基因的克隆、表达载体构建及功能验证Word版

基因的克隆、表达载体构建及功能验证（一般性方法）

一、基因克隆

★事前三问

a.克隆这个基因干什么？它有什么功能？

b.这个基因在哪种材料中扩增？

c.材料需要怎么处理？

◎ 实验前准备工作

a.设计引物，准备材料，

b.购置试剂：Taq酶、反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、连接试

剂盒

c.实验试剂及用具：枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌；Amp+ 、Kan+等抗生素准备

※ 基本流程

提取和纯化RNA—cDNA第一条链合成—PCR—凝胶电泳—胶回收—连接—转化—

涂平板—挑单菌落—摇菌—提质粒—测序

1.总RNA的提取、纯化及cDNA第一链合成

1.1叶片、根总RNA的提取

Trizol是一种高效的总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解植物细胞，抑制细胞释放出的核酸酶，所提取的RNA完整性好且纯度高，以利于下一步的实验。

1）实验前准备

预先配制0.1%的DEPC水（ddH2O中含0.1%DEPC，V/V，37 ℃过夜处理12 h），高温灭菌后，用DEPC水配制 75%乙醇，研钵、量筒、试剂瓶等需200℃灭菌至少4 h，所用枪头和枪盒均去RNA酶处理(直接购买)。

2)Trizol 法（小麦）叶片或根的总RNA实验步骤如下：

（1）提前在1.5 ml离心管中加入1 mlTrizol，然后将200 mg样品液氮中研磨成白色粉末，移入管内，用力摇15 s，在15-30℃温育5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。

（2）4℃，12000g离心10min，取上清，离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。

（3）吸取上清液加0.2 ml氯仿，盖好盖，用力摇15 s，15～30 ℃温育2～3 min。（4）在≤12000g，4℃离心10 min，样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层，RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。（5）将上层水相转移到新的1.5 ml离心管中，加2倍体积的无水乙醇沉淀RNA，室温静止30 min。

（6）在≤12000g，4℃离心10 min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。

（7）用≥1 ml的75%乙醇洗RNA，涡旋振荡样品，在≤7500g，4℃离心5 min，弃上清。（8）室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟，加无RNase的水100μl用枪头吸几次，55～60℃温育10 min使RNA溶解。

（9）配制以下体系：

10×DNase buffer 5 μl

DNase I （RNase-free）（40 μg/μl） 1 μl

RNasin Inhibitor（40 μg/μl） 1 μl

Total RNA 70 μg

加去RNase水至总体积为50 μl

（10）37 ℃水浴1h，加DEPC处理的水至总体积为100 μl，加入等体积氯仿抽提一次。（11）取上清，加入10 μl的3 mol/L NaAC溶液，200 μl的无水乙醇，-80 ℃沉淀30 min。（12）2～8 ℃，12000g离心10 min，弃清液，干燥后取50μl无RNase的水溶解RNA。3） RNA的质量及纯度检测

（1）电泳检测取2ul RNA 与1 ul 10×Loading buffer上样缓冲液混合均匀在1% 的琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下观察RNA 条带并记录实验结果。

（2）分光光度计RNA纯度检测

取1ul RNA液，以DEPC水为空白对照，测定A260/ A280 比值，估测RNA质量。

4） cDNA第一条链的合成

按照以下体系将提取的总RNA反转录成第一链cDNA：

1）在Eppendorf管中配制下列混合液：

试剂名称使用量

模板RNA 1 μg

Oligo dT primer (50 μM) 1 μl

dNTP Mixture(10 mM) 1 μl

RNase free dH2O up to 10 μl

2） 65 ℃保温15 min 后迅速在冰上急冷2 min。

3）离心数秒使模板RNA/引物等的混合液聚集Eppendorf管底部。

4）在上述Eppendorf管中配制下列反转录反应液:

试剂名称使用量

上述模板RNA/引物等的混合液 10 μl

5×Frist-Stand Buffer 4 μl

RNase Inhibitor(40 U/ μl) 0.5 μl

MTV RTase (10 U/μl) 0.5 μl

RNase free dH2O up to 20 μl

5） 37 ℃保温60 min。

6） 95 ℃,5 min后冰上冷却，得到的cDNA溶液用于PCR扩增。

1.2小麦胚及胚乳总RNA的提取

（1）配制RNA抽提buffer，50 ml中含有：

1M Tris-HCl（PH 9.0） 2.5 ml

4MNaCl 1.5 ml

10%SDS 5 ml

DEPC-H2O 41.25 ml

（2）取以上RNA提取液650 ul，加350 ul水饱和酚，放入1.5 ml离心管中，65 ℃水浴预热。

（3）研磨0.3 g材料，直至呈粉末状，待液氮刚刚挥发，迅速加入到上述预热的提取液中，立即剧烈震荡，约10 min。

（4）再加入400ul氯仿，抽提10 min，12000rpm 4 ℃离心10 min。

（5）取上清，加入等体积的氯仿，混匀摇10 min，12000rpm 4℃离心10 min。

（6）取上清，加1/3体积的8 M氯化锂，4 ℃保存过夜。

（7）离心10 min，弃上清液，留沉淀，用75%乙醇洗1次，再用无水乙醇洗5-10 s，晾干，溶于80 ul DEPC水中。

（8）加入9 ul DNA酶(无RNA酶)，10 ul 10×buffer（DNA酶所带）和1 ulRasin（Rnas 抑制剂），37 ℃ 30分钟（再加500 ul水）

（9）取出用 300 ul氯仿和 300 ul苯酚抽提，摇10 min钟，静止10 min，12000 rpm 4 ℃离心10 min。

（10）取上清，加入等体积的氯仿，摇10 min，静止10 min，4 ℃离心10 min。

（11）取上清，加1/10 NaAC（3M，PH 5.2），再加2倍体积的预冷无水乙醇， -80 ℃冰箱过夜；

（10）12000rpm离心15 min，弃上清液，留沉淀，晾干，溶于40 ul DEPC水中，电泳检测其完整性，保存于-80℃，备用。

2.2.2.1 cDNA第一条链的合成

（1）基因组DNA的去除反应

试剂使用量

5xgDNA Eraser Buffer 2.0 ul

gDNA Eraser 1.0 ul

Total RNA 5 ul

RNase Free dH2O up to 10.0 ul

42 ℃ 2 min

4 ℃ 10 min

(2)反转录反应

试剂使用量

5xPrimeScript@Buffer 2(for Real Time) 4.0 ul

PrimeScript@RT Enzyme MixI 1.0 ul

RT Prime Mix 1.0 ul

①的反应液 10.0 ul

RNase Free dH2O up to 20.0 ul

37 ℃ 15 min

85 ℃ 5 sec

4 ℃ 10 min -20 ℃保存备用

2.基因cDNA克隆

2.1基因片段的PCR扩增

以反转录后的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为20ul：10×PCR Buffer 2.0 ul，2.5 mM dNTPs 1.6 ul，10 mM上下游引物各0.8 ul，Taq 酶0.3 ul，模板cDNA1.0 ul，ddH2O 补足至20 ul。按照下列条件进行PCR扩增：

