缺氧缺血性脑损伤与凋亡的进展

[收稿日期]2002-12-17 [修回日期]2003-03-31Tel:0591-*******;E-mail:chenmi nrong7688605

[文章编号] 1000-4718(2004)07-1318-04

缺氧缺血性脑损伤与凋亡的进展

陈敏榕, 陈燕惠

(福建医科大学附属协和医院儿科,福建福州350001)

Research progress in apoptosis and hypoxic -ischemic brain damage

CHEN Min-rong,CHEN Yan-hui

(Department o f Pediatric,Union Hos pital ,Fujian Medical University ,Fuzhou 350001,China) A Review Apoptosis is one of the most important causes,which results in the central neuronal system complication in hypoxic-ischemic brain damage (HIBD).Apoptosis occurs in the developing brain more than in the developed brain.Apoptosis can last several weeks and may be inverted its pathology by appropriate thera py.Caspase inhibitor,neurotrophic factors,anti-apoptosis gene Bcl-2,mild hypothermia,and early inter vention play important roles in promoting neuronal cell survival and preventing from apoptosis through different mechanisms.It may be a ne w way for rehabilitation of HIB D.

[关键词] 细胞凋亡;缺氧缺血,脑 [KEY WORDS] Apoptosis;Hypoxia-ischemia,brain [中图分类号] R72 [文献标识码] A 缺氧缺血脑损伤常导致严重的中枢神经系统远期并发症如脑瘫,癫痫,智力低下,精神运动发育迟滞等。研究认为缺血再灌注期发生的选择性迟发性神经元死亡即凋亡是导致上述神经系统后遗症的重要原因。发育期脑较成熟脑在缺氧损伤后易发生凋亡[1],凋亡的持续时间可长达数周[2],且经适当治疗可逆转凋亡的病理过程改善预后。缺氧缺血后神经元凋亡的具体机制尚不明确[19],但抗凋亡治疗已受到广大学者的重视。新近报道应用白细胞介素1 转化酶抑制剂,神经营养因子,抗凋亡基因Bcl-2,亚低温,早期干预等均可通过不同机制抑制凋亡,促进脑损伤后细胞存活。本文就此作一综述。1 白细胞介素1 转化酶抑制剂

白细胞介素1 转化酶(caspase),它直接水解激活与DNA 断裂等凋亡特征性改变密切相关的蛋白,故又名凋亡蛋白酶。现已发现的介导凋亡的caspase 有多种,根据功能不同可分为启动者和效应者,任一caspase 激活均可在瞬间引起caspase 级联反应,其中caspases-3是该级联的必经之路。它直接作用于多种底物如聚二磷酸苷核糖合成酶(poly ADP-ribose

polymerase ,PARP 又称DNA 修复酶),核膜层蛋白,DNA-PK 等导致细胞核细胞骨架或细胞膜结构蛋白降解,形成凋亡形态学和生化学改变的基础。Han 等[2]报道新生大鼠缺氧缺血后6h 脑皮层caspase-3活化,12-18h 纹状体和海马caspase-3活化,cas pase-3活化高峰出现于损伤后24h 与凋亡出现的时间和高峰相一致。大鼠短暂全脑缺血后,海马CA1区锥体神经元可见caspase-3mRNA 表达上凋,以缺血24h 最显著,96h 后显著下降[3]。新生7d 龄大鼠短暂缺氧后纹状体皮层caspase-3阳性细胞数可超过90%

[1]

。由此可见caspase 在凋亡中的重要

性。由caspase 诱导的凋亡主要发生于动物的海马,纹状体,皮层;这些部位均与学习、记忆、运动能力密切相关。研究者们设想能否通过caspase 抑制剂阻断凋亡病理进程,改善缺氧缺血脑损伤预后,希望进一步的研究证实其可行性。Cheng 等

[4]

发现脑室内或

腹腔注射caspase 抑制剂BAF 可明显减轻新生7d 龄HIB D 大鼠脑损伤程度,用药组大鼠海马、皮质部位体积缩小程度及神经元密度减少均明显轻于对照组。选择性caspase-1抑制剂Ac-WE HD-C HO 及广谱caspase 家族抑制剂z-VAD.FMK 能明显减少海马C A1区锥体神经元的迟发性死亡[5]。由caspase 激活的神经元凋亡是一个延迟发生的过程,这就为

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1318!中国病理生理杂志 Chinese Journal of Pathophysiology 2004,20(7):1318-1321

临床治疗提供了时间保证。人工合成的caspase抑制剂是非肽类小分子物质,能通过血脑屏障及细胞膜,在动物实验中能有效抑制凋亡,但由于其不良反应尚不明确,影响了它在临床上的推广。相信随着对不同caspase类抑制剂疗效和不良反应研究的深入,将会有越来越多更特异有效的药物应用于临床。

