invitrog逆转录试剂盒说明书

ThermoScript ? RT-PCR System

Catalog nos. (25 reactions): Catalog nos. (100 reactions): 11146-024

11146-016

11146-057 (w/ Platinum ? Taq DNA polymerase) 11146-032 (w/ Platinum ? Taq DNA polymerase)

11146-040 (w/ Platinum ? Taq DNA polymerase High Fidelity)

Store at -20°C (stability can be extended by storing at -70°C)

Description

The ThermoScript ? RT-PCR System is designed for the sensitive and reproducible detection and analysis of RNA molecules in a two-step process. ThermoScript ? RT, an avian reverse transcriptase with reduced RNase H activity, is engineered to have higher thermal stability,

produce higher yields of cDNA, and produce more full-length cDNA transcripts than AMV RT. cDNA synthesis is performed in the first step using either total RNA or poly(A)+-selected RNA primed with oligo(dT), random primers or a gene-specific primer, at 50-65°C. In the second step, PCR is performed in a separate tube using primers specific for the gene of interest. RNA targets from 100 bp to >12 kb can be detected with this system, using 10 pg to 5 Yg of total RNA. PCR is carried out with Platinum ? Taq DNA Polymerase or Platinum ? Taq DNA Polymerase High Fidelity. Platinum ? Taq DNA Polymerase High Fidelity is suitable for templates from 100 bp to >12 kb. Platinum ? Taq DNA polymerase (1) provides automatic hot-start conditions for increased specificity up to 3 kb.

Reagents are provided for 25 or 100 cDNA synthesis reactions of 20 μl each and 25 or 100 amplification reactions of 50 μl each.

Component 25 rxn kit 100 rxn kit ThermoScript ? RT (15 U/Yl) 25 μl 100 μl 5X cDNA Synthesis Buffer* 500 μl 500 μl 0.1 M DTT 250 μl 250 μl 10 mM dNTP Mix 100 μl 2 × 250 μl

RNaseOUT ? (40 U/Yl) 25 μl 100 μl

Oligo (dT)20 (50 YM) 25 μl 100 μl

Random Hexamers (50 ng/Yl) 50 μl 250 μl

DEPC-Treated Water 1.25 ml 1.25 ml

E . coli RNase H (2 U/Yl) 50 μl 2 × 50 μl

*250 mM Tris acetate (pH 8.4), 375 mM potassium acetate, 40 mM

magnesium acetate, stabilizer

Catalog numbers 11146-057 (25 rxns) and 11146-032 (100 rxns) include the following, in addition to the components to the left:

Component 25 rxn kit 100 rxn kit

Platinum ? Taq DNA polymerase (5 U/Yl) 100 units 250 units

10X PCR buffer Minus Mg 1.0 ml 1.0 ml 50 mM MgCl 2 1.0 ml 1.0 ml Catalog number 11146-040 (100 rxns) includes the following, in addition to the components to the left: Component 100 rxn kit Platinum ?

Taq DNA Polymerase High Fidelity (5 U/μl) 100 units 10X High Fidelity PCR Buffer 1.0 ml 50 mM MgSO 4 1.0 ml Quality Control

The Certificate of Analysis (CofA) provides detailed quality control information for each product. The CofA is available on our website at

https://www.sodocs.net/doc/801762786.html,/cofa, and is searchable by product lot number, which is printed on each box .

Summary of Procedure

Part no. 11146.pps MAN0000941 Rev. date: 11 Jun 2010

20 GSP

r andom hexame r C, 30-60 min 50-65°C, 30-60 min 25°C, 10 min ↓ 50-60°C, 20-50 min

↓

85°C, 5 min

↓ Add 1 μl RNase H 37°C, 20 min ↓ Remove 2 μl aliquot for PCR

Water 1 *If less than 1 ng of RNA is used, reduce the amount of ThermoScript RT in the reaction to 0.5 μl. For technical support, email tech_support@https://www.sodocs.net/doc/801762786.html,. For country-specific contact information, visit https://www.sodocs.net/doc/801762786.html, .

Page 2 of 4 Important Parameters to Consider

RNA

?High quality intact RNA is essential for successful full-length cDNA synthesis and successful long RT-

PCR.

?RNA should be devoid of any RNase contamination and aseptic conditions should be maintained. ?Recommended methods of total RNA isolation include the Micro-to-Midi Total RNA Purification

System (Catalog no. 12183-018) and TRIzol? Reagent

(Catalog no. 15596-026) (2, 3). Oligo(dT)-selection for

poly(A)+ RNA is typically not necessary, although

incorporating this step may improve the yield of

specific cDNAs.

cDNA Synthesis Primers

?Oligo(dT)20 (50 pmoles/reaction) is recommended for priming polyadenylated RNA. Use of Oligo(dT)20

allows the detection of multiple transcripts from a

single first-strand reaction.

?Random hexamers (50-250 ng/reaction) are efficient primers for the detection of multiple short RT-PCR

targets. Use of more than 50-100 ng primer/Yg of

RNA can increase the yield of short products but may inhibit detection of long targets (>3kb) or rare

transcripts. If random hexamers are used, the first-

strand reaction must be incubated at 25°C for 10 min

to extend the primers prior to increasing the reaction

temperature for synthesis.

?Gene-specific primers (GSP) should be used at 10 to

20 pmol/reaction. Specificity of priming may be

improved by optimizing annealing/reaction

temperature.

?Treatment of cDNA with RNase H to remove the complementary RNA prior to PCR is optional. RNase

H digestion will improve the RT-PCR signal of many

targets and is required for the efficient and consistent

amplification of long RT-PCR templates.

cDNA Synthesis Reaction

?Denaturation of the RNA template and primer by incubating at 65°C for 5 min is optional. Most targets

can be reverse transcribed efficiently without this step.

However, heating the RNA in the absence of reaction

buffer and enzyme prior to cDNA synthesis can

remove secondary structure that may impede full-

length cDNA synthesis.

?ThermoScript? RT can be used at 50-65°C. We recommend incubation at 50-55°C for most RT-PCR

targets. However, incubation at 50-60°C for oligo(dT)

and 50-65°C for gene-specific primers can be

employed to reduce secondary structure or to improve specificity.

?Most targets can be amplified after only a 30-min incubation for the first-strand reaction. Rare RNAs,

long transcripts, or targets at the 5′ end of long

transcripts benefit from longer incubation times (50-60 min).PCR Primers

? A final primer concentration of 0.2 - 0.4 μM for each primer is generally optimal; however, a primer

titration is recommended for best results.

