乙型肝炎DNA测序指导原则

指导原则编号

乙型肝炎病毒DNA定量检测试剂注册申报资料技术指导原则

（征求意见稿）

二〇一二年四月

目录

一、前言 (1)

二、范围 (2)

三、注册申报要求 (4)

（一）综述资料 (4)

（二）产品说明书 (4)

（三）拟定产品标准及编制说明 (10)

（四）注册检测 (10)

（五）主要原材料研究资料 (10)

（六）主要生产工艺及反应体系的研究资料 (13)

（七）分析性能评估资料 (14)

（八）参考值（范围）确定资料 (22)

（九）稳定性研究资料 (22)

（十）临床试验研究 (23)

四、名词解释 (28)

五、参考文献： (29)

乙型肝炎病毒DNA定量检测试剂注册申报资料技术指

导原则

（征求意见稿）

一、前言

本指导原则旨在指导注册申请人对乙型肝炎病毒（以下简称乙肝病毒）DNA定量检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。

本指导原则是对乙肝病毒DNA定量检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。如申请人认为有必要增加本指导原则不包含的研究内容，可自行补充。

本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其它方法，也可以采用，但需要提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。

本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的

不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。

二、范围

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是一个严重的公共卫生问题。全球每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌（肝癌），肝癌患者中，75%以上由HBV所致。

我国属HBV感染地方性流行区。根据2006年全国乙型肝炎流行病学调查，我国现有的慢性HBV感染者约9300万人，其中慢性乙型肝炎患者约2000万例，每年因HBV导致的肝硬化和肝癌死亡约30余万例，新发乙型肝炎病例约50～100万例。乙肝防治是当前及今后相当长时间内要面临的重要任务。

HBV是血源传播性疾病，主要经血（如不安全注射等）、母婴及性接触传播。乙型肝炎病毒属嗜肝DNA病毒科（hepadnaviridae），基因组长约3.2 kb，为部分双链环状DNA。急性乙型肝炎病毒感染HBV DNA存在先阳性后消失的发展过程，慢性乙型肝炎病毒感染的自然史一般可分为4个期，即免疫耐受期、免疫清除期、非活动或低（非）复制期和再活动期，其中免疫耐受期HBV DNA滴度较高（大于20 000 IU/ml），免疫清除期表现为血清HBV DNA滴度大于2000 IU/ml，但一般低于免疫耐受期。非活动或低（非）复制期和再活动期可表现为HBV DNA检测不到（PCR法）或低于检

测下限。但并不是所有HBV感染者都经历以上四期。

HBV已发现有9个基因型（A～I），每个基因型又可分为不同亚型，且存在基因型之间的重组现象。我国已发现A、B、C、D基因型，中东部地区以B、C基因型占优势，其中北方地区（长江以北）主要为C2亚型；南方大部分地区流行株为B2、C2、C1亚型，并有少部分D基因型；西部地区尤其是新疆地区以D基因型为主，西部藏族居民中以C/D重组基因型为主；A型和B1亚型罕见。

乙肝病毒DNA定量检测试剂是指利用包括实时荧光PCR 或其他的分子生物学方法在内的核酸检测技术，以乙肝病毒基因序列为检测目的，对人血清、血浆及其他人体样本中的乙肝病毒DNA进行体外定量检测的试剂。结合临床表现和其他实验室指标，可作为乙肝辅助诊断的指标之一，还可通过对血中HBV DNA水平的监测，用于HBV感染的诊断、治疗适应证的选择及抗病毒疗效的判断。本试剂不用作HBV的血源筛查。

本指导原则主要针对实时荧光PCR方法的乙肝病毒DNA 定量检测试剂，其它核酸定量检测方法可参照本指导原则，但应根据产品的具体特性确定其中内容是否适用，如不适用，应另行选择适用自身方法学特性的研究步骤及方法。本指导原则适用于进行首次注册申报和相关许可事项变更的产品。

三、注册申报要求

（一）综述资料

综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、研究结果的总结评价以及同类产品上市情况介绍等内容，其中同类产品上市情况介绍部分应着重从方法学及检出限等方面写明拟申报产品与目前市场上已获批准的同类产品之间的主要区别。应符合《体外诊断试剂注册管理办法（试行）》（以下简称《办法》）和《体外诊断试剂注册申报资料基本要求》（国食药监械[2007]609号）的相关要求。

（二）产品说明书

说明书承载了产品预期用途、试验原理、试验方法、检测结果解释以及注意事项等重要信息，是指导实验室工作人员正确操作、临床医生针对检验结果给出合理医学解释的重要依据，因此，产品说明书是体外诊断试剂注册申报最重要的文件之一。产品说明书的格式应符合《体外诊断试剂说明书编写指导原则》的要求，境外试剂的中文说明书除格式要求外，其内容应尽量保持与原文说明书的一致性，翻译力求准确且符合中文表达习惯。产品说明书的所有内容均应与申请人提交的注册申报资料中的相关研究结果保持一致，如某些内容引用自参考文献，则应以规范格式对此内容进行标注，并单独列明文献的相关信息。

结合《体外诊断试剂说明书编写指导原则》的要求，下面对乙肝病毒核酸检测试剂说明书的重点内容进行详细说明，以指导注册申报人员更合理地完成说明书编制。

1.【预期用途】应至少包括以下几部分内容：

（1）试剂盒用于定量检测人血清和/或血浆等样本中的乙肝病毒DNA，适用样本类型的确定应结合实际的临床研究完成情况进行确认。

（2）待测人群特征介绍：主要为接受抗病毒治疗的乙肝患者。

（3）临床用途：主要通过对乙肝患者血中HBV DNA基线水平和变化情况的监测，用于评估抗病毒治疗的应答和治疗效果监测。（如有其它用途应作特别说明。）

（4）强调：该检测不得作为患者病情单独的评价指标，必须结合临床表现和其他实验室检测指标对患者病情进行评价。

（5）明确说明该检测不得作为血液筛查HBV病毒的筛查试剂使用。

2.【主要组成成份】

（1）说明试剂盒包含组分的名称、数量、比例或浓度等信息，定量标准品、阴/阳性对照品（或质控品）可能含有人源组分，应提供其生物学来源、活性及其他特性；说明不同批号试剂盒中各组份是否可以互换。

（2）试剂盒中不包含但该项检测必需的组份，说明书中应列出相关试剂/耗材的名称、货号及其它相关信息。

（3）如果试剂盒中不包含用于核酸分离/纯化的试剂组分，则应在此注明经验证后推荐配合使用的商品化核酸分离/纯化试剂盒的生产企业、产品名称以及产品货号等详细信息。

3.【储存条件及有效期】

试剂盒的效期稳定性、开封稳定性、复溶稳定性、运输稳定性、冻融次数要求等。应标明具体的储存条件及效期。

4.【样本要求】

（1）样本采集时间点的选择：按照慢性乙型肝炎防治指南（2010年版或新版）采样要求。

（2）对血液样本应当说明对采血管及抗凝剂的要求：明确样本类型、采血管和抗凝剂。其他样本应说明样本采集、处理及保存方式。

（3）样本运送、处理及保存：对血样离心条件的要求，核酸提取前的预处理、保存条件及期限（短期、长期）、运送条件等。冷藏/冷冻样本检测前是否须恢复至室温，冻融次数的要求。如有需要应对高于检测范围的样本稀释方法进行规定。

