我国溶菌酶的研究与应用进展

我国溶菌酶的研究与应用进展

马正智1　胡国华1　方国生2

(1.上海师范大学工程食品研究所,上海　200234;

2.江苏南通正昊生物科技有限公司,南通　226001)

摘　要:本文对溶菌酶的结构特点、分离纯化、活性测定等研究内容做了综述,并对溶菌酶在我国医药,食品、化工等行业的应用前景进行了概述。

关键词:溶菌酶;分离;活性;应用

中图分类号:TS20112+5 文献标识码:A 文章编号:1006-2513(2007)02-0177-06

The advance s on l ysozy m e re sea rch and

app li ca ti o n i n Chi na

M A Zheng2zh i1　HU Guo2hua1　FANG Guo2sheng2

(1.Shanghai Nor mal University Engineering Food Research I nstitute,Shanghai　200234;

2.J iangsu Nant ong Zhenghao B i ol ogical Technol ogy Co.,L td,Nant ong　226001)

Abstract:I n this paper,the lys ozy me on its structure,is olati on,purificati on and the mensurati on of activity was in2 tr oduced.The app licati on of this enzy me was als o outlined in medical field,food and che m istry industry etc.

Key words:lys ozy me;is olati on;activity;app licati on

溶菌酶(Lys ozy me),又称胞壁质酶、球蛋白G、N-乙酰胞壁质聚糖水解酶。最早对溶菌酶的研究起于N icolle1907年发表的枯草芽孢杆菌中的溶解子,1922年Fle m ing等发现,在人的唾液、眼泪中存在有能够溶解细胞壁杀死细菌的酶,因而被命名为溶菌酶[1]。1965年,英国的菲利普等用X衍射法对溶菌酶进行研究分析,第一个完全弄清了溶菌酶的立体结构[2]。此后人们发现溶菌酶广泛地存在于高等动物组织及分泌物、植物及各种微生物中,其中在新鲜的鸡蛋清中含量最高。

溶菌酶可选择性地分解微生物细胞壁的同时不破坏其它组织,且本身无毒无害,因而它是一种天然的安全性能很好的杀菌剂、防腐剂,将可广泛应用于食品防腐、医药制剂、日用化工等行业。在我国,溶菌酶的应用范围和应用量还比较有限,但可以预计溶菌酶将会是应用于我国食品工业中一种重要的功能性食品添加剂。

1　溶菌酶的结构特点和抗菌作用机制

111　结构特点与复性

大多数鸡蛋清溶菌酶是由129个氨基酸组成的碱性球状蛋白,相对分子量在14000～18000。其等电点可达1017,存在4个二硫键,正常条件下溶菌酶作用的最适温度为45℃～50℃。蛋清溶菌酶在低温干燥下可长期保存,其纯品为白色粉

收稿日期:2006-12-18

作者简介:马正智(1983年-),男,在读硕士研究生,研究方向:功能与复合食品添加剂。

末状结晶,无臭、味甜,易溶于低浓度的食盐水。在碱性条件下易被破坏,但在酸性溶液中其化学性质稳定,热稳定性很强,在pH4～7时, 100℃下处理1m in酶仍保持良好的活性,在pH3时,100℃加热处理45m in仍能保持活性[3]。溶菌酶在水溶液中6215℃下,维持30m in则完全失活,在2015%的乙醇中,在6215℃下维持20m in 而不失活[4]。王玮等[5]研究表明,在一元醇和二元醇溶液中溶菌酶分子的稳定性均随着醇浓度的增大而提高。林翠花等[6]报道,人溶菌酶分子量为14600,由130个氨基酸组成,也存在4个二硫键,其酶活性比鸡蛋清溶菌酶高2倍左右。

在生产或应用溶菌酶时,由于工艺或环境的变化,极易造成酶的变性失活,因此必须采取一定的手段使蛋白复性,减少损失。史晋辉等[7]研究发现,当酶浓度较低时,017mol/L的盐酸胍即可使溶菌酶完全复性。此外,溶菌酶和其它酶具有相似的性质,Karupp iah等[8]研究表明,向复性溶液中加入适量的β-环糊精,可使变性的碳酸脱水酶的复性率达到80%。董晓燕等[9]利用β-环糊精和十六烷基三甲基溴化的联合作用,在适宜盐酸胍浓度下,溶菌酶可完全复性。王彦等[10]利用离子交换色谱法研究发现,当复性缓冲液中不含其它盐类时,脲浓度为210mol/L时复性产率最高,当脲浓度高时,硫酸铵能很好地提高溶菌酶的复性回收率。

