质,可刺激软骨细胞产生有正常多聚体结构的蛋白多糖,提高软骨细胞的修复能力,抑制可损害关节软骨的酶,并可防止损伤细胞的超氧化物自由基的产生,促进软骨基质的修复和重建,从而可缓解骨关节疼痛,改善关节功能,并延缓关节病变的发展;硫酸软骨素在关节中具有润滑和支撑功能,还具有抗动脉粥样硬化与抗粥样斑块作用;两者复方在临床上主要用于骨性关节炎的防治,减慢软骨退化和缓解疼痛。目前国内仅有氨基葡萄糖常规口服片剂和胶囊的生产与销售,尚无复方氨基葡萄糖制剂(氨基葡萄糖和硫酸软骨素)。为此我们开发了复方氨基葡萄糖咀嚼片,为控制其质量,建立了测定氨基葡萄糖咀嚼片含量的高效液相色谱法。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 试药与试剂硫酸氨基葡萄糖氯化钠复盐(浙江海正药业股份有限公司);氨基葡萄糖对照品(中国药品生物制品鉴定所;批号:649200001);复方氨基葡萄糖咀嚼片(规格:氨基葡萄糖∶硫酸软骨素=250mg∶200mg),甲醇色谱纯,乙酸钠、醋酸及邻苯二甲醛等为分析纯。 1.1.2仪器高效液相色谱仪(Waters 600E泵控系统),WatersTM 486紫外检测器,Rheodge 7125进样器,HW色谱工作站。 1.2 色谱条件 色谱柱:Hypersil C18(50mm×4.6mm);流动相:以0.05mol·L-1乙酸钠水溶液(取6.80g三水合乙酸钠,加入700ml水使其溶解,用醋酸调pH至5.9,加水至1000ml)甲醇(900∶100)为流动相;UV检测波长340nm;流速1.0ml·min-1;进样量为20μl。 1.3 溶液制备 1.3.1 衍生化试剂的制备称取50mg邻苯二甲醛置14ml聚丙烯试管中,加入

对葡萄糖转运蛋白的讨论

关键词：葡萄糖转运蛋白糖尿病胰岛素释放障碍胰岛素抵抗葡萄糖转运蛋白是细胞转运葡萄糖的载体。研究发现，葡萄糖转运蛋白（后简称GLUT）是一个蛋白家族，包括多种蛋白，它们在体内的公布以及与葡萄糖分子的亲合力差异显著。其中GLUT2和GLUT4尤为重要。GLUT2是胰岛B细胞膜上的转运蛋白，在血糖浓度升高时，促进GLUT2对葡萄糖的转运功能，继而刺激胰岛素释放。GLUT4在脂肪细胞和肌细胞中表达，胰岛素刺激GLUT4在脂肪细胞和肌细胞或表达，胰岛素刺激GLUT4分子转移到细胞膜上，促进葡萄糖分子的转运过程。GLUT2和GLUT4分子的研究对于糖尿病的胰岛素释放障碍和胰岛素抵抗有重要意义。1GLUT的分类除了肾和肠道有能量依赖性的钠-葡萄糖协同转运外，其它大多数细胞都有非能量依赖的转运体存在。它们将葡萄糖分子从高浓度向低浓度载过细胞膜。现已发现至少存在五种这样的转运蛋白，它们对葡萄糖的转运有各自不同的特点，分为GLUT1、GLUT2、GLUT3、GLUT4和GLUT5。GLUT1分子在人类所有组织中均存在，它调节葡萄糖摄取。它对葡萄糖分子有很高的亲合力，因此在相对低浓度葡萄糖的状态下也能转运葡萄糖分子。由于这个原因，GLUT1是一种重要的脑血管系统成分，保证足够血浆葡萄糖分子转运进入中枢神经系统。与GLUT1不同，GLUT2分子对葡萄糖亲合力极低，似乎仅在血浆葡萄糖水平相对较高时才作为转运体发挥载体功能。例如饭后，胰岛B细胞和肝细胞中起葡萄糖转运功能的分子就是GLUT2。这种生理功能抑制了正常状态或饥饿条件下肝脏对葡萄糖分子的摄取和胰岛素不正常分泌。OgawaY等人研究发现，对于Ⅱ型、Ⅰ型早期糖尿病人和胰腺移植失败的病人，在血糖浓度升高时，普通B细胞中GLUT2分子的表达有所下降。因此他们得出结论：对于上述病人，高血糖通过对GLUT2的下调作用减少葡萄糖诱导的胰岛分泌，加重病情。虽然，GLUT2分子是葡萄糖刺激胰岛素分泌的一个关键因子，但其他环节如糖激酶异常，ADP-核糖生成障碍等均与胰岛素分泌障碍有关，因此上述实验只能说明GLUT2分子在胰岛B细胞的葡萄糖转运中起着重要作用，其它结论还有待研究。GLUT3分子在所有组织中均已发现，主要作为神经元表面的葡萄糖转运体，它对葡萄糖分子也有高亲合性，负责将葡萄糖从脑脊液转运至神经元细胞。GLUT4主要存在于骨骼肌、脂肪细胞的胞浆中，一般情况下，不能起转运葡萄糖的作用，仅在胰岛素的信号刺激下，才能通过易位作用转运到细胞膜上，促进饭后葡萄进入上述组织中储存起来。GLUT5在人类小肠刷状缘上表达，主要作为果糖转运体，在肝脏也高度表达。2GLUT4分子是研究的一个热点糖尿病的发病机制归纳而言无外乎两个方面，一是胰岛素分泌不足，二是胰岛素抵抗。胰岛素抵抗的结果，血浆中胰岛素水平虽高，但血糖浓度还是比正常情况高。葡萄糖转运机制障碍是胰岛素抵抗的一个重要方面，也是现今研究的一个热点。在骨骼肌和脂肪细胞，胰岛素刺激葡萄糖转运过程如下：首先胰岛素与细胞膜上的受体结合，然后通过至今仍不明确的信号传递过程使含有GLUT4分子的囊泡从胞内池移动到细胞膜，然后与膜融合，将GLUT4分子固定在细胞膜上，从而发挥转运葡萄糖等C1-C3位置有相同结构的其它糖分子（如L-阿拉伯糖、D-木糖、半乳糖）的作用。 [!--empirenews.page--] 胰岛素抵抗虽然包括GLUT4转运活性的下降，但这种缺陷是否是GLUT4分子数量不足引起的呢？GarveywT等人研究证实，无论是在糖尿病人还是非糖尿病患者，只要存在胰岛素抵抗，GLUT4的数量并无明显减少，但GLUT4的易位作用发生了障碍，它们在高密度膜区异常积累，但不能转移到细胞膜上。这种现象在骨骼肌细胞和脂肪细胞中均已被发现。所以胰岛素抵抗的机制之一可能是GLUT4分子易位障碍，而不是合成、释放不足。既然GLUT4分子在葡萄糖转运过程中如此重要，它是如何发挥作用的呢？GLUT4分子镶嵌在细胞膜的脂质分子双层中，通过构象改变将葡萄糖分子运进细胞内，而不是借助蛋白本身的运动。即所谓的“ping pong”机制。这种构象改变可能与GLUT4分子的磷酸化、去磷酸化有关。JE-Reusch等人在脂肪细胞培养液中加入PTH，发现GLUT4磷酸化程度明显增加，而胰岛素刺激的去磷酸化作用显著降低。同时，PTH对GLUT4分子在细胞内分布没有影响。磷酸化的GLUT4分子在内在活性明显降低，可能与其构象改变障碍有