5.【适用机型】注明所有适用的仪器型号，并提供与仪器有关的重要信息以指导用户操作。

6.【检验方法】详细说明试验操作的各个步骤，包括：

（1）试验条件：实验室分区、实验环境的温度、湿度、空调气流方向控制等注意事项。

（2）试剂准备及配制方法、注意事项。

（3）详述待测样本及相关标准品、对照品（质控品）核酸提取的条件、步骤及注意事项。

（4）核酸提取/纯化方法的详细介绍。

（5）扩增反应前准备：加样体积、顺序等。

（6）PCR各阶段的温度、时间设臵、循环设臵及相关注意事项。

（7）仪器设臵：特殊参数、结合探针的荧光素标记情况对待测基因及内标的荧光通道选择。

（8）基线、循环阈值（Ct值）的选择方法。

（9）定标方法的描述。

（10）实验的有效性判断：试剂盒内阴/阳性对照品（质控品）的Ct值要求（包括内标）。

7.【检验结果的解释】

检验结果应用IU/mL表示，结合阴阳性质控结果，对低于检出限未检出、低于定量限、检测范围内及高于检测范围的检测结果分别进行界定。

8．【检验方法局限性】

（1）本试剂盒的检测结果仅供临床参考，对患者的临

床诊治应结合其症状/体征、病史、其它实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。

（2）不合理的样本采集、转运、储存及处理过程均有可能导致错误的检测结果。

（3）临床实验室应严格按照《临床基因扩增实验室工作规范》配备设备及操作人员，应严格按照说明书要求进行操作。

（4）明确该检测仅限于规定的样本类型及适用机型。

9.【产品性能指标】详述以下性能指标：

（1）对相应国家参考品检测的符合情况。

（2）最低检出限及定量限：说明试剂不同样本类型的最低检出浓度和最低定量浓度，简单介绍最低检出限/定量限的确定方法以及对最低检出限/定量限验证所采用的基因型。

（3）精密度：精密度参考品的组分、浓度及评价标准。

（4）线性范围：确定线性范围的方法、浓度范围、相关系数等信息。

（5）对不同基因型的覆盖：验证该试剂对不同基因型的检测效果。

（6）分析特异性：

①临床特异性：应采用一定数量的临床HBV DNA阴性样本进行验证。

②交叉反应：易产生交叉反应的其它病原体核酸的验证情况，建议以列表的方式表示经过交叉反应验证的病原体名称、型别、浓度等信息；

③干扰物质：样本中常见干扰物质对检测结果的影响，如血红蛋白、甘油三酯、胆红素等，应注明可接受的最高限值；

④药物影响：常用抗病毒药物、干扰素对检测结果的影响，如未进行相关研究也应提供相关警示说明。

（7）对比试验研究（如有）：简要介绍参比试剂（方法）的信息、所采用的统计学方法及统计分析结果。

10.【注意事项】应至少包括以下内容：

（1）有关人源组份（如有）的警告，如：试剂盒内对照品（质控品）或其它可能含有人源物质的组分，虽已经通过了HBs-Ag、HIV1/2-Ab、HCV-Ab等项目的检测，但截至目前，没有任何一项检测可以确保绝对安全，故仍应将这些组份作为潜在传染源对待。

（2）实验室管理应严格按照国家有关分子生物学实验室、临床基因扩增实验室的管理规范执行。实验人员必须进行专业培训；实验过程应分区进行（试剂准备区、样本制备区、扩增和产物分析区），实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区各阶段用品不得交叉使用；各区间人员流动及空气流向应有严格要求，最大限度避免交叉污染；实验

用消耗品（如离心管、吸头等）应有合理的清洁和质检程序，避免污染或扩增反应抑制物造成假阴性结果。

（三）拟定产品标准及编制说明

拟定产品标准应符合《办法》和《体外诊断试剂注册申报资料基本要求》的相关规定。另外，对于首次申报注册的国产试剂，应参考《中国生物制品规程》（2000年版），将拟申报产品的主要原材料、生产工艺及半成品检定等内容作为附录附于标准正文后，并在正文的“产品分类”项中引出该附录内容。附录中应将待测靶基因的基因位点、全序列，引物/探针序列、来源及验证情况，各种酶的来源、特性以验证情况等信息的重点内容予以明确。

乙肝病毒核酸定量检测试剂的注册检测应符合国家参考品检测要求。产品的性能指标应与说明书内容相符。

如果拟申报试剂已有相应的国家/行业标准发布，则企业标准的要求不得低于上述标准要求。

（四）注册检测

根据《办法》要求，首次申请注册的第三类产品应该在国家食品药品监督管理局认可的、具有相应承检范围的医疗器械检测机构进行连续三个生产批次样品的注册检测。对于已经有国家标准品的乙肝病毒项目，在注册检测时应采用相应的国家标准品进行。

（五）主要原材料研究资料

应提供主要原材料如引物、探针、企业参考品或标准品等的选择与来源、制备过程、质量分析和质控标准等的相关研究资料。若主要原材料为企业自己生产，其生产工艺必须相对稳定；如主要原材料来自市场（从其他单位购买），应提供的资料包括：对物料供应商审核的相关资料、购买合同、供货方提供的质量标准、出厂检定报告，以及该原材料到货后的质量检验资料。

1.企业内部参考品的制备、定值过程。建议采用灭活病毒建立参考品，不宜使用质粒。

2．核酸分离/纯化组分（如有）的主要组成、原理介绍及相关的验证资料。

3．PCR组分的主要材料（包括引物、探针、内标、各种酶及其它主要原料）的选择、制备、质量标准及实验研究资料，主要包括以下内容：

（1）脱氧三磷酸核苷（dNTP）

核酸的组成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP，对纯度、浓度、保存稳定性等的详细验证资料。

（2）引物

由一定数量的dNTP构成的特定序列，通常采用DNA合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化。对序列准确性、纯度、稳定性、功能性实验等的验证。如为外购，应提供合成机构出具的合成产物的质检证明，

如PAGE电泳结果或HPLC分析图谱。

（3）探针

特定的带有示踪物（标记物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能与互补核酸序列退火杂交，用于特定核酸序列的探测。合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化，在5'-端(和/或3'-端)进行标记，如荧光素报告基团或其他发光标记物，在3'-端标记荧光素淬灭基团，并经HPLC 或其他适宜方法纯化。纯度应达到HPLC纯，应提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如HPLC分析图谱；应对探针的核酸序列及标记的荧光素或化学发光物进行核实，并作HPLC分析。

（4） PCR反应所需酶

DNA聚合酶，应具有DNA聚合酶活性，无核酸内切酶活性，具热稳定性，如：94℃保温1小时后仍保持50%活性；尿嘧啶糖基化酶（UNG），具有尿嘧啶糖基化活性，无核酸外切酶及核酸内切酶活性，应对酶活性有合理验证；应提供有关保存稳定性、活性及功能实验等的验证资料。

4．内对照（内标）、定标品、对照品（质控品）的原料选择、制备、定值过程及试验资料。内标可采用灭活的病毒或缺陷病毒（假病毒）、质粒。定标品及外部阳性对照宜采用灭活病毒或假病毒。

5．核酸类检测试剂的包装材料和耗材应无DNase和

RNase污染。

（六）主要生产工艺及反应体系的研究资料

基本生产工艺主要包括：配制工作液、半成品检定、分装和包装。配制工作液的各种原材料及其配比应符合要求，原材料应混合均匀，配制过程应对pH、电导率等关键参数进行有效控制。

生产工艺研究的资料应能对反应体系涉及到的基本内容，如样本类型、样本用量、试剂用量、反应条件、校准方法、质控方法、稳定性和有效期，提供确切的依据，主要包括以下内容：

1.主要生产工艺介绍，可以图表方式表示。

2.反应原理介绍。

3.基因位点选择、PCR方法学特性介绍。

4.DNA提取纯化方法优化，建议包含纯化步骤，内标、标准品、质控品均应全程参与提取纯化。不建议采用煮沸法进行DNA提取。

5.确定最佳PCR反应体系的研究资料，包括酶浓度、引物/探针浓度、dNTP浓度、阳离子浓度、样本量、加样量及反应体积等。样本量应不少于200微升、加样量应不少于20微升、反应体积应不少于40微升。

6.确定最适PCR反应各阶段温度、时间及循环数的研究资料。

7．对于基线阈值（threshold）和阈值循环数（Ct）确定的研究资料。

8.不同适用机型的反应条件如果有差异应分别详述。

另外，对于试剂盒的内标、定标品、对照（质控）品设臵，建议企业参考以下要求执行：

（1）乙肝病毒核酸定量检测试剂盒的外部对照（质控）品应至少设臵三个量级水平的系列定标品:临界阳性对照（质控）品、强阳性对照（质控）品和阴性对照（质控）品，定标品和质控品均应参与样本核酸的平行提取，以对整个PCR反应过程、试剂/设备、交叉污染等环节进行合理质量控制。企业应对各种对照（质控）品的Ct值做出明确的范围要求。注意，建议采用与实际检测样本具有相同或相似性状的基质溶液作为阴性对照（质控）品，不推荐采用水作为阴性对照（质控）品。

（2）样本反应管应设臵合理的内对照（内标）以对管内抑制可能造成的假阴性结果进行质控。申请人应对内标的引物、探针和模板的浓度做精确验证，既要保证内标荧光通道呈明显的阳性曲线但又不能对目的基因的检测造成竞争性抑制而导致假阴性。对内标的Ct值也应有明确的范围要求。

（七）分析性能评估资料

企业应提交原厂在产品研制或成品验证阶段对试剂盒进行的所有性能验证的研究资料，对于每项分析性能的评价都

应包括具体研究目的、实验设计、研究方法、可接受标准、实验数据、统计方法等详细资料。有关分析性能验证的背景信息也应在申报资料中有所体现，包括实验地点（实验室）、适用仪器、临床样本来源等。分析性能评价的实验方法可以参考相关的CLSI-EP文件或国内有关体外诊断产品性能评估的文件进行。对于乙肝病毒核酸定量类检测试剂，建议着重对以下分析性能进行研究。

