达安-HBV-DNA定量试剂说明书

1 目的

规范LightCycler荧光PCR检测仪检测乙型肝炎病毒（HBV-DNA）的检验工作，指导检验人员正确进行乙肝病毒核酸定量的检测，保证检验结果的质量。

2 范围

本规程适用于LightCycler荧光PCR检测仪检测乙型肝炎病毒（HBV-DNA）

3 试剂

中山大学达安基因公司乙肝病毒(HBV)核酸扩增荧光检测试剂盒

4 仪器

Roche LightCycler荧光PCR检测仪

高速台式冷冻离心机

微量加样器（覆盖1-1000μl）

5 样品处理

样品处理按《PCR实验室标本处理规程》进行收集和处理，具体操作见本规程附录1和附录2。

6 测定

6.1 PCR扩增

6.1.1 打开稳压器电源，再打开计算机电源。

6.1.2 打开扩增仪电源，按仪器操作规程进入扩增循环条件设定。

6.1.3 将循环条件设定为：

6.1.4 检查反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。

6.1.5 将待反应的PCR反应管放入扩增仪中，并根据实际情况和仪器操作规程在程序中定好反应孔位置。

6.1.6 关闭扩增仪盖，按仪器操作规程开始循环。

6.1.7 扩增结束后关闭扩增仪电源，取出PCR反应管，密封放入垃圾桶。

6.2 产物分析

6.2.1 条件设置：反应结束后自动保存检测数据文件，调整荧光数值为F1/F2。点击Quantification读取结果。

6.2.2 基线的确定：取3～8个循环的荧光信号。

6.2.3 噪声容限（阈值）：调节在阴性质控品以上，要求在Step3：Analysis下相关性r 值＜-0.97，接近-1.0。

6.2.4 对照标准：保证阴性质控品的Ct值不出现任何数值（默认为40）。

6.2.5 最后记录仪器自动分析计算出的未知标本数值（M），关闭计算机。

7结果判断

7.1 如果Ct值＝40，则实验样品的UU DNA含量（基因拷贝数/ml）＜1×103。

7.2 如果Ct值＜40，则实验样品的UU DNA含量（基因拷贝数/ml）＝ M

7.3 检测样本中核酸阳性时，按实际结果报告；对可疑结果应复查，需要时与临床联系。

8 注意事项

8.1 各标本沸水浴时间误差不超过1分钟。

8.2 加样时每加完一个要立即盖上封闭好离心管。

9 支持性文件

9.1 《乙型肝炎病毒核酸扩增荧光定量检测试剂盒操作说明书》

8.2 《临床基因扩增检验实验室工作规范》

10 质量记录

附录1：HBV项目标本采集、运送流程图

TAKARA 实验室常规试剂配制方法

031*-2./4,+ 5 8679giaifi [`eg]\_debe^h \ZgZbe^ edb`d]:mwwtYOOyyyNwioiuiNjsqNjr .1/{30,z +|2}-4*~ Q c gunvM_\p Jt_WNTL WNVL XNPK : I JRNS7GDO :H :8b~:;:8:M JRNS QK :H 4^R U ;8t 3L A99 POg /} T8Yclw\1yU <8[?`~t 3-C9ix ;AD gQG O U =8u 1E j 2P :HU >8m >m B,{qY 7>]dU SF Z I61E |0P7>q N ijQG O Y Hkg_ra G peY > k +5m:VY 1E gQG O e L vh989I JRNS7GDO : H :8b~:A:8@M JRNS QK :H 4^R U ;8t 3L A99POg /}T8Yclw\1yU <8J-C9ixQG OP A8AU =8u 1E j 2P :HU >8m >m B,{qY 7>]dU SF Z I61E |0P7>q N ijQG O Y Hkg_ra G peY > k +5m:VY 1E gQG O e L vh989m B,{U =87>]dU S c

人类K-ras基因突变检测试剂盒说明书

人类K-ras基因突变检测试剂盒（PCR-熔解曲线法）说明书 【产品名称】 通用名：人类K-ras基因突变检测试剂盒（PCR-熔解曲线法） 英文名：Diagnostic kit for Mutations of Human K-ras Gene (PCR-Melting Curve Analysis) 【包装规格】 20测试/盒 【预期用途】 K-ras基因位于12号染色体短臂上，是重要的癌基因之一，编码一种21kD 的kras蛋白，参与细胞内的信号传递，主要包括PI3K/PTEN/AKT 和 RAF/MEK/ERK信号转导途径，这些转导途径是当前肿瘤靶向药物研究的热点，靶向药物通过抑制这些途径发生药理作用。K-ras基因第12和13密码子发生突变，将导致kras蛋白变异并处于持续激活状态，使药物失效。。据中国2010版《肿瘤学临床实践指南》，在一项包含101例肺腺癌亚型细支气管肺泡癌患者的回顾性研究中，所有患者均接受厄洛替尼单药一线治疗。K-ras突变者无一例缓解（0/18），而无K-ras突变者则有20例缓解（20/62，32%），差别有统计学意义（P <0.01）。因此，指南建议，非小细胞肺癌和结直肠癌患者使用靶向药物前应进行K-ras基因突变状态的检测。 本试剂盒以人非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤组织切片提取的基因组DNA为检测样本，用于检测肿瘤组织K-ras基因第12，13密码子的12种体细胞突变（表1），提供突变状态的定性结果。为临床肿瘤靶向药物的个体化用药提供辅助诊断依据，本品适用于进入个体化靶向治疗疗程前的患者使用。 【检验原理】 本试剂盒基于实时PCR平台，结合了特异引物、荧光探针和熔解曲线技术，定性检测DNA样品中K-ras基因12，13密码子是否存在突变。用一对K-ras基因特异引物，该引物可

常用试剂的配制.