氨基葡萄糖的检测方法汇总

氨基葡萄糖的检测 葡萄糖的一个羟基被一个氨基取代的化合物。分子式C6H13O5N，俗称氨基糖，简称氨糖。又名葡萄糖胺，广泛存在于自然界；市面上氨糖主要分为盐酸氨糖与硫酸氨糖两种。目前，氨糖的分析方法主要有分光光度法、HPLC和HPIC等，最常用的分析方法为高效液相色谱法，近年来离子色谱技术在糖类化合物分析中的应用也越来越广泛。 分光光度法 （《中国药典》2010 年版二部附录IVA）测定。 1 对照品溶液的制备：精密称取经105干燥至恒重的盐酸氨基葡萄糖对照品适量，加水溶解制成每1ml约含25μ的溶液作为对照品溶液。 2 供试品溶液的制备：精密称取样品约25mg，置100ml 量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取10ml，置100ml 量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，既得。 3 测定法：分别取对照品溶液及供试品溶液各 5ml 分别置具塞试管中，另取具塞试管蒸馏水5ml作为空白，各加乙酰丙酮试液（取乙酰丙酮2ml，加 0.5mol/L 碳酸钠溶液至50ml，临用前配置成1.0ml，摇匀，置沸水浴中（1分钟后密塞），准确加热25 分钟，取出，用冰水迅速冷却后，加无醛乙醇3.0ml，60水浴中保温10 分钟后，再加对二甲氨基苯甲醛试液（对二甲氨基苯甲醛0.8g，加无醛乙醇15ml 及盐酸15ml，摇匀)1.0ml，强力振摇，并继续在 60水浴中保温1 小时，立即用冷水冷却至室温。参照分光光度法（《中国药典》2010 年版二部附录IVA）在525nm 波长处分别测定吸光度，计算，既得。 HPLC-ELSD法（高效液相色谱法） 依据：GB/T20365-2006 1、主要使用仪器 高效液相色谱仪， ELSD蒸发光散射检测器，色谱柱 2、标准溶液的配制 准确称取硫酸软骨素和氨基葡萄糖标准品各约0.1g。分别加1mL乙腈，超声1min后，加纯水定容至10mL。吸取上述硫酸软骨素和氨基葡萄糖标准溶液各