94 ℃ 4 min

94 ℃ 30 sec

50 ℃ 40 sec 30 cycles 72 ℃ 1 min

72 ℃ 10 min

2.2 PCR扩增产物的检测和回收纯化

PCR扩增产物在1% 琼脂糖凝胶(含有 0.5 ug/ml溴化乙锭)上进行电泳，在紫外灯照射下进行观察，与标准分子量进行比较估测扩增DNA片段的大小，若与预计的大小相符，则使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒将扩增出的片段回收，主要操作步骤如下：

1) 在紫外灯下切下将要回收的条带(尽量使用长波长的UV)，称重。

2) 按每 100 mg 琼脂糖胶加入300 ul溶胶液PN，置于50 ℃水浴中 10 min，每隔2 min 混匀一次，使胶彻底融化，室温放置2 min。

3) 将UNIQ-10柱放入2 ml的收集管中，加入600 ul平衡液BL，13000rpm，离心30 sec。

3) 取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的平衡液，将融化的胶溶液转移到UNIQ-10柱中，静止2-3 min，13000rpm，离心30 sec。

4) 取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，再放回收集管中，加入700 ul漂洗液PW(使用

前先检查是否已加入无水乙醇)，13000rpm离心30 sec。

5) 取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，放回收集管中，加入 500 ul漂洗液PW，13000

rpm离心30 sec，重复一次。

6) 取下UNIQ-10柱，倒掉废液，放回收集管中,13000rpm，离心2 min。

7) 将UNIQ-10柱放入一新的1.5 mlEp管中，在柱子的吸附膜中央悬空滴加50 ul预热70℃

洗脱液EB，室温放置5 min。

8) 12000 rpm，离心l min，Ep管中液体即为回收的DNA片段，-20℃保存备用。

2.3 回收产物与PMD-T载体的连接与转化

采用TAKARA公司的PMD-T载体进行连接反应，感受态细胞DH5a作为转化细胞进行转化。

具体操作步骤如下：

SolutionI、PMD18-T或19-T、DNA回收产物置于冰中溶解。

在0.2ml离心管中配制反应体系10ul：

PMD18-T 载体 0.5 ul

SolutionI 5 ul

回收DNA产物 4.5 ul 混匀，16 ℃反应过夜（3h就可以）。

连接反应快结束时，从-80 ℃冰箱中取出DH5a感受态细胞，将离心管置于冰上使之融

化。

1）取5 ul 的连接产物加到50 ul 感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30 min。

2）将离心管置于42 ℃水浴90 s，间不要摇动离心管。取出管后立即置于冰浴中放置2-3 min，

其

3）向离心管中加入600-900 ul LB（不含抗生素）液体培养基，150r/min，37℃震荡培养

60 min。

4）吸取150 ul 已摇好的菌液涂布在含有Amp(终浓度50 ug/ml)的LB固体培养基上，待液

体完全被培养基吸收后，倒置平板，37℃，培养12-14小时。

2.4重组克隆的验证及序列测定

随机挑选5个左右单菌落于10 ml含50 ug/ml的LB液体培养基中，于恒温摇床37 °C，

180r/min震荡培养过夜，培养至菌液OD600为0.6～0.8，用天根的质粒小提试剂盒提取质粒。

也可按照下列步骤提取质粒：

1）将培养好的菌液倒入2.0 ml 离心管中，12000rpm离心1min，去掉上清液，再重复二次。

2）加入100 ul预冷的溶液P1涡旋使充分悬浮，室温静止5 min。

3）加入200 ul溶液P2，同一方向缓慢匀速转动离心管使溶液混合均匀，置冰上5 min。

4）加入150 ul溶液P3，同一方向缓慢匀速转动离心管使内含物在溶液中分散均匀，置冰上5 min。

5）12000 rpm，离心10 min，取上清，用等体积的苯酚和氯仿:异戊醇(24:l)，各抽提一次。6）12000 rpm，离心3 min，取上清。

7）向上清中加入2倍体积的无水乙醇，混匀，-20℃，放置30 min，12000 rpm，离心10 min。8）弃上清，加入l ml75%乙醇，洗涤沉淀，12000 rpm离心3 min，弃上清，自然晾干。9) 每管中加入30 ul TE (pH 8.0) buffer和1 μl RNase(10ug/ul )，37℃水浴30 min溶解质粒DNA,-20℃贮存备用。

溶液的配制：SolutionI:葡萄糖50 mM; EDTA(PH8.0) 10 mM;Tris-Hcl 25 mM

SolutionII:NaOH 0.2 M;SDS 1%(现用现配)

SolutionIII:乙酸钾 60 mM;冰乙酸 11.5 ml;ddH2O 28.5 ml 采用上文中的P1、P2特异性引物以质粒为模板进行PCR扩增，扩增结果与RT-PCR相同的质粒为验证的阳性质粒，由华大基因工程有限公司进行序列测定。

二、植物转化表达载体的构建

★事前三问

a.构建什么载体（过表达，干扰？还是别的）？酶切位点有哪些是可以用的？怎么

用方便？

b.载体的细菌抗性和筛选抗性分别是什么？

c.准备转到哪种材料里？用什么方法转？

◎ 实验前准备工作

a.选择一个合适的表达载体

b.酶切位点选择：用DNAMAN中的Restriction-Restriction Analysis 分析待插

入基因中包含的酶切位点，避免使用基因中已有的酶切位点。剩下的酶切位点的

选择依据的原则为：方便（酶反应温度、Buffer一样，可以双酶切）、快捷（可

以省时酶切）、便宜。

c.设计带酶切位点的引物

d.购置试剂：高保真酶或LA Taq酶、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA连

接试剂盒等

e.实验试剂及用具：枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌；Amp+ 、Kan+等抗生素

※ 基本流程

a.过表达载体

酶切#：如果两个酶可以同时酶切，就直接双酶切；如果不能，按以下方法进行以NcoI和BstEII为例和：

1）取一灭菌的200ul的离心管按顺序依次加入：

10×Buffer 2 ul

NcoI 1 ul

Plasmid 2-3 ul

ddH2O 补足20 ul

2)混匀，37℃水浴3 h，再向管中加入2倍体积的无水乙醇，4℃放置1 h，12000 rpm离心10 min，75%的酒精洗涤一次，晾干，再向离心管中分别加入：