?Design primers that anneal to sequence in exons on both sides of an intron or exon/exon boundary of the mRNA to allow differentiation between amplification of cDNA and potential contaminating genomic DNA. ?Primers should not be self-complementary or complementary to each other at the 3′ ends.

PCR Reactions

?Most targets will be efficiently amplified using 2 Yl or less of the cDNA synthesis reaction.

?The optimum magnesium concentration varies from

1.5 to 3 mM. Generally, 1.82 mM magnesium chloride

for Platinum? Taq DNA polymerase and 2.32 mM

magnesium sulfate for Platinum? Taq DNA

Polymerase High Fidelity is effective for most primer sets. However, titration of the magnesium

concentration is recommended for the best result.

Each Yl of the cDNA synthesis reaction adds 0.16 mM to the final magnesium concentration in a 50-μl PCR

reaction.

?Assemble the PCR reactions on ice, transfer them to a pre-heated thermal cycler (85-95°C) and immediately start the PCR amplification program.

?The annealing temperature should be 10°C below the melting temperature of the primers used.

?The optimum extension temperature for Platinum?Taq DNA Polymerase High Fidelity is 68°C. The

extension time varies with the size of the amplicon

(approximately 1 min per 1 kb of amplicon).

Page 3 of 4

cDNA Synthesis

1. In a 0.2- or 0.5-ml tube, combine primer (50 μM Oligo(dT)20,

50 ng/μl random primer or 10 μM gene-specific primer), RNA, and dNTP mix and adjust volume to 12 Yl with

DEPC-treated water.

Component Amount

Primer 1 Yl

RNA (10 pg -5 Yg) x Yl

10 mM dNTP Mix 2 Yl

DEPC-treated water to 12 Yl

2. Denature RNA and primer by incubating at 65°C for 5 min

and then place on ice (optional).

3. Vortex the 5X cDNA Synthesis Buffer for 5 s just prior to

use.

4. Prepare a master reaction mix on ice and vortex gently.

Component 1 Reaction 10 Reactions

5x cDNA Synthesis Buffer 4 Yl 40 Yl

0.1 M DTT 1 Yl 10 Yl

RNaseOUT? (40 U/Yl) 1 Yl 10 Yl

DEPC-treated water 1 Yl 10 Yl

ThermoScript? RT (15 units/Yl)1 Yl* 10 Yl*

*NOTE: If less than 1 ng of template RNA is used, reduce the amount of ThermoScript? RT in the reaction to 0.5 μl/reaction

(5 μl/10 reactions). Increase the amount of DEPC-treated

water in the master reaction mix to 1.5 μl/reaction (15 μl/10 reactions).

5. Pipet 8 Yl of master reaction mix into each reaction tube on ice.

6. Transfer the sample to a thermal cycler preheated to the appropriate cDNA synthesis temperature and incubate as follows.

Oligo(dT)20 primed: 30-60 min at 50°C (or 50-60°C)

Gene-specific primed 30-60 min at 50°C (or 50-65°C) Random-hexamer primed: 25°C for 10 min, followed by 20-

50 min at 50°C (or 50-65°C)

7. Terminate the reaction by incubating at 85°C for 5 min.

8. Add 1 Yl of RNase H and incubate at 37°C for 20 min (optional).

9. cDNA synthesis reactions can be stored at -20°C or used for PCR immediately.

PCR with Platinum?Taq DNA Polymerase High Fidelity

Use only 10% of the cDNA synthesis reaction (2 Yl) for PCR.

Use of 2 μl of 50 mM MgSO4 and 2 Yl of cDNA (0.32 mM magnesium in a 50-Yl PCR) results in a final concentration of

2.32 mM magnesium, which is effective for most primer sets. However, titration of the magnesium concentration with the provided 50 mM MgSO4 is recommended for best results.

1. Add the following to a 0.2- or 0.5-ml, thin-walled, PCR tube: Component 1 Reaction 10 Reactions

10X High Fidelity PCR Buffer 5 Yl 50 Yl

50 mM MgSO4 2

μl 20

μl

10 mM dNTP Mix 1 Yl 10 Yl

10 YM sense primer 1 Yl 10 Yl

10 YM antisense primer 1 Yl 10 Yl

Platinum?Taq High Fidelity 0.2 Yl 2 Yl

cDNA (from cDNA synthesis reaction) 2 Yl 20 Yl

DEPC-treated water 37.8 Yl 378 Yl

Final volume 50 Yl 500 μl 2. Mix gently and overlay with silicone oil or mineral oil if the

thermal cycler lacks a heated lid.

3. Incubate at 94°C for 2 min, then perform 20 to 40 cycles of

PCR with optimized conditions for your sample (1 min/kb extension time at 68°C).

4. Analyze 10 Yl of the amplified sample by agarose gel

electrophoresis.

PCR with Platinum? Taq DNA Polymerase

Use only 10% of the cDNA synthesis reaction (2 Yl) for PCR. Use of 50 mM MgCl2 and 2 Yl of cDNA will result in a final magnesium concentration of 1.82 mM, which is adequate for most primers and targets. However, titration of magnesium concentration is recommended for best results.

1. Add the following to a 0.2- or 0.5-ml, thin-walled, PCR tube: Component 1 Reaction 10 Reactions 10X PCR Buffer Minus Mg 5 Yl 50 Yl

50 mM MgCl2 1.5 Yl 15 Yl

10 mM dNTP Mix 1 Yl 10 Yl

10 YM sense primer 1 Yl 10 Yl

10 YM antisense primer 1 Yl 10 Yl

Platinum?Taq DNA polymerase 0.4 Yl 4 Yl

(5 U /Yl)

cDNA (from cDNA synthesis reaction) 2 Yl 20 Yl DEPC-treated water 38.1 Yl 381 Yl Final volume 50 Yl 500 μl 2. Mix gently and overlay with silicone oil or mineral oil if the

thermal cycler lacks a heated lid.

3. Incubate at 94°C for 2 min, then perform 20 to 40 cycles of

PCR with optimized conditions for your sample (1 min/kb extension time at 68-72°C)

4. Analyze 10 Yl of the amplified sample by agarose gel

electrophoresis.

Control Reactions

An RT-PCR Primer and Control Set is available separately for monitoring the performance of the system (Cat. Number 10929-016).

1. Use 1 ng of the Control RNA in the cDNA Synthesis

Reaction.

2. Perform the PCR using Platinum? Taq DNA Polymerase, as described above.

Page 4 of 4 Troubleshooting Guide

Problem Possible cause Possible solution

No RT-PCR product No cDNA synthesis (temperature too high) For the cDNA synthesis step, incubate at 45-50°C.