常用试剂的配制 1．无Ca2+、Mg2+Hanks液 NaCl 4.5g KCl 0.2g NaHCO 3 0.175g Na 2HPO 4 ·12H 2 O 0.076g KH 2PO 4 0.03g 葡萄糖 0.5g 0.4%酚红 2.5ml 将上述成分依次溶解或加入到双蒸水中, 最后补加双蒸水至500ml, 以5.6%NaHCO 3调整 pH 值至7.4，4℃冰箱保存备用。 2．甲基红试剂 （1）成份 甲基红 0.1g 蒸馏水 200ml 95％乙醇 300ml （2）用途：测定甲基红反应。 3．Hanks液（原液） 原液甲： NaCl 160g KCl 8g MgSO 4·7H 2 O 2g MgCl 2·6H 2 O 2g 上述试剂加入800ml双蒸水。溶解。 CaCl 2 2.8g溶于100ml双蒸水 上述二液混合，加双蒸水至1000ml，再加2ml氯仿防腐，4℃保存。 原液乙： Na 2NPO 4 ·12H 2 O 3.04g KH 2PO 4 1.2g 葡萄糖 20g 加入800ml双蒸水，溶解。 0.4%酚红溶液100ml 上述二液混合，加双蒸水至1000ml，再加2ml氯仿防腐，4℃保存。 使用时甲,乙原液按下列比例配成Hanks 液使用液：原液甲1份、原液乙1份、双蒸水18份滤过，8磅20min灭菌，放4℃冰箱保存，使用前用NaHCO 3 调整PH值。 4．0.4%酚红溶液 称取0.4g酚红置研钵中研碎，逐渐加入0.lmol/LNaOH并不断研磨，直到所有的颗粒

几乎完全解，加入0.lmol/LNaOHl0ml，然后倒入容量瓶中，并加蒸馏水至l00ml,棕色瓶保存备用。 5．pH7.2 Tris-NH 4 CI溶液(红细胞崩解液） Tris (三羟甲基氨基甲烷) 1.03g NH 4 Cl（氯化氨) 3.735g 加双蒸水至500ml，用浓HCl调pH=7.2，10磅15min灭菌后放4℃保存。 6．0.05moI/L pH8.6 巴比妥缓冲液 巴比妥 1.84g 加蒸馏水 200ml 加热溶解 巴比妥纳 10.3g 叠氮纳 0.2g 加蒸馏水溶解 , 并补加到 1000ml 。 7．磷酸盐缓冲液(PB) A 液：为 0.2mol/L 磷酸二氢钠水溶液 ,NaH 2PO 4 ·H 2 O 27.6g, 溶于蒸馏水中, 最 后补加蒸馏水至 1000ml 。 B 液：为 0.2mol/L 磷酸氢二钠水溶液 ,Na 2HPO 4 .7H 2 O 3.6g（或 Na 2 HPO 4 ·12H 2 O 71.6g, 或Na 2HPO 4 · 2H 2 O 35.6g ）, 加蒸馏水溶解，最后加水至 1000ml。若再加 蒸馏水至200ml则成为0.1mol/LPB。 8．0.1mol/LPH8.4 硼酸缓冲液（BBS） 硼酸钠（Na 2B 4 O 7 .10H 2 O） 0.46g 硼酸（H 2BO 3 ） 0.51g 加蒸馏水至100ml 溶解。9．PH7.4 0.01mol/L 磷酸盐缓冲液（PBS）配制方法一： 0.2mol/L Na 2HPO 4 （ Na 2 HPO 4 ·12H 2 O 71.6g加蒸馏水至1000ml） 0.2mol/L NaH 2PO 4 （NaH 2 PO 4 ·2H 2 O 35.6g加蒸馏水至1000ml） 取0.2mol/L Na 2HPO 4 81.0ml 加0.2mol/L NaH 2 PO 4 19ml,再加1900mlH 2 O和 17gNaCl即为PH7.4 0.01mol/L PBS。 PH7.4 0.01mol/L PBS再加入0.05%Tween-20即为ELISA试验的洗涤液。 配制方法二： 甲液（0.1mol/LKH 2PO 4 溶液）：KH 2 PO 4 13.608g，加蒸馏水至1000ml。 乙液（0.1mol/L Na 2HPO 4 溶液）：Na 2 HPO 4 35.814g，加蒸馏水至1000ml。 取甲液19ml，乙液81ml NaCl8.5g、Tween-20 0.5ml混合后加蒸馏水至1000ml即可。

翻译好罗氏公司Tel试剂盒操作说明书

罗氏(Roche)公司Tunel试剂盒操作说明书 (In situ cell death detection kit-POD法) 一、原理： TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。 二、器材与试剂 器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等； 试剂：试剂盒含： 1号（蓝盖）Enzyme Solution 酶溶液：TdT 10×、 2号（紫盖）Label Solution标记液：荧光素标记的dUTP 1×、 3号（棕瓶）Converter-POD:标记荧光素抗体的HRP； 自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、