112　溶菌酶的抗菌作用机制

目前已知的几种溶菌酶有:内-N-乙酰己糖胺酶、酰胺酶、β-1,3、β-1,6葡聚糖酶和甘露聚糖酶、几丁质酶、磷酸甘露糖酶、脱乙酰壳多糖酶[11]。参与细菌细胞壁溶解作用的溶菌酶大致可分为作用于糖苷键和作用于肽和酰胺部分的两类。内-N-乙酰己糖胺酶、β-1,3、β-1,6葡聚糖酶等主要作用于糖苷键,使糖苷键断裂,破坏细胞壁的分子结构,而酰胺酶等则主要作用于多肽,使多肽断裂。以内-N-乙酰己糖胺酶为例,内-N-乙酰己糖胺酶能够催化水解细胞壁肽聚糖分子中的N-乙酰胞壁酸(NAM)与N-乙酰葡萄糖氨(NAG)之间的β-1,4糖苷键,使肽聚糖分子发生断裂,使细胞壁内外两侧渗透压失衡,造成细胞破裂,导致微生物因细胞壁溶解而被杀死[12]。溶菌酶对革兰氏阳性菌

(G+)细胞与革兰氏阴性菌(G-)的溶菌作用,由于两者细胞壁中肽聚糖含量不同而存在差异, G+细胞壁含80%肽聚糖,而G-细胞壁只有在内壁层含有少量肽聚糖,因此,溶菌酶能有效杀死G+菌,而对G-细胞破坏很小。

2　溶菌酶的分离纯化方法

211　结晶法

结晶法是传统的提取溶菌酶的方法,此方法原料易得,制备过程不是很烦琐。起先Mayer Abraha m等研究并利用此法,于1937年获得结晶状物质[13],1945年A ldert on等提出直接结晶法制备溶菌酶的方法[14]。杨景芝等[15]对传统结晶法做出了改进,通过调整透析液pH值,加入磷酸盐,再调整其pH值,然后离心去除杂质得到纯化液,使产率提高,活性增加。

212　离子交换层析法

离子交换层析法是根据各种蛋白质所带电荷数的不同而与离子交换剂之间结合力的差异,进而将不同蛋白质分离的技术。该法应用于溶菌酶分离始于80年代,由于其操作简便、高效、成本低、可自动化连续操作的优点,一直以来都是溶菌酶生产的常用方法[16]。目前国内外常用的离子交换剂有Duolite-464、724、732弱酸性阳离子交换树脂、D903、201大孔离子交换树脂、羧甲基纤维素(C MC)和羧甲基琼脂糖等[17]。宋宏新等[18]采用724树脂,装柱后抽提液缓慢流入柱中,用缓冲液洗涤,再用硫酸铵洗脱,结果表明724树脂的吸附率达到8315%。由于Duolite-464非常适合于连续自动化操作,因此利用它来分离纯化溶菌酶,可取得较高的产率。如L i Chan 等[19]利用Duolite-464从性质均一的蛋清溶液中分离溶菌酶,使溶菌酶的回收率达90%～95%。

213　亲和层析法

亲和层析法是根据酶与作用底物的特异性亲和能力,利用酶分子独有的专一性结合位点或结构性质的分离方法[20]。它的应用始于上世纪70年代,由于底物可以专一性与溶菌酶结合,进而与其它蛋白分离,是一种高效的分离方法。目前,利用亲和层析法分离溶菌酶的报导很多,如

He LZ等[21]采用多步亲和层析法分离纯化溶菌酶,结果表明,利用三步亲和过滤系统从原料中纯化溶菌酶,与一步法相比产率从61%提高到了96%。214　超滤

超滤是一种新兴分离纯化技术,利用控制超滤膜孔径大小来滤过杂质,水及小分子物质可以通过,从而获取产物。在反渗析及浓缩等工艺中广泛应用,同时在蛋白质分离中应用也开始兴起。与传统生化分离技术相比,它的优点是产品的产出量高、杂质少、纯度相对较高。在2000年,Ghosh R等[22]采用小型的中空纤维超滤系统(30k Da MWCO,聚砜膜)从蛋清干粉中分离溶菌酶,溶菌酶选择性透过膜,而其它大分子蛋白质被膜所截留。溶菌酶的粗提液经过超滤技术后,有时部分杂质如无机离子等未能全部除去,若将超滤与结晶法,或是与离子交换法等结合,将取得精制溶菌酶。邹艳丽等[23]报道,超滤浓缩溶菌酶经C M-Sephar ose FF阳离子交换柱后,纯度提高了2119倍。张灏等[24]研究表明,将磷酸盐缓冲液稀释10倍,在24MPa下均质,利用截留相对分子质量为30000的聚醚砜(PES)膜进行超滤,溶菌酶制品活力达到14610u/mg。