Incomplete synthesis of target cDNA (secondary structure of RNA blocks synthesis) For the cDNA synthesis step, incubate at 50-70°C. For long mRNAs, increase cDNA synthesis incubation time (up to 50 min)

RNase contamination Maintain aseptic conditions; add RNaseOUT? (RNase

inhibitor).

Concentration of template RNA in reaction is too low Increase the concentration of template RNA; use 1-5 μg of total RNA or reduce the volume of ThermoScript? RT used in the reaction.

RNA has been damaged or degraded Replace RNA.

RT inhibitors are present in RNA Remove inhibitors in the RNA preparation by an

additional 70% ethanol wash after ethanol

precipation.

Note: Inhibitors of RT include SDS, EDTA,

guanidinium chloride, formamide, sodium

phosphate and spermidine (4).

Cycle number is too low Increase cycle number.

Low yield/low specificity in PCR Reaction conditions not optimal Optimize magnesium concentration.

Optimize the primer concentration

Optimize the annealing temperature and extension

time.

Increase temperature of RT reaction to 50-60°C.

Unexpected bands after electrophoresis RNA contamination with genomic DNA Pre-treat RNA with DNase I.

Redesign PCR primers to anneal to sequence in exons

on both sides of an intron in the target gene.

References

1.Westfall, B., Sitaraman, K., Solus, J., Hughes, J., and Rashtchian, A. (1997) Focus?19, 46.

2.Chomczynski, P and Sacchi, N. (1987) Anal. Biochem. 162, 156.

3.Chirgwin, J.M., Przybyla, A.E., MacDonald, R.J., and Rutter, W.J. (1979) Biochemistry 18, 529

4.

4.Gerard, G.F (1994). Focus?16, 102.

Limited Use Label License No. 1: Thermostable Polymerases (applies to 11146-057, 11146-032, and 11146-040)

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天根 一步法逆转录PCR试剂盒说明书

通用型一步法RT-PCR试剂盒说明书 前言 本试剂盒适用于对各种动、植物、病毒RNA进行PCR 检测。用户可根据被分析基因，配合一对引物，或同时采用Taqman 荧光探针，先将提取的RNA反转录(reverse transcription).成cDNA，再经过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)技术对特异性片段进行扩增，进行电泳或实时荧光分析。 一步法RT-PCR可使RT及PCR过程在单管中完成，比分开进行RT及PCR更方便。由于不需要在RT完成后打开反应管，尽可能地避免了样品间的相互污染。 规格 20人份 适用仪器 适用于各种普通PCR仪器和实时荧光PCR仪器。 试剂盒组成 试剂准备 根据下表配制反应液： 振荡混匀后，按每管 40 μl(可根据需要调整)分装，备用。 PCR扩增 将均一化后的RNA提取样本10 μl加入各反应管，混匀、离心后，置普通PCR仪器或实时荧光PCR仪器上进行扩增及实

时检测。 结果判断 扩增产物可直接进行电泳检测；实时荧光检测可根据相应仪器的配套软件进行结果分析。 保存及有效期 -20℃保存，有效期为6个月。 注意事项 1. 开始检测前请仔细阅读本说明书全文。 2. 整个检测过程中，反应体系的配制、样本处理及加样、PCR扩增（荧光检测）应分区进行以避免污染。 3. 操作人员应戴口罩，经常更换一次性手套，以避免RNA酶的污染；实验中所用器具均应经过除RNA酶处理。 4. 试剂盒组成中的试剂使用前应充分融化并混匀。 5. 进行实时荧光分析时，应使用透光性能较好的一次性薄壁离心管；.荧光探针应避光保存，加入缓冲液中后，应尽快进行扩增。 6. 注意适当处理检测中遗留的样品、扩增产物及可能被污染的试剂。 生产企业： 上海蓝创生物科技发展有限公司

通用反转录试剂盒(M-MLV)使用说明

通用反转录试剂盒(M-MLV)使用说明 货号：RP1105 规格：50T/100T 保存：-20℃保存，避免反复冻融，复检期为1年。 产品内容： 试剂盒组成50次100次 M-MLV(200U/μL)50μL50μL×2 5×M-MLV Buffer200μL400μL (10uM)100μL200μL Oligo(dT) 16 RNasin(40U/μL)25μL50μL dNTPs(10mM)50μL100μL O1mL1mL×2 RNase-free ddH 2 说明书1份1份 产品简介： 通用反转录试剂盒适用于各种RNA制品的反转录反应。它采用M-MLV进行反转录反应，能够获得较长的反转录产物用于后续的PCR扩增和分子克隆实验。 通用反转录试剂盒中配置的酶为进口的酶。RT酶采用进口的M-MLV，所以cDNA更长，基因的信息保留得更完整！反转录过程中特异的RNase抑制剂可有效降低由于外源RNase污染而导致实验失败的风险。通用反转录试剂盒可广泛用于cDNA克隆及目的基因检测等分子生物学实验。 操作步骤： 一、反转录反应 1、在冰浴的无RNase的离心管中加入如下反应成分：

1-5μg总RNA或50-500ng mRNA 2μL Oligo(dT) 或2pmole基因特异性引物 16 O至14.5μL 补RNase-free ddH 2 2、70℃保温5min后迅速在冰上冷却2min，简短离心收集反应液后加入以下各组分： 4μL5×M-MLV Buffer 1μL dNTPs 0.5μL RNasin 1μL M-MLV 3、42℃温浴60min，如果是用随机引物，请先将离心管置25℃温浴10min，再42℃温浴60min。 4、95℃加热5min终止反应，置冰上进行后续实验或-20℃保存。 5、若用于后续PCR扩增,用RNase-free ddH2O将反应体系稀释到50μL，取2-5μL作为PCR 反应模板。 注意事项： 1、用于cDNA合成反应的相关试剂和耗材尽可能用DEPC进行处理，并在高压灭菌后使用。有些试剂不能高压灭菌时，首先用经过灭菌的器具、水等配制溶液后，再将溶液进行过滤除菌处理。 2、试剂盒的各组分应在-20℃保存，避免反复冻融，有效期12个月。 3、RNA样品要避免反复多次冻融，应使RNA在冰浴中处于融化状态。 相关试剂： PC2440Random PC2450Oligo T16 R1600DEPC处理水

通用RT-PCR试剂盒(M-MLV)