B-raf基因突变检测试剂盒(PCR-毛细管电泳法)标准化操作流程

B-raf基因突变检测试剂盒(荧光PCR-毛细管电泳法) 标准化操作流程 1、预期用途 该产品用于定性检测确诊的结直肠癌患者石蜡包埋病理组织切片DNA的B-rafV600E 基因突变。B-raf 基因是一种癌基因，编码一种丝/ 苏氨酸特异性激酶，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK 通路重要的转导因子，参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生长、分化和凋亡等。B-raf 基因位于7p34，长约190kb，转录mRNA 长2.5kb，编码783 氨基酸的蛋白，相对分子质量为94000-95000 Da。 研究表明，在多种人类恶性肿瘤中，如恶性黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的B-raf 突变，B-raf 突变主要发生在Exon15 上的激活区的第1799 氨基酸上(T 突变为A)，导致编码的氨基酸由谷氨酸变成缬氨酸(V600E)，该突变能使B-raf 激酶活性提高，V600E 突变能模拟T598 和S601 两个位点磷酸化作用，使BRAF 蛋白激活。近来研究表明，对于野生型Kras、但存在B-raf 基因V600E 突变患者，抗EGFR 单抗治疗无效。2010 年版《NCCN 结直肠癌临床实践指南》中已明确指出“如K-ras 基因无突变时，需检测B-raf 基因突变，如果后者存在V600E突变，则不应该给予抗EGFR 单抗治疗。” 2、仪器配置要求 移液器，振荡器，微型离心机，生物安全柜，高速冷冻离心机，定性PCR仪，荧光定量PCR仪（ABI7500，LightCycler? 480，MX3000P，CFX-96等），微量紫外分光光度计，基因分析仪（ABI3130，ABI3500DX）。 3、耗材要求 无菌带滤芯吸头、吸水纸，离心管（1.5ml，0.5ml，0.2ml）、PCR反应管（配套荧光定量PCR仪型号）及无粉一次性乳胶手套，基因分析板。 4、责任人 基因扩增实验室室长负责技术指导和质量监督。 5、执行人 操作人员应经过专业培训，具有合格的操作技能的检验专业技术人员。 6、检测原理 本产品选取人类基因组B-raf 基因Exon 15 上设计特异性引物和探针，对扩增后的PCR 产物片段进行测序分析。使用尿苷酶(UNG)防污染体系，经加热可以选择性地降解U-DNA，以防止先前PCR 扩增产物的污染。 7、试剂来源 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司 8、样本要求 8.1用量：每例标本切5张(10μm)白片，连续切片，不漂洗脱蜡，直接封存于1.5ml EP管中； 8.2质量：为确保DNA提取成功率，必须选择2年以内的石蜡标本； 8.3标本收集方法：石蜡包埋病理切片样品应确定含有肿瘤病变细胞，为了保证切片组织中

大量全血基因组DNA提取试剂盒操作方法及步骤说明书

大量全血基因组DNA提取试剂盒 目录号：DN04 DN0401 16次×10ml DN0402 32次×10ml DN0403 96次×10ml 适用范围： 适用于快速提取各种动物全血基因组DNA 试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成保存16次×10ml 32次×10ml 96次×10ml 10x红细胞裂解液室温50 ml 100 ml 300 ml 细胞核裂解液室温180 ml 180×2 ml 250 m l×4 蛋白沉淀液室温55 ml 110 ml 330 ml DNA溶解液室温15 ml 30 ml 90 ml 本试剂盒在室温储存18个月不影响使用效果。 储存事项: 1.环境温度低时细胞核裂解液中某些去污剂成份会析出出现浑浊或者沉淀，可在 37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。 2.蛋白沉淀液可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，如果不 能完全溶解，也不影响使用效果，直接取用上层溶液即可。

3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时 盖紧盖子。 产品介绍： 本试剂盒根据全血特点采用几个快速步骤提取基因组DNA。首先红细胞裂解液裂解去除不含DNA的红细胞，细胞核裂解液裂解白细胞释放出基因组DNA，然后蛋白沉淀液选择性沉淀去除蛋白，最后纯净的基因组DNA通过异丙醇沉淀并重溶解于DNA 溶解液。 产品特点： 1.从十几个配方中优选出的红细胞裂解液配方，裂解快速完全。 2.不需要使用有毒的苯酚等试剂。 3.快速，简捷，单个样品操作一般可在1小时内完成。 4.结果稳定，产量高（典型的产量10ml全血可提取出150-500μg），OD260/OD280 典型的比值达 1.7～1.9，长度可达50kb-150kb，可直接用于构建文库、PCR、Southern-blot和各种酶切反应。 注意事项 1.所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到2,500 x g，并配备容纳50ml心 管转头的传统台式离心机。 2.用户需自备异丙醇和70％乙醇。 3.典型的产量10ml全血可提取出150-500μg基因组DNA（不同样品尤其疾病样品中 中白细胞数量差异可能非常大，因此产量的个体差异也可能非常大）。 4.本试剂盒为溶液型，可以很容易的按照比例扩大或者缩小每次处理的全血量 （20μl-10ml），请联系我们索取其它处理量的操作手册。

Takara RT-PCR Kit

Code No.：DRR019A RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0 （100次量）

目录 内 容 页 码 ●制品说明 1 ●制品内容 1 ●保存 2 ●RNA PCR原理 2 ●试剂盒特点 3 ●RNA样品制备 4 ●使用注意 4 ●引物选择 5 ●实验操作 5 ●Q&A9 ●参考文献 9