3　溶菌酶活性的测定

目前,国内外对溶菌酶活性的测定方法,主要有比浊法、紫外分光光度法、比色测定法、琼脂火箭糖电泳法和高效液相色谱法等,但上述各种方法中均存在一定的缺点,如比浊法干扰因素多,重复性差,对单个样品测定速度快,比色法操作简单但误差较大[25],因此,各种方法都在不停改进中。传统方法测定溶菌酶活性时要将溶壁微球菌制成冻干粉,此过程不仅步骤烦琐而且易造成细菌大量死亡,影响结果。赵玉萍等[26]向溶壁微球菌直接加保护剂(20%的甘油)置于普通冰箱冷冻,使用时解冻,读第1m in的吸光度值和第2m in的吸光度值即可。使溶菌酶的测定方法更加节约高效,准确性又好。同样,李德海等[27]也采取了类似的方法。而苍金荣等[28]采用聚苯乙烯微量反应板,建立了微量快速比浊检测溶菌酶的方法,使标本用量减少,反应时间缩短,灵敏度较好。近年来,许多报道采用标记乙二醇化几丁和011mol/L、pH值415的醋酸-醋酸钠缓冲溶液作底物,在600n m下来测定吸光度变化的简便方法,也取得了很好的效果。

4　溶菌酶在食品、生物医药等工业中的应用

溶菌酶作为一种天然蛋白质,能在胃肠内被消化和吸收,对人体无毒害作用,是一种安全系数很高的食品保鲜剂、营养保健品和药品。由于溶菌酶具有良好的理化特性,具有一定的保健作用,如在化妆品中用可消除粉刺,使皮肤滑嫩,促进皮肤的新陈代谢;具有止血,促进组织再生的作用,如在牙膏中添加可防止牙龈出血、保护牙龈并具有杀菌作用。因此溶菌酶的应用领域非常广泛,在食品、医药、生物工程等方面都具有很大的应用前景。此外,溶菌酶除作为医药原材料外,仅在食品防腐、强化方面市场就比较可观,如乳制品、肉制品、酒类发酵、水果防腐等方面。随着对溶菌酶的研究的深入和应用产品的不断开发,溶菌酶一旦被人们认识接受,其对市场的占有率将大幅提高。

411　溶菌酶在食品中的应用

41111　溶菌酶在乳制品中的应用

人乳与牛乳的最大差别之一在于溶菌酶的含量,在欧洲溶菌酶已经广泛用于婴儿食品添加剂,将一定量的溶菌酶添加到牛乳及其制品中,使牛乳人乳化[29],能够强化血清灭菌蛋白,γ-球蛋白等防御因子,抑制肠道中腐败性细菌的增殖,增强婴儿对病菌的抵抗力。因此,在牛乳或奶粉中添加一定量溶菌酶,不但防腐,而且强化营养,有利于婴儿健康成长[30]。此外,在奶酪产业溶菌酶也被广泛使用,如在干酪生产中替代硝酸盐,加入01001%的溶菌酶,可防止干酪产气,保持香味物质丁酸[31]。德国于1995年11月22日发布了奶酪法规,批准使用溶菌酶来阻止在半硬奶酪的生产中由厌氧孢子增殖所引起的胀气现象[32]。41112　溶菌酶在肉制品中的应用

低温肉制品由于口感鲜嫩,营养丰富,获得消费者的喜爱。但由于肉类冷藏的温度,并不能彻底杀死微生物或抑制其生长,因而保鲜期短,不能满足消费者需求。溶菌酶本身无毒、无害,可替代如苯甲酸及其钠盐等化学防腐剂添加到肉

制品中,能有效延长食品保质期。如顾仁勇等[33]采用0105%溶菌酶和0105%N isin混合液保鲜猪肉,4℃下可保鲜12d,真空包装保鲜期可达24d。而傅伟昌等[34]在此基础上添加了18%NaCl和415%葡萄糖组成复合保鲜剂,用于小包装分割冷却肉的保鲜,保质期明显提高。同样,曾友明等[35]将溶菌酶与N isin、复合磷酸盐、茶多酚、酪朊酸钠组成复合保鲜剂与鲜肉混合,制成盐水火腿,其保质期可达3个月。同时,溶菌酶在红肠的加工,延长其货架期方面的报道也非常多。总体上溶菌酶在肉制品上的保鲜作用已经得到认可,并且取得了不少的进展,各种相关工作也在广泛展开。

41113　溶菌酶在水果保鲜上的应用

经溶菌酶浸泡过的水果,其表面细菌被有效抑制,在防止烂果、延长水果保鲜期方面有重要意义。如章银良等[36]研究指出,应用复合含溶菌酶0107%、氯化钙015%、甘氨酸115%比例下的保鲜剂对草莓保鲜效果最好。又如吴晓英等[37]在溶菌酶涂膜保鲜杨梅中研究表明,加入溶菌酶的处理组,其烂果率、失重率,分别下降了60%、415%。

41114　溶菌酶在海产品和水产品保鲜上的应用研究采用0105%的溶菌酶、115%甘氨酸和3%的食盐溶液中将海产品或水产品浸渍5m in,沥干水分,常温下保存9d后无异味、无色泽变化。溶菌酶的使用,极大提高了海产品或水产品的保鲜期,对其储存、运输等带来了很大的方便。

41115　溶菌酶在低度酒及饮料中的应用

在低度酒中添加溶菌酶不仅对酒的风味无任何不良影响,还可防止产酸菌生长,是低度酒良好的防腐剂。在日本清酒中大部分微生物不能生存,但有一种叫做火落菌的乳酸菌则能生长,并产酸使酒发臭,添加溶菌酶后火落菌被有效抑制,成功代替水杨酸作防腐剂用于清酒中[38]。倪瑛等[39]报道,向葡萄酒中加入一定量的溶菌酶,