通用RT-PCR试剂盒(M-MLV) 货号：RP1100 规格：25T/50T/100T 保存：-20℃保存，避免反复冻融，复检期为1年。 产品内容： 试剂盒组成25次50次100次 M-MLV(200U/ul)25ul50ul50ul×2 5×M-MLV Buffer100ul200ul400ul (10uM)50ul100ul200ul Oligo(dT) 16 RNasin(40U/ul)12.5ul25ul50ul dNTPs(10mM)50ul100ul200ul Taq Polymerase(5U/ul)12.5ul25ul50ul 10×PCR Buffer125ul250ul500ul O500ul1ml1ml×2 RNase-free ddH 2 说明书1份1份1份 产品简介： 本试剂盒适用于各种RNA制品的反转录反应以及随后的PCR扩增。它采用M-MLV进行反转录反应，能够获得较长的反转录产物。同时，在20ul反转录体系和50ul PCR反应体系中，还可以一次性得到足够量的PCR产物用于后续的克隆实验。 操作步骤： 一、反转录反应 1、在冰浴的无RNase的离心管中加入如下反应成分： 1-5ug总RNA或50-500ng mRNA 或2pmole基因特异性引物 2ul Oligo(dT) 16 O至14.5ul 补RNase-free ddH 2 2、70℃保温5min后迅速在冰上冷却2min，简短离心收集反应液后加入以下各组分：

4ul5×M-MLV Buffer 1ul dNTPs 0.5ul RNasin 1ul M-MLV 3、42℃温浴60min，如果是用随机引物，请先将离心管置25℃温浴10min，再42℃温浴60min。 4、95℃加热5min终止反应，置冰上进行后续实验或-20℃保存。 5、用RNase-free ddH2O将反应体系稀释到50ul，取2-5ul进行PCR反应。 二、PCR反应 1、按以下各组分配制50ul PCR反应体系： 10×PCR Buffer5ul dNTPs1ul 上游引物（用户自备10um）1ul 下游引物（用户自备10um）1ul RT反应产物2ul Taq Polymerase0.5ul O x ul ddH 2 Total Volume50ul 2、混匀后短暂离心，PCR仪扩增，琼脂糖凝胶电泳观察结果。 注意事项： 1、用于cDNA合成反应的相关试剂和耗材尽可能用DEPC进行处理，并在高压灭菌后使用。有些试剂不能高压灭菌时，首先用经过灭菌的器具、水等配制溶液后，再将溶液进行过滤除菌处理。 2、试剂盒的各组分应在-20℃保存，避免反复冻融，有效期12个月。 3、RNA样品要避免反复多次冻融，应使RNA在冰浴中处于融化状态。

一步法RT-PCR试剂盒使用说明书

一步法RT-PCR 检测试剂盒 (一步法RT-PCR 扩增试剂盒) (目录号HS0612-2) 产品包装 保存条件 -20℃ 产品简介 本试剂盒是专为一步法RT-PCR 实验研制，逆转录和PCR 在同一反应体系中进行，反应过程中无需添加试剂，无需打开管盖，在避免污染的同时提高了检测灵敏度和实验效率。本试剂盒包括全新高效逆转录酶、快速热启动DNA 聚合酶，同时包含适用于逆转录和PCR 扩增的反应缓冲液和实验中所必需的反应组分。经过重组表达的SuperRT 逆转录酶RNase H 活性缺失，减少了逆转录反应中RNA 的降解，更容易获得全长的cDNA 。该逆转酶逆转录效率高，可对少量 RNA 模板进行良好的逆转录反应。SuperRT 逆转录酶与RNA 亲合性高，能通读GC 含量高，二级结构复杂的RNA 模板，获得高产量的cDNA 。PCR 反应使用的DNA 聚合酶具有扩增效率高、延伸速度快的优良性能。独特的缓冲体系使逆转录酶和聚合酶同时发挥最大功效。使用该试剂盒能够方便快捷的在同一个反应管内完成逆转录和PCR 扩增反应。使用本试剂盒扩增得到的目的产物3′端附有一个″A ″碱基，可直接用于T/A 克隆。 北京厚生博泰科技有限公司 Beijing Hooseen Biotech Co., Ltd.

产品特点 1. 效率高，可以高效转录GC含量高，二级结构复杂的RNA模板。 2. 耐热性及稳定性强。 3. 操作简单迅速,最大限度的避免污染。 4. 独特的缓冲体系使逆转录酶和聚合酶同时发挥最大功效。 使用方法

1）一般PCR实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5℃，退火时间一般为20 ~ 30秒，无法得到理想的扩增效率时，适当降低退火温度；发生非特异性反应时，提高退火温度，由此优化反应条件。 2）延伸时间根据所扩增的片段大小设定，本产品中所包含的DNA Polymerase的扩增效率为1 kb/30s。 3）可根据扩增产物的下游应用设定循环数。循环次数太少，扩增量不足；循环次数多，错配机率会增加，非特异性背景严重。所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数。 5. 反应结束后取5 ul反应产物，加入适量上样缓冲液后进行电泳检测结果。

逆转录试剂盒( transcriptor first strand cdna synthesis kit )操作步骤

Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 逆转录步骤 1，使用前解冻结冰的试剂 2，将试剂短暂离心 3，冰上操作：（操作RNA实验需要戴手套） 将模板与引物在PCR管上混合 试剂体积最终浓度 细胞总RNA 或 1 ug 总RNA 或10ng 多聚尾(A)+m RNA 多聚尾(A)+ mRNA 任选其中一个引物: Anchored-oligo(dT)18 Primer, 1 ul 2.5 uM 50 pmol/ul (vial 5) 或Random Hexamer Primer, 2ul 60uM 600 pmol/ul (vial 6) 或 Sequence-Specific Primer 可变0.5-2.5 uM 1%DEPC水, (vials 7 or 9) 可变使总体积为 13 ul 总体积13ul 注：以上为初次实验的推荐浓度。总RNA的适用浓度为10ug到5ng， 以及mRNA的适用浓度为1到100ng,当RNA模板浓度较低时添加10ug/ml 的MS2 RNA* 来稳定模板RNA。 4，（可选）65度水浴上述混合物10分钟，使模板引物混合物变性（确 保失活RNA二级结构），水浴后立即冰浴至少一分钟

5，往上述混合物继续加入以下试剂（冰上操作） 试剂体积最终浓度. Transcriptor Reverse Transcriptase 4 ul 1×(8 mM MgCl2) Reaction Buffer, 5× conc. (vial 2) Protector RNase Inhibitor, 0.5 ul 40 U/ul (vial 3) 20 U Deoxynucleotide Mix, 2 ul 每个1 mM 10 mM each (vial 4) Transcriptor Reverse 0.5 ul 10U Transcriptase, 20 U/ul (vial 1) 最终体积20 ul 注：小心混合上述试剂，不要振荡，短暂离心使试剂沉在管底6，将PCR管放在PCR仪上孵育，孵育条件如下：