10×Buffer 2 ul

BstEII 1 ul

ddH2O 17 ul

3)混匀，60 ℃水浴3h后用1.2﹪的琼脂糖凝胶电泳检测，将所需要的目的片段在紫外光下切下来，用琼脂糖DNA回收凝胶剂盒回收纯化小片段。

同时用同样的方法酶切表达载体（如PCAMBIA3301），回收大片段。

b.RNA干扰载体的构建

三、功能验证

目前本实验基因的功能验证主要采取转基因的方法，常用的转基因方法有基因枪转化法和农杆菌介导法。目前实验室做的是农杆菌介导法转化水稻。下面把两种方法都介绍一下：◎ 实验前准备工作

a. 准备好诱导愈伤的材料（我们用农杆菌介导法转化小麦茎尖用豫麦34，转化水

稻愈伤用kitake；用基因枪法一般用豫麦18）。

b.准备好配制各种组培培养基的试剂和药品。

c.准备好光照恒温培养箱。

※ 基本流程（农杆菌介导法转化水稻）

种子消毒诱导愈伤（30d左右）共培培养（3d）恢复培养（7d）

农杆菌转化重组载体

筛选培养（30d以上）分化培养（90d左右）移栽到花盆至成熟§农杆菌介导法转化水稻

1. 农杆菌感受态细胞的制备转化

1)取出-80 ℃保存的含农杆菌菌株EHA105的菌液冰上解冻，划线接菌于YEB固体培养基（含Rif 50 mg/L）中，28 ℃恒温培养2天。

2)挑取农杆菌EHA105单克隆，接种于10 ml YEB液体培养基（含Rif 50 mg/L）中，于恒温摇床中28 ℃、200rpm/min培养1-2天。

3)在250 ml的三角瓶中加入50 mlYEP液体培养基及上述过夜培养物的菌液2 ml，200 rpm/ min

，28℃培养至OD600为0.5-1。

4)冰浴冷却菌液，4000rpm，4℃，5-10 min离心收集菌体。

5)去上清，沉淀悬浮于1 ml预冷的0.15 mol/L CaCl2中，使细胞充分悬浮，分装成100 μl/管，每管中加入100 ul预冷的50%甘油，液氮中速冻后至-80 ℃保存。

6）每管加入约1 μg构建好的质粒DNA，混匀冰上放置30 min。

7）液氮中速冻1 min。

8）迅速置于37 ℃水浴锅中，水浴5 min。

9）加600 ul YEP液体培养基，28 ℃，50rpm慢摇2-4 h，使抗性基因得到表达。

10）于超净工作台上将菌液涂布于YEP固体培养基（含Rif 50 mg/L，Kan 50mg/L），同时设置一个仅含抗生素的平板做对照。

11）于28 ℃恒温培养箱中2-3 d后检测其生长情况。

12）挑取单菌落进行培养提取质粒，并且进行酶切鉴定。

附：YEB 培养基的制备

灭菌：121℃，20min

2．水稻基本培养基的配制

表2-1 水稻基本培养基的配制

Table 2-1 Preparing the minimal medium of rice

单位：mg/L

3.根癌农杆菌介导水稻转化

3.1 种子消毒和愈伤组织的诱导

1）选取成熟饱满健康的水稻种子去壳后，75%的乙醇消毒1 min，无菌水漂洗3次，用20％的次氯酸钠溶液消毒20 min，无菌水漂洗5次。

2）将种子种胚朝下放置到N6-P固体基本培养基上，28 ℃，光照（12h）/ 黑暗(12 h)，冷光条件下培养30天左右。

3.2 农杆菌介导水稻转化

以农杆菌菌株EHA105为介导，分别将构建好的表达载体导入受体材料Kitaake，并获得相应的转基因植株。

水稻成熟胚遗传转化的基本流程为：

1）28 ℃培养以上含重组质粒的农杆菌16 h，收集菌体，并稀释到含有100 μmol/L AS的N6液体培养基中至浓度为OD600≈0.5；

2）将适量培养至一个月的水稻成熟胚胚性愈伤组织与上述菌液混合侵染30 min，滤纸吸干菌液后转入共培养培养基中，24 ℃共培养3 d；

3）将上述愈伤接种在含有3 mg/L Bialaphos（或潮霉素）的N6固体筛选培养基上第一次筛选16 d；

4）挑取健康愈伤转入5 mg/L bialaphos的N6固体筛选培养基上第二次筛选，每15 d继代一次；

5）挑取抗性愈伤转入分化培养基上进行分化培养；

6）待分化成苗的再生水稻植株长至20 cm高时（约90 d）开口炼苗3 d，并移栽至温室栽培。4．转基因植株的初步鉴定

4.1 转基因水稻DNA的提取

按上述方法用CTAB法提取转基因水稻株系总DNA，并按顺序记号编号

4.2 转基因植株的PCR检测

以提取的DNA为模板，用引物P1、P2进行PCR检测，同时用提取的重组质粒做阳性对照，以水和未转化的水稻kitaake为阴性对照，在1.0%琼脂糖凝胶电泳上检测目的条带是否存在，以确定转基因的个体。

5．外援目的基因的表达分析

为了检测外源性目的基因是否在转基因植株中转录表达，及其在组织部位的表达量，选取已鉴定为阳性植株的转基因水稻株系，在花后10 d分别取根、茎、叶及未成熟胚乳总RNA，用Actin为内参，进行定量RT-PCR检测。

6．种子萌发实验

将经PCR鉴定的转基因株系种子（T1）收获后与同非转基因水稻品种在相同的条件下萌发实验，一周之后观察种子发芽情况。为进一步研究该基因水稻种子萌发特性的变化及ABA 和胁迫条件下的反应，选取经分子鉴定为稳定遗传的健康转基因种子（T2），50℃打破休眠，采用不同浓度的ABA溶液，以及75 mmol/LNaCl和200 mmol/L甘露醇溶液浸泡种子，观察记录其萌发。

