真核生物基因组DNA的提取和含量测定

实验报告

课程名称： 生物化学实验 实验名称： 真核生物基因组DNA 的提取和含量测定 指导老师： 同组学生： 廖杰 成绩：__________________

真核生物基因组DNA 的提取和含量测定

【实验原理】 制备具有生物活性的大分子核酸，必需采取温和的制备条件，避免过酸、过碱

的反应环境和剧烈的搅拌，防止核酸酶的作用，并要求在低温下进行操作 。

一、 真核生物基因组DNA 的提取

本实验选用小鼠肝脏细胞作为实验材料，采用匀浆法破碎组织细胞。

DNP 在0.14mol/L NaCl 中不溶解,而RNP 可溶解。

用无菌水溶解沉淀，加入蛋白酶消化液（含有蛋白酶K 和SDS ）。

１温和方法的破碎细胞而不产生机械剪切以致破坏DNA 的完整性，

２可以变性Dnase ，

３还可以去除部分的蛋白。

４使核蛋白体从DNA 上解离。

然后加RNase 以去除RNA ，再用苯酚:氯仿抽提法反复抽提提取DNA

苯酚:氯仿抽提法：

酚、氯仿是有机溶剂，能有效地使蛋白质变性。纯酚在与水混合时处于下层。然而有机相和水相会难于分开。 专业： 药学 姓名： 阿卜杜合力力 学号： 3100105256 日期： 2012.5.10 地点： 生化实验室 装

订 线

若使用酚：氯仿混合物抽提，由于氯仿的比重较大(1.47)，可在很大程度上解决这个问题，促进两相的分离。

异戊醇则可减少操作过程中产生的气泡。

变性蛋白一般集中在两相之间的界面层，而脂类则有效地分配在有机相中，核酸则被留于上层水相。

该法其具有操作条件比较温和，能迅速使蛋白质变性并同时抑制核酸酶的活性，可得到具有生物活性的高聚合度的核酸等优点。

但其操作步骤较为繁琐，去除蛋白质需要反复进行多次。

砷盐、氟化物、柠檬酸、EDTA等可抑制DNase的活性；皂土等可抑制RNase 的活性。

收集上清液后用乙醇沉淀DNA，最后用TE缓冲液溶解DNA，并用紫外吸收法测定DNA的含量及纯度。

二、紫外吸收法测定基因组DNA的含量及纯度

1．紫外分光光度法测定核酸含量：

由于DNA在260nm处有最大的吸收峰，因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，吸光度A值为1相当于大约50μg /ml双链DNA。

2．紫外分光光度法测定DNA纯度：

由于DNA在260nm处有最大的吸收峰，而蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，DNA纯品的算A260/ A280为1.8（1.7~1.9），故根据算A260/ A280的值可以估计DNA的纯度。

若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。

三，二苯胺显色法测定DNA含量

DNA在酸性条件下加热，酸解释出脱氧核糖。脱氧核糖在酸性环境中脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，后者与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应，在595 nm 处有最大吸收。

在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。除脱氧核糖外，脱氧木糖、阿拉伯糖也有同样反应。其他多数糖类，包括核糖在，一般无此反应。

【操作与步骤】

一、基因组DNA的提取

1．组织细胞的裂解

（1）切取0.2g鼠肝，冰冷生理盐水洗3次。当组织离开机体，DNA酶就会表现出活性。在冰冷的生理盐水中，可以降低DNA酶的活性，防止基因组DNA被降解。

（2）碎鼠肝转入玻璃匀浆器中，加入2mL分离缓冲液，匀浆（冰上操作）。（3）匀浆液转入2mL离心管，4℃ , 5000rpm离心5min；沉淀加0.4mL无菌水，吹散后再加0.4mL的蛋白酶消化液（含100μg/ml的蛋白酶K），慢慢颠倒混匀，50℃保温90分钟, 直到组织完全解体。

（4）加10mg/ml的RNase 16μl (终浓度200μg/ml)，37℃保温40min。

2．裂解物中蛋白质的去除

（1）加等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，慢慢颠倒混匀，冰上静置5min。待分层后, 于4℃，12000rpm离心15min。离心后可见分层，上层为水相含DNA，下层为有机溶剂层，变性蛋白质介于两层之间。