RT-PCR试剂盒说明书

R T-P C R试剂盒说明书-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1

RT-PCR试剂盒说明书 公司：TIANGEN Order:0 Toll-free:800-990-6057/400-810-6057 TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD 版本号：KR121221 TIANScript RT Kit TIANScript cDNA第一链合成试剂盒 目录号：KR104 储存条件：-20℃保存。 产品介绍： TIANScript RT Kit（cDNA第一链合成试剂盒）是专为两步法RT-PCR第一步实验配制的，具有高灵敏度的RT-PCR反应系统，可以从极低量的总RNA或poly (A)+ RNA合成第一链cDNA。与PCR反应相结合，可用于检测稀有基因的表达、从极少量细胞中定量检测特定mRNA的表达水平、克隆特定基因的cDNA 片段等。 产品特点： 合理配备了与cDNA第一链合成反应相关的各种组分，该试剂盒中的TIANScript M-MLV具有高效的逆转录酶活性，对后续的PCR或定量PCR实验兼容性好，适合于各种PCR耐热聚合酶。 注意事项： 1. 用于cDNA合成反应的溶液试剂尽量可能用DEPC进行处理，并在高压灭菌后使用。有些试剂不能高压灭菌时，首先用经过灭菌的器具、水等配制溶液后，再将溶液进行过滤除菌处理。 2. RNA样品要避免基因组DNA污染。 3. 避免多次反复冻融RNA，使RNA保持在冰浴中处融化状态。 4. 试剂盒的各组成成分应在-20℃保存。 5. cDNA产物应置于-20℃保存。 操作步骤： 1. 在冰浴的无核酸酶的离心管中加入如下反应混合物： 1-5 μg总RNA或50-500 ng mRNA； 2 μl oligo (dT)15或2 μl Random或2 pmol基因特异引物；

通用RT-PCR试剂盒(M-MLV)使用说明

通用RT-PCR试剂盒(M-MLV)使用说明 货号：RP1100 规格：25T/50T/100T 保存：-20℃保存，避免反复冻融，复检期为1年。 产品内容： 试剂盒组成25次50次100次M-MLV(200U/ul)25ul50ul50ul×2 5×M-MLV Buffer100ul200ul400ul (10uM)50ul100ul200ul Oligo(dT) 16 RNasin(40U/ul)12.5ul25ul50ul dNTPs(10mM)50ul100ul200ul Taq Polymerase(5U/ul)12.5ul25ul50ul 10×PCR Buffer125ul250ul500ul O500ul1ml1ml×2 RNase-free ddH 2 说明书1份1份1份产品简介： 通用RT-PCR试剂盒(M-MLV)适用于各种RNA制品的反转录反应以及随后的PCR扩增。它采用M-MLV进行反转录反应，能够获得较长的反转录产物。同时，在20ul反转录体系和50ul PCR反应体系中，还可以一次性得到足够量的PCR产物用于后续的克隆实验。 通用RT-PCR试剂盒(M-MLV)中配置的酶均为进口的酶。RT酶采用进口的M-MLV，所以

cDNA更长，基因的信息保留得更完整！反转录过程中特异的RNase抑制剂可有效降低由于外源RNase污染而导致实验失败的风险。通用RT-PCR试剂盒(M-MLV)使用方便、快捷，可广泛用于cDNA克隆及目的基因检测等分子生物学实验。 操作步骤： 一、反转录反应 1、在冰浴的无RNase的离心管中加入如下反应成分： 1-5ug总RNA或50-500ng mRNA 2ul Oligo(dT)16或2pmole基因特异性引物 补RNase-free ddH2O至14.5ul 2、70℃保温5min后迅速在冰上冷却2min，简短离心收集反应液后加入以下各组分： 4ul5×M-MLV Buffer 1ul dNTPs 0.5ul RNasin 1ul M-MLV 3、42℃温浴60min，如果是用随机引物，请先将离心管置25℃温浴10min，再42℃温浴60min。 4、用RNase-free ddH2O将反应体系稀释到50ul，取2-5ul进行PCR反应。 二、PCR反应 1、按以下各组分配制50ul PCR反应体系：

Thermo Scientific Rever id First Strand cDNA Synthesis Kit K 说明书 第一链cDNA合成试剂盒

RevertAid?第一链cDNA Synthesis试剂盒 #K1621, #K1622 分析证明书 #K1621 Lot 质量控制 采用100 fg对照GAPDH RNA和对照引物进行RT-PCR反应，通过在1%琼脂糖上进行凝胶电泳和溴化乙锭染色显示得到足够量的496 bp的产物 质量认证人：Jurgita Zilinskiene 目录 页码 试剂盒组成 (2) 存储条件 (2) 产品说明 (2) 注意事项 (3) 操作步骤 (6) RT-PCR (6) 合成cDNA用于克隆 (7) 实验对照 (8) 问题分析与解决 (10)

试剂盒成分 RevertAid?第一链cDNA 合成试剂盒 20 次 #K1621 100 次 #K1622 RevertAid? M-MuLV 反转录酶（200 u*/μl ） 25 μl 120 μl RiboLock? RNA 酶抑制剂 (20 u**/μl) 25 μl 120 μl 5×反应缓冲液 （250 mM Tris-HCl (pH 8.3), 250 mM KCl, 20 mM MgCl 2, 50 mM DTT ）150 μl 500 μl 10mM dNTP 混合物 50 μl 250 μl Oligo(dT)18 引物 100 μM, 0.5 μg/μl (15 A 260 u/ml) 25 μl 120 μl 随机六聚体引物 100 μM, 0.2 μg/μl (6 A260 u/ml) 25 μl 120 μl GAPDH 正向引物, 10 μM 5’ – CAAGGTCATCCATGACAACTTTG – 3’ 20 μl 20 μl GAPDH 反向引物, 10 μM 5’ – GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG - 3’ 20 μl 20 μl 对照GAPDH RNA 1.3 kb 3’-poly(A) tailed RNA transcript, 0.05 μg/μl 20 μl 20 μl 无核酸酶高纯度水 2x1.25 ml 2x1.25 ml * 一个单位的RevertAid?M-MLV 逆转录酶在37℃10 分钟将1 nmol 的dTMP 转化为多核苷酸组分（吸附在DE81上）。 ** 一个单位的RiboLock?RNase 酶抑制剂抑制5ng RNA 酶A 50%的活性。 存储条件 试剂盒中所有组分应存储在-20°C 。对照用RNA 可存储于-70°C 以便长期使用。 产品说明 RevertAid?第一链cDNA 合成试剂盒以mRNA 或者总RNA 为模板，高效合成第一链cDNA 。本试剂盒使用RevertAid? M-MuLV 反转录酶，它的RNA 酶H 的活性与AMV 反转录酶相比较低。该反转录酶可耐受42-50°C 温度，合成的cDNA 片段长度达13kb 。 试剂盒中含有RiboLock? 重组RNA 酶抑制剂，防止RNA 降解，可耐受55°C 高温。 试剂盒同时含有oligo(dT)18和随机六聚体引物。随机六聚体引物与模板非特异性地结合，以总RNA 中任何RNA 为模板合成cDNA 。oligo(dT)18选择性和RNA 3’poly(A)配对结合，只以有poly(A)尾巴的mRNA 为模板合成cDNA 。使用本试剂盒也可采用序列特异性引物。 合成的第一链cDNA 能直接用作PCR 或荧光定量PCR 的模板，第二链cDNA 的合成或线性RNA 扩增，也可用于需要用带有放射性或非放射性核苷酸标记第一链cDNA 的实验，比如将标记好的第一链cDNA 作为杂交实验中的探针或者用于微阵列分析。