可以大大减少S O

2的使用量,减小了S O

2

使用过

多可能对人体造成的毒害作用。此外,溶菌酶还可以添加到果汁中作为防腐剂使用。

41116　溶菌酶在降解壳聚糖上的应用

天然的壳聚糖广泛存在于虾壳、蟹壳及真菌中,在医学、食品等领域具有重要的应用价值,但由于壳聚糖分子量很大,溶解性差使它的应用受到极大限制。研究表明,低分子量的壳聚糖不仅易吸收,而且具有更强的生物活性[40]。目前,发现溶菌酶在降解天然高分子壳聚糖有着得天独厚的优势。邓倩莹等[41]研究报道,溶菌酶可以大大提高壳聚糖的降解速率,无溶菌酶时,壳聚糖11天降解了19%,而在溶菌酶的作用下,壳聚糖11天降解了44%。

41117　溶菌酶在其它食品中的应用

研究表明,用溶菌酶处理后的酵母,在培养过程中氮核蛋白质的释放量增加,提高了酵母蛋白利用率。面包、蛋糕、饼干等容易腐败变质的食品,在焙烤中添加一定量的溶菌酶,可起到良好的防腐效果。

412　溶菌酶在生物医药上的应用

41211　溶菌酶在基因工程和酶工程上的应用随着生物科学的发展,溶菌酶已成为基因工程及酶工程中必不可少的工具酶,用以制造和提取菌体内的活性物质如核酸、酶及活性多肽等[42]利用其专一性水解细胞壁的特点,有助于人们对细胞壁细微结构的认识,为我们深入研究细胞壁的构造打下了坚实的基础,同时作为是一种重要的破壁酶,在原生质体的制备方面提供了新的方法,因此溶菌酶被广泛应用于生物技术、生物工程中。

41212　溶菌酶在抗菌消炎、增强免疫力方面的应用

溶菌酶对G+、枯草杆菌等有很好的杀灭作用,对大肠杆菌、普通变球菌等G-也具有一定程度溶解。此外,溶菌酶与抗菌素合用效果更佳,因而,溶菌酶广泛应用于医药行业,如利用溶菌酶治疗各种五官科炎症,尤其对急性炎症如急性咽炎、急性喉炎、急性中耳炎等效果明显[43]。

41213　溶菌酶在多种疾病诊断方面的应用戴清源等[40]报道,正常情况下,人体尿液中一般只存在少量溶菌酶,因此测量尿中溶菌酶含量,有助于检测肾小管功能障碍性疾病。同时,烧伤病人分泌的溶菌酶比常人多出几倍,也可在尿液中检出,有助于对手术移植排斥、烧伤严重程度的判断。此外,血清中溶菌酶含量高低对白血病的诊断起辅助作用。1996年O sser man等[44]

首先把血清溶菌酶水平的测定作为白血病分型的依据,提供了诊断急性白血病的新方法。41214　溶菌酶在牙膏、洗手液等产品中的应用溶菌酶广泛应用于牙膏行业和漱口液的生产中,目前在日本已经生产出含有溶菌酶的漱口液和牙膏,研究表明这种产品可有效防治龋齿的发生。同时含有溶菌酶的洗手液也开始在国内生产,如国内某公司生产的洗手液,能有效防止手部细菌的增殖。

5　我国溶菌酶的生产应用现状及前景随着环境的污染日益严重,科学技术的进步和人民生活水平的提高,人们对食品和医药的安全性要求越来越高,许多国家对某些化学防腐剂已限制使用,因此高效、安全、具有天然活性成分的溶菌酶势必倍受人们的关注。

目前,国外对溶菌酶进行了较深入的研究,我国对溶菌酶的研究、应用起步较晚,虽然相继开展了一些有关溶菌酶提取和应用方面的研究工作,但与发达国家相比溶菌酶制造业规模小、设备和生产技术相对落后。当前,国内外主要从蛋清中提取溶菌酶,因为从蛋清中提取溶菌酶,是一项生产相对简单、投资较少、见效快的工程,对于畜产品深加工、综合利用,均有巨大的经济价值。蛋清溶菌酶在国外已于20世纪80年代进入规模化生产,上世纪90年代末以来,已形成近千吨的市场规模,溶菌酶生产厂家主要分布在欧美亚等地。其中丹麦、加拿大占世界市场的一半以上,由于我国生物酶工程研究起步比较晚,我国于20世纪80年代对蛋清溶菌酶技术开始研究,已多次列为国家“863”计划及“十五计划”等的重点科研攻关项目。目前国内已投产的蛋清溶菌酶企业有许多家,全国年产量不足50吨,溶菌酶的生产尤其是高活性的溶菌酶供应还不能满足我国日益增长的需求。