●制品说明 PCR（Polymerase Chain Reaction；聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的简单而有效的方法。虽然原理上PCR法是扩增DNA，RNA不能直接被扩增，但是经过反转录酶的作用把RNA反转录成cDNA 后，PCR法便可应用于RNA的解析了。迄今为止，此方法已广泛应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种领域。 TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0是使用AMV（Avian Myeloblastosis Virus）由来的反转录酶将RNA合成cDNA，然后在同一反应管中使用Hot Start PCR用TaKaRa Ex Taq HS DNA聚合酶扩增此cDNA的RT-PCR试剂盒。本试剂盒含有从RNA到cDNA，然后使用PCR法扩增此cDNA所需的全部试剂。 本试剂盒中的Oligo dT-Adaptor Primer的独特设计，大大地提高了Poly(A )+ RNA 3′端区域的cDNA合成效率。Hot Start PCR用DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq HS的应用，大大地增加了本试剂盒的扩增性能。 ●制品内容（100次量） 1. AMV Reverse Transcriptase XL（5 U/μl） 50 μl （Avian Myeloblastosis Virus来源） 2. RNase Inhibitor（40 U/μl） 25 μl 3. Random 9 mers（50 pmol/μl） 50 μl 4. Oligo dT-Adaptor Primer（2.5 pmol/μl） 50 μl 5. RNase Free dH2O 1 ml 6. TaKaRa Ex Taq?HS（5 U/μl） 40 μl 7. M13 Primer M4（20 pmol/μl） 50 μl 8. 10×RT Buffer 1 ml [100 mM Tris-HCl（pH8.3），500 mM KCl] 9. 5×PCR Buffer 1 ml 10. dNTP Mixture（各10 mM） 150 μl 11. MgCl2（25 mM） 1 ml 12. Control R-1 Primer（20 pmol/μl） 25 μl （Positive Control RNA下游引物） 13. Control F-1 Primer（20 pmol/μl） 25 μl （Positive Control RNA上游引物） 14. Positive Control RNA（2×105 copies/μl） 25 μl （Transcribed poly(A)+ RNA of pSPTet3 plasmid） 【各种引物序列】 引物名称 各引物序列 Random 9 mers 5′-（P）NNNNNNNNN-3′ Oligo dT-Adaptor Primer 包含dT区域及M13 Primer M4序列。 Control F-1 Primer 5′-CTGCTCGCTTCGCTACTTGGA-3′ Control R-1 Primer 5′-CGGCACCTGTCCTACGAGTTG-3′ M13 Primer M4 5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′ -1-

Braf基因突变检测试剂盒说明书

人类B-raf基因V600E突变检测试剂盒（荧光PCR法）说明书 【产品名称】 通用名：人类B-raf基因V600E突变检测试剂盒（荧光PCR法） 英文名：Diagnostic kit for V600E Mutation of Human B-raf Gene(Fluorescence PCR Analysis) 【包装规格】 20测试/盒 【预期用途】 B-raf基因位于7号染色体长臂上，是一种癌基因，属RAF基因家族，有18个外显子，编码一种含783个氨基酸的B-raf蛋白，是EGFR通路RAS/RAF/MEK/MRK/MAPK中重要的转导因子，参与调控细胞生长、分化和凋亡等多种生理过程。 针对EGFR的肿瘤靶向药物通过抑制该途径发生药理作用。研究表明在非小细胞肺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中存在B-raf基因突变，其中第15外显子上V600E点突变最常见，约占所有突变的90%以上，该突变导致B-raf蛋白被异常激活，从而使患者接受EGFR-TKI药物和EGFR单抗类药物治疗失效。据中国2010版《肿瘤学临床实践指南》建议，对K-raf基因检测正常的非小细胞肺癌和结直肠癌患者，应进一步检查B-raf基因的突变状态，以指导靶向药物治疗方案。 本试剂盒以人非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤组织切片提取的基因组DNA为检测样本，用于肿瘤组织B-raf 基因V600E点突变的定性检测，为临床肿瘤靶向药物的个体化用药提供依据。本公司尚无临床实例证实B-raf 基因突变与靶向药物的相关性，其相关性主要来自文献报道，因此本试剂盒检测结果仅用于辅助临床医生对肿瘤患者制定用药方案。 【检验原理】 本试剂盒基于实时荧光PCR平台，结合等位基因特异性扩增（ARMS）技术、野生型基因扩增抑制技术和多重PCR技术检测B-raf基因V600E突变。ARMS技术是指PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增，通过设计特异性ARMS引物，对存在V600E突变的B-raf基因靶序列进行PCR扩增放大，并利用FAM基团标记的Taqman 探针对扩增产物进行检测。因为采用了野生型基因扩增抑制剂，使ARMS体系能够耐受更高浓度的背景野生型B-raf基因，降低了试剂盒对基因组样本的DNA浓度要求，提高了检测灵敏度。 为质控扩增体系的有效性，试剂盒设置了内质控和外质控，内质控基因是人类基因组的一个保守片段，长

组织基因组DNA提取试剂盒磁珠法

组织基因组DNA提取试剂盒（磁珠法） 使用说明书（Cat#Yu-TD02-1） 【产品介绍】 组织基因组DNA提取试剂采用国内领先的专利技术合成的纳米磁珠颗粒和多次实验优化的缓冲液体系，能从样品中分离纯化高质量DNA。在一定条件下，磁珠表面修饰的基团高效吸附目的DNA，而当条件改变时，磁珠释放吸附的DNA，达到快速分离纯化DNA的目的。整个过程安全、无毒、便利，提取的DNA质量稳定、纯度高。纯化后的DNA适用于多种后续实验。本试剂盒可以从少量动物组织中分离纯化出高质量、高浓度的DNA。 【产品特点】 1. 效率高：DNA提取得率高，操作简便。 2. 安全、无毒害：整个操作过程无需使用苯酚、氯仿等有毒物质，提取环境更加安全。 3. 高纯度：OD260/230在1.5左右，OD260/280在2.0左右。可直接用于各种分子生物学实验。 【试剂盒组成】 【规格】50T/盒 【自备试剂】无水乙醇，异丙醇 【贮藏与有效期】 裂解吸附液和Buffer AW1必须室温（15-25℃）避光保存；磁珠室温保存；其他所有试剂室温保存，有效期为1年。 【注意事项】