§基因枪轰击法转小麦

1.培养基的配制

1）愈伤组织诱导及继代培养基

MS基本培养基＋2 mg/L 2,4-D＋30 g/L蔗糖＋7 g琼脂/L，pH为5.6-5.8。在此培养基中，培养前两周附加0.5 mg/L ABA

2）高渗培养基

MS基本培养基＋2 mg/L 2,4-D＋0.4 mol/L甘露醇＋30 g/L蔗糖＋7 g琼脂/L，pH为5.6-5.8

3）分化筛选培养基

MS基本培养基+1.0 mg/L IAA+2.0 mg/L ZT+3-5 mg/L bialaphos+0.7%琼脂+3%蔗糖，pH5.6-5.8

4）生根筛选培养基

1/2MS基本培养基+0.5 mg/L IAA+1-2 mg/L bialaphos+1.5 mg/L多效唑+3%蔗糖+0.7%琼脂，pH5.6-5.8

以上所有培养基均采用常规方法灭菌，选择剂Bialaphos及激素均采用过滤灭菌，培养基冷却至60 ℃左右时加入。

2.微弹的制备

称取50 mg金粉(直径为1.0 um)放入1.5ml离心管中，加入1 ml 96%的酒精充分振荡30 s，使金粉充分散开，12000rpm离心1 min，除去上清液，再加1 ml 96%乙醇重悬金粉，

重复上述步骤

3次。至完全除去乙醇后，加入1 ml无菌水制成浓度为50 mg/ml的金粉悬浮液，用前吸取50 ul金粉悬浮液至Eppendorf管中，加入质粒DNA 5 ul（1 ug/ul），振荡混匀，再依次加入50 ul 2.5 mol/L的CaCl2和20 ul 0.1 mol/L的亚精胺(spermidine现用现配)溶液混匀，然后冰浴15 min。在12000 rpm下离心5 s，弃去上清液，用250 ul纯酒精旋涡振荡1 min，离心弃上清液。最后将金粉-DNA重悬于100 ul无水乙醇。4℃保存备用。轰击时，每枪上样5 ul。

3.基因枪转化

本试验采用PDS-1000/He基因枪(Bio-Rad公司生产)。在基因枪轰击之前将用于枪击的受体材料转接于含0.4 mol/L甘露醇的诱导培养基上，进行高渗处理。轰击前分别预处理6 h和12 h，轰击后继续将愈伤组织留在高渗培养基上处理18 h（即分别设置轰击前6h轰击后18 h、轰击前12 h轰击后18 h两种处理），按照该基因枪说明书所述程序对靶材料进行轰击。轰击参数如表2所示。

表2-2 基因枪轰击参数表

Table 2-2 Parameters for particle bombardment

参数名称参数值

可裂圆片与载片之间的距离（cm） 2.5

载片与阻挡网之间的距离（cm） 1.1

阻挡网与轰击材料之间的距离（cm） 5.5

轰击气体压力(Psi) 1100/900

真空度(inch Hg) 26

4．培养方法

选取开花后14-16 d豫麦18的麦穗，取中部大小一致的未成熟籽粒（幼胚直径：1-1.5 mm）。幼嫩种子用70%的酒精表面消毒1 min，无菌水冲洗3次后用0.1%的HgCL2消毒6 min，无菌水冲洗3-4次。然后在超净工作台上用解剖镊剥出幼胚，幼胚盾片朝上接种于MS诱导培养基上，每皿放40粒幼胚；parafilm封口，25±1℃暗培养7-15 d。将愈伤组织集中在培养皿中央，经渗透培养基处理4-6 h，用BIO-RAD公司的PDS1000/He基因枪进行轰击，轰击后16-18 h，将幼胚从高渗培养基转移至正常MS诱导培养基，同时将经枪轰击后的幼胚穗24 h后散开，在25℃下暗培养诱导愈伤组织28 d，每隔15 d继代一次。然后转移至分化筛选选培养基上（含筛选剂）进行光照分化培养，培养条件为25±1℃光强为3000 Lx，16 h/d。待分化的芽长至2-3 cm时转移到生根筛选培养基上进行生根培养，再生植株生长到适宜大小是移入花盆，置于温室。

5.转基因植株的PCR鉴定

取转基因小麦株系的叶片放入2 ml离心管中，记号编号，按上述方法用CTAB法提取小麦叶片的总DNA用于PCR检测，同时用质粒做阳性对照，用水和未转基因的豫麦18做阴性

对照。

克隆载体与表达载体

克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。 克隆载体（Cloning vector ）：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。 （这是为携带”感兴趣的外源DNA实现外源DNA勺无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。） 其中，为使插入的外源 DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。 是否含有表达系统元件，即启动子 -- 核糖体结合位点 -- 克隆位点 -- 转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。 表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。 表达载体（ Expression vectors ）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。如表达载体 pKK223-3 是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中，有一 个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。 （RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在 mRNAk有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3?10 bp处的由3 —9bp组成的序列。这段序列富含嘌吟核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体 RNA的识另U与结合位点。根据发现者的名字，命名为 Shine-Dalgarno 序列，简称 S-D 序列。 由于它正好与30S小亚基中的16s rRNA3 '端一部分序列互补，因此 S-D序列也叫做核糖体结合序列。 真核生物存在于真核生物mRNA勺一段序列，其在翻译的起始中有重要作用。加Kozark sequence（GCCACC）, Kozak sequence 是用来增强真核基因的翻译效率的。是最优化的ATG环境， 避免 ribosome 出现 leaky scan ） 克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒，所以常带有较强的自我复制元件，如复制起始位点等，往往在菌体内存在多拷贝，所以抽质粒会抽出一大堆。但不具备表达元件。而表达质粒有复杂的构成，为的是控制目标蛋白的表达，如各种启动子（T7），调节子（LacZ）等，而且以pET为代表的表达载体在菌体内 都是低拷贝的，防止渗漏表达。 克隆载体只是把你要的基因片段拿到就可以了，不管读码框什么的，但是表达载体是不但要你的目的基因连在上面，而且要表达蛋白，所以就要求你的读码框不能乱了，否则就不能得到你想到的表达产物。 1. 载体即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细 胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector ）。2. 载体的分类 按功能分成：（ 1）克隆载体 : 都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。（2）表达载体：具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。 按进入受体细胞类型分：（ 1 ）原核载体（ 2）真核载体（ 3）穿梭载体（ sbuttle vector ）指在两种宿 主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）.