溶菌酶具有特异性,只能抑制某些细菌而不能降解真菌的细胞壁,若在今后食品应用溶菌酶时,还应注意几个事项:首先,要充分了解食品的营养成分、pH、食盐浓度等影响溶菌酶效果的因素以及造成某种食品腐败的主要微生物群体,之前采取相应的预实验确定添加一定量的溶菌酶,才能达到有效的防腐效果。其次,为了更好的发挥溶菌酶防腐作用,可以与其它物质配比使用[46]。如甘氨酸和溶菌酶的配比使用可取得了很好的防腐效果。

近年来天然防腐剂越来越受到食品消费者的青睐,因此开发高效、安全、性能稳定和经济的天然防腐剂已成为国内外一个炙手可热的研究领域,而溶菌酶优良的理化性质恰好符合人们对食品安全性的要求,它将成为新型食品防腐剂中重要一员发挥愈来愈重要的作用。

参考文献

[1]Leheninger AL,Nels on DL,Cox MM.,Princi p les of B i oche m is2

try.2nd Editi on.Ne w York:Worth Publishers.1993:180, 312.

[2]刘仲敏,何伯安.溶菌酶及其在食品工业中的应用[J].食

品与发酵工业,1995,No. 5.

[3]谭斌.酶在食品保鲜中的应用.食品科技,1998(5):32～

33.

[4]王玮,白姝,董晓燕,孙彦.水溶性醇类对溶菌酶空间结构

和折迭过程的影响[J].化工学报,2006,57(1):74～78.

[5]凌关庭等,食品添加剂手册[M],北京,化学工业出版社

(第三版).2003年2月.

[6]林翠花,肖素荣,孟庆国.溶菌酶结构特点及其应用.潍坊

学院学报,2005(2):108～110.

[7]史晋辉,董晓燕,孙彦.盐酸胍浓度对变性溶菌酶复性的影

响[J].生物化学与生物物理学报,2001,33(4):447～451.

[8]Karupp iah D,Shar ma A.B i oche m.B i https://www.sodocs.net/doc/858857184.html,m.,

1995,211:60.

[9]董晓燕,史晋辉,孙彦.β-环糊精促进变性-还原溶菌酶

复性[J].化工学报,2002,53(1):373～377.

[10]王彦,耿信笃.离子交换色谱流动相组成对溶菌酶复性的

影响[J].西北大学学报,2004,30(1):47～51. [11]刘莹,孙荣丹,杨翔华,王丽.溶菌酶的应用现状[J].

饲料工业,2006,27(6):19～20.

[12]叶丹,连宾.溶菌酶及其应用[J].贵州科学,2003年9

月,第2l卷第3期.

[13]黄建安,欧阳建华.溶菌酶制备技术研究进展[J].江苏

食品技术与发酵,2002,2:20～23.

[14]A ldert on G,W ard W,Fevold H.Is olati on of lys ozy me fr om

egg white.[J].B i ol.Che m.,1945,157:43～58.

[15]杨景芝,孙衍华,白吉刚,张杰道,杨国栋,李菡.鸡蛋

清溶菌酶提取工艺的改进[J].食品与发酵工业,2004,

NO5:85～87.

[16]陈慧英,吴晓英,林影.溶菌酶分离纯化方法的研究新进

展[J].广东药学院学报,2003,19(4):356～358. [17]黄建安,欧阳建华.溶菌酶制备技术研究进展[J].江苏

食品技术与发酵,2002,2:20～23.

[18]宋宏新,薛海燕,杨芳,鸡蛋壳溶茵酶分离纯化工艺研究

[J].食品工业科技,2003,9:60～63.

[19]L i chan E,Nakai S,Si m J,et al.L ys ozy me sep rarati on fr om

egg white by cati on exchang column chr omat ography[J].Jour2 nal of f ood science,1986,51(4):1032.

[20]船津胜等编着,溶菌酶,济南,山东科技大学出版社.

[21]He LZ,Sun Y.Purificati on of lys ozy me by multistage affinity

filtrati on[J].B i op r ocess B i osyst Eng,2002,25:155. [22]Ghosh R,Silva SS,Cui ZF.Lys ozy me separati on by holl ow2

fibre ultrafiltrati on[J].B i oche m ical Engi m neering j ournal,

2000,6:19.

[23]邹艳丽,孙谧,王跃军.海洋微生物溶菌酶的纯化与性质

研究[J].生物工程学报,2005,21(3):420～424. [24]张灏,赵玉萍,杨严俊,徐榕榕.超滤法提取蛋清溶菌酶

[J].无锡轻工大学学报,2002,21(6):607～612. [25]洪潇,余若黔.溶菌酶的活性测定方法[J].生物技术通

报,2004,5:40～42.

[26]赵玉萍,张灏,杨严俊.溶菌酶测定方法的改进[J].食

品科技,1:57～58.

[27]李德海,迟玉杰.溶菌酶活力的简易测定[J].中国乳品

工业,2002,30(5).

[28]苍金荣,杨万里,李云璋等.陕西医学检验,1994,9

(1):38.