1、Buffer AW1使用前，加入18mL无水乙醇，混匀，使乙醇含量为60%。★ 2、Buffer AW2使用前，加入21mL无水乙醇，混匀，使乙醇含量为70%。★ 3、磁珠使用前必须充分混匀。★ 4、组织最好置于组织核酸（DNA/RNA）保存液（Cat#Yu-TP01）或液氮中保存。【操作步骤】 1、样本的处理 1.1、液氮中保存的组织将组织在液氮中磨成粉末后，使液氮充分挥发。再以50-100mg组织中加入1mL裂解吸附液，充分研磨。以下进入步骤2。 1.2、组织保存液中保存的样本取出在组织保存液中保存的组织，加入1mL无水乙醇洗涤组织两次。再以50-100mg组织中加入1mL裂解吸附液，充分研磨。以下进入步骤2。 2、吸取400μL研磨后的裂解吸附液转入1.5mL的EP管中，加入5μL蛋白酶K，60℃1500rpm10分钟。 3、取出EP管，加入250μL异丙醇和10μL混匀的磁珠，闭盖，充分混匀。室温1500rpm振荡10min。 4、取出EP管，瞬时离心，将EP管放于磁力架上，吸附磁珠4分钟。 5、在磁力架上，打开EP管盖，吸弃液体，保留磁珠。 6、加入600μL Buffer AW1，闭盖。从磁力架上取下EP管，充分混匀使磁珠完全分散至洗液中。 注：可以在漩涡振荡仪上3000rpm振荡20秒，使EP管壁上的磁珠完全分散至洗液中。 7、将EP管放回磁力架，吸附磁珠3分钟至液体清澈（吸附磁珠2分钟后，颠倒磁力架3次，使EP管盖上残留的磁珠被充分回收）。打开EP管盖子，吸弃液体，保留磁珠（需吸干EP管底和管盖中的残留液体）。 注：由于各个实验室磁力架磁力不尽相同，吸附时间可以延长，直至液体清澈。 8、加入600μL Buffer AW2，闭盖。从磁力架上取下EP管，充分混匀使磁珠完全分散至洗液中。 注：可以在漩涡振荡仪上3000rpm振荡20秒，使EP管壁上的磁珠完全分散至洗液中。

Takara说明书

Code No. RR047A 研究用 PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) 说明书

目录 内容页码 ●制品说明1 ●制品内容 1 ●试剂盒外必备材料 1 ●保存 1 ●特长 2 ●使用注意 2 ●操作方法 2 ●Real Time PCR 4 ●实验例 6 ●附录7 ●关联产品8

●制品说明 为了准确地进行基因表达量分析，必须满足只有cDNA作为模板检出的先决条件，但Total RNA中常常混有基因组DNA，并可以直接作为PCR反应的模板进行扩增，因此会造成解析结果不准确。为了避免这种情况发生，通常将检测用引物设计在内含子前后的外显子上，使基因组DNA得不到扩增。但是，此方法不适合具有单个外显子的基因或两个外显子之间所跨的内含子过小的基因，同时当基因组上有伪基因存在时、或设计引物对基因组有非特异性扩增时、以及基因信息没被完全解析的生物种等也同样不适合于本方法。在这种情况下，我们常常需要对Total RNA样品进行DNase I处理，以除去残存的基因组DNA。而DNase I处理通常要进行复杂的纯化操作，同时会造成RNA的降解和损失。 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser是可以除去基因组DNA进行Real Time RT-PCR反应的专用反转录试剂。Kit中使用了具有较强DNA分解活性的gDNA Eraser，通过42℃，2 min即可除去基因组DNA。同时由于反转录试剂中含有抑制DNA分解酶活性的组分，经过gDNA Eraser处理后的样品可以直接进行15 min的反转录反应合成cDNA，因此，20 min内即可迅速完成从基因组DNA去除到cDNA 合成的全过程。 使用本制品合成的cDNA适用于SYBR? Green分析法和TaqMan?探针分析法，可以根据实验目的，选择与SYBR?Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）、Premix Ex Taq（Probe qPCR）等定量试剂组合使用。注意：Takara Bio使用SYBR? Green I作为研究试剂已得到Molecular Probes Inc.的许可。SYBR?为Molecular Probes Inc.的注册商标。 ●制品内容（20 μl反应×100次） 1. gDNA Eraser 100 μl 2. 5×gDNA Eraser Buffer*1200 μl 3. PrimeScript RT Enzyme Mix I*2100 μl 4. 5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）*3400 μl 5. RT Primer Mix*4 400 μl 6. RNase Free dH2O 1 ml×2 7. EASY Dilution（for Real Time PCR）*5 1 ml *1：5×gDNA Eraser Buffer在反转录反应前使用，请务必进行基因组DNA的除去反应。 *2：含有RNase Inhibitor。 *3：含有dNTP Mixture。 *4：含有Oligo dT Primer和Random 6 mers。 *5：制作标准曲线时梯度稀释DNA或RNA标准品的稀释液。模板DNA或RNA如果用水或TE Buffer稀释时，由于受Microtube吸附作用等的影响，往往不能准确地进行稀释，导致实验结果精 度降低。使用本制品时，即使稀释至低浓度也能够进行准确地稀释，容易在宽广范围内获得准确定 量的标准曲线。本制品不影响反转录和PCR反应，用其稀释后的样品可直接使用。EASY Dilution 也可以单独购买（Code No.9160）。 注意：EASY Dilution请与本公司Real Time PCR试剂组合使用，对于其他公司的同类制品的适用性本公司尚未进行确认。 ●试剂盒外必备材料 热循环仪（或37℃水浴，42℃水浴和85℃加热块） 反转录反应所用0.2 ml和1.5 ml的微量反应管 微量移液器和枪头（高压灭菌） ●保存：-20℃。