常用的克隆载体

第一章 概 论 第二章 基因疫苗工作 原理 第三章 基因疫苗抗原 基因的筛选和克隆 第四章 基因疫苗的构 建 第五章 基因疫苗制备 第六章 基因疫苗免疫方法 第七章 基因疫苗免疫 效果检测 第八章 影响基因疫苗免疫效果的因素 第九章 基因疫苗安全性 第十章 细菌病基因疫苗 第十一章 病毒病基因 疫苗 第十二章 寄生虫病基 因疫苗 第十三章 肿瘤基因疫 苗 第十四章 控制动物生 长性能的基因疫苗 四、常用的克隆载体 克隆载体就是将目的基因导入宿主细胞进行复制，从而获得大量克隆化片段的运载工具，常用的克隆载体种类很多，主要包括质粒、粘粒和噬菌体等。其中，质粒是目前应用最为广泛 的克隆载体。下面简要介绍作为克隆质粒的特性和结构。 （一）质粒特性 质粒是指在染色体外能够独立复制和稳定遗传的一类环状双链 DNA 分子。有的质粒处于染色体外的游离状态，可以随着染色体的复制而复制，并且通过细胞分裂传递到子代。有的质 粒在一定条件下能够可逆地整合到寄主染色体上。 质粒的表示常根据 1976 年提出质粒命名原则，用小写字母 p 代表质粒，在 p 字母后面 用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或者实验室名称。例如质粒 pUCl8 ，字母 p 代表质粒， UC 是构建该质粒的研究人员的姓名代号， 18 代表构建的一系列质粒的编号。 质粒广泛地分布于原核生物细胞中，也存在于一些真核细胞中。质粒相对分子质量范围为10 6 -2 @ 10 8 。根据质粒在受体细胞内的数量将质粒分为严紧型质粒和松弛型质粒两种类 型。严紧型质粒在每个细胞只有 1 个至几个拷贝；松弛型质粒在每个细胞中有 10-200 个拷贝。 质粒可以分为三种构型，一种是呈现超螺旋的 SC 构型（ scDNA ），一种是开环 DNA （ ocDNA ），另一种是呈线形分子的 L 构型。质粒 DNA 与一般 DNA 分子的理化性质相似，例如溶于水、不溶于乙醇等有机溶剂、能吸收紫外线、可嵌入溴乙锭染料等。实验室常利用这 些理化特性鉴定和纯化质粒。 质粒具有以下几项生物学特性： ? 寄生性：质粒可以在特定的宿主细胞内存在和复制。 ? 稳定性：每种质粒在特定的宿主细胞内保持着一定的拷贝数。 ? 重组性：两种不同的质粒处于同一宿主细胞中或者一种质粒处于一种宿主细胞中，有可能发生质粒与质粒之间或质粒与染色体之间的重组。 ? 不相容性：有相同复制始区的不同质粒不能共存于同一宿主细胞中，其分子基础主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。 ? 传递性：有些质粒在细菌间能够传递，具有传递性的质粒带有一套与传递有关的基 因。

克隆载体表达载体构建详细版

一、稀释引物 1、4℃，15min、13000转离心（先等离心机降温） 2、根据OD值加DD水。 3、静置30min（冰上） 4、准备1.5毫升EP管，并加90ulDD水。 5、向EP管中加10ul引物，震荡离心，-20℃保存。 二、跑MIX检测引物（20ul体系）、 上引物0.8ul 下引物0.8ul Mix 10ul DNA（日本晴）1ul DD水7.4ul 三跑高保真酶（50ul体系） DNAorCDNA 2ul 上引物2ul 下引物2ul 5*buffer 10ul dNTPs 5ul DD水28ul Pfu（最后加）1ul 四胶回收流程 1、在紫外线下切胶，用牙签装入2ml的EP管中。 2、按量加XP2，放在55℃水浴锅中10min，每2min摇匀1次，涡旋，短离。 3、将液体冷却到室温，转移到平衡住中，离心10000转，1min30s，倒掉滤液。 4、加入xp2 300ul，离心10000r，1min30s，倒掉滤液。 5、加入spw700ul，离心10000r，1min，倒掉滤液（重复一次） 6、空转2min，13000r，之后换1.5mlEP管。 7、套上保鲜膜放入37℃烘箱中，30min。 8、加入DD水10ul，静置2min，离心2min，13000r，重复3次，-20℃保存。 五、胶回收产物检测（10ul）体系 上引物0.4ul 下引物0.4ul Mix 5ul 回收产物1ul DD水 3.2ul 六、构建blunt cloning 载体（克隆载体）（4ul 体系） 胶回收产物 3.5ul Blunt cloning 0.5ul 混匀后，PCR：25℃15min 盖子温度50℃

基因克隆载体上的各种常用蛋白标签

基因克隆载体上的各种常用蛋白标签 蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： 标签的量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能; His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性; His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究; His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和; 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。 FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。

三四章分子克隆载体---答案_完_

第三章分子克隆载体（Molecular cloning vectors） 一、名词解析 1.质粒：质粒是染色体外的遗传因子，能进行自我复制（但依赖于宿主编码的 酶和蛋白质）；大多数为超螺旋的双链共价闭合环状DNA分子（covalently closed circle , cccDNA），少数为线性；大小一般为1～200Kb，有的更大。2.质粒拷贝数：质粒拷贝数(plasmid copy numbers)是指细胞中单一质粒的份数 同染色体数之比值,常用质粒数/每染色体来表示。不同的质粒在宿主细胞中的拷贝数不同。 3.质粒的不相容性：两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容 性，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及DNA 限制系统时出现的现象。 不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。 4.质粒的转移性：质粒具转移性。它是指在自然条件下，很多质粒可以通过称 为细菌接合的作用转移到新宿主内。它需要移动基因 mob ，转移基因 tra ，顺式因子 bom 及其内部的转移缺口位点 nic。 5.穿梭质粒：既能在真核细胞中繁殖又能在原核细胞中繁殖的载体。这类载体 必须既有细菌的复制原点或质粒的复制原点，又含有真核生物的复制原点，还具备酶切位点和合适的筛选指标。它用来转化细菌，又可以用于转化真核细胞。 6.α-互补：α-互补是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完 整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶（β -galactosidase ，由 1024 个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。α-互补是基于在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的 7.温和噬菌体：既能进入溶菌生命周期又能进入溶源生命周期的噬菌体。 8.溶源性细菌：具有一套完整的噬菌体基因组的细菌叫溶源性细菌。 9.整合：如果噬菌体的DNA是被包容在寄主细菌染色体DNA中，便叫做已整合 的噬菌体DNA。这中细菌提DNA组入细菌染色体DNA的过程，叫做噬菌体DNA 的整合或插入。 10.溶源化：用温和的噬菌体感染细菌培养物使之形成溶源性细菌的过程叫做溶 源化。