1、乙肝病毒核酸（DNA）提取

病毒DNA提取主要有以下目的：富集靶核酸浓度、保证靶核酸序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR 抑制物，是决定PCR成败的关键环节。因此，无论申报产品是否含有DNA分离/纯化的组分，企业都应对核酸提取的环节做详细的验证。临床标本中可能含有各式各样的PCR抑制物，因此，对于DNA提取试剂的选择，除最大量分离出目的DNA外，还应有纯化步骤，尽可能去除PCR抑制物。常见的DNA分离纯化方法（如酚抽提法、甲酰胺解聚法等）和改良方法各有优势和不足，申请人应结合申报产品的特性，合理选择DNA分离/纯化试剂，并提供详细的验证资料（提取效率、与后续试验的配合等）。

2、最低检测限（分析灵敏度）

（1）最低检测限与定量限的确定

建议使用国际标准品/国家标准品进行最低检测限确

定，使用多份标准品制备梯度病毒稀释液、每个梯度的病毒稀释液重复适当次数（4次），将具有95%以上阳性检出率的病毒水平作为最低检测限。建议最低检测限应≤30IU/mL。

定量限应高于或等于检测限，将多次（至少10次）测量的计算误差符合试剂准确度研究规定的误差要求的最低病毒水平作为最低定量限。

（2）最低检测限和定量限的验证

申报试剂应在最低检测限或接近最低检测限的病毒浓度对国内常见（至少包括B、C、D型）基因型进行验证，总测试数不少于60次。定量限的验证应对国内常见（至少包括B、C、D型）基因型进行验证，总测试数不少于40次。

对此，企业应能够提供用于最低检出限/定量限验证的各个病毒株的来源、型别确认及滴度确认试验等信息。

3.线性范围

线性范围确定的研究应使用高值临床样本（由可溯源至国家标准品/国际标准品的方法定量）进行梯度稀释，稀释剂应使用经确认为阴性的混合人血清或血浆，应包含9-13个浓度（应包含接近最低检测限的临界值浓度），使用至少3个批次的试剂进行试验。通过评价一定范围内的线性关系及各水平的准确度确定该方法的线性范围。

4. 准确度

对测量准确度的评价依次包括：与国家标准品（和/或国

际标准品）的偏差分析、回收实验、方法学比对等方法，企业可根据实际情况选择合理方法进行研究。

（1）与国家（国际）标准品的比对研究

该检测有相应国家（国际）标准品，使用国家（国际）标准品进行验证，重点观察对相应标准品检测结果的偏差情况。

（2）回收试验。用于评估定量检测方法准确测定加入纯分析物的能力，结果用回收率表示。通常对样本进行3-5次回收试验，取平均值即平均回收率。

回收试验注意事项：

①加入的标准液体积一般应小于样本体积的10%；

②尽量使加入标准液后样本中的被测物浓度接近医学决定水平；

③标准物的浓度应该足够高，以得到不同浓度的回收样本；

④注意基质效应，尽量采用与临床待测样本接近的基质。（3）方法学比对

采用参考方法或国内/国际普遍认为质量较好的同类试剂作为参比方法，与拟申报试剂同时检测一批病人样品，从测定结果间的相关性了解拟申报试剂与参比方法间的一致情况。如显著相关，说明两检测系统对病人标本测定结果基本相符，对同一份临床样本的医学解释，拟申报试剂与参比方法相比不会产生显著差异结果。

在实施方法学比对前，应分别对拟申报试剂和参比试剂进行初步评估，只有在确认两者都分别符合各自相关的质量标准后方可进行比对试验。方法学比对时应注意质量控制、样本类型、浓度分布范围并对结果进行合理的统计学分析。

5.精密度

测量精密度的评价方法并无统一的标准可依，可根据不同产品特征或企业的研究习惯进行，前提是必须保证研究的科学合理性。具体实验方法可以参考相关的CLSI-EP文件或国内有关体外诊断产品性能评估的文件进行。企业应对每项精密度指标的评价标准做出合理要求，如标准差或变异系数的范围等。针对本类产品的精密度评价主要包括以下要求。

（1）对可能影响检测精密度的主要变量进行验证，除申报试剂（包括提取组分和PCR组分）本身的影响外，还应对PCR分析仪、操作者、地点等要素进行相关的验证。

（2）合理的精密度评价周期，例如：为期至少20天的连续检测，每天至少由2人完成不少于2次的完整检测，从而对批内/批间、日内/日间以及不同操作者之间的精密度进行综合评价。如有条件，申请人应选择不同的实验室进行重复实验以对室间精密度进行评价。

（3）用于精密度评价的质控品应至少包括四个水平: ①阴性质控品：不含HBV DNA的质控品，阴性检出率应为100%（n≥20）。

DNA测序常见问题及分析

DNA测序过程可能遇到的问题及分析 对于一些生物测序公司（如Invitrogen等），我们的菌液或质粒经过PCR和酶切鉴定都没问题，但几天后的测序结果却无法另人满意。 为什么呢？ PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。这是由于Taq酶能够在PCR反应的末端非特异性地加上一个A碱基，我们所用的T载体克隆PCR产物就是应用该原理，通常PCR产物结束的位点，PCR产物测序一般末端的一个碱基为A（绿峰），也就是双脱氧核甘酸ddNTP终止反应的位置之前的A,A后的信号会迅速减弱。 N值情况一般是由于有未去除的染料单体造成的干扰峰。该干扰峰和正常序列峰重叠在一起，有时机器377以下的测序仪无法正确判断出为何碱基。有时，在序列的起始端的小片段容易丢失，导致起始区信号过低，机器有时也无法正确判读。在序列的3’端易产生N值。一个测序反应一般可以读出900bp以上的碱基（ABI3730可以达到1200bp），但是，只有一般600bp以前的碱基是可靠的，理想条件下，多至700bp的碱基都是可以用的。一般在650bp以后的序列，由于测序毛细管胶的分辩率问题，会有许多碱基分不开，就会产生N值。测序模板本身含杂合序列，该情况主要发生在PCR产物直接测序，由于PCR产物本身有突变或含等位基因，会造成在某些位置上有重叠峰，产生N值。这种情况很容易判断，那就是整个序列信号都非常好，只有在个别位置有明显的重叠峰，视杂合度不同N值也不同。 测序列是从引物3’末端后第一个碱基开始的，所以就看不到引物序列。有两种方法可以得到引物序列。1.对于较短的PCR产物 （<600bp），可以用另一端的引物进行测序，从另一端测序可以一直测通，可以在序列的末端得到该引物的反向互补序列。对于较长的序列，一个测序反应测不通，就只能将PCR产物片段克隆到载体中，用载体上的通用引物(T7/SP6)进行测序。载体上的通用引物与所插入序列间

乙型肝炎病毒耐药基因及分型检测

乙型肝炎现状如何？ 乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起的、以肝脏炎性病变为主，并可引起多器官损害的一种疾病，主要存在于肝细胞内，可引起肝细胞炎症、坏死和纤维化。 乙型肝炎病毒(HBV)感染呈世界性分布，全球约有3.6亿感染者，每年约有100万人死于与HBV相关的肝脏疾病。我国属于感染的高发区，现有的慢性HBV感染者约9300万例。 乙型肝炎病毒（HBV）基因分型的临床意义 HBV根据DNA差异可分为A、B、C、D、E、F、G、H八种类型，不同型别在流行特征，致病性，对药物治疗反应等方面存在差异，其中，我国以B型和C型为主，感染HBV基因型B的患者发生肝纤维化及肝细胞癌的平均年龄要比感染HBV基因型C的患者的年龄大。 通过分型检测，可判断病毒复制活跃程度及突变发生率情况。研究表明，与HBV-B型相比，C型复制较活跃，不易发生HBeAg血清转换；HBV-B型易产生前C区突变，C型核心启动子区变异发生率更高，与重型肝炎发病机制密切相关，可作为肝癌高危指标之一。同时，HBV-B、C型患者易产生拉米夫定耐药突变，通过分型检测，可指导临床治疗方案制定，有针对性进行临床治疗，更大程度上提高患者的生活质量。 乙肝的治疗方式有哪些？ HBV感染主要的治疗方法是抗病毒治疗，国内外普遍使用的药物有干扰素和核苷（酸）类。由于干扰素需要反复注射，且副作用较多，近年来，核苷(酸)类似物(NA)已成为抗HBV感染的主要方法之一，NA因其抑制病毒复制能力强、使用方便、耐受性好且疗效确切，适用于不同阶段的肝病患者，是长期治疗的合理选择。但随着治疗时间的延长，往往会出现病毒耐药株，从而需要监测乙型肝炎病毒耐药基因型，指导临床用药。 乙肝病毒产生耐药的机理是什么？ HBV对某种药物的耐药性一般是指由HBV基因组上某些位点的变异导致这种药物对HBV的抑制作用减弱或无作用。通常分为以下几种： （1）原发性耐药变异：指药物作用靶位的基因及其编码的氨基酸发生变异，导致变异病毒株对治疗药物的敏感度下降； （2）继发性耐药变异(又称补偿性耐药变异)：指由于原发性耐药变异病毒株复制能力下降，在原发性耐药变异的基础上，病毒株也可在其他位点发生变异，这些变异可部分恢复变异病毒的复制能力或可导致变异病毒对药物敏感度的进一步下降； （3）基因型耐药：指检测到已在体外的表型分析研究中被证实与抗病毒药物耐药相关的HBV变异；（4）表型耐药：通过体外复制系统证实检测到的HBV变异会降低其对抗病毒药物的敏感度。 HBV属于嗜肝DNA病毒科，基因组长约3.2kb，是部分双链环状DNA结构。HBV基因组含有4个部分重叠的开放读框(open reading frame，ORF)，分别为S基因区、C基因区、P基因区和x基因区。产物为含末端蛋白、间隔区、逆转录酶区和RNA酶H区4部分的HBV聚合酶。 HBV虽然属于DNA病毒，但其复制过程并非DNA—DNA的直接复制过程，而是经过前基因组RNA的中间过程，即DNA—RNA—DNA的复制过程。在前基因组RNA逆转录为负链DNA的过程中，HBV逆转录酶由于缺乏严格的校正机制，导致HBV复制过程中核苷酸错配率较高，发生变异的频率为每年(1.4～3.2)X105核苷酸替换／位点。HBV复制的这种过程和特点，决定了同一患者体内不同的HBV株基因序列之间也存在差别。 核苷（酸）类药物主要通过抑制HBV聚合酶的逆转录酶区活性，阻止HBV复制过程中以HBV的前基因组RNA为模板逆转录生成新的病毒DNA，从而发挥抑制病毒复制的作用，HBV前基因组RNA是以HBV 的cccDNA为模板合成的，即NA的药效靶点在cccDNA的下游，所以NA不能直接清除已经存在的cccDNA。