葡萄糖转运载体测定方法

一.刷状缘膜囊的制备：（方法参照Kessler(1978),Shirazi-Beechey(1991)和Bauer （2001b）修正） 所有操作过程需在冰上或者4℃下进行。将冷冻样品进行称重，并在冷烧杯中用缓冲剂（100mM 甘露醇，2mM HEPES/Tris 缓冲剂，pH7.1）解冻。解冻后，在冷的有盖培养皿中用剪刀和镊子将组织样剪为1cm小块，将小块组织样重放入冷烧杯，然后将组织块悬液振动2次(设定为No.80)，每次一分钟。用布氏漏斗过滤振动后溶液，溶液转入250mL量筒，记录滤液体积后转移至400mL烧杯中。将烧杯放置冰上，搅拌溶液。制作多个平行样以备进一步分析，这些处理后样品为匀浆液。已知浓度的氯化镁溶液加入到匀浆液中以达到10mM的终浓度，温和搅拌溶液20分钟，然后进行两种离心：5min，3000*g；30min，30000*g。利用20-G型检测针对剩余的颗粒进行再悬浮，缓冲液为100mM甘露醇+20mM HEPES/Tris，pH7.5。悬浮颗粒在组织研磨机（Potter-Elvehjam; Teflon/glass）中均匀搅拌十次后在30000*g离心30min。最终颗粒用23-G型检测针在500μL缓冲液中（300mM甘露醇，0.1mM硫酸镁，20mM HEPES/Tris，pH7.5）再次悬浮。悬浮颗粒（囊泡）由反复流过27-G型检测针10次的溶液制备均匀，避免出现气泡。将试样等分入冷冻管后-80℃保存。 二.检测 利用BSA(牛血清白蛋白)作为匀浆蛋白浓度和囊泡浓度的标准。麦芽糖酶是刷状缘膜富集度的标记酶，Truner 和Moran（1982）的方法测定麦芽糖酶活，使用25mM磷酸盐缓冲液（pH6.3）和30mM麦芽糖。释放的葡萄糖通过COBAS FaraⅡ（全自动生化仪）（Roche，Montclair，NJ）测定麦芽糖酶活表达为μmol product/min*mg of protein。囊泡中麦芽糖酶活的富集（enrichment）表示为囊泡麦芽糖酶活/匀浆麦芽糖酶活。 37℃下将5μL（50μg of protein）的小囊泡置于预热的微量离心管中，预热的培养基中包含100mM硫氰酸钠或硫氰酸钾、99.8mM甘露醇、20mM HEPES/Tris （pH7.5），再加入200μM葡萄糖（1.0μCi【U-14C】-D-glucose）。加入1mL冰冻终止溶液（150mL氯化钠，250μM根皮苷）3s后葡萄糖吸收被终止。移取0.9mL上述溶液，迅速通过0.45μm圆形纤维素薄膜。整个薄膜用终止溶液（5*1mL）清洗。将薄膜置于20mL 闪烁计数瓶中，瓶中加入12mL scintillation cocktail（Scintisafe Plus 50%LSC Cocktail）。样品通过Quantasmart软件用于放射性测定（闪仪Tri-Carb 2900TR/SL）。在Na+和K+存在的前提下，葡萄糖吸收的测定重复五次。钠依赖性葡萄糖的吸收通过硫氰酸钠孵化值减去硫氰酸钾孵化值得到。 三.免疫印迹

葡萄糖转运蛋白

2014年5月18日，清华大学医学院教授颜宁研究组在Nature在线发表了题为“Crystal structure of the human glucose transporter GLUT1”的研究论文，在世界上首次报道了人源葡萄糖转运蛋白GLUT1的晶体结构，初步揭示其工作机制以及相关疾病的致病机理。 葡萄糖（D-glucose）是地球上包括从细菌到人类各种生物已知最重要、最基本的能量来源。葡萄糖代谢的第一步就是进入细胞：亲水的葡萄糖不能自由穿透疏水的细胞膜，其进出细胞需要通过镶嵌于细胞膜上的葡萄糖转运蛋白完成。其中一类属于主要协同转运蛋白超家族（Major Facilitator Superfamily，简称MFS）的转运蛋白是大脑、神经系统、肌肉、红细胞等组织器官中最重要的葡萄糖转运蛋白（glucose transporters，简称GLUTs）。在人体的14个GLUTs中， GLUT1、2、3、4这四种蛋白生理功能最重要，研究最广泛，其中GLUT1因发现最早而得名。 GLUT1几乎存在于人体每一个细胞中，是红细胞和血脑屏障等上皮细胞的主要葡萄糖转运蛋白，对于维持血糖浓度的稳定和大脑供能起关键作用。在已知的人类遗传疾病中，导致GLUT1功能异常的突变会影响葡萄糖的正常吸收，导致大脑萎缩、智力低下、发育迟缓、癫痫等一系列疾病。另一方面，当发生癌变时，葡萄糖是肿瘤细胞最主要的能量来源，但是肿瘤细胞由于缺乏氧气供应而只能对葡萄糖进行无氧代谢，同质量葡萄糖所提供的能量不到正常细胞的10%，因而对葡萄糖的需求剧增，在很多种类的肿瘤细胞中都观察到GLUT1的超量表达，以大量摄入葡萄糖维持肿瘤细胞的生长扩增，这使得GLUT1的表达量可能作为检测癌变的一个指标。 自从获得了大量生理、病理、细胞、生化信息之后，获取GLUT1的三维结构就变成了该领域最期待的下一个突破。颜宁研究组在2012年首次解析了GLUTs的大肠杆菌同源蛋白XylE与葡萄糖结合的高分辨率晶体结构，并利用同源建模预测了GLUT1-4的三维结构；时至今日，人源GLUT1蛋白的晶体结构的捕获为理解这个具有历史研究意义的转运蛋白掀开了新的一章。 利用上海光源生物大分子晶体学线站（BL17U1）颜宁研究组最终解析了GLUT1的三维晶体结构。GLUT1呈现经典的MFS家族折叠方式——12个跨膜螺旋组成N端和C端两个结构域。两个结构域之间的腔孔朝向胞内区，即该结构呈现向内开放构象。而在结晶中用到的去污剂头部恰好是葡萄糖苷，其结合位点与此前XylE中观测到的葡萄糖结合位点基本重合，证实了MFS家族具有单一结合位点。有趣的是，GLUT1在胞内可溶区还具有一个由4个α螺旋组成的结构域（简称ICH），这一序列只在MFS中的糖转运蛋白亚家族中（Sugar Porter subfamily）观察到，因此ICH是属于该家族蛋白的特有结构特征。 利用GLUT1的晶体结构可以精确地定位与疾病相关的突变氨基酸，揭示其致病机理。分析显示，三十余个突变氨基酸基本集中于三个区域：底物结合区域、胞外门控区、胞内门控区，它们的突变或者影响了底物识别，或者影响转运蛋白的构象变化。晶体结构使得理解这些致病突变的机理一目了然。与之前获得的向胞外半开口的XylE晶体结构比较揭示出