CK-MB试剂盒说明书(罗氏)

the MB isoenzyme of creatine kinase，CK-MB 11821598 322 100测试 主要用途 用免疫学方法定量测定人血清或血浆中肌酸 激酶同工酶MB含量。 电化学发光免疫测定试剂，适用于罗氏 Elecsys和cobas e免疫测定分析仪。 临床应用1、2、3 肌酸激酶（CK）是一种二聚体酶，它有四种不 同的形式：线粒体同工酶和胞浆同工酶CK-MM （肌型）、CK-BB（脑型）和CK-MB。 血清中CK-MB的测定值是诊断心肌缺血（例如 急性心肌梗塞、心肌炎等）的重要指标。CK-MB 在心脏症状出现3－8小时后即可检出并且可 持续较长时间，这取决于病情经过。 CK-MB还可出现在其它临床条件下，例如横纹 肌溶解症和中风。实验室诊断方面，测定总体 CK、肌钙蛋白T和/或肌红蛋百有助于鉴别这些 临床疾病。 CK-MB测定的灵敏度与取样时间有关。因此跟 踪测定非常有意义。 Elecsys Ck-MB测定法采用了两种不同的直接 对抗人CK-MB的单克隆抗体。 检测原理 双抗体夹心法，总检测时间：18分钟 ●第一次孵育：15μl标本、生物素化的抗 CK-MB单克隆抗体和钌（Ru）a标记的CK-MB 特异性单克隆抗体一起反应生成抗原抗 体夹心复合物。 ●第二次孵育：添加包被链霉亲和素的磁珠 微粒后，该复合物通过生物素和链霉素之 间的反应结合到微粒上。 ●将反应液吸入测量池中，通过电磁作用将 磁珠吸附在电极表面。未与磁珠结合的物 质通过ProCell被去除。给电极加以一定 的电压，使复合体化学发光，并通过光电 倍增器测量发光强度。 ●仪器自动通过2点校正的定标曲线计算得 到检测结果。 a)Tris(2,2’-bipyridyl) ruthenium(II)- complex (Ru(bpy){ 2 3 }三联吡啶钌 试剂－工作溶液 M 包被链霉亲和素的磁珠微粒（透明瓶 盖），1瓶，6.5ml；包被链霉亲和素的 磁珠微粒，0.72mg/ml；防腐剂。 R1 生物素化的抗CK-MB抗体（灰盖），1瓶， 10mL：生物素化抗CK-MB单克隆抗体（小 鼠）1.2mg/L；磷酸盐缓冲液100mmol/L， pH值7.0；防腐剂。 R2 Ru(bpy)32+标记的抗CK-MB抗体（黑盖）， 1瓶，10mL；钌标记的抗CK-MB单抗 1.2mg/L；磷酸盐缓冲液100mmol/L，pH 值 7.0；防腐剂。 警告和注意事项 仅用于体外诊断。 在使用本试剂盒时必需遵循所有试验室试剂 操作的注意事项。 所有废弃物必需按照当地法规进行处置。 专业人员可要求获得安全数据报告。 避免试剂和样本（样本、定标液和质控品）产 生气泡。 试剂处理 试剂盒为即用型，不能分开使用。 试剂相关信息可以通过试剂条形码阅读获取。 储存及稳定性 存放于2－8℃。 请垂直摆放Elecsys CK-MB试剂盒，确保使用 前仪器通过自动搅拌能够完全混匀磁珠微粒。 样本的采集和准备 仅以下罗列的样本通过检测要求。 血清样本须用标准试管或有分离胶的真空管 收集。 肝素锂、肝素钠、K3-EDTA和枸橼酸钠抗凝的 血浆都适用。使用枸橼酸钠抗凝的血浆时，结 果必须按＋10％校正。 标准：回收率在血清值的90-110%以内或斜率 0.9-1.1＋截距<±2×分析灵敏度（LDL）＋相 关系数>0.95。 稳定性：18-23℃保存4小时，2-8℃保存8小时， -20℃保存3个月。 样本只能冰冻一次。