一代测序常见问题及解决策略

测序常见问题及解决策略 一、PCR常见问题 1.假阴性，不出现扩增条带 PCR出现假阴性结果，可从以下几个方面来寻找原因： 1）模板：①模板中有杂蛋白；②模板中有Taq酶抑制剂；③在提取制备模板时丢失过多；④模板核酸变性不彻底。 2）酶：酶失活或反应时忘了加酶。 3）Mg2+浓度：Mg2+浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR 扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 4）反应条件：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。 5）靶序列变异：靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。 2.假阳性 假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。常见原因有： 1）引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引 物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。 2）靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。二是空气中的 小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。 3.出现非特异性扩增带 PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物

浅析乙肝病毒基因突变检测及治疗(一)

浅析乙肝病毒基因突变检测及治疗(一) 一、概况 由于我国人民生活水平低和卫生资源溃乏，造成乙肝泛滥。据统计：我国有乙肝病毒携带者约1.5亿、慢性迁延性肝炎约2500万、慢性活动性肝炎约1000万、重症肝炎约150万、肝硬化约100万和肝癌16～30万。肝硬化和肝癌80%以上是由乙肝病毒引起，而且80%左右来源于家族性垂直传播、与病人接触而感染机率很少。乙肝传染病已被国家疾病预防控制中心列为重点监控的疾病之一。 乙型肝炎病毒（HBV）属嗜肝病毒科，基因结构复杂，根据HBV-DNA核苷酸序列异质性≧8%为一种基因型的规定，HBV目前分为A～H8个基因型，其中A、B、C、F4个基因型存在不同的亚型，且分布呈区域性。由于其在复制过程中HBV-DNA聚合酶缺乏校正功能，导致易于变异，有报导HBV的基因型与基因型变异可能与HBV相关性肝癌的发生发展有关。HBV 变异给疾病的预防、诊断、治疗和预后带来了新问题，不同基因型的基因变异、临床表现及对抗病毒、肝移植等的治疗反应存在差异。 二、变异及区域 HBV受自然压力、个体免疫力和药物治疗作用出现变异。HBV有四个开放阅读框架（ORE）即S、C、P、X区。 1、C区变异：用基因芯片检测HBV前C区和C基因启动子（BCP）区4位点突变，发现前C 区A1896、前C区A1814、BCP区nt176 2、BCP区nt1764突变检出率分别是58.57%、12.86%、54.29%、52.86%。突变的发生依次是慢重肝、慢乙肝重度、中度、轻度，血清病毒标志是HBeAg(-)HBeAb(+)、HBV-DNA定量在104-106copy/ml之间的突变发生率最高。可以解释小三阳DNA阳性之原因：HBeAg前C区A1896位的G变异成A，密码子UGG变为终止UAG，使HBeAg不能合成，但不影响病毒复制。 2、S区变异：前S1有识别功能，前S2是介导受体进入功能。前S区的变异可能是病毒逃避宿主免疫的一种方法，前S区的变异决定不同的HBV亚型。124、131位变异或122-124间插入变异可改变S抗原决定簇的构型，致HBsAg假阴性。145、141、126、133位氨基酸的改变，用常规试剂仍可检出HBsAg，但可能削弱HBsAg的无免疫性，使高效价的乙肝免疫球蛋白或接种诱生的HBsAb难与变异株的HBsAg结合，缺乏中和特性，使HBsAg与HBsAb 同时阳性。在HBV-DNA阳性时，无论是乙肝病毒基因变异株或野毒株，前S1抗原是判断乙型肝炎病毒复制的重要指标。 3、P区变异：用微孔板核酸杂交法检测乙肝病毒P基因区变异，突变位点主要位于HBV-DNA 聚合的区域（YMDD），M1（蛋氨酸）可被VC（缬氨酸）或IC（异亮氨酸）替代。研究用拉米夫啶（LMV）治疗慢性乙肝而发生耐药的有关变异可见：LMV本身可引起HBV的变异即YMDD变异，用LMV四周后50-70%的病人出现YMDD变异。 4、X区变异：HBV-X蛋白对信号转导通路及细胞凋亡有影响，X蛋白对核转运影响和对线粒体直接作用。X区变异引起X蛋白（HBXAg）过度表达，激活体内癌基因和抑制抑癌基因，导致肝癌的发生。有报导：用聚合酶链反应检测原发性肝细胞癌（HCC）患者癌组织及癌周组织中HBV-X基因，检出率分别为68%和77%。

20个测序常见的问题

20个测序常见的问题 1．为什么需要新鲜的菌液？ 首先，新鲜的菌液易于培养，可以获得更多的DNA，同时最大限度地保证菌种的纯度。2．如何提供菌液？ 如果您提供新鲜菌液，用封口膜封口以免泄漏；也可以将培养好的4～5ml菌液沉淀下来，倒去上清以方便邮寄。同时邮寄时最好用盒子以免邮寄过程中压破。 3．如何制作穿刺菌？ 用灭菌过1.5ml或2ml离心管加入LB琼脂(7g/L)斜面凝固，用接种针挑取分散良好的单菌落穿过琼脂直达管底，不完全盖紧管盖适当温度培养过夜，然后盖紧盖子加封口膜，室温或4度保存。 4．PCR产物直接测序有什么要求？ （1)扩增产物必须特异性扩增，条带单一。如果扩增产物中存在非特异性扩增产物，一般难以得到好的测序结果； (2）必须进行胶回收纯化； (3）DNA纯度在1.6—2.0之间，浓度50ng/ul以上。 5．为什么PCR产物直接测序必须进行Agarose胶纯化？ 如果不进行胶纯化而直接用试剂盒回收，经常会导致测序出现双峰甚至乱峰，这主要是非特异性扩增产物或者原来的PCR引物去除不干净所导致。大多所谓的PCR“纯化试剂盒”实际上只是回收产物而不能起到纯化的作用的。对于非特异性扩增产物肯定无法去除，而且通常他们不能够完全去除所有的PCR引物，这会造成残留的引物在测序反应过程中参与反应而导致乱峰。 6．如何进行PCR产物纯化？ PCR产物首先必须用Agarose胶电泳，将特异扩增的条带切割下，然后纯化。使用凝胶回收试剂盒回收，产物用ddH2O溶解。 7．PCR产物直接测序的好处？ （1) PCR产物直接测序可以反映模板的真实情况； （2) 省去克隆的实验费用和时间； （3) PCR产物测序正确的片段进行下一步克隆实验使结果更有保障； （4) 混合模板进行PCR的产物直接测序可以发现其中的点突变。 8．对用于测序的质粒DNA的要求有哪些？ 对测序模板DNA的一般要求：（1)DNA纯度要求高，1.6—2.0之间，不能有混合模板，也不能含有RNA，染色体DNA，蛋白质等；（2)溶于ddH2O中，溶液不能含杂质，如盐类，或EDTA等螯合剂，将干扰测序反应正常进行。 9．如何鉴定质粒DNA浓度和纯度？ 我们使用水平琼脂糖凝胶电泳，并在胶中加入0.5ug/ml的EB(电泳缓冲液中不必加E，加一个已知浓度的标准样品。电泳结束以后在紫外灯下比较亮度，判断浓度和纯度。此方法可以更直接、准确地判断样品中是否含有染色体DNA、RNA等，也可以鉴别抽提的质粒DNA 的不同构型。 质粒DNA的3种构型是指在抽提质粒DNA过程中，由于各种原因的影响，使得超螺旋的共价闭合环状结构的质粒(SC)的一条链断裂，变成开环状(OC)分子，如果两条链发生断裂，就变成为线状(L)分子。这3种分子有不同的迁移率，通常，超螺旋型(SC)迁移速度最快，其次为线状(L)分子，最慢为开环状(OC)分子。使用紫外分光光度计检测，或者用溴乙锭-标准浓度DNA比较法只能检测抽提到的产物中的浓度，甚至由于抽提的质粒DNA中含有RNA、蛋白质、染色体DNA等因素的干扰，浓度检测的数值也是没有多少意义的。