常用分子克隆实验方法

常用分子克隆实验方法I 一、植物总DNA的小量提取 方法1：提取吸附法。无须巯基乙醇、氯仿等有毒物质，产物无须Rnase处理。 (1)充分研磨。称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml溶液 A，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头将所有溶液移至1.5ml离心管 中，55℃水浴30min； (2) 高速离心去杂质。10,000rpm离心5min，取约600ul上清至新1.5ml离心管； (3) 核酸吸附。往上清液中加入1倍的异丙醇，轻轻混匀，再加入总体积1/4已混匀的 溶液B，静置3min; (4) 低速离心沉淀。5000rpm离心1min，轻轻倒掉上清，并用吸水纸轻吸离心管口， 再用移液枪吸走大部分残余液体； (5) 75%乙醇清洗。加入1ml75%乙醇，5000rpm离心30s，轻轻倒掉上清，用吸水纸稍 吸离心管口。重复该步骤一次，再5000rpm离心30s，然后用移液枪吸走管底的残 液，晾干5min； (6) 核酸洗脱。加入约55ul TE（PH8.0）至管底，轻轻重悬硅土，静置3min，10,000rpm 离心1min，用小枪头轻轻吸取出50ul管底溶液，冷藏。 方法2：CTAB法，此为在经典方法基础上，经过摸索改进，提高了得率，减少了污染。 (1)充分研磨。称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml CTAB 提取液，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头移至1.5ml离心管，65℃ 水浴30-60min。 (2) 氯仿抽提。10,000rpm离心3min，取约600ul上清。加入1倍的氯仿，轻轻混匀， 10,000rpm离心3min，取上清再抽提1遍。 (3) 核酸沉淀。加入预冷的1倍异丙醇或2倍乙醇，轻混匀，6000rpm离心3min，弃 上清。 (4) 清洗沉淀。轻加入1ml 75%乙醇，再吸掉上清，重复一次，倒置于吸水纸或横放于 离心管架上晾干5min。 (5) 溶解DNA。加50ul含Rnase A（约10ug/ml）的TE，常温下放置30min。取约3-5ul 电泳检测后，低温冷藏。

克隆载体与表达载体---—朕已阅

一部分：概念解析 二部分：问题解答 克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。 克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。) 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。 是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。 表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。 （RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。根据发现者的名字，命名为Shine-Dalgarno序列，简称S-D序列。 由于它正好与30S小亚基中的16s rRNA3’端一部分序列互补，因此S-D序列也叫做核糖体结合序列。 真核生物存在于真核生物mRNA的一段序列，其在翻译的起始中有重要作用。加Kozark sequence(GCCACC), Kozak sequence是用来增强真核基因的翻译效率的。是最优化的ATG环境，避免ribosome出现leaky scan） 克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒，所以常带有较强的自我复制元件，如复制起始位点等，往往在菌体内存在多拷贝，所以抽质粒会抽出一大堆。但不具备表达元件。而表达质粒有复杂的构成，为的是控制目标蛋白的表达，如各种启动子（T7），调节子（LacZ）等，而且以pET为代表的表达载体在菌体内都是低拷贝的，防止渗漏表达。 克隆载体只是把你要的基因片段拿到就可以了，不管读码框什么的，但是表达载体是不但要你的目的基因连在上面，而且要表达蛋白，所以就要求你的读码框不能乱了，否则就不能得到你想到的表达产物。 1.载体即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。 2. 载体的分类 按功能分成：（1）克隆载体: 都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。（2）表达载体:具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs

为什么要先构建克隆载体再用表达载体

为什么要先构建克隆载体再用表达载体 构建克隆载体是大量扩增DNA片段，用以测序、酶切和改造等对DNA实施的后续操作，构建表达载体是大量得到翻译产物——蛋白质。 为什么要先构建克隆载体，再用表达载体，我猜是因为： ①得到大量的DNA，虽然PCR也可以，但PCR扩增有出错率、但你每做一次常规的PCR，而且每次都要重新提DNA和RNA才行，而且，PCR反应的试剂盒又不便宜，用PCR来制备大量DNA有点得不偿失。尽管构建克隆载体也存在操作复杂（相对于PCR），成功率不是极高，而且还要筛选，但一旦你重组成功并转入了大肠杆菌，你就可以保存了，你想什么时候用，摇个菌，就可以制备到大量的DNA。 ②测序需要。你想转表达，你首先得确定你扩增的目的片段是不是你要的，不要以为你设计了个特异性引物，然后跟你mark的长度就可以确定了，这也只是推测，在科学上不严谨。扩增出的基因片段保险起见或者经费允许，要拿去测序，而一般送测的序列都是构建到载体上的序列，克隆载体上一般也都带有测序引物，已确定这就是你要的那条序列。你要写论文必须要给人真凭实据。 先构建克隆载体再构建表达载体并不是一个必须的选择，如果你的扩增PCR目的条带很亮，而且单一性很好，我建议你可以直接克隆进入表达载体。 很多人选择先构建克隆载体，是因为在扩增基因时目的条带模糊，特异性不好，这样将基因连接到克隆载体上就可以便于挑去单克隆进行测序，增加测序的准确度，从而确认自己克隆基因序列的正确性。单纯的PCR产物往往是一些各种PCR片段的混合物，直接送过去测序，往往导致测序信号峰很杂，有时候并不能测出想要的信号序列。同时保存的PCR片段比较容易降解，而构建好克隆载体后形成的质粒是很容易扩增和保存的。 先构建克隆载体，一是为了便于测序，确认克隆序列正确，二是为了便于基因PCR片段的保存。 怎么构建克隆载体和表达载体？ 首先根据你的实验需要选择相应的载体。 其次分析你的基因序列以及载体序列上的酶切位点，切记在载体上所选择的酶切位点要和你