盐酸氨基葡萄糖片检测标准操作程序

1. 目的建立盐酸氨基葡萄糖片检测标准操作程序。 2. 范围本标准适用盐酸氨基葡萄糖片。 3. 职责质量保证部、QC负责本标准的实施。 4. 程序 4.1 性状 目测：本品为为绿色薄膜包衣片，除去包衣后显白色或类白色。 4.2 鉴别 4.2.1 葡萄糖基的鉴别反应 ⑴试剂与试液：碱性酒石酸铜试液（取硫酸铜结晶6.93g，加水使溶解成100ml；取酒石酸钾钠结晶34.6g与氢氧化钠10g，加水使溶解成100ml；将两试液等量混合，即得）。 ⑵仪器与用具：电子分析天平、量筒、量瓶、移液管、试管。 ⑶操作方法：取本品细粉适量（约相当于盐酸氨基葡萄糖0.1g），加水5ml，振摇使溶解后，过滤，滤液中加碱性酒石酸铜试液1ml，加热，即生成红色沉淀。 4.2.2 氨基的鉴别反应 ⑴试剂与试液：茚三酮。 ⑵仪器与用具：电子分析天平、量筒、量瓶、移液管、试管。 ⑶操作方法：取本品细粉适量（约相当于盐酸氨基葡萄糖75mg），加水10ml，振摇使溶解后，过滤，取滤液1ml，加入茚三酮约2mg，加热，溶液显紫红色。 4.2.3氯化物的鉴别反应 ⑴试剂与试液：硝酸银试液（取硝酸银17.5g，加水适量使溶解成1000ml，摇匀，即得。）、氨试液（取浓氨溶液400ml，加水使成1000ml，即得。）、碘化钾淀粉试纸、硫酸、稀硝酸、二氧化锰。 ⑵仪器与用具：电子分析天平、量筒、量瓶、移液管、试管。 ⑶操作方法： ①取供试品溶液，加稀硝酸使成酸性后，滴加硝酸银试液，即生成白色凝乳状沉淀；分离，沉淀加氨试液即溶解，再加稀硝酸酸化后，沉淀复生成。 ②取供试品少量，置试管中，加等量的二氧化锰，混匀，加硫酸湿润，缓缓加热，即发生氯气，能使用水湿润的碘化钾淀粉试纸显蓝色。 4.2.4 盐酸氨基葡萄糖的鉴别 ⑴试剂与试液：水、磷酸、磷酸二氢钾、乙腈、盐酸氨基葡萄糖对照品。

氨基葡萄糖检测方法

氨基葡萄糖检测方法 样品处理： 取1 mL反应液，离心去除反应中沉淀，用去离子水进行适当稀释后经孔径为0.22 μm的滤膜过滤。 检测方法1 分析方法：OPA 硼酸柱前衍生化 色谱条件：(1)色谱柱：色谱柱C18（250*4.6）mm （2）柱温：40℃ （3）流动相A：称取3.02 g无水乙酸钠于烧杯中，加去离子水溶解并定容至1 L，然后加入200 μL三乙胺，用5%的醋酸将PH调到7.20±0.05；抽滤后加入5毫升四氢呋喃，混合后备用。 流动相B：称取3.02 g无水乙酸钠于烧杯中；加去离子水溶解并定容至200 mL；用5%醋酸将PH调到7.20±0.05；抽滤后，再向此溶液加入400 mL乙腈和400 mL甲醇，混合后备用。 （4）流速：1.0 ml/min； （5）紫外检测器：338 nm （6）柱温：40℃ （7）梯度洗脱： 时间A% B% 流速（ml/min） 0 92 8 1.0 20.0 40 60 1.0 22.5 0 100 1.0 23.5 0 100 1.2 24.5 0 100 1.2 25.0 0 100 1.2 26.5 92 8 1.2 （8）进样程序： 试剂摆放位置：P1A1：OPA P1A3：水

P1A4：硼酸P1A5：水 抽取：使用默认值补偿值从含200ul/min的位置P1A4上抽取7 ul 清洗：在位置P1A3清洗针一次 抽取：使用默认补偿值从含200ul/min的样品位置抽取1 ul 清洗：在位置P1A3清洗针一次 混合：将来自空气中的8 ul与最大速度混合3次 抽取：使用默认补偿值从含200ul/min的位置P1A1上抽取2 ul 清洗：在位置P1A3清洗针一次 混合：将来自空气中的10 ul与最大速度混合15次 抽取：使用默认补偿值从含200ul/min的位置P1A5上抽取30 ul 混合：将来自空气中的20 ul与300ul/min混合3次 进样：进样 （9）定量方法：采用外标法定量 检测结果如图1所示