提逆转录步骤

【一、提RNA】 一、实验准备： 1、试剂：75%乙醇、Trizol、1.5mL 进口EP管、氯仿、异丙醇、进口枪头(RNA专用)、 2、配75%乙醇(DEPC水+无水乙醇)，放-20℃冰箱预冷； 3、预冷离心机(1.5mL EP管用的)； 4、清洁桌面，酒精喷过之后擦干，新手套、两层口罩； 二、操作步骤： 01、弃上清（不回收，直接倒去）； 02、1mL/孔 PBS洗两遍（不回收，直接倒去，随后用200μL枪吸尽PBS）； 03、每孔加500μL Trizol，轻晃，随后室温放置2min左右； 04、枪头吹打，吸出放入1.5mL 进口EP管； 05、加入100μL氯仿(即1/5体积的trizol)； 06、4℃离心机，12000g，15min； 07、吸200μL(可减少)上清放入新的1.5mL 进口EP管中（注意：只能吸到上清）； 08、加入等体积异丙醇，充分混匀，常温放置10-30min(15min)； 09、4℃离心机，12000g，10min； 10、倒掉液体，加入1mL预冷的75%乙醇剧烈混匀； 11、4℃离心机，7500g，5min； 12、倒掉上清，加入1mL预冷的75%乙醇，混匀； 13、4℃离心机，7500g，5min； 14、倒掉上清，倒扣在餐巾纸上，5-10min，用针头或者200微升枪头去掉管壁上的水珠； 15、每管中加入40μL(40μ-60μL)的DEPC水，吹打溶解； 16、测浓度（先知楼21楼测RNA浓度，带DEPC水、灭菌的dd水、10微升枪和枪头）； 三、注意事项 01、如果当时不测RNA浓度，可暂时把RNA放在-20℃冰箱。但长时间(>24h)保存，需要放在-80℃冰箱； 02、异丙醇作用是沉淀RNA，作用比乙醇好； 03、 04、 05、 06、 07、 08、 09、 【二、测RNA浓度】 一、实验准备： 01、先知楼21楼-2109教室，一个冰盒+DEPC水+10微升枪、灭菌dd H2O、10μL枪头(RNA 专用)、本子+笔； 二、操作步骤： 01、登记； 02、打开电脑==>打开“N”软件==>点击“Nucleic acid”==>选择“OK”==>选择“RNA”； 03、灭菌dd H2O清洗2-3遍，擦干；

invitrog逆转录试剂盒说明书

ThermoScript ? RT-PCR System Catalog nos. (25 reactions): Catalog nos. (100 reactions): 11146-024 11146-016 11146-057 (w/ Platinum ? Taq DNA polymerase) 11146-032 (w/ Platinum ? Taq DNA polymerase) 11146-040 (w/ Platinum ? Taq DNA polymerase High Fidelity) Store at -20°C (stability can be extended by storing at -70°C) Description The ThermoScript ? RT-PCR System is designed for the sensitive and reproducible detection and analysis of RNA molecules in a two-step process. ThermoScript ? RT, an avian reverse transcriptase with reduced RNase H activity, is engineered to have higher thermal stability, produce higher yields of cDNA, and produce more full-length cDNA transcripts than AMV RT. cDNA synthesis is performed in the first step using either total RNA or poly(A)+-selected RNA primed with oligo(dT), random primers or a gene-specific primer, at 50-65°C. In the second step, PCR is performed in a separate tube using primers specific for the gene of interest. RNA targets from 100 bp to >12 kb can be detected with this system, using 10 pg to 5 Yg of total RNA. PCR is carried out with Platinum ? Taq DNA Polymerase or Platinum ? Taq DNA Polymerase High Fidelity. Platinum ? Taq DNA Polymerase High Fidelity is suitable for templates from 100 bp to >12 kb. Platinum ? Taq DNA polymerase (1) provides automatic hot-start conditions for increased specificity up to 3 kb. Reagents are provided for 25 or 100 cDNA synthesis reactions of 20 μl each and 25 or 100 amplification reactions of 50 μl each. Component 25 rxn kit 100 rxn kit ThermoScript ? RT (15 U/Yl) 25 μl 100 μl 5X cDNA Synthesis Buffer* 500 μl 500 μl 0.1 M DTT 250 μl 250 μl 10 mM dNTP Mix 100 μl 2 × 250 μl RNaseOUT ? (40 U/Yl) 25 μl 100 μl Oligo (dT)20 (50 YM) 25 μl 100 μl Random Hexamers (50 ng/Yl) 50 μl 250 μl DEPC-Treated Water 1.25 ml 1.25 ml E . coli RNase H (2 U/Yl) 50 μl 2 × 50 μl *250 mM Tris acetate (pH 8.4), 375 mM potassium acetate, 40 mM magnesium acetate, stabilizer Catalog numbers 11146-057 (25 rxns) and 11146-032 (100 rxns) include the following, in addition to the components to the left: Component 25 rxn kit 100 rxn kit Platinum ? Taq DNA polymerase (5 U/Yl) 100 units 250 units 10X PCR buffer Minus Mg 1.0 ml 1.0 ml 50 mM MgCl 2 1.0 ml 1.0 ml Catalog number 11146-040 (100 rxns) includes the following, in addition to the components to the left: Component 100 rxn kit Platinum ? Taq DNA Polymerase High Fidelity (5 U/μl) 100 units 10X High Fidelity PCR Buffer 1.0 ml 50 mM MgSO 4 1.0 ml Quality Control The Certificate of Analysis (CofA) provides detailed quality control information for each product. The CofA is available on our website at https://www.sodocs.net/doc/801762786.html,/cofa, and is searchable by product lot number, which is printed on each box . Summary of Procedure Part no. 11146.pps MAN0000941 Rev. date: 11 Jun 2010 20 GSP r andom hexame r C, 30-60 min 50-65°C, 30-60 min 25°C, 10 min ↓ 50-60°C, 20-50 min ↓ 85°C, 5 min ↓ Add 1 μl RNase H 37°C, 20 min ↓ Remove 2 μl aliquot for PCR Water 1 *If less than 1 ng of RNA is used, reduce the amount of ThermoScript RT in the reaction to 0.5 μl. For technical support, email tech_support@https://www.sodocs.net/doc/801762786.html,. For country-specific contact information, visit https://www.sodocs.net/doc/801762786.html, .