人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒说明书

人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒说明书 【产品名称】 通用名称：人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒 英文名称：Shuwen? Human EGFR Gene Mutation Detection Kit for Real-Time PCR 【包装规格】 7测试/盒 【预期用途】 EGFR是一种细胞膜表面的糖蛋白受体，具有酪氨酸激酶（Tyrosine Kinase，TK）活性，是原癌基因c-erbB-1（HER-1）的表达产物。EGFR 的主要信号转导途径有：PI3K-PDK 通路，RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK 通路，PLC-γ 通路，JAK-STAT 通路。通过这些途径，将胞外信号转化为胞内信号，从而有效应对外界的信号刺激，调节细胞的生长、增殖、分化，抑制细胞的凋亡。EGFR异常调节通过多种机制促进细胞恶性转化，包括受体的过度表达、突变、生长因子-受体自分泌环的活化以及特定的磷酸酶失活，其中涉及肿瘤发生和进展的机制中最常见的是EGFR的基因突变和过度表达。 EGFR基因位于7号染色体短臂7pl2-14区，由28个外显子组成。其突变主要发生在EGFR酪氨酸激酶的ATP结合位点的编码区（第18-20外显子），研究表明，EGFR酪氨酸激酶抑制剂（例如吉非替尼、厄洛替尼和埃可替尼等）疗效与EGFR基因的突变有密切的相关性。目前已经报道大约有30种突变与吉非替尼的药物反应相关，主要是19外显子上的缺失突变和21外显子上的L858R的点突变。外显子19上747-750位氨基酸的大约20种缺失约占所有突变的45%，其中以两种delE746-A750(2235_2249del15和 2236_2250del15)最为常见，占到外显子19缺失总数的75%；外显子21上L858R的点突变占所有突变的45%左右；外显子18的3种点突变（G719X）约占5%；外显子20的突变占1%左右。另外研究发现外显子20上的T790M突变与酪氨酸激酶抑制剂药物的耐药性相关。 本试剂盒以肿瘤DNA为检测样本，提供EGFR基因突变的定性检测。本试剂盒仅为临床医生肿瘤靶向治疗药物的选择提供参考，具体临床应用时须结合实际情况进行判断，不能以本试剂盒检测结果作为临床诊断的唯一依据。 【检测原理】 本试剂盒结合特异性引物和TaqMan探针技术，用实时荧光PCR方法检测DNA样品中的EGFR突变基因。利用特异性引物对突变靶序列进行扩增，同时阻滞野生型的扩增，通过TaqMan探针对扩增产物进行检测，使得突变基因得到扩增而野生型基本不扩增，从而达到高检测特异性和高灵敏度。 【主要组成成分】 本试剂盒具体包含组分如表1 表1

DNAzol基因组DNA快速提取试剂盒操作方法及步骤说明书

DNAzol 基因组DNA快速提取试剂 目录号：DN26 DN2601 50ml DN2602 100ml 产品介绍： DNAzol 是一种完全的、可直接使用的基因组DNA提取试剂，简单高效，结果可靠，可快速提取基因组DNA，适用于多种大量或少量样品。DNAzol 可在一个步骤中裂解细胞并水解RNA，经过乙醇沉淀后即可快速得到基因组DNA。整个过程只需10-30 分钟，DNA 回收率可达70-100％，得到的DNA 不需再纯化，可直接用于Southern 杂交、斑点杂交、分子克隆、PCR 反应和其他分子生物学应用。 产品储存： 室温保存至少一年。 注意事项： DNAzol 有毒害性，应避免直接接触皮肤和眼睛。 操作步骤：（实验前请先阅读注意事项） 1.裂解，匀浆 a.组织：25-50mg 组织加1ml DNAzol ，使用匀浆仪处理5-10 次。少量 （5-10mg）柔软组织，如脾或脑组织，可切成或者捣成小块使用微量取样器吹打

混匀，室温放置5-10 分钟。 b.细胞：单层培养的细胞应直接裂解，倒出培养基，加入DNAzol 用取样器吹 打几次混匀。每10cm2 细胞培养板加0.75-1.0ml DNAzol。 c.细胞沉淀或悬浮液：每1-3×107细胞（体积小于0.1ml）加1ml DNAzol，反复 吹打混匀。 以上均要使用大口径枪头吹打，以免过度剪切断基因组。 2.离心 4 -25℃，10000g 离心10 分钟。将得到的上清转入新管。 此步骤去除组织碎片、部分水解的RNA和多糖。如果所提样品为含较多细胞和细胞外物质的样品，如肝、肌肉和大部分植物组织等，或要提取不含RNA 的DNA 时，可加此步骤。其他样品可省略此步。 3.沉淀 每使用1ml DNAzol 加0.5ml 100%乙醇，颠倒离心管5-8 次，混匀样品至出现DNA 沉淀，室温放置1-3分钟。可以看见DNA 絮状沉淀，让沉淀自然沉降到管底，尽可能吸弃上清。用枪头搅绕DNA贴附在离心管上端壁上，仔细吸弃剩下的在管底和管壁的上清。如果因为剪切太厉害导致形成小片段或者量少的DNA(少于15ug)，无法缠绕到枪头上，可在4 -25℃，4000g 离心1-2分钟沉淀DNA，弃上清。 4.漂洗 用0.8-1ml 75％乙醇漂洗DNA 两次。漂洗时，将DNA 悬浮在乙醇中，颠倒离心管3-6 次，然后静置0.5-1 分钟使DNA 沉降到管底，尽可能吸弃上清。 如果需要，可在4 -25℃，1000g 离心1-2 分钟沉淀DNA。从组织中提取DNA 时，如需去除其他内含物，第一次漂洗可用70％DNAzol 和30％乙醇的溶液代替75％乙醇。