葡萄糖转运体

葡萄糖转运体 葡萄糖转运体是一类镶嵌在细胞膜上转运葡萄糖的载体蛋白质，它广泛分布于体内各种组织。根据转运葡萄糖的方式分为两类:一类是钠依赖的葡萄糖转运体(SGLT)，以主动方式逆浓度梯度转运葡萄糖；另一类为易化扩散的葡萄糖转运体(GLUT)，以易化扩散的方式顺浓度梯度转运葡萄糖，其转运过程不消耗能量。研究发现GLUT的分布及质量与DM糖尿病的发生发展具有极为密切的关系。细胞的糖代谢取决于细胞对葡萄糖的摄取，葡萄糖无法自由通过细胞膜脂质双层结构进入细胞，细胞对葡萄糖的摄入需要借助细胞膜上的葡萄糖转运体(glucose transporter ，GLUT)来完成。GLUT结构具有以下共同特点：①具有12个跨膜螺旋环；②螺旋环上存在7个保守氨基酸残基；③胞膜内面存在几个酸性和碱性氨基酸残基；④具有两个保守的色氨酸残基；⑤具有两个保守的酪氨酸残基。它们是一组有着高度结构同源性的糖蛋白分子，所有的GLUT都具有12个跨膜节段的结构特征，均含有两个较大的环形结构，其中一个定位于第一、第二跨膜节段的细胞外区域，另一个定位于第六、第七跨膜节段的细胞内区域。其氨基末端及羧基末端均位于细胞膜的胞浆面。 葡萄糖转运体与糖尿病 自1921年，班廷发现胰岛素，人类一直将糖尿病治疗聚集于胰岛素，然而，美国制药有限公司首席医学专家约翰·朗霍斯特博士通过长达30年的研究发现：对于糖尿病的治疗，葡萄糖转运体的地位甚至比胰岛素还要高。 胰岛素的唯一作用就是降低血糖，健康人只有在进食的时候才会分泌胰岛素，其他绝大多数时间内胰岛β细胞并不分泌胰岛素，大量临床和事实证明，如果，胰岛素分泌过多，不仅会导致低血糖，甚至足以置人于死地。 可见，胰岛素只能起到降低血糖作用，根本无法起到平衡血糖浓度的作用！ 人体在正常状态下，调节并控制着葡萄糖代谢的平衡的是葡萄糖转运体！ 葡萄糖的代谢取决于细胞对葡萄糖的摄取，然而，葡萄糖无法自由通过细胞膜脂质双层结构进入细胞，细胞对葡萄糖的摄入需要借助细胞膜上的葡萄糖转运蛋白（glucose transporters）简称葡萄糖转运体（GLUT）转运功能才能得以实现。 葡萄糖转运体存在于身体各个组织细胞中，24小时不间断从高浓度像低浓度转运葡萄糖的，用以控制人体葡萄糖代谢的平衡，而且在转运过程并不消耗能量，如果说胰岛素是机动部队，哪里有问题去哪里，葡萄糖转运体就是无私奉献的常驻部队，不到生命终结或任务结束的一刻，葡萄糖转运体就会不停的工作，最为值得称道的是，无论葡萄糖转运体的数量如何增加，都只会使血糖在细胞和组织间保持相对的血糖平衡，而不会出现血糖突然降低危及健康的现象。 也因此，医学界得出结论，身体葡萄糖代谢的真正主宰，是葡萄糖转运体，而不是胰岛素，调节身体糖代谢，必须从葡萄糖转运体入手。 不仅如此，人体所有细胞均需葡萄糖的营养供给，合成胰岛素的β细胞也不例外，特别是胰岛素的生成过程，需要大量营养供给，也就是只有葡

对葡萄糖转运蛋白的讨论(一)

对葡萄糖转运蛋白的讨论(一) 关键词：葡萄糖转运蛋白糖尿病胰岛素释放障碍胰岛素抵抗葡萄糖转运蛋白是细胞转运葡萄糖的载体。研究发现，葡萄糖转运蛋白（后简称GLUT）是一个蛋白家族，包括多种蛋白，它们在体内的公布以及与葡萄糖分子的亲合力差异显著。其中GLUT2和GLUT4尤为重要。GLUT2是胰岛B细胞膜上的转运蛋白，在血糖浓度升高时，促进GLUT2对葡萄糖的转运功能，继而刺激胰岛素释放。GLUT4在脂肪细胞和肌细胞中表达，胰岛素刺激GLUT4在脂肪细胞和肌细胞或表达，胰岛素刺激GLUT4分子转移到细胞膜上，促进葡萄糖分子的转运过程。GLUT2和GLUT4分子的研究对于糖尿病的胰岛素释放障碍和胰岛素抵抗有重要意义。 1GLUT的分类 除了肾和肠道有能量依赖性的钠-葡萄糖协同转运外，其它大多数细胞都有非能量依赖的转运体存在。它们将葡萄糖分子从高浓度向低浓度载过细胞膜。现已发现至少存在五种这样的转运蛋白，它们对葡萄糖的转运有各自不同的特点，分为GLUT1、GLUT2、GLUT3、GLUT4和GLUT5。GLUT1分子在人类所有组织中均存在，它调节葡萄糖摄取。它对葡萄糖分子有很高的亲合力，因此在相对低浓度葡萄糖的状态下也能转运葡萄糖分子。由于这个原因，GLUT1是一种重要的脑血管系统成分，保证足够血浆葡萄糖分子转运进入中枢神经系统。 与GLUT1不同，GLUT2分子对葡萄糖亲合力极低，似乎仅在血浆葡萄