分子克隆技术第三章

2017/2/21 第三章载体 第一节基因克隆技术概述 一、基因克隆技术 基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组的DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。 二、目的基因的取得 1、直接 2、反转录酶 3、化学合成 4、基因文库 5、PCR ?首先利物理方法（如剪切力、超声波等）或酶化学方法（如限制性 内切核酸酶）将生物细胞染色体DNA切割成为基因水平的许多片段，继而将这些片段与适当的载体结合。将重组DNA转入受体菌扩增，获得无性繁殖的基因文库，再结合筛选方法，从众多的转化子菌株中选出含有某一基因的菌株，从中将重组的DNA分离、回收。这种方法也就是应用基因工程技术术分离目的基因，其特点是绕过直接分离基因的难关，在基因组DNA文库中筛选出目的基因。可以说这是利用“溜散弹射击”原理去“命中”某个基因。由于目的基因在整个基因组太小，在像当程度上还得靠“碰运气”，所以人们称这个方法为“鸟 枪法”或“散弹枪”实验法。 三、重组体的构建 1、载体 要把一个有用的基因通过基因工程手段送进生物细胞中，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫载体（Vector）。 （1）质粒（plasmid) （2）噬菌体λ的衍生物 （3）科斯质粒（cosmid） （4）单链DNA噬菌体 M13（5）病毒?面包酵母吲哚甘油磷酸脱氢酶基因的制取，先 用Eco RI把面包酵母DNA切成许多片段，使这些片段与λ载体连成重组DNA，可把这些重组DNA导入“吲哚甘油磷酸脱氢酶型组氨酸缺陷型”大肠杆菌，在基本培养基中培养。只有引入了该基因的细菌才能生长。进一步分离这种菌株，可以得到目的基因。 2、载体的性质 1）它必须具有能够在某些宿主细胞中独立地自我复制和表达的能力。 2）载体DNA的分子量应该较小。 3）载体上最好应具有两个以上的容易检测的遗传标记（如抗药性基因等），以赋予宿主细胞以不同的表型。 4）载体应该具有多个限制性内切酶的单一切点；载体上的单一酶切位点最好是位于检测表型的遗传标记基因之内，这样目的基因是否已连接载体就可以通过这一表型的改变与否而得知，利于筛选重组体。 3、酶系的选用

基因克隆的质粒载体

基因克隆的质粒载体 在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了比较详尽研究的主要有F质粒、R质粒和Col质粒。 ①F质粒又叫F因子或性质粒（sex plasmid）。它们能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。 ②R质粒通称抗药性因子。它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。 ③Col质粒即所谓产生大肠杆菌素因子。它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。 第一节质粒的一般生物学特性一．质粒DNA 细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份。绝大多数的质粒都是由环形双DNA组成的复制子（图4-1）。 质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状，但在一定的条件下又可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型： 1．当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形DNA（cccDNA），这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型； 2．如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA（ocDNA），此即OC构型； 3．若质粒DNA经过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂形成线性分子（IDNA），通称L构型（见图4-2）。 在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA，尽管分子量相同，仍具有不同的电泳迁移就绪。其中走在最前沿的是SC DNA，其后依次是L DNA和OC DNA（图4-3）。 凡经改建而适于作为基因克隆载体的所有质粒DNA分子，都必定包括如下三种共同的组成部分，即复制基因（replicator）、选择性记和克隆位点。 二．质粒DNA编码的表型 质粒DNA仅占细胞染色体组的1%～3%左右，但却编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状。其中对抗菌素的抗性最质粒的最重要的编码特性之一。

分子克隆载体

分子克隆载体（vector） 载体（vector）是指运载外源DNA有效进入受体细胞内的工具。载体同外源DNA在体外重组成DNA 重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。重组DNA 技术中最常用的载体有质粒、噬菌体λ，柯斯质粒（cosmid）和噬菌体M13。 载体（vector）是指运载外源DNA有效进入受体细胞内的工具。载体同外源DNA在体外重组成DNA重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。因此，作为载体应该满足以下几方面的要求：①有某种限制酶的一个切点，最好是有许多种限制酶的切点，而且每种酶的切点只有一个；②外源DNA插入后不影响载体在受体细胞中进行自我复制，载体应对受体细胞无害，以及载体能接纳尽可能大的外源DNA片段；③有利于选择的标记基因，可以很方便地知道外源DNA已经插入，以及把接受了载体的受体细胞选出；④具有促进外源DNA表达的调控区。 重组DNA技术中最常用的载体有质粒、噬菌体λ，柯斯质粒（cosmid）和噬菌体M13。它们的受体细胞都是大肠杆菌。这四种载体的大小和结构尽管各不相同，但它们的共同特点是：①都能在大肠杆菌中自主复制，而且能连同所带的外源DNA一起复制；②都很容易同细菌DNA分开并加以纯化；③都有一段DNA对于它们自身在细菌中的增殖不是必需的。因此，外源DNA可以插入这一段DNA中，或是置换这一段DNA而不影响载体的复制。根据这一特点，载体又可分成插入型和置换型两大类。 质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可整合到细菌染色体DNA中，随着染色体DNA的复制而复制。 载体可以分为：克隆载体、表达载体及穿梭载体。 1.克隆载体(cloning vector):通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。将重组后的载体引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中大量繁殖。常见的载体有质粒，噬菌粒，酵母人工染色体。 对载体的要求一种用作克隆载体的理想质粒一般具备下述特点：①具有松驰型复制子（如ColE1），复制子（replicon）是质粒自我增殖所必不可少的基本条件，并可协助维持使每个细胞含有一定数量的质粒拷贝。②在复制子外存在几个单一的酶切位点（或多克隆位点），以便目的DNA片段插入。③具有插入失活的筛选标记，理想的质粒载体应具有两种抗菌素抗性标志，如氨苄青霉素抗性基因（Amp r）和四环素抗性基因（Tet r）等，以便从

分子克隆之载体构建完整步骤

分子克隆之载体构建完整步骤 一、目的片段的扩增和酶切 PCR反应的基本成分包括：模板DNA(逆转录所得cDNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液及水。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的高温变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的低温退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：DNA模板--引物结合物在。 准备： A.模板DNA：质粒DNA，逆转录cDNA或挑菌落 B.引物配制： a)存储液100uM：公司合成的引物干粉，13000rpm离心2min，加入管壁 nmol数x10ul的ddH2O振荡充分溶解。 b)工作液10uM：上下游引物存储液各10ul加80ul ddH2O混匀配制100ul 工作液。终浓度200-400nM。 1. PCR反应体系(50ul) Taq酶体系：Thermo 10x buffer （无Mg2+）5ul MgCl2（25mM）5ul dNTP （10mM）1ul 上下游引物工作液1ul 模板cDNA（质粒DNA 不超过100ng）2-4ul Taq DNA聚合酶0.5ul ddH2O 补充至50 ul 注：1. 其他体系如菌落PCR反应20ul按比例调整即可。2. 其他公司Taq酶或2x buffer mix已包含Taq酶、dNTPs时作相应调整。 PCR仪设置反应条件： 95℃ 5min 预变性 循环x30-35： 变性95℃ 30s 退火60℃ 30s （退火温度为引物Tm值-3~5℃） 延伸72℃ 60s （延伸时间根据产物长度：Taq酶效率约1kb/min）72℃ 7 min 补充延伸 4-10℃ 保温 高保真Pfu酶体系（优选）：Thermo