2 神经营养因子

神经营养因子(neurotrophic factors,NTFs)及受体在保障特定神经细胞存活,促进生长分化,特别是防止凋亡方面有显著的生物学效应;只有从靶组织接受到足够的神经营养因子的神经元才能继续生长,其余的则发生凋亡。主要的神经营养因子有碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neu rotrophic factor,B DNF)、神经生长因子(nerve growth factor,NGF)等。在缺氧缺血再灌注损伤期有大量内源性神经营养因子表达,推测与脑损伤修复有关。动物实验证实此时给予外源性神经营养因子bFGF、BDNF、NGF能逆转凋亡,促进受损神经元存活和远期脑功能康复。Cuevas等[6]报道静脉注射bFGF能在海马C A1区锥体神经元周围聚集,使缺血再灌注损伤大鼠CA1区神经元凋亡明显减少。单纯玻璃体内注射bFGF能保护传播性海绵样脑病小鼠光感受器,有效降低光感受器凋亡数目[7]。目前认为bFGF可能通过阻止细胞内钙超载,阻断兴奋性氨基酸及其受体,抑制一氧化氮的毒性作用,或通过上调Bcl-2的表达,阻止缺血后的脑细胞凋亡[8]。洪新如等[9]研究发现脑内移植B DNF载体可显著降低新生大鼠缺氧缺血后48h损伤侧皮层海马纹状体等脑区的细胞凋亡,对损伤后21d脑萎缩,脑组织减少和神经细胞死亡具有拮抗作用。脑室内注射B DNF可通过阻止缺血诱导的caspase-3表达来阻断凋亡[2]。BDNF 也可能通过阻止半暗带钙超载,使钙敏感性核糖核酸酶不能被激活,无法降解DNA双链而阻止凋亡。Guegan等[10]在NGF转基因小鼠研究中发现,局灶缺血后NGF持续表达1周,伴凋亡细胞明显减少,损伤脑铜锌超氧化物歧化酶,谷胱甘肽转移酶,Bcl-2水平明显高于对照组,提示NGF可能通过清除自由基,上调Bcl-2表达而发挥神经保护作用。虽然神经营养因子具有明确的抗凋亡、促进受损神经元修复的作用,但由于神经营养因子是大分子多肽,不易通过血脑屏障,限制了其临床应用,相信随着分子生物学研究的进展,通过蛋白修饰与基因工程技术改造,使外源性神经营养因子越过血脑屏障,在损伤局部定位,高水平持久释放,将为缺氧缺血性脑损伤修复提供新途径。

3 基因治疗

目前研究较多的与凋亡有关的基因可分为抗凋亡基因如Bcl-2,Bcl-X,Bcl-XL,Mcl,adenovirus, EBV,ced-9,HSP70,HSP72等,促凋亡基因如Bax, Bak,Bcl-xs,c-myc,c-fos,c-jun,fas/apo-1,P53, P75NGR等。其中Bcl-2家族基因在调控发育过程和成体细胞的正常存活及细胞凋亡起重要作用,是最重要的抗凋亡基因。Bcl-2是从淋巴瘤白血病细胞中分离出的一种原癌基因,广泛分布于发育期及成熟大鼠脑中,与神经元存活有关。Bcl-2表达减少易导致神经细胞死亡,Bcl-2过度表达则抑制神经元凋亡。Nakamura等[11]在宫内脑缺氧损伤模型研究中发现,过度表达Bcl-2转基因鼠脑损伤后同侧大脑半球,海马C A3区,齿状回组织缺失明显少于对照组。而Bcl-2基因敲除鼠,缺血后梗死面积明显增大,神经元缺失加重[12]。这些均提示Bcl-2能够抑制缺血神经元凋亡,存在一定的脑保护作用。Bcl -2抗凋亡机制尚不明确,可能是缺氧缺血后大量钙超载、线粒体损伤、细胞色素C释放,使Bcl-2与凋亡活化因子(apoptosis active factor,Apaf-1)分离,后者激活caspase-9,进而导致caspase级联反应,细胞凋亡。目前技术能将Bcl-2基因转导入脑内,并使其在特定脑区表达,有效阻止神经元凋亡,发挥神经保护作用。Antona wich等[13]将表达Bcl-2基因的单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)载体转染至海马CA1区,能够大大减少短暂全脑缺血大鼠海马CA1区锥体神经元的缺失。由于技术水平限制,转基因治疗还存在操作复杂,创伤大,转染率低等特点,Bcl-2在抗凋亡同时还能使细胞增殖,虽未有报道其致癌作用,但其利弊仍有争论,故基因治疗临床推广尚待时日。

4 亚低温疗法

亚低温指温度比正常脑温低2-6?,亚低温能明显降低脑组织能量代谢率和耗氧量,减轻脑水肿,抑制兴奋毒性,大大减少缺血后神经元凋亡,显示了显著神经保护作用。近年来,亚低温与细胞色素C 的关系的研究成为一个热点。Yenari等在体外培养细胞凋亡研究中发现亚低温5h能显著减少缺血后线粒体细胞色素C释放数量,但不伴有Bcl-2、Bax 的表达,亦无caspase活化;更进一步研究发现亚低温24h,caspase-3,8,9活性显著低于常温组,细胞色素C释放明显减少,Bcl-2、Ba x、HSP-70无明显改变,