[29]Huang J.,Nandi S.,W u L.,Yalda D.,Bartley G.,Ro2

driguez R.,Lonnerdal B.,Huang N..Exp ressi on of natural anti m icr obial human lys ozy me in rice grains[J].Molecular2

B reeding,2002(10):83～94.

[30]赵龙飞,徐亚军.鸡蛋清中溶菌酶的应用性研究[J].食

品工业,2006,3:19～20.

[31]徐敬宜,徐永平,刘姝,金礼吉,王宇.溶菌酶及其在食品

工业中的应用[J].食品与机械,2006,22(1):90～92. [32]王燕,车振明.溶菌酶的提取和应用[J].牙膏工业,

2005,3:17～19.[33]顾仁勇,马美湖,付伟昌,王进,洪亮发,彭南山溶菌酶、

N isin、山梨酸钾用于冷却肉保鲜的配比优化[J].食品与

发酵工业,2003,29(7):45～48.

[34]傅伟昌,顾仁勇,马美湖,王进,洪亮发,粟云菊,彭南

山.小包装分割冷却肉保鲜技术研究[J].肉类工业,

2002,3:26～29.

[35]曾友明,马小明,丁泉水,林煜.天然保鲜剂延长低温肉

制品货架期的研究[J].肉类工业,2002,11:21～24. [36]章银良.溶菌酶对草莓的保鲜效果[J].食品工业科技,

1999,21(1):32～33.

[37]吴晓英,陈慧英,林影.溶菌酶涂膜保鲜杨梅[J].食品

科技,2005,26(8):157～158.

[38]赵龙飞,徐亚军.鸡蛋清中溶菌酶的应用性研究[J].食

品工业,2006,3:19～20.

[39]倪瑛,钟立人.溶菌酶在葡萄酒中的应用[J].食品研究

与开发,2003,24(6):162～163.

[40]周桂,黄在银,谭学才,梁致源,周萍.溶菌酶对海洋生

物高分子壳聚糖的降解研究.海洋科学,2002,26(3):

53～56.

[41]邓倩莹,李立华,李毅群,蒋笃孝,周长忍.溶菌酶、过

氧化氢对壳聚糖降解性能的影响[J].化学世界,2005,

6:338～340.

[42]叶丹,连宾.溶菌酶及其应用[J].贵州科学,2003,第

2l卷第3期.

[43]王燕,车振明.溶菌酶的提取和应用[J].山西食品工业,

2005,1:14～16.

[44]戴清源,陈祥贵,李晓霞,张庆.溶菌酶的研究进展[J].

食品科技,2005,2:33～34.

[45]O sser man https://www.sodocs.net/doc/858857184.html, wl or DP.Serum and urinary lys oz me(mu2

ra m idase)in monocytic and monomyel ocytic leukem ia.JExp

Med,1996,124(5):921.

[46]肖怀秋,林亲录,李玉珍,赵谋明.溶菌酶及其在食品工

业中的应用[J].中国食物与营养,2005,2:32～35.

2007年度中国食品添加剂协会主要活动安排活 动时 间地 点

第十一届中国国际食品添加剂和配料展览(F I C2007)2007年3月28～30日上海光大会展中心上海国际展览中心

第十二届日本国际食品配料及食品添加剂展览会及会议(ifia JAP AN2007)2007年5月30日～6月1日日本东京2007年美国食品科技展览会(I FT Food EXP O2007)2007年7月27～29日美国芝加哥南美食品配料展览会(I ngredients and Food Soluti on)2007年9月18～20日巴西圣保罗

2007中国(广州)秋季食品添加剂和配料展览(F I C2007-Autumn)2007年11月7～9日广州进出口商品交易会展馆

俄罗斯国际食品配料展览会(I ngredients Russia2007)2007年12月4～7日俄罗斯莫斯科

溶菌酶

溶菌酶 溶菌酶 溶菌酶( Lysozyme，E．C．3.2.17)，全称为1，4-p -N -溶菌酶，又称为细胞壁溶解酶，是自然界普遍存在的一种酶，因其能溶解细菌细胞壁具有溶菌作用而得名。 （一）溶菌酶的结构及物理化学性质 溶菌酶易溶于水，遇碱易破坏，不溶于丙酮、乙醚，是一种白色、无臭的结晶粉末。相对分子质量为14.7ku，由129个氨基酸残基组成，碱性氨基酸残基及芳香族氨基酸如色氨酸残基的比例很高，含有4个二硫键，如图2 -24所示，其等电点为10~11。在37℃条件下溶菌酶的生物学活性可保持6h，当温度较低时保持时间更长，利于溶菌酶在体内发挥作用。禽蛋蛋清是溶菌酶的重要来源，蛋清溶菌酶的物理化学性质如表17 -1所示。溶菌酶由两个区域组成，由一个长的α螺旋所联接，其二级结构大多是α螺旋。N末端的区域( f40~80)由一些螺旋线组成，大多数是反平行的β折叠。第二个区域由fl~39和f89~129氨基酸残基组成。分子中的这两个区域被一个螺旋体（f87天冬氨酸- 114精氨酸）所分离，分子组成了内部疏水外部亲水的基本结构，对溶菌酶发挥抗菌功能起着巨大的作用。 表17 -1 蛋清溶菌酶的物理化学特性 特性数值 相对分子质量14 400 亚基数 1 氨基酸129 等电点10.7 二硫键数 4 碳水化合物所占比例0 E1%280nm 26.4 93℃时的D热值（每分钟破坏90%的活性）110 酶活力的实验通过浑浊溶壁微球菌的细胞溶解 （二）溶菌酶的来源 溶菌酶在自然界中普遍存在，在人和许多哺乳动物的组织和分泌液中，均发现有溶菌酶存在，其物化性质基本相似，溶菌酶的来源如表17 -2所示。溶菌酶主要分布于禽蛋和鸟类蛋清中，尤其是浓厚蛋白的系带膜状层中。禽蛋中异常丰富，占整个蛋清中的 3.5%，鸡蛋蛋清是溶菌酶的主要商业来源。 表17 -2溶菌酶的来源