实验室常用生化试剂配方

实验室常用生化试剂配方 1.常用抗生素配制以及使用说明（参考链霉菌室操作手册2019版） 抗生素 英文名称及缩写 抗性基因 贮藏液浓度(mg/ml) 100 25(无水乙醇配) 50 25 50 50 25(DMSO配) 100 50 35 25(0.15M NaOH配) 50(DMSO配) 50 50 MM 使用终浓度（μg/ml）链霉菌 2CM YEME 大肠杆菌 LA或LB 氨苄青霉素氯霉素潮霉素卡那霉素壮观霉素链霉素硫链丝菌素红霉素阿泊拉霉素紫霉素萘锭酮酸 TMP Ampicillin, Amp bla Chloramphenicol, Cml Hygromycin, Hyg Kanamycin, Km Spectinomycin, Spc Streptomycin, Str Thiostrepton, Thio Erythomycin, Ery Apramycin, Am Viomycin,Vio Nalidixic acid Trimethoprim cat hyg aac/aph aadA str tsr ermE aac(3)IV vph －* 10 10 2 5 10 5 100 10 －－ 25 25 20 25 10 － 50 －－－－－－ 2.5 － 5 50-100 25 － 25 50 25 25 20 10-30

注意事项： (1) –表示无记录或不能使用，贮存液除特别说明外均用无菌水配制，配制过程请 确保抗生素粉末充分溶解混匀后再分装； （2）Km 和Am有交叉抗性，同时具有这两种抗性基因时应适当提高抗生素的量，并 设置阴性对照； （3）Hyg、Vio易见光分解，配制好后应用锡箔纸包好,使用过程中建议避光操作。有些抗生素需要在低盐的环境（如DNA培养基）下筛选效率较高，如Hyg, Km, Vio （4）用无菌水配制的抗生素需在超净工作台内用0.22 μm一次性过滤器过滤除菌并 分装；氯霉素、TMP、硫链丝菌素可以在超净工作台外配制分装，无需过滤除菌，但需确 保配制贮存液所用溶剂（无水乙醇、DMSO）未遭受污染，建议配制氯霉素时使用新的无水 乙醇，不要使用抽提质粒或总DNA时用的无水乙醇，以防止污染；DMSO，即二甲亚砜，易 挥发，有剧毒； （5）长期不用的抗生素请置于-20℃保存，抗生素粉末按照使用说明一般置于4℃保存，经常使用时可以暂置于4℃保存； （6）抗生素的实际使用浓度请结合实验经验进行适当调整； (7)配制抗生素时应尽量一次性称取抗生素粉末，配制过程中建议穿工作服，戴一次 性橡胶手套及口罩，及时清理称量配制抗生素时使用的台面及器具，以避免抗生素及溶剂 对自身的损伤及对工作环境的污染。 注意事项： (1)表中所列酶均可以用无菌水配制，也可以用相应的缓冲液配制，缓冲液配制方法 参考《分子克隆实验指南（第3版）》： 蛋白酶 K缓冲液：50 mM Tris（pH 8.0），1.5 mM 乙酸钙； RNase A缓冲液：TE （pH 7.6）：10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA；溶菌酶缓冲液：10 mM Tris-HCl（pH 8.0）； (2) RNase A配制好后沸水浴处理5 min，取出贮存RNase A后首次使用时也需沸水 浴处理5 min后再使用； （3）制备原生质体时使用的溶菌酶配制时需过滤除菌，其他情况一般无需过滤除菌； （4）所有酶均应在-20℃保存，使用过程中避免反复冻融，配制过程中尽量避免外界 污染。 （1）IPTG用无菌水配制，0.22μm一次性滤膜过滤除菌，分装保存于-20℃；

通用基因组DNA提取试剂盒使用说明

通用基因组DNA提取试剂盒使用说明 货号：D2100 规格：50T/100T 保存：室温(15℃-25℃)干燥保存，复检期12个月，2℃-8℃保存时间更长。开封后请将RNase A，蛋白酶K于-20℃保存。 试剂盒内容：D2100-50T D2100-100T RNase A1ml1ml×2 蛋白酶K1ml1ml×2 溶液A25ml50ml 溶液B25ml50ml 漂洗液15ml15ml×2 洗脱液15ml30ml 吸附柱50个100个 收集管50个100个 说明书1份1份 产品简介: 本试剂盒为通用型，适合于从土壤，粪便，昆虫，以及其他样本中提取基因组DNA。对细菌，真菌，昆虫等样本都具有很好的裂解效果，最大限度的保留了生物DNA的多态性。 使用本试剂盒提取的DNA产量大、完整性好，可直接用于各种常规操作，包括酶切、PCR、文库构建、Southern杂交等实验。

操作步骤： 使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。 1、样品的处理： 1）土壤：称取0.1-0.3g(根据干湿)土壤，放入研钵中，倒入适量的液氮，立即研磨，重复3次，使土壤颗粒研成粉末，加500ul溶液A，振荡至彻底悬浮。 2）粪便：称取0.1-0.3g(根据干湿)粪便，加500ul溶液A，振荡至彻底悬浮。 3）昆虫：称取0.1-0.3g昆虫，倒入适量的液氮，立即研磨，重复3次，使昆虫研成粉末，加500ul溶液A，振荡至彻底悬浮。 4）未知样品，如为细未状，可直接称取0.1-0.3g(根据干湿)加500ul 溶液A，如为块状，可0.1-0.3g用液氮研磨成粉未，再加500ul溶液A，振荡至彻底悬浮。 2、向悬浮液中加入20ul10mg/ml的RNase A，55℃放置10min。 3、加入20ul10mg/ml的蛋白酶K，充分混匀，55℃水浴消化，30min。消化期间可颠倒离心管混匀数次，12000转离心10min。将上清转移到一个新的离心管中。如有沉淀，可再次离心。 4、加入500ul溶液B，充分混匀。如出现白色沉淀，于55℃放置5min，沉淀即会消失，不影响后续实验。如溶液未变清亮，说明样品消化不彻底，可能导致提取的DNA量少及不纯，还有可能导致上柱后堵柱子，请增加消化时间。