糖水平相对较高时才作为转运体发挥载体功能。例如饭后，胰岛B细胞和肝细胞中起葡萄糖转运功能的分子就是GLUT2。这种生理功能抑制了正常状态或饥饿条件下肝脏对葡萄糖分子的摄取和胰岛素不正常分泌。OgawaY等人研究发现，对于Ⅱ型、Ⅰ型早期糖尿病人和胰腺移植失败的病人，在血糖浓度升高时，普通B细胞中GLUT2分子的表达有所下降。因此他们得出结论：对于上述病人，高血糖通过对GLUT2的下调作用减少葡萄糖诱导的胰岛分泌，加重病情。虽然，GLUT2分子是葡萄糖刺激胰岛素分泌的一个关键因子，但其他环节如糖激酶异常，ADP-核糖生成障碍等均与胰岛素分泌障碍有关，因此上述实验只能说明GLUT2分子在胰岛B细胞的葡萄糖转运中起着重要作用，其它结论还有待研究。 GLUT3分子在所有组织中均已发现，主要作为神经元表面的葡萄糖转运体，它对葡萄糖分子也有高亲合性，负责将葡萄糖从脑脊液转运至神经元细胞。 GLUT4主要存在于骨骼肌、脂肪细胞的胞浆中，一般情况下，不能起转运葡萄糖的作用，仅在胰岛素的信号刺激下，才能通过易位作用转运到细胞膜上，促进饭后葡萄进入上述组织中储存起来。 GLUT5在人类小肠刷状缘上表达，主要作为果糖转运体，在肝脏也高度表达。 2GLUT4分子是研究的一个热点 糖尿病的发病机制归纳而言无外乎两个方面，一是胰岛素分泌不足，

细胞的跨膜运输方式

物质跨膜运输 一、结构基础：细胞膜的选择透过性 二、跨膜运输的实例：细胞的吸水和失水 原理：渗透作用。该作用必须具备两个条件： （1）具有半透膜；（2）膜两侧溶液存在浓度差。 渗透系统的组成：完整的渗透系统，由两个溶液体系（A和B）以及两者之间的半 透膜组成。当容易浓度A＞B时，水分通过半透膜从B流向A, 当容易浓度A＜B时， 水分通过半透膜从A流向B，当溶液浓度A=B时，渗透体系处于动态平衡状态。 易混易错： （1）发生渗透平衡只意味着半透膜两侧水分子达到动态平衡，既不可看作没有 水分子移动也不可看做两侧溶液浓度相等。 （2）溶液浓度指物质的量浓度而非质量浓度； 1、动物细胞的吸水和失水：（以红细胞为例，动物细胞的细胞膜相当于半透膜） ①当细胞质浓度大于外界溶液浓度时，细胞质渗透压高于外界渗透压，细胞吸水膨 胀 ②当细胞质浓度等于外界溶液浓度时，细胞质渗透压等于外界渗透压，水分子进出 细胞处于动态平衡。 ③当细胞质浓度小于外界溶液浓度时，细胞质渗透压低于外界渗透压，细胞失水皱 缩 植物细胞的吸水和失水： 结构基础： （1）细胞液：成熟植物细胞的中央大液泡占据了细胞的大部分空间，将细胞质挤成一薄层，因此细胞内的液体环境主要指液泡的细胞液。 （2）原生质层：细胞膜和液泡膜以及两层膜之间的细胞质称为原生质层。相当于半透膜，具有选择透过性 （3）细胞壁的特性：全透性，伸缩性小 植物细胞的质壁分离和复原现象 ①当细胞液浓度小于外界溶液浓度时，细胞失水，发生质壁分离现象 ②当细胞液浓度大于外界溶液浓度时，细胞吸水，发生质壁分离复原现象。

注意：如果质壁分离的细胞死亡，则不会发生质壁分离的复原。 实验探究： 材料选取：紫色洋葱鳞片叶（含有颜色为佳，也可选水绵细胞） 实验结果：质壁分离前，细胞呈现紫色，原生质层紧贴细胞壁；当加入蔗糖溶液后，液泡由大变小，颜色由浅变深，原生质层与细胞壁分离；对质壁分离的细胞加入清水后，液泡由小变大，颜色由深变浅，原生质层恢复原状。 思考：不含中央大液泡的植物细胞（如根尖分生区细胞、种子的胚细胞）能发生质壁分离的现象吗？ 不能，因为不含大液泡的植物细胞不会失去较多的水，因此不会发生质壁分离的现象 细胞对无机盐离子的吸收实例： 1、水稻吸收SiO 44-多，吸收Ca2+和Mg2+少，番茄吸收Ca2+和Mg2+较多，吸收SiO 4 4-较少， 说明不同植物对不同的无机盐离子吸收表现出较大的差异。 2、人体甲状腺滤泡上皮细胞中碘的含量明显高于血液中碘的含量。 3、不同微生物对无机盐离子吸收表现出很大的差异。 物质跨膜运输的特点： 1、物质跨膜运输并不都是顺相对含量梯度的。 2、细胞对于物质的输入和输出有选择透过性。