溶菌酶应用简介

1. 溶菌酶简介 溶菌酶，又称细胞壁水解酶，广泛存在于高等动植物组织及分泌物、原生动物、昆虫和各种微生物中。1922年Fleming等发现，在人的唾液、眼泪中存在有能够溶解细胞壁杀死细菌的酶，因而被命名为溶菌酶。它能够水解N一乙酰葡萄糖胺与N一乙酰胞壁酸之间的β一1，4糖苷键，因此可以溶解大多数革兰氏阳性菌的细胞壁而具有溶菌作用，溶菌酶本身是一种蛋白质，安全性能高，在食品、医药、生物学中得到了广泛的应用。 2. 溶菌酶的理化性质（可要可不要） 溶菌酶是一种糖苷水解酶，是由129个氨基酸残基组成的小分子碱性球蛋白，相对分子质量为14 300，分子中富含碱性氨基酸和芳香族氨基酸，其多肽链经盘绕折叠形成二级和三级结构，形成一个椭圆形的外形结构， 溶菌酶纯品为白色粉末结晶，无臭、甜味，易溶于水和低浓度的盐溶液，不溶于丙酮、乙醚等有机溶剂。正常条件下溶菌酶作用的最适温度为45--50℃，最适pH为5～7，在低温干燥条件下可长期保存，热稳定性强，耐酸性强，pH为4—7时，100℃下处理45 min仍能保持其酶活性，但在碱性条件下化学性质不稳定，易变性。 3. 溶菌酶的作用 1．抗菌消炎 2．抗病毒：溶菌酶能与带负电荷的病毒蛋白直接作用。与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。 3．增强免疫力：溶菌酶作为机体非特异免疫因子之一，参与机体多种免疫反应，在机体正常防御功能和非特异免疫中，具有保持机体生理平衡的重要作用。 4．其它方面的药理作用：溶菌酶还具有激活血小板的功能。可以改善组织局部血液循环障碍，分泌脓液，增强局部防卫功能，从而体现其止血、消肿等作用。它还可以作为一种宿主抵抗因子，对组织局部起保护作用。 5．促进双歧乳酸杆菌增殖：溶菌酶在婴儿体内可以直接或间接促进婴儿肠道细菌双歧乳酸杆菌的增殖，促进婴儿消化吸收，可以促进人工喂养婴儿肠道细

溶菌酶的研究及应用简介

溶菌酶的研究及应用简介 摘要溶菌酶（lysozyme）是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，又称胞壁质酶（muramidase）。人们对溶菌酶的研究始于20 世纪初，英国细菌学家Fleming在发现青霉素的前6年（1922年）发现人的唾液、眼泪中存在能溶解细菌细胞壁的酶，因其具有溶菌作用，故命名为溶菌酶，其中鸡蛋溶菌酶的研究和应用已相当深入和广泛［1］。通过对它的结构、性质、来源的研究；溶菌酶已广泛的应用于医药、生物工程和食品工业等多个方面。 关键词溶菌酶；结构；应用；研究进展 溶菌酶（Lysozymc EC3.2.1.17）又名胞壁质酶（muramidase）、乙酞胞壁酸聚糖水解酶（N-acctylmuramide glyca-nohydrolase）,广泛地分布于自然界[2]。在病毒（如噬菌体T4）、细菌（如枯草杆菌）、植物（如番木瓜）、动物（如鼠、狗）及人体都含有。人体多数组织器官含有一定浓度的溶菌酶。但以脾、肾含量较高。在鼻及支气管分泌液、泪液、脑脊液、唾液、乳汁及血液中均含有一定量的溶菌酶。此酶自被发现以来,经科学家们不断地研究,使得它在酶学及临床医学中均占有一定的重要位置，也将其应用于医疗、食品、畜牧及生物工程中。 1 溶菌酶的发现 1907年Nicollc[2]猜测芽胞杆菌（Bacillus）及枯草杆菌中含有溶解细菌的酶。1909年https://www.sodocs.net/doc/858857184.html,schtchenko[3]第一个报道了鸡蛋清含有溶解细菌的酶。1922年Alexander Fleming[2]发现鼻粘液里有一种能溶解微球菌（micrococcus

