质粒提取原理和方法Word文档
质粒DNA提取的原理及方法
碱裂解法质粒DNA提取原理
质粒DNA提取主要包括以下几个方面：如何将细胞裂解释放质粒DNA，如何将质粒DNA和基因组DNA分离开来，如何去除RNA污染，如何去除蛋白质和其它杂质。
质粒提取方法中，最常用的方法是碱裂解法，它具有得率高，适用面广，快速，纯度高等特点。其原理是：
强碱性条件下，质粒DNA和基因组DNA同时从细胞中释放出来，并发生变性。在pH中性，并有高盐浓度存在的条件下，质粒DNA会迅速发生复性，仍为可溶性状态，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，在去垢剂SDS作用下，染色体DNA与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，通过离心去除沉淀后，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA，用异丙醇或乙醇沉淀可将之纯化出来。
BIOMIGA公司质粒DNA纯化系列试剂盒，采用碱裂解法质粒提取原理，在高盐环境下，采用硅胶膜特异性的吸附质粒DNA，而蛋白质不被吸附，最后用低盐洗脱液将DNA从膜上洗脱下来，方法简单，快速，质量好，收获量高。
影响质粒提取的因素
影响质粒提取的因素有很多种，如质粒拷贝数，宿主菌株的种类，细菌的培养时间、培养基种类、培养条件等等。
质粒拷贝数
质粒DNA最终收获量取决于质粒的拷贝数和质粒的大小。BIOMIGA 公司质粒DNA提取系列试剂盒，操作步骤适用于高拷贝数质粒的纯化，对于低拷贝质粒纯化提取，应加大起始菌液量的体积，并且相应地增加各种缓冲液的用量。
下表给出一些常用质粒载体的拷贝数：
质粒种类
复制起点
拷贝数
1 mL菌液质粒DNA收获量(μg)
pSC101
pSC101
5
0.1-0.2
pACYC
P15A
10-12
0.4-0.6
pSuperCos
pMB1
10-20
0.4-1
pBR322
pMB1
15-20
0.6-1
pGEMR
Muted pMB1
300-400
6-7
pBluescriptR
ColE1
300-500
6-8
pUC
Muted pMB1
500-700
8-12
宿主菌株
宿主菌株的种类将会影响质粒的收获量。含内源核酸酶的宿主菌株，如JM101, JM110, HB101, TG1以及它们的衍生菌株，通常因为内源核酸酶的存在，或者在提取过程中释放出来的核酸
酶的作用下，将会显著影响最终收获量，或者纯化到的质粒容易降解，推荐客户将质粒转化至不含内源核酸酶的宿主菌株中，如Top10, DH5a进行质粒纯化。
如果从含内源核酸酶的宿主菌株中纯化质粒DNA，请用试剂盒附送的核酸酶去除溶液，去除核酸酶的污染。或选用HP系列试剂盒进行质粒的纯化。
下表给出一些常用的宿主菌株种类：
EndA- Strains of E. Coli
DH5α
DH1
DH21
JM106
JM109
SK2267
SRB
XLO
TOP10
DH10B
JM103
JM107
SK1590
MM294
Stbl2?
XL1-Blue
BJ5182
DH20
JM105
JM108
SK1592
Select96?
Stbl4?
XL10-Gold
EndA+ Strains of E. Coli
C600
JM110
RR1
ABLE? C
CJ236
KW251
P2392
BL21(DE3)
HB101
TG1
TB1
ABLE? K
DH12S?
LE392
PR700
BL21(DE3) pLysS
JM101
JM83
TKB1
HMS174
ES1301
M1061
Q358
BMH 71-18
All NM strains
All Y strains
菌液培养
BIOMIGA 公司质粒DNA提取系列试剂盒，标准操作适用于在LB培养基中培养12~16小时，OD600在2.0~3.0的菌液质粒DNA的提取。如果使用丰富培养基，如TB，2 x YT培养基，请保证OD600不超过3.0。菌液过量，将会影响最终的收获量和纯度。
培养方式
如果用于质粒小提，请从固体培养基平板上挑取新鲜单菌落，接种到加入筛选抗生素的培养基中，震荡培养12~16小时。
如果用于中提、大提或超大提，请按照以下方式制备菌液：
挑取单克隆，接种到1~5mL培养基中，进行初摇，然后按照1:1000的比例进行放大培养，培养瓶中培养基的体积最好不要超过培养瓶的1/4体积。
抗生素浓度的选择
对含有抗性的质粒载体，在进行筛选或培养时应加入相应的抗生素。
各种抗生素的工作浓度请参照下表：
抗生素
溶解性
保存条件
严紧型质粒
松弛型质粒
氨苄青霉素
50 mg/mL(溶于水)
-20℃
20 μg/mL
60 μg/mL
羧苄青霉素
50 mg/mL溶于水
-20℃
20 μg/mL
60 μg/mL
氯霉素
34 mg/mL溶于无水乙醇
-20℃
25 μg/mL
170 μg/mL
卡那霉素
10 mg/mL溶于水
-20℃
10 μg/mL
50 μg/mL
链霉素
10 mg/mL溶于水
-20℃
10 μg/mL
50 μg/mL
四环素
5 mg/mL溶于无水乙醇
-20℃
10 μg/mL
50 μg/mL
质粒质量鉴定
纯化到的质粒DNA一般可以通过以下三种方式进行质量鉴定。
琼脂糖凝胶电泳检测
理想条件下，经碱裂解法纯化到的质粒DNA，应该只出现超螺旋一条带。但在质粒提取过程中机械力，强碱溶液的作用等原因，纯化到的质粒常常会出现三条带，甚至有时候会出现四条带(变性超螺旋)，不管是哪种形式的超螺旋，经单酶切后，呈现一条带，则说明提取结果正常，没有基因组污染。