氨基葡萄糖盐酸盐分析方法比较

氨基葡萄糖盐酸盐分析方法比较 摘要：分别采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法（HPLC-ELSD）、高效液相色谱-示差折光检测法（HPLC-RID）和高效离子色谱-脉冲安培检测法（HPIC-PAD）检测氨基葡萄糖盐酸盐，确定了几种方法的检测限和线性范围，考察了方法的精密度，测定了氨基葡萄糖盐酸盐的加标回收率。结果显示，在三种方法中HPIC-PAD方法能测定到最低浓度的氨基葡萄糖盐酸盐，且具有最高的精密度；HPLC-RID方法检测限最高，精密度最差。 关键词：高效液相色谱，高效离子色谱，蒸发光散射，示差折光，脉冲安培检测 前言： 氨基葡萄糖类物质具有重要的生理活性，Elson-Morgan法[1]是此类物质测定的经典方法，由于其只能测定总的糖类而使其应用受到限制。多种色谱方法在糖类的分析中发挥着重要作用，如气相色谱法[2]（GC）、凝胶色谱法[3]（GPC）、高效毛细管电泳法[4]（HPCE）、高效液相色谱法[5,,,678]（HPLC）、高效离子色谱法[9,10]（HPIC）等。这些检测方法对不同糖类化合物的检测分析各有不同的优势。最常用的糖类化合物的分析方法为高效液相色谱法，近年来离子色谱技术在糖类化合物分析中的应用也越来越广泛。 本文对几种糖类物质测定方法在氨基葡萄糖盐酸盐分析中的应用进行了比较，为氨基葡萄糖类物质分析的方法选择提供指导。 1、实验仪器和材料 1.1试剂和样品 乙腈（TEDIA，HPLC级），超纯水（Milli-Q），氨水（西陇化工，分析纯） 氨基葡萄糖盐酸盐标准样品（国家海洋局第三海洋研究所），氨基葡萄糖盐酸盐对照品（中国药品生物制品检定所），硫酸氨基葡萄糖胶囊（由厦门蓝湾科技有限公司提供） 准确称取、精确定容的浓度为40.00mg/mL和1.00mg/mL的氨基葡萄糖盐酸盐标准储备液。 1.2仪器和条件 电子天平（Sartorius BP211D），Milli-Q Biocel A10超纯水机（Millipore） HPLC-ELSD法：Waters-Alliance 2695型高效液相色谱仪，Alltech ELSD800蒸发光散射检测器，Waters Carbohydrate柱（250 mm×4.6 mm，4μm）；流动相为乙腈：水=70：30；流速：1.0 mL/min；柱温：28oC；ELSD参数：载气流速为3.00L/min，蒸发管温度为80oC。 HPLC-RID法：高效液相色谱仪（Waters），K-2401 RI 检测器（诺尔KNAUER），氨基

葡萄糖与氨基酸的跨膜转运机制

葡萄糖与氨基酸的跨膜转运机制 物质的跨膜运输是高考的一个高频考点，统计发现：近5年在新课标全国卷中出现的频率为0.8，刚好最近正在指导学生的“物质跨膜方式”的相关复习，感觉学生对这方面的理解没有一个很好的逻辑，判断跨膜输运方式纯粹靠背诵记忆，非常机械，不能站在生命系统的范围去理解，缺乏生命观念和科学思维。为了让学生在复习后对跨膜运输有个清晰的认识和理解，彻底突破瓶颈，备课时我特意查阅了一些知网上的文献。先说一下我的总体思路： 生物膜的成分——生物膜的结构（流动镶嵌模型）——物质的跨膜运输。 一、举例分析： ①氧气、二氧化碳、氮气、水、乙醇（共性：比磷脂分子的缝隙小，自由穿过） ②苯、甘油（共性：脂溶性，与磷脂互溶，也自由穿过） ③氨基酸、葡萄糖、核苷酸（较大（比缝隙大）：需借助蛋白质） ④钠离子、钾离子（离子很小，但溶液中水合离子较大（比缝隙大）：需借助蛋白质） ⑤大分子物质（大过膜蛋白：需借助囊泡） 二、归纳： 1.很小的分子和脂溶性物质：自由扩散。比如①② 2.不大不小的：借助蛋白质（载体蛋白和通道蛋白），比如③④ 3.很大很大的：借助囊泡（胞吞和胞吐），比如⑤ 提示：水分子跨膜运输的方式：自由扩散和水通道蛋白介导的协助扩散（做题时，如题干没有信息提示，一般认为水分子跨膜运输的方式是自由扩散）。 三、摆事实（资料） 小肠上皮细胞靠近肠腔一端的细胞膜呈“刷”状，这大大增加了细胞膜的表面积，有人经过计算，发现小肠的吸收面积如果全部展开，足有400平方米之大。这么大的吸收面积，足以导致食物分解后在局部形成的葡萄糖浓度比小肠上皮细胞中的要低。还有肾小管上皮细胞对葡萄糖的重吸收也是如此。（方式：主动运输） 由于主动运输的原因，小肠上皮细胞的葡萄糖浓度明显大于组织液中的葡萄糖浓