CHIP SEQ分析常见问题集锦

ChIP-Seq分析常见问题集锦 染色质免疫共沉淀测序（ChIP-Seq）是指对染色质免疫共沉淀（ChIP）获得的DNA片段进行大规模测序，并能把所研究蛋白的DNA结合位点精确定位到基因组上。 Roche GS FLX Titanium、Illumina Solexa GA IIx和AB SOLID4这3种测序技术均可以用于ChIP-seq，其中采用Illumina Solexa GA IIx进行ChIP-Seq已有较多文献报道。 ChIP-Seq技术高质量、高通量、低成本的数据产出，为表观遗传组学研究奠定了技术基础。研究者可以在以下几方面展开研究：（1）判断DNA链的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰；（2）检测RNA polymerase II及其它反式因子在基因组上结合位点的精确定位；（3）研究组蛋白共价修饰与基因表达的关系；（4）CTCF转录因子研究。 ChIP-Seq有什么样品要求？ 答：（1）请提供浓度≥10ng/ul、总量≥200ng、OD260/280为1.8~2.2的DNA样品；若单次ChIP后DNA量不够，建议将2~3次ChIP的DNA合并在一起。 （2）请提供DNA打断时检测胶图，要求打断后DNA电泳主带在200-500bp范围内；请对于ChIP 获得DNA设计引物进行QPCR验证和定量，能够提供检测位点的检测报告。附阳性和阴性对照。（3）样品请置于1.5ml管中，管上注明样品名称、浓度以及制备时间，管口使用Parafilm 封口。在运输前将所有样品管固定于50ml带盖离心管中，再将50ml管放在封口袋中。 ChIP-Seq相比ChIP-chip有哪些优势？ 答：第一，ChIP-Seq能实现真正的全基因组分析。目前所能获得的芯片上固定的探针只能代表全基因组部分序列，所获得的杂交信息具有偏向性；第二，对于结合位点分析，ChIP-Seq 通过寻找“峰”，结合分辨率可精确到10~30bp，而芯片上探针由于长度所限，无法精确定位，即使目前最高水平的商业芯片都无法提供可与ChIP-Seq媲美的分辨率；第三是所需样本数量。ChIP-chip需要多达4~5μg的起始样本，在杂交之前需要进行LM-PCR，但可能导致背景增高，竞争性扩增等导致假阳性。而ChIP-Seq仅需要纳克级起始材料，如SOLiD起始材料可低至20ng。两者技术特点如下： 研究方法CHIP-on-chip CHIP-Seq 分辨率30~100bp1bp 覆盖范围受芯片容量限制，只能选择性地扫 描特定区域，无法覆盖全基因组只要测定的序列（Reads）能够定位到基因组上，就能获得全部基因组信息 缺陷探针和非特异性区域杂交测序数据会有一些GC含量偏向 性价比只能研究在基因组上广泛存在的目 的位点（Broading bingding）可以扫描全基因组；可以研究在基因组上存在的稀有目的位点（Sharp bingding） 需要的DNA 量 高低（10~50bp）动态量程弱信号会被遗弃；强信号会饱和没有局限 选择数据产 出量 不可以可以

HBV耐药基因突变检测

HBV耐药基因突变检测 项目简介：HBV是一种经血液传播的嗜肝DNA病毒，是导致慢性肝炎、肝硬化和肝癌的重要因素。抗病毒治疗是最常见的乙肝治疗方式。国内外公认的抗病毒药物主要有干扰素和核苷（酸）类药物两类。核苷（酸）类药物因口服方便、毒副作用少、病毒载量下降较快而受到广泛关注。 长期服用核苷（酸）类药物易产生耐药。在用药过程中，患者体内HBV DNA及谷丙转氨酶（ALT）逐渐下降，继而达到一个平稳期，患者病情减轻。此时，HBV很难被完全清除，而是处于一个低复制非活动时期。随着用药时间的延长，对药物敏感的野生株数量下降，具有耐药突变的变异株因对药物不敏感，而得以不断复制、增加，从而导致HBV DNA及ALT重新上升，使得肝炎复发。耐药发生的直接后果即为药物疗效的降低和丧失，具体表现为肝炎复发、肝病急性加重、肝硬化，甚至出现肝衰竭。 乙型肝炎病毒耐药是指在核苷酸类似物作用下，药物靶乙型肝炎病毒 P 基因中的某些位点发生改变，导致这种药物对乙型肝炎病毒的抑制作用下降或消失。自拉米夫定上市以来，目前经美国FDA 批准先后上市的核苷酸类似物有阿德福韦、恩替卡韦和替比夫定。这些药物作用下出现的病毒耐药均与乙型肝炎病毒 P 基因变异有关。如拉米夫定耐药相关突变位点为D 区M204V/ I、B 区L180M，阿德福韦相关突变位点为D 区N236T、B 区A181V，替比夫定为M204I，L180M，病毒只需要1 个上述位点突变就可发生对这些药物耐药。而对恩替卡韦耐药必须建立在拉米夫定耐药基础上(L180M +M204I/V)，同时出现Al84G 或S202I 或M250V 突变。随着用药时间推移，各类核苷酸类似物发生耐药的几率是不尽相同的。其中拉米夫定几率最高，而恩替卡韦由于具有较高耐药基因屏障，所以产生耐药的几率最低，在用药后的4 年内都维持在1.1%。 因此通过检测HBV耐药基因突变点有助于判断治疗的效果、制定个体化抗病毒治疗方案。使用核苷酸药物导致耐药基因突变原理如下图所示。

基因测序(PCR常见问题)

基因测序（PCR常见问题）生物专业很实用 PCR常见问题 PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性) 问题1：无扩增产物 现象：正对照有条带，而样品则无 原因: 1.模板:含有抑制物，含量低 2.Buffer对样品不合适 3.引物设计不当或者发生降解 4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短 对策: 1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 2.更换Buffer或调整浓度 3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 4.降低退火温度、延长延伸时间 问题2：非特异性扩增 现象：条带与预计的大小不一致或者非 特异性扩增带

原因： 1.引物特异性差 2.模板或引物浓度过高 3.酶量过多 4.Mg2+浓度偏高 5.退火温度偏低 6.循环次数过多 对策： 1.重新设计引物或者使用巢式PCR 2.适当降低模板或引物浓度 3.适当减少酶量 4.降低镁离子浓度 5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法 6.减少循环次数 问题3：拖尾 现象：产物在凝胶上呈Smear状态。 原因： 1.模板不纯 2.Buffer不合适 3.退火温度偏低 4.酶量过多 5.dNTP、Mg 2+浓度偏高 6.循环次数过多 对策： 1.纯化模板 2.更换Buffer 3.适当提高退火温度 4.适量用酶 5.适当降低dNTP和镁离子的浓度 6.减少循环次数 问题4：假阳性 现象：空白对照出现目的扩增产物 原因： 靶序列或扩增产物 的交*污染 对策： 1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。 3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存 PCR引物设计的黄金法则（转自tiangen）