克隆载体及其主要功能

.克隆载体及其主要功能 载体是克隆基因的关键组分，载体使重组DNA分子能够在受体细胞中复制。质粒和噬菌体是两种天然的DNA载体。目前，能在不同受体细胞中使用的载体有数百种，其中，可以在大肠杆菌中使用的载体数目最多。 质粒pBR322是一种典型的大肠杆菌克隆载体，它全长仅为4.3kb。pBR322带有两种抗生素抗性基因：b -内酰胺酶基因和四环素抗性基因，前者修饰并消除氨苄青霉素对大肠杆菌的毒性。通常，目的基因插入载体质粒将破坏四环素抗性功能。因此，使用含有氨苄青霉素和四环素的培养基，我们可以鉴别大肠杆菌的转化细胞：带有重组质粒的转化细胞只能在含氨苄青霉素、不含四环素的培养基上生长；另一方面，原受体细胞不能在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上生长；而有载体质粒但没有目的基因的转化细胞能在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上生长。另外，pBR322是一种松弛型质粒，在培养液中加入氯霉素可以使转化细胞中的质粒拷贝数由通常的15个增至1000-3000个，此间，大肠杆菌的染色体并不复制。 在细菌中，噬菌体载体是另外一类常用的克隆载体。和质粒不同的是，噬菌体载体通过感染过程即转导进入宿主大肠杆菌细胞。通常，作为克隆载体的噬菌体，都经过一定的突变和缺失处理。因此，这类噬菌体进入大肠杆菌细胞之后，并不像一般噬菌体那样在宿主染色体上整合，而是直接进入裂解周期：大量复制噬菌体、裂解宿主细胞，最终在培养基上形成含有大量噬菌体拷贝的噬菌斑。 和质粒载体相比，噬菌体载体能够克隆更长的DNA片断。 3.重组克隆筛选 3.1.抗性基因插入失活筛选法 根据抗生素抗性基因插入失活原理而设计的插入失活法是重组体常用的筛选方法。如非重组的pBR322质粒DNA上的四环素和氨苄青霉素抗性基因都是正常的, 表型为AprTcr。带有这种质粒的受体菌可以在加有四环素和氨苄青霉素的双抗性平板上生长。但是, 如果在该质粒的四环素抗性基因内插入外援片段, 就会造成四环素抗性基因失活, 变成AprTcs, 携带这种质粒的宿主菌可以在氨苄青霉素的平板上生长, 而不能在四环素抗性平板上生长。 3.2. 蓝白斑筛选法 根据抗生素抗性基因插入失活原理而设计的插入失活法需要进行菌落平板的影印复制, 才能够将所需的重组体挑选出来, 大大增加了筛选的工作量。后来, 人们设计了以β-半乳糖苷酶的产生作为颜色筛选标记的载体, 简化了筛选程序, 提高了灵敏度。这类载体系统包括M13噬菌体、pUC质粒系统、pEGM质粒系统。它们的共同特点是载体上携带一段细菌的lacZ基因, 它编码β-半乳糖苷酶的一段146个氨基酸的α-肽, 载体转化的受体菌为lacZΔM15基因型。这样, 载体同宿主通过互补, 具有完整的β-半乳糖苷酶的活性。如果在载体的lacZ基

分子克隆技术

分子克隆技术
生
物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！

克隆载体
l
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是用来在生物学寄主和试管间“传送”克隆的序 列的DNA分子 (如从细菌到试管再到植物细 胞)。 其共性有四点： 1. 启动自发复制的能力. 2. 含有遗传标记 (通常是显性的) 供选择。 3. 唯一的限切位点以利于克隆插入的DNA 4. 非必需DNA序列 尽可能少以克隆更大片 段。
生
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生
pBR322
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生
pBR322
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pBR322是4362bp的环状 双链DNA载体，有2个抗 药性基因（四环素和氨 苄青霉素），一个复制 起始点和多个用于克隆 的限制酶切点。当缺失 抗药性基因的大肠杆菌 被pBR322成功地转化 时，它便从该质粒获得 了抗生素抗性。两个抗 生素基因中均含供插入 外源DNA用的不同的单一 酶切位点。一般只选一 个抗生素基因作为插入 外源DNA之用。外源DNA 插入后该抗生素抗性失 活。另一抗生素抗性基 因则作为转化细菌后筛 选阳性克隆之用。
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四个重要位点
l (1)
负责质粒复制的rep复制子 (来自 pMB1; (2) 编码Rop 蛋白的rop基因，促进 不稳定的 RNA I – RNA II 复合体转变为 稳定的复合体并起着减少质粒拷贝数的 作用 (来自 pMB1); (3) 编码 beta-内酰胺 酶的bla基因，赋予对氨苄青霉素的抗性 (来自 Tn3转座子); (4) 编码四环素抗性蛋 白的tet基因 (来自 pSC101).
生
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分子生物学克隆表达常用载体序列

pcDNA3.1载体序列：5428bp GACGGA TCGGGAGA TCTCCCGA TCCCCTA TGGTGCACTCTCAGTACAA TCTGCTCTGA TGCCGCA TAGTTAAGCCAGTA TCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAG CAAAA TTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAA TTGCA TGAAGAA TCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGA TGTACGGGCCAGA TA TACGCGTTGACA TTGA TTA TTG ACTAGTTA TTAA TAGTAA TCAA TTACGGGGTCA TTAGTTCA TAGCCCA TA TA TGGAGTTCCGCGTTACA TAACTTACGGTAAA TGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCA TTGACG TCAA TAA TGACGTA TGTTCCCA TAGTAACGCCAA TAGGGACTTTCCA TTGACGTCAA TGGGTGGAGTA TTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACA TCAAGTGTA TCA TA TGCCAAGTACGCC CCCTA TTGACGTCAA TGACGGTAAA TGGCCCGCCTGGCA TTA TGCCCAGTACA TGACCTTA TGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACA TCTACGTA TTAGTCA TCGCTA TTACCA TGGTGA TGCGGTT TTGGCAGTACA TCAA TGGGCGTGGA TAGCGGTTTGACTCACGGGGA TTTCCAAGTCTCCACCCCA TTGACGTCAA TGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAA TCAACGGGACTTTCCAAAA TGTCG TAACAACTCCGCCCCA TTGACGCAAA TGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTA TA TAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTA TCGAAA TTAA TACGACT CACTA 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