NAG N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶检测试剂盒(速率法)

N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶检测试剂盒（速率法）说明书 【产品名称】通用名称：N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶检测试剂盒（速率法） 英文名称： N-acetyl-β-D-glucosaminidase Assay Kit （NAG ） 【包装规格】R 1：2?40ml R 2：2?10ml 、R 1：2?60ml R 2：2?15ml 、R 1：2?20ml R 2：2?5ml ，校准 品（选配）：1?1ml 、质控品（选配）：1?1ml 。 【预期用途】用于临床实验体外定量分析人尿液中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的活力。临床上主要用于辅助评价肾小管损害。 【检验原理】采用6-甲基-2-巯基吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷（MPT-NAG ）为基质。此基质在样品中的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG ）的作用下，分解生成6-甲基-2-巯基吡啶（MPT ）。通过测定MPT 在340nm 处吸光度的增加速度可求得NAG 的活力。 NAG MPT-NAG+ H 2 O MPT+ N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖（NAG 糖苷） 【主要组成成份】由试剂R 1、试剂R 2和校准品、质控品组成。试剂R 1：磷酸氢二钠缓冲液；试剂R 2：磷酸氢二钠缓冲液，6-甲基-2-巯基吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷（MPT-NAG ）。校准品:N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（ NAG ）、磷酸氢二钠；质控品：磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶 注：校准品浓度具体见每批瓶标签，校准品可溯源至Roche 参考品；质控品浓度具有批特异性，见瓶标签；不同批号试剂盒中各组分不可以互换。 【储存条件及有效期】试剂和校准品、质控品在2℃～8℃无腐蚀性气体中避光储存，若无污染，可稳定至失效期，有效期为365天。试剂开瓶后2℃～8℃可稳定15天。质控品复溶后在2～8℃条件下可稳定1周。 【适用仪器】日立7170、奥林巴斯AU640、贝克曼LX-20全自动生化分析仪。 【样本要求】 1、新鲜随机尿液。 2、如尿液标本不能及时测定，4℃冷藏不应超过7天，避免冷冻。有菌尿时（如泌尿系统感染），应及时检测，避免细菌繁殖，影响测定值。 3、当样品中的抗坏血酸、葡萄糖、血红蛋白超过一定浓度时影响NAG 的测定。 4、样品应在低温条件下运输保存， 【检验方法】 （1）双试剂无需配制，直接使用。 （2）试验条件：样本（S ）：15 μl 试剂1(R 1) ：200 μl 试剂2（R 2）：50 μl 温度：37 ℃ 测定类型：速率法 主波长：340 nm 副波长：700 nm 反应方向：上升 方法：先将样本与R 1混合，37 ℃5分钟后加入R 2试剂，然后测定加入R 2后3分钟至5分钟之△A/min 。 测定空白吸光度（A 1） 测定反应吸光度（A 2） 0 5 8 10 （反应时间：10min ） 37℃ R 12（3）校准程序：使用校准品进行校准，每次更换试剂批次时都应进行校准。校准后，各实验室要用质 控品验证。如果质控结果不在可接受范围值内，则需要进行重新校准。 （4）质量控制程序：选用适当的质控品进行质量控制。各实验室建立各自的质控频率和可接受范围值。 当测定结果超出可接受范围时，有必要采取相应措施。 （5）计算 （A 2 - A 1）样品

物质的跨膜运输方式教案(详案)

第3节物质的跨膜运输方式 一、,教材分析 1、教材的地位和作用 《物质跨膜运输的方式》是人教版必修一第四章第三节的内容,本模块第3章已经介绍了细胞膜的化学组成和细胞膜结构以及大致的功能,本节着重介绍细胞膜控制物质进出这一重要功能,包括小分子或离子进出细胞的方式和大分子物质进出细胞的方式。通过对几种跨膜运输方式的探究,，培养学生对图表数据的解读能力,即信息解读和知识迁移转化的能力及运用建模思想构建生物学数学模型的能力。.这部分内容和前面所学的"分泌蛋白的合成和运输"有关联的地方,同时又是对生物膜具有流动性和选择透过性的一个很好的佐证.对学生理解细胞是基本的生命系统有着重要的意义。 2、对课程标准的理解 （1）课程标准：说出物质进出细胞的方式；进行图表数据解读。 （2）我的理解：物质进出细胞的方式包括三种跨膜运输和胞吞胞吐方式，这与细胞膜系统的结构和功能密切相关。要求学生能够举例说明并描述这些运输方式的基本特征，并且与之前所学知识融会贯通。同时训练学生解读图表数据的能力，学会分析资料及数据并得出相关结论。 3、教学目标 根据新课程标准的要求和教材的具体内容,根据学生的实际情况,拟定了下列教学目标: (1)知识与技能目标 a、能举例说出物质跨膜运输方式的类型及特点。 b、通过对教材的阅读和探究,说明被动运输与主动运输方式的异同点。 c、阐述主动运输对细胞生活的意义。. d、能正确解读柱形图。 (2)能力目标 a、通过学生对教材的阅读、思考，总结归纳出三种运输方式的特点，培养学生获取信息的能力。 b、通过学生对物质进出细胞的几种方式的探究和对比，培养学生探究能力和对比归纳能力。