国内专家谈HBV耐药及其管理

北京大学医学部庄辉 北京大学医学部庄辉教授 一、核苷(酸)类似物耐药现状 目前我国用于治疗|的核苷(酸)类似物(NAs)主要有4种：拉米夫定(LAM)、阿德福韦酯(ADV)、替比夫定(LdT)和恩替卡韦(ETV)。在欧美及亚洲的一些国家和地区，还有替诺福韦酯(TDF)等。LAM治疗1年时的耐药率为24%，治疗5年时的耐药率高达70%。LdT治疗2年时，HBeAg阳性和阴性慢性乙型肝炎患者的耐药率分别为25%和11%；治疗5年时，HBeAg阳性和阴性慢性乙型肝炎患者的累积耐药率分别为42%和29%。我国报告，ADV治疗HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者5年累积耐药率为14.6%。ETV治疗5年时的耐药率为1.2%(但在随访队列中排除了少数无应答者；治疗3年后ETV用1mg剂量；系基于108例患者的资料)。TDF单药治疗至240周时仍未检测到相关的耐药变异。 二、核苷(酸)类似物耐药机制及影响因素 (一)耐药机制 病毒耐药的发生反映病毒为逃逸药物压力而发生的一系列适应性突变，最终导致病毒对药物的敏感性下降。在患者体内HBV的复制效率很高，每天可产生1012~1013个病毒颗粒，较丙型肝炎病毒(HCV)和人类免疫缺陷病毒(HIV)分别高10和100倍，HBV聚合酶是一种逆转录酶，缺乏校正能力，其错配率较高，每复制105个碱基对即可产生一个突变。依此推算，患者体内的HBV每天可发生1010~1011位点突变。HBV的基因组全长为3.2kb，如此高的突变率，HBV全基因组的每个位点均可能发生突变。HBV复制的这一特点也决定在同一患者体内的病毒构成并不均一，而是由基因序列存在差异的多种病毒株组成，这些序列不同的病毒群构成了准种(quasispecies)。目前抗病毒治疗的NAs作用靶点均为病毒聚合酶基因，已知与耐药相关的突变均位于HBV聚合酶基因的逆转录酶区(RT区)，可分为原发耐药突变和继发耐药突变。 (二)耐药的影响因素 1.病毒因素：包括病毒的复制速度、复制的保真性、基线的HBV DNA载量、准种、预存耐药突变、耐药突变株的适应性和复制空间等。

埃博拉+细菌耐药+乙肝

埃博拉防控 5．1预防性措施目前我国尚未出现埃博拉病毒爆发趋势，但防治管理不可松懈。我国暂可通过以下形式与方法进行预防与管理： 1）政府建立出入境特殊传染病筛查监测体制，要加强进、出境检疫，加强对动物的检疫，尤其是要加强对非人灵长类和蝙蝠等野生动物的检疫工作。口岸检疫部门一旦发现可疑病例或动物，要及时通报卫生部门做好疫情调查和处理。 2）对公众以及前往埃博拉流行地区的旅游和进行医护工作的人员要进行有关埃博拉出血热防病知识的普及和教育，使其提高警惕意识，做好个人防护。提高卫生工作人员对埃博拉的诊断、报告水平及意识。医务人员需严格遵守洗手规程，并认真清理、消毒暴露表面。患者需被安置在一个单独的隔离观察室。 3)建议公众近期不要前往几内亚、利比里亚和塞拉利昂旅行，若要前往尼日利亚也要格外小心病毒暴露风险。 4) 建议所有自几内亚、利比里亚、尼日利亚和塞拉利昂归国的游客，连续 21天密切监测体温和身体其他体征改变，一旦出现如寒战、皮疹等类埃博拉症状，应立即报告给当地医院或医生，并主动提供近期疫区接触史，以便有关部分及时采取适当的预防措施。 5）加强国际间信息交流与合作．密切关注该病的流行动态，尤其要高度关注曾出现过埃博拉出血热流行的地区。 6) 任何疑似病例都需要进行隔离，直至被确诊或被排除。 5．2疫情控制措施 1）多地多种相关部门建立联系与快捷信息渠道，保证一旦发现可疑病例及其接触者，应立即采取严格的隔离措施．以防止疫情的扩散及流行。 2）与病人接触时做好个人防护，防止直接接触患者污染物。对病人的分泌物、排泄物要严格消毒，污染的针头、注射器等可用焚烧或高压蒸汽进行消毒处理。 3）所有涉及埃博拉病毒的实验室活动应严格按照我国有关规定进行。相关的实验室检查病料送检过程中一定要注意防止病毒的散播。病毒分离与培养只能在生物安全4级实验室(BSL-4)进行。该病无特效治疗措施，主要采用对症和支持疗法，注意水、电解质平衡，预防和控制出血，控制继发感染。 一、细菌耐药性检测的方法 1、细菌耐药表型检测：判断细菌对抗菌药物的耐药性可根据NCCLS标准，通过测量纸片扩散法、肉汤稀释法和E试验的抑菌圈直径、MIC值和IC值获得。也可通过以下方法进行检测：（1）耐药筛选试验（2）折点敏感试验（3）双纸片协同试验（4）药敏试验的仪器化和自动化 2．β-内酰胺酶检测：主要有碘淀粉测定法和头孢硝噻吩纸片法。 3．耐药基因检测 4．特殊耐药菌检测 （1）耐甲氧西林葡萄球菌检测：（2）耐青霉素肺炎链球菌检测（3）耐万古霉素肠球菌检测（4）产超广谱β-内酰胺酶的肠杆菌科细菌检测

乙型肝炎病毒分型(B型、C型、D型)和耐药突变基因检测.doc

乙型肝炎病毒分型(B型、C型、D型)和耐药突变基因检测 一．检验项目：乙型肝炎病毒分型(B型、C型、D型)和耐药突变基因检测 二．检验目的：在进行抗病毒治疗前和抗病毒治疗中进行乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测，能够：1). 区分中国和其他亚洲国家常见的HBV-B、C、D基因型； 2). 检测HBV抗病毒药物5个热点突变位点的6种突变类型； 3). 对HBV实行动态监控，辅助确定个性化的临床诊疗方案，进行HBV流 行病学研究。 三．临床意义： HBV基因型分为9种（A-I），其分布具有地域性，中国乃至亚洲流行的乙型肝炎病毒几乎都是B、C型，此外还有少量D型，不同的基因型易发生的突变类型不同，与病情转归也密切相关，如基因型C较B更容易引起严重的肝炎或肝癌，对干扰素的应答率A型高于D型，B型高于C型，C型高于D型。与C型患者相比，B型患者较早出现HBeAg血清学转换，较少进展为慢性肝炎，肝硬化和原发性肝细胞癌。 核苷（酸）类似物，如拉米夫定（Lamivudine，LMV），替比夫定（Telbivudine,LdT），阿德福韦酯（Adefovir,ADV）和恩替卡韦（Enticavir,ETV）等是抗HBV常见药物。但这些药物都无法彻底清除大多数乙肝病人体内的HBV，患者需要长期维持治疗。HBV在宿主体内感染以及抗病毒治疗的过程中会发生基因变异，并在宿主体内免疫系统的压力下和在治疗干预过程中进行变异的优势选择，以达到逃逸免疫、对抗药物、实现物种生存的目的，进而发生耐药。乙肝病人一旦出现耐药突变，其肝功能恶化的比例将显著增高，甚至快速进展至肝衰竭。 四．标本送检要求：4ml黄色帽血清管，空腹采集后立即送检，室温放置不宜超过2小时，如不能立即送检可于4℃保存一周，如需长期保存请放入－20℃冻存，运输过程中请注意保持低温。 五．开单名称：乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测 进入本科室“医生工作站”→选择开单病人“姓名”→选择“项目类别”→选择“检验” →选择“乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测”→确定 或进入本科室“医生工作站”→选择开单病人“姓名”→选择“项目类别”→选择“检验”→选择“实验室”→选择“乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测”→确定六．收费：570元/例 七．送检时间：周一至周日8：00am－12：00am 八．送检地点：检验科三楼服务台 九．报告时间：抽血后，7个工作日后进入我院计算机检查报告系统，查看检测结果。 联系电话：84206146 检验科