罗氏第一链cDNA合成试剂盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 中文说明书

反应次数目录号反应次数 04 379 012 001 50次，包括10次对照反应 04 896 866 001 100次 04 897 030 001 200次 试剂盒包装与含量小瓶/瓶盖标签适用于a) 04 379 012 001 b) 04 896 866 001 c) 04 897 030 001 1 红色 Transcriptor Reverse Transcriptase（逆转录酶） a) 1瓶，25 μl (20 U/μl) b) 1瓶，50 μl (20 U/μl) c) 2瓶，各50 μl (20 U/ μl) 储存缓冲液：200 mM 磷酸钾，2 mM 二硫苏糖醇，0.2% Triton X-100(v/v)，50% 甘油(v/v)，pH 约为7.2? 2 无色 Transcriptor RT Reaction Buffer(5×) （逆转录缓冲液） a) 1瓶，1 ml b) 1瓶，1 ml c) 2瓶，各1 ml 5×浓度：250 mM Tris/HCl，150 mM KCl，40 mM MgCl2，pH约为8.5(25°C)? 3 无色 Protector RNase Inhibitor （RNase抑制剂） a) 1瓶，50 μl(40 U/μl) b) 1瓶，100 μl(40 U/μl) c) 2瓶，各100 μl(40 U/μl) 储存缓冲液：20 mM Hepes-KOH，50 mM KCl，8 mM 二硫苏糖醇，50 % 甘油(v/v)，pH 约为7.6 (4°C)? 4 黄色/ 紫色 Deoxynuc-leo-tide Mix （dNTP） a) 1瓶，100 μl(黄色瓶盖) b) 1瓶，200 μl(紫色瓶盖) c) 2瓶，各200 μl(紫色瓶盖) dATP, dCTP, dGTP, dTTP各10 mM?5 蓝色 Anchored-oligo(dT)18 Primer （锚定oligo(dT)18引物） a) 1瓶，100 μl(50 μM) b) 1瓶，200 μl(50 μM) c) 2瓶，各200 μl(50 μM) 6 Random Hexamer a) 1瓶，100 μl(600 μM) 蓝色 Primer（随机引物） b) 1瓶，200 μl(600 μM) c) 2瓶，各200 μl(600 μM) 7 绿色 Control RNA （对照RNA） a) 1瓶，20 μl(50 ng/μl) 包含提取于永生细胞系(K562)的总RNA 片段稳定溶液? 8 绿色 Control Primer Mix PBGD （对照基因引物） a) 1瓶，40 μl 5 μM 人类PBGD特异性正向与反向引物? 9(b和c为瓶7) 无色 Water, PCR-grade a) 1瓶，1 ml b) 2瓶，各1 ml c) 3瓶，各1 ml 注意：货号为04 896 866 001和04 897

bcrabl融合基因荧光定量rtpcr诊断试剂盒说明书

PML/RARα融合基因荧光RT-PCR诊断试剂盒 一、试剂盒采用荧光定量RT-PCR方法，快速、特异、灵敏、定量地检测临床白血病标本中PML/RARα融合基因的情况, 约有90%的急性早幼粒细胞白血病患者骨髓细胞和血细胞中会出现PML/RARα融合基因。因此检测PML/RARα融合基因已成为诊断急性早幼粒细胞白血病以及治疗后追踪残余白血病细胞的主要依据。 二、试剂盒组成(20人份) RNA提取液（20ml /瓶）1瓶Taq酶（40μl /管）1管 反应液I （165μl /管）1管定量标准品（50μl /管）8管 反应液II （165μl /管）1管DEPC H2O （500μl /管）1管 反应液Ⅲ（350μl /管）1管去离子水（1100μl /管）1管 逆转录酶（25μl /管）1管 三、检测步骤 1．标本采集 抽取外周血5ml抗凝后密封送检，或3ml新鲜骨髓标本密封送检。 2．标本处理 将5ml抗凝外周血或3ml骨髓加入等体积生理盐水稀释，取10ml离心管，先加入2ml淋巴细胞分离液，再取稀释好的标本5ml沿管壁缓慢加入，4℃静置5分钟后，2,000rpm离心15分钟，小心吸取白细胞层于离心管中，离心留沉淀，用生理盐水洗沉淀一次，沉淀加入RNA提取液，充分混匀。室温静置5分钟，加入氯仿，盖上管盖，用力振摇15秒，4℃静置2-3分钟，4℃12,000rpm离心15分钟，离心后反应管分三层，底层为微黄色的氯仿层，中间层及无色水相上层，水相上层的体积一般为提取液体积的60%。小心将上层水相转移至灭菌的离心管中，加等体积异丙醇4℃静置10分钟，然后4℃，12,000rpm离心10分钟，离心前通常看不见RNA 沉淀，离心后可见胶状沉淀。去上清，加入400μl 75%的乙醇洗涤RNA沉淀，混匀，4℃7,000 rpm离心5分钟，小心吸去大部分乙醇。将沉淀在室温空气中干燥10分钟。(注：75% 乙醇配制时须用试剂盒中提供的DEPC H2O）。用40μl DEPC H2O溶解沉淀，吸出部分溶液，测A260-A280处的吸光值，并计算RNA含量。 3．逆转录反应：取灭菌离心管, 按以下要求配备逆转录体系 反应液I 逆转录酶模板（RNA）DEPC H2O 总反应体积 μl 1μl 2μg（或5μl）μl 20μl 反应条件：37℃水浴60分钟。 4．第一步PCR扩增：取灭菌PCR反应管, 按以下要求配备PCR体系 反应液II Taq酶模板（cDNA）去离子水总反应体积 μl μl 5μl 13μl 25μl 反应条件：94℃→4分钟预变性, 然后按94℃30秒→54℃30秒→72℃60秒, 共做20个循环。 5．第二步PCR扩增：取灭菌PCR反应管, 按以下要求配备实时定量PCR体系 反应液ⅢTaq酶模板（PCR产物）去离子水总反应体积 14μl 1μl 5μl 30μl 50μl 注：每次实验取105、10６、10７、10８一组阳性标准品瞬时离心上机即可 反应条件：93℃→2分钟预变性, 然后按93℃45秒→55℃60秒, 共做40个循环。 6．结果分析条件的设定与判定