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而c-JunN-末端激酶活化,亚低温48h 凋亡细胞数较常温组减少一半

[14,15]

。提示亚低温能在早期阻断

凋亡可能与亚低温抑制c-junN 末端酶的活化,进而抑制线粒体细胞色素C 的释放,继发性阻断caspase 级联,阻断凋亡进程有关。即其抗凋亡机制可能与亚低温能保持线粒体完整,抑制细胞色素C 的释放从而阻断凋亡有关,而与Bcl-2、Ba x 基因表达、cas pase 活化无关。也有学者持反对意见,认为亚低温通过改变即刻早期基因和抗凋亡基因Bcl-2的表达来抑制凋亡。Zhang 等[16]发现前脑缺血10min,亚低温3h,72h 后亚低温组海马CA1区神经元存活率达90%,常温组为55%,Bcl-2阳性细胞数多于假手术组和常温组。故认为亚低温通过使Bcl-2表达增加而阻断凋亡。虽然亚低温抗凋亡的机制尚有争议,但成人应用中因其容易实施且病人可以很好耐受,从而易在临床中推广。深入研究亚低温抗凋亡机制将为非药物性抗凋亡治疗开辟新途径。

5 早期干预

早期干预是通过有组织有目的的丰富环境(视觉、触觉、嗅觉、味觉、听觉等各方面丰富的环境刺激)来减少发育期脑损伤及神经系统后遗症,促进脑损伤康复的一种手段。大量动物实验证实丰富的环境刺激可改善损伤后脑的形态和功能,使树突棘密度增加,突触联系范围扩大,神经递质改变,空间学习记忆能力增强等。临床实践证实早期干预能使正常婴儿及脑损伤患儿智力发育商数和行为发育商数明显提高。但早期干预促进脑损伤修复的具体机制尚未明了。Young 等[17]的研究证实丰富环境3周能使成年大鼠海马神经元自发性凋亡数减少45%,海马齿状回颗粒细胞层体积增大,对脑损伤惊厥的发生具有抵抗力。免疫组化显示胶质源性神经营养因子(glial-derived neurotrophic factor,GDNF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)等的表达增加,转录因子c-AMP 反应元件结合蛋白(cyclic adenosine monophosphate response element-bind ing protein ,CREB)磷酸化增多,原位杂交显示GDNF -mRNA 表达上调。推测丰富环境减轻脑损伤机制可能与GDNF 、BDNF 等的表达增加及C REB 磷酸化有关。C REB 磷酸化成为活性形式可调节神经兴奋性、突触可塑性及发育,发挥神经保护作用。神经营养因子则有明确的营养神经元,逆转损伤脑组织凋亡的作用。Pinaud 等

[18]

研究发现丰富环境通过使大

鼠皮质(尤其#-?层)即刻早期基因arc-mRNA 表达上调、凋亡减少来减轻脑损伤。从而得出早期干

预通过调节即刻早期基因表达抗凋亡的结论。以丰富环境为主的早期干预通过使神经元凋亡减少发挥脑保护作用成为无可争议的事实。出生后最初两年是中枢神经系统生长发育最迅速、代偿力及可塑性最强的时期。脑重量迅速增加,脑胶质细胞增殖旺盛,大脑皮层的移行仍在继续,同时也是树突发育和突触发生的重要时期。此期内的良性干预可促使脑损伤后脑功能的代偿适应,及脑解剖结构的适应性改变,大大减少脑损伤后遗症的发生。因此深入探讨早期干预是通过何种机制减少凋亡,促进再生,将为脑损伤的康复提供新思路。

此外钙离子、兴奋性氨基酸及其受体、氧自由基、一氧化氮等均参与缺氧缺血后神经元凋亡,故其相应钙拮抗剂,谷氨酸受体拮抗剂,氧自由基清除剂及一氧化氮合酶抑制剂均可通过阻断脑损伤后神经元凋亡而发挥神经保护作用。近年,细胞凋亡已被公认为是缺氧缺血性脑损伤后神经细胞受损的重要机制,抗凋亡治疗已成为脑损伤后期修复的一个重要手段。

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(上接第1303页)

这是否与S T的致癌机制有关尚需进行深入研究。

本研究还发现S T在不同剂量和作用后不同时间对肾脏细胞的增殖均无明显影响,可能与观察时间较短有关,但其确切机制尚需进一步探讨。

本研究首次揭示了短暂ST暴露即可明显促进小鼠肾脏细胞的凋亡,说明ST对肾脏有明显的毒性作用。因此,在实际工作中,应注意严格检测饮食及饲料中的S T污染情况,采取措施尽量防止或降低人和动物暴露水平。

[参 考 文 献]

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