测序常见问题解答

1．为什么需要新鲜的菌液？ 首先，新鲜的菌液易于培养，可以获得更多的DNA，同时最大限度地保证菌种的纯度. 2．如何提供菌液？ 如果您提供新鲜菌液，用封口膜封口以免泄漏；也可以将培养好的4—5ml菌液沉淀下来，倒去上清以方便邮寄。同时邮寄时最好用盒子以免邮寄过程中压破. 3．如何制作穿刺菌？ 用灭菌过1.5ml或2ml离心管加入LB琼脂(7g/L)斜面凝固，用接种针挑取分散良好的单菌落穿过琼脂直达管底，不完全盖紧管盖适当温度培养过夜，然后盖紧盖子加封口膜，室温或4度保存。 4．PCR产物直接测序有什么要求？ 1)．扩增产物必须特异性扩增，条带单一.如果扩增产物中存在非特异性扩增产物，一般难以得到好的测序结果；.2）必须进行胶回收纯化；3）DNA纯度在16—2.0之间.浓度50ng/ul以上. 5．为什么PCR产物直接测序必须进行Agarose胶纯化？ 如果不进行胶纯化而直接用试剂盒回收，经常会导致测序出现双峰甚至乱峰。这主要是非特异性扩增产物或者原来的PCR引物去除不干净所导致。大多所谓的PCR"纯化试剂盒"实际上只是回收产物而不能起到纯化的作用的。对于非特异性扩增产物肯定无法去除，而且通常他们不能够完全去除所有的PCR引物，这会造成残留的引物在测序反应过程中参与反应而导致乱峰。 6．如何进行PCR产物纯化？ PCR产物首先必须用Agarose胶电泳，将特异扩增的条带切割下，然后纯化。使用凝胶回收试剂盒回收.产物用ddH2O溶解。 7．PCR产物直接测序的好处？ A) PCR产物直接测序可以反映模板的真实情况. B) 省去克隆的实验费用和时间. C) PCR产物测序正确的片段进行下一步克隆实验使结果更有保障. D) 混合模板进行PCR的产物直接测序可以发现其中的点突变. 8．对用于测序的质粒DNA的要求有哪些？ 对测序模板DNA的一般要求：1).DNA纯度要求高，1.6—2.0之间，不能有混合模板，也不能含有RNA，染色体DNA，蛋白质等；2).溶于ddH2O中，溶液不能含杂质，如盐类，或EDTA等螯合剂，将干扰测序反应正常进行。 9．如何鉴定质粒DNA浓度和纯度？ 我们使用水平琼脂糖凝胶电泳，并在胶中加入0.5ug/ml的EB(电泳缓冲液中不必加EB)，加一个已知浓度的标准样品。电泳结束以后在紫外灯下比较亮度，判断浓度和纯度。此方法可以更直接、准确地判断样品中是否含有染色体DNA、RNA等，也可以鉴别抽提的质粒DNA的不同构型。 质粒DNA的3种构型是指在抽提质粒DNA过程中，由于各种原因的影响，使得超螺旋的共价闭合环状结构的质粒(SC)的一条链断裂，变成开环状(OC)分子，如果两条链发生断裂，就变成为线状(L)分子。这3种分子有不同的迁移率，通常，超螺旋型(SC)迁移速度最快，其次为线状(L)分子，最慢为开环状(OC)分子。使用紫外分光光度计检测，或者用溴乙锭-标准浓度DNA比较法只能检测抽提到的产物中的浓度，甚至由

DNA测序结果中常见的几个问题

D N A测序结果中常见 的几个问题 公司内部档案编码：[OPPTR-OPPT28-OPPTL98-OPPNN08]

1 、为什么开始一段序列的信号很杂乱，几乎难以辨别 这主要是因为残存的染料单体造成的干扰峰所致，该干扰峰和正常序列峰重叠在一起；另外，测序电泳开始阶段电压有一个稳定期，所以经常有20-50 bp 的紧接着引物的片段读不清楚，有时甚至更长。 2 、为什么在序列的末端容易产生 N 值，峰图较杂 由于测序反应的信号是逐渐减弱的，所以序列末端的信号会很弱，峰图自然就会杂乱，加上测序胶的分辨率问题，如果碱基分不开，就会产生N 值，正常情况下ABI377测序仪能正确读出500个碱基的有效序列。 3 、测序结果怎么找不到我的引物序列 如果找不到测序所用的引物序列。这是正常的，因为引物本身是不被标记的，所以在测序报告中是找不到的；如果找不到克隆片段中的扩增引物，可能是您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近，开始一段序列很杂，几乎难以辨别，有可能看不清或看不到扩增引物；另外插入片段的插入方向如果是反的，此时需找引物的互补序列。 4 、测序结果怎么看不到我克隆的酶切位点 可能的原因同上，您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近，开始一段序列很杂，几乎难以辨别，有可能看不清或看不到酶切位点。通常我们会尽量选择距离酶切位点远点的引物，当然，若是样品出现意外原因，如空载、载体自连等，克隆的酶切位点也是看不到的。 5 、你测出的结果与我预想的不一致，给我的结果与我需要的序列有差距，这是怎么回事

首先，我们会核实给您的测序结果是否对应您的样品编号，如果对应的是您的样品，由于不知您的实验背景，测得的序列是否与您预想的结果一致我们无法判断，我们能做到的是检查发送给您的测序结果和您提供来的样品是否一致。 6 、序列图为什么会有背景噪音(杂带)是否会影响测序结果 序列图的背景杂带是由荧光染料引起，如果太强会影响测序结果，要看信噪比，我们给的结果信噪比大都在98%以上。 7 、测序结果为什么与标准序列有差别 原因可能有：样品个体之间的差别、测序准确率的问题，自动测序仪分析序列的准确并非100%，建议至少测一次双向，通过双向测序可以最大限度减少测序的错误。当然尽管我们有时做了最大努力，但还是保证不了和文献序列完全一致，但我们测序报告是客户样品序列的真实结果。 8 、 PCR 产物测序与克隆后测序序列为什么有差别 PCR 产物克隆到载体中进行测序，有两个方面可能序列有变化：首先，PCR 扩增过程中可能产生错配。将片段克隆到载体中也有可能发生突变；其次，测序的准确率并非100%。 9 、有杂合位点，但你们的报告上看不到杂合的信号！ 如果在您认为应该出现杂合信号的位置上只出现单一的信号，那么可能是您样品突变的模板与正常的模板的比例没达到可以测出的浓度。测序反应的信号强度直接与模板的量有关，如果突变的模板所占的比例很低，仪器会自动将它作为背景信号了，很难检测出来。只有当测序反应体系中正常的和突变的模板量比较接近时，才能较可靠地检测到突变体

测序过程常见问题分析与解答

测序过程常见问题分析与解答 1、DNA测序样品用什么溶液溶解比较好？ 答：溶解DNA测序样品时，用灭菌蒸馏水溶解最好。DNA的测序反应也是Taq酶的聚合反应，需要一个最佳的酶反应条件。如果DNA用缓冲液溶解后，在进行了测序反应时，DNA溶液中的缓冲液组份会影响测序反应的体系条件，造成Taq酶的聚合性能下降。有很多客户在溶解DNA测序样品时使用TE Buffer。的确，TE Buffer能增加DNA样品保存期间的稳定性，但TE Buffer对DNA测序反应有影响，根据我们的经验，我们还是推荐使用灭菌蒸馏水来溶解DNA测序样品。 2、提供DNA测序样品时，提供何种形态的比较好？ 答：我们推荐客户提供菌体，由我们来提取质粒，这样DNA样品比较稳定。如果您要以提供DNA样品，我们也很欢迎，但一定要注意样品纯度和数量。提供的测序样品为PCR产物时，特别需要注意DNA的纯度和数量。PCR产物应该进行切胶回收，否则无法得到良好的测序效果。有关DNA测序样品的详细情况请严格参照“测序模板的要求”部分的说明。 3、提供的测序样品为菌体时，以什么形态提供为好？ 答：一般菌体的形态有：平板培养菌、穿刺培养菌，甘油保存菌或新鲜菌液等。我们提倡寄送穿刺培养菌或新鲜菌液。平板培养菌运送特别不方便，我们收到的一些平板培养菌的培养皿在运送过程中常常已经破碎，面目全非，需要用户重新寄样。这样既误时间，又浪费客户的样品。一旦是客户非常重要的样品时，其后果更不可设想。而甘油保存菌则容易污染。制作穿刺菌时，可在1.5ml的Tube管中加入琼脂培养基，把菌体用牙签穿刺于琼脂培养基（固体）中，37℃培养一个晚上后便可使用。穿刺培养菌在4℃下可保存数个月，并且不容易污染，便于运送。 4、与测序引物有关的问题