RT-PCR试剂盒说明书

RT-PCR试剂盒说明书 公司：TIANGEN Order:0 Toll-free:800-990-6057/400-810-6057 TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD 版本号：KR121221 TIANScript RT Kit TIANScript cDNA第一链合成试剂盒 目录号：KR104 产品内容： 储存条件：-20℃保存。 产品介绍： TIANScript RT Kit（cDNA第一链合成试剂盒）是专为两步法RT-PCR第一步实验配制的，具有高灵敏度的RT-PCR反应系统，可以从极低量的总RNA或poly (A)+ RNA 合成第一链cDNA。与PCR反应相结合，可用于检测稀有基因的表达、从极少量细胞中定量检测特定mRNA的表达水平、克隆特定基因的cDNA片段等。 产品特点： 合理配备了与cDNA第一链合成反应相关的各种组分，该试剂盒中的TIANScript M-MLV具有高效的逆转录酶活性，对后续的PCR或定量PCR实验兼容性好，适合于各种PCR耐热聚合酶。 注意事项： 1. 用于cDNA合成反应的溶液试剂尽量可能用DEPC进行处理，并在高压灭菌后使用。有些试剂不能高压灭菌时，首先用经过灭菌的器具、水等配制溶液后，再将溶液进行过滤除菌处理。

2. RNA样品要避免基因组DNA污染。 3. 避免多次反复冻融RNA，使RNA保持在冰浴中处融化状态。 4. 试剂盒的各组成成分应在-20℃保存。 5. cDNA产物应置于-20℃保存。 操作步骤： 1. 在冰浴的无核酸酶的离心管中加入如下反应混合物： 1-5 μg总RNA或50-500 ng mRNA； 2 μl oligo (dT)15或2 μl Random或2 pmol基因特异引物； 2 μl Super Pure dNTPs mM each); 补RNase-Free ddH2O定容至μl。 2. 70℃加热5min后迅速在冰上冷却 2 min。简短离心收集反应液后加入以下各组分： 4 μl 5×First-Strand Buffer (含有DTT)；μl RNasin。 3. 加1 μl（200U）TIANScript M-MLV，轻轻用移液器混匀。如果用随机引物，请将离心管置25℃温浴10 min。 4. 42℃温浴50 min。 5. 95℃加热5 min终止反应，置冰上进行后续实验或冰冻保存。 如果需要RNase H处理，进行步骤6。否则，进行步骤7。 6. 加RNase H 1 μl (2 U)，37℃温浴20 min以降解RNA。然后95℃加热5 min 使酶失活。 7. 用RNase-Free ddH2O将反应体系稀释到50 μl，取2-5 μl进行PCR扩增反应。 PCR反应： 应吸取10%的第一链反应液（2 μl）进行PCR反应；即使加入更多量的第一链反应液也不能增加其扩增的产物量，反而可能会抑制正常的PCR反应。 1. 请将以下成分加入到一PCR管中并使其终反应体积为50 μl：

逆转录-聚合酶链(RT-PCR)实验的具体步骤及方法

逆转录-聚合酶链（RT-PCR）实验的具体步骤及方法 提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，从而获得目的基因或检测基因表达。 一、总RNA的提取 见总RNA的提取相关内容。 二、cDNA第一链的合成 目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。 1．在0.5 ml微量离心管中，加入总RNA 1-5 ug，补充适量的DEPC H2O使总体积达11 ul。在管中加10 uM Oligo（dT）12-18 1 ul，轻轻混匀、离心； 2．70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min； 3．取0.5 ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2 ul；上游引物（10 pM）2 ul；下游引物（10 pM）2 ul；dNTP(2mM) 4 ul；10x PCR buffer 5 ul；Taq 酶（2 u/ul）1 ul。轻轻混匀，离心。42℃孵育2-5 min；

4．加入SuperscriptⅡ1 ul ，在42℃水浴中孵育50 min； 5．于70℃加热15 min以终止反应； 6．将管插入冰中，加入RNase H 1 μl ，37℃孵育20 min，降解残留的RNA。-20℃保存备用。 三、PCR 1．取0.5 ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2 ul；上游引物（10 pM）2 ul；下游引物（10 pM）2 ul；dNTP(2 mM) 4 ul；10x PCR buffer 5 ul；Taq 酶（2 u/ul）1 ul； 2．加入适量的ddH2O，使总体积达50 ul。轻轻混匀，离心； 3．设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照； 4．电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果；

反转录试剂盒介绍及使用说明

USuperRT cDNA Kit SuperRT cDNA 第一链合成试剂盒 Cat. No.WD3126 保存：-20℃ 组分说明 产品简介 本产品包含从RNA 模板逆转录成cDNA 第一链所需的所有试剂，其中包括高效逆转录酶、反应缓冲液、引物、dNTP等。经过重组表达的SuperRT 逆转录酶RNase H 活性缺失，减少了逆转录反应中RNA 的降解，更易获得全长的cDNA。该逆转酶逆转录效率高，可对少量RNA 模板进行良好的逆转录反应。SuperRT 逆转录酶与RNA 亲合性高，能通读GC 含量高，二级结构复杂的RNA 模板，获得高产量的cDNA。适用于第一链cDNA 的合成、RT-PCR、Real-Time PCR 以及全长cDNA 文库的构建等。 注意事项 1.在操作过程中应避免RNase污染，防止RNA降解或实验中的交叉污染，建议在专门的区域进行RNA操作，使用专门的仪器和耗材，操作人员带口罩和一次性手套并经常更换手套，实验相关耗材应用0.1％DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃处理12小时，并高压灭菌30分钟后使用。 2.本试剂盒中的所有试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。所涉及的酶类使用后应尽快放回-20℃，避免反复冻融。 3.若起始RNA的量小于50 ng，建议加入RNA酶抑制剂（RNasin）。本试剂盒并未提供，如需要可单独向本公司订购. 使用方法 注意：1 ng-5 μg总RNA可建立20 μl反应体系，如果总RNA量大于5 μg，请按比例扩大反应体系。 ⅰ逆转录操作步骤： 1.将RNA 模板、Primer Mix、dNTP Mix、RT Buffer、SuperRT 和RNase-Free Water 溶解并置于冰上备用。 2.根据以下表格配置反应体系，总体积为20 μl。