乙型肝炎病毒耐药专家共识

·指南·乙型肝炎病毒耐药专家共识 乙型肝炎病毒耐药专家委员会 经国家食品药品监督管理局（SFDA）批准用于抗乙型肝炎病毒（HBV）治疗的核苷（酸）类似物有拉米夫定（LAM）、阿德福韦酯（ADV）、恩替卡韦（ETV）和替比夫定（LdT）。核苷（酸）类似物已成为继干扰素α（IFN α）之后的又一类用于抗HBV治疗的有效药物。大多数接受核苷（酸）类似物治疗的患者难以在短期内实现持久应答，必须接受长期治疗，这必将增加抗病毒耐药的发生风险，随着核苷（酸）类似物种类的增加，HBV耐药变异的复杂性也将大大增加。因此，迫切需要对HBV耐药变异的相关概念和命名方法、耐药变异的检测方法以及耐药变异发生后的临床处理等问题进行规范化，以便于学术交流，提高临床诊治水平。为此，《中华实验和临床感染病杂志》（电子版）编辑部组织全国感染病学及肝病学领域知名专家在循证医学原则指导下，对目前临床试验研究结果综合分析的基础上，就上述问题进行了讨论，达成以下共识。 一、乙型肝炎病毒耐药的病毒学基础 HBV属于嗜肝DNA病毒科（hepadnaviridae），基因组长约3.2 kb，是部分双链环状DNA结构。HBV 基因组含有4个部分重叠的开放读框（ORF），即前-S/S区、前-C/C区、P区和X区。前-S/S区编码大蛋白（前-S1 + 前-S2 + S）、中蛋白（前-S2 + S）、主蛋白（S），前-C/C区编码HBeAg和HBcAg，P区编码聚合酶/逆转录酶，X区编码HBxAg。不同患者血清中的HBV基因序列存在差异，根据HBsAg蛋白质一级结构和抗原性的不同，HBV可分成不同的血清型，如ayw、ayr、adr和adw等；根据HBV全基因序列差异≥ 8%或S区基因序列差异≥4%，HBV可分成A～H基因型，各基因型又可分成若干个基因亚型。同一患者体内不同的HBV株基因序列之间也存在差别，但在遗传学上高度相关；因此，每一个患者体内的病毒都是由存在基因序列差异的病毒株组成的病毒群，优势和劣势群是相对的，并始终处在不断的变化之中，因此，HBV的病毒群符合准种（quasispecies）的特点。 HBV侵入人体后，与靶细胞膜上的受体结合，脱去包膜，穿入细胞质中，脱去外壳，部分双链环状HBV DNA进入靶细胞核中，在DNA聚合酶作用下，以负链DNA为模板，延长正链，修补裂隙区，形成共价闭合环状DNA（ccc DNA）。HBV DNA的复制首先以ccc DNA为模板，在RNA聚合酶的作用下，转录成3.5 kb、2.4 kb、2.1 kb和0.7 kb等大小不同的HBV mRNA，部分3.5 kb的HBV mRNA属于前基因组RNA，含有HBV的全部遗传信息，在HBV逆转录酶的作用下，合成负链DNA，以此为模板，在DNA 聚合酶的作用下合成正链DNA，形成子代病毒的部分双链HBV DNA。其他的HBV mRNA在细胞浆中翻译成病毒的各种蛋白成分，并与子代HBV DNA装配成完整病毒颗粒，释放至细胞外。部分子代HBV DNA，

乙型肝炎病毒分型和耐药突变(GC-HBV)检测项目开展指南

乙型肝炎病毒分型和耐药突变（GC-HBV）检测项目开展指南 一乙型肝炎病毒（HBV）分型和耐药突变基因检测流程图 二实验室建设 1最佳HBV分型和耐药突变基因检测实验室设计平面图 1）实验室应具有试剂准备区、标本制备区、PCR扩增区及杂交分析区（如上图）2）临床样本的收取及储存应该在这4个区域以外的地方完成。 3）进入各个工作区必须遵循严格的单一方向顺序。 4）进入各工作区必须严格按照要求更换各区域特定颜色的工作服，并同时佩戴一次性手套。出工作区之前必须脱去区域特定工作服及手套才可。 5）每一个工作区都应有独立的一套仪器设备及耗材（包括移液器、离心机、水浴锅、试管架、一次性手套、移液吸头、离心管及冰箱等），且不同区域的仪器设备及耗材不能混用。 2实验室环境

1）工作区域必须始终保持清洁整齐。 2）所有实验台面及地面均应保持清洁。 3）所有实验废料及垃圾使用专用垃圾袋装好后，封口处理。 4）在每次工作前后对工作台面进行消毒液擦洗、消毒酒精擦洗工作，并在完成工作后开启紫外灯进行灭菌。 3 实验室制度及人员配备 1）实验室必须有完整详细的操作规章制度并严格遵守。 2）操作人员需要一定的专业技术知识和经验。 3）操作人员需要有强烈的责任感，且工作认真细心。 4）操作人员需要严格遵守HBV基因分型和耐药突变检测操作规程。 三实验所需试剂、设备及其功能简介 HBV分型和耐药突变基因检测实验主要由以下三个实验组成：血清中乙肝病毒DNA的提取，基因扩增（PCR）和杂交分析。 1 实验所需试剂及耗材 2 实验所需仪器（推荐使用）及功能简介

乙型肝炎病毒分型和耐药突变（GC-HBV）检测临床检测结果及常见问题解答 1 HBV分型及耐药突变基因检测有何意义？ 研究发现，HBV亚型的类别与HBV的致病性、临床表现及抗病毒药物治疗的选择都有一定的相关性。在已知的8种亚型中，我国以以B和C型为主并有少量的D型，感染C型的患者肝脏损伤程度比B型严重，D型致肝炎、肝硬化及肝癌发病可能性更大。 感染HBV C型、B型患者易产生拉米呋啶（贺普丁）耐药突变，导致乙肝病毒对拉米夫定的敏感性下降，治疗失败，甚至导致病情恶化，因此临床上检测乙肝病毒亚型及耐药突变对及时调整治疗方案、指导临床用药及实时监控抗病毒药物疗效具重要的指导意义。 2 目前HBV分型及耐药突变基因检测方法主要有哪些？ 主要方法有全基因序列测定法、PCR-限制性片段长度多态性分析法 (RFLP) 、型特异性引物PCR法、荧光定量PCR法和基因芯片检测法等。上述方法均可进行HBV 基因分型和耐药突变检测，但前两种方法技术复杂和费用昂贵、效率低而难以大规模的临床应用。荧光定量PCR法检测位点较少，一般只能检测YMDD 两个位点的耐药突变，而型特异性引物PCR法特异性差，准确率低。基因芯片检测法（PCR+反向杂交）可在一张膜芯片上同步检测HBV的亚型和多个耐药突变位点，操作简便快捷、结果判读方便、检测通量大、需要样本量少，已成为HBV 基因分型和耐药突变检测的一种最新方法。 3 乙肝病毒分型及其耐药突变基因检测有何技术优点？

国内专家谈乙肝病毒耐药及其管理体系

国内专家谈乙肝病毒耐药及其管理体系

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国内专家谈乙肝病毒耐药及其管理 医脉通2013-10-12分享 慢性乙肝口服药抗病毒治疗已有10余年的历史，各种核苷（酸）类似物随着临床应用经验的日益积累，目前已经迈向通过优化治疗提高疗效、管理耐药的时代。各种核苷（酸）类似物都在努力寻找适合自身特点的优化方法，不仅把耐药风险降至最低，同时最大限度地提高疗效，从而真正使患者达到慢性乙肝治疗近期目标，即持久抑制乙肝病毒（HBV）DNA 复制和实现乙肝病毒e抗原（HBeAg）血清学转换。 北京大学医学部庄辉 一、核苷(酸) 类似物耐药现状 目前我国用于治疗|的核苷(酸) 类似物(NAs) 主要有4种：拉米夫定(LAM)、阿德福韦酯(ADV)、替比夫定(LdT) 和恩替卡韦(ETV)。在欧美及亚洲的一些国家和地区，还有替诺福韦酯(TDF) 等。LAM治疗1年时的耐药率为24%，治疗5年时的耐药率高达70%。LdT治疗2年时，HBeAg阳性和阴性慢性乙型肝炎患者的耐药率分别为25%和11%；治疗5年时，HBeAg阳性和阴性慢性乙型肝炎患者的累积耐药率分别为42%和29%。我国报告，ADV治疗HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者5年累积耐药率为14.6%。ETV治疗5年时的耐药率为1.2% (但在随访队列中排除了少数无应答者；治疗3年后ETV用1mg剂量；系基于108例患者的资料)。TDF单药治疗至240周时仍未检测到相关的耐药变异。 二、核苷(酸) 类似物耐药机制及影响因素 (一) 耐药机制 病毒耐药的发生反映病毒为逃逸药物压力而发生的一系列适应性突变，最终导致病毒对药物的敏感性下降。在患者体内HBV的复制效率很高，每天可产生1012~1013个病毒颗粒，较丙型肝炎病毒(HCV) 和人类免疫缺陷病毒(HIV) 分别高10和100倍，HBV聚合酶是一种逆转录酶，缺乏校正能力，其错配率较高，每复制105个碱基对即可产生一个突变。依此推算，患者体内的HBV每天可发生1010~1011位点突变。HBV的基因组全长为3.2kb，如此高的突变率，HBV全基因组的每个位点均可能发生突变。HBV复制的这一特点也决定在同一患者体内的病毒构成并不均一，而是由基因序列存在差异的多种病毒株组成，这些序列不同的病毒群构成了准种(quasispecies)。目前抗病毒治疗的NAs作用靶点均为病毒聚合酶基因，已知与耐药相关的突变均位于HBV聚合酶基因的逆转录酶区(RT 区)，可分为原发耐药突变和继发耐药突变。 (二) 耐药的影响因素 1.病毒因素：包括病毒的复制速度、复制的保真性、基线的HBV DNA载量、准种、预存耐药突变、耐药突变株的适应性和复制空间等。 2.宿主因素: 包括既往抗病毒治疗史、依从性、机体免疫和代谢状况、药物遗传学和宿主的体重等。 3.药物方面：包括药物的耐药基因屏障、抗病毒效力、剂量、化学结构等。