lysodeikticus）及其他细菌的酶，他把这种酶命名为溶菌酶（lysozyme）。经过仔细的观察和研究，他发现此酶广泛地存在于生物组织及机体的某些分泌物中。之后Robert及Wolff 也从鸡蛋清里提取出溶菌酶。1937~1946年间Abraham[3]，Robinson, Alderson及Fevold等人通过实验从而分别获得了溶菌酶的结晶。 2 溶菌酶的理化性质、空间结构 2.1溶菌酶的理化性质 溶菌酶由129个氨基酸构成的单纯碱性球蛋白，在酸性环境下，溶菌酶对热的稳定性很强。当pH值为1.2～11.3围剧烈变化时，但其结构几乎维持不变。当pH值为4～7，96℃热处理15 min仍能保持87%的酶活性；当pH值为3 时能耐100℃加热处理45min；但碱很容易破坏酶活性，当处于碱性pH 值围时，溶菌酶的热稳定性就很差[4]。在干燥条件下，溶菌酶可以长期在室温存放,其纯品为白色或微黄色。黄色的结晶体或无定形粉末，无臭，味甜。易溶于水，易遭碱破坏，不溶于丙酮和乙醚。其分子结构如下: 2.2 空间结构 溶菌酶是第一个结构弄清楚的酶，在很长一段时间中,其中有许多蛋白晶体研究及蛋白质结构与功能关系研究。这些进展都是利用溶菌酶获得的溶菌酶一直

溶菌酶的应用进展

第28卷第6期 V ol 128　N o 16长春师范学院学报(自然科学版)Journal of Changchun N ormal University (Natural Science )2009年12月Dec.2009 溶菌酶的应用进展 丁亦男1,聂洪峰2 (1.长春师范学院生命科学学院,吉林长春　130032; 2.吉林省辽源市第五中学,吉林辽源　136200) [摘　要]介绍了溶菌酶的生物学价值、在各领域中的应用,并对利用溶菌酶时存在的问题进行了分 析,最后对溶菌酶的应用前景进行了展望。 [关键词]溶菌酶;生物学价值;应用;展望 [中图分类号]Q556 [文献标识码]A [文章编号]1008-178X (2009)06-0046-02 [收稿日期]2009-06-09 [作者简介]丁亦男(1982-),女,吉林长春人,长春师范学院生命科学学院助理实验师,硕士研究生,从事动物营养与饲 料科学研究。 溶菌酶(lys ozyme )是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶,又称细胞壁溶解酶(murami -dase ),或N -乙酰胞壁质聚糖水解酶(N -acetyl muramide glycanohydralase )[1]。它是由129个氨基酸残基组成的碱性球蛋白,N -乙酰胞壁酸(NAM )与N -乙酰葡萄糖胺(NAG )之间的β-1,4-糖苷键之间的联结,破坏肽聚糖支架,在内部渗透压的作用下细胞胀裂开,引起细菌裂解。该酶广泛存在于人体多种组织中,鸟类和家禽的蛋清,哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液以及微生物中也含此酶,其中以蛋清含量最为丰富。 1　溶菌酶的生物学价值 111　抗菌消炎　溶菌酶是一种能水解粘多糖的碱性水解酶,此类粘多糖是细菌细胞壁的主要成分之一。该酶能催化水解细胞壁中的N -乙酰胞壁酸和N -乙酰氨基葡萄糖胺之间的β-1,4-糖苷键,使细胞壁不溶性多糖分解成可溶性糖肽,细菌内容物溢出而使细胞壁溶解。溶菌酶能直接水解革兰氏阳性菌,在分泌型免疫球蛋白A 、补体的参与下,还能水解革兰氏阴性菌如大肠杆菌。此外,它还可与各种诱发炎症的酸性物质结合,使其失活,并能增强抗生素和其它药物的疗效,改善组织基质的粘多糖代谢,从而达到消炎、修复组织的目的。 112　抗病毒　溶菌酶能与带负电荷的病毒蛋白直接作用,与DNA 、RNA 、脱辅基蛋白形成复盐,使病毒失活。该酶也可以预防和治疗病毒性肝炎,尤其对输血后肝炎及急性肝炎效果显著。在机体内它还有抗流感病毒的活性,其与胆酸盐的复合物能强烈抑制流感病毒和腺病毒的生长,并能防止疱疹性病毒感染。113　增强免疫力　溶菌酶作为机体非特异性免疫因子之一,参与机体多种免疫反应,在机体正常防御功能和非特异性免疫中,具有保持机体生理平衡的重要作用。实验表明溶菌酶可改善和增强巨嗜细胞吞噬和消化功能,激活白细胞吞噬功能,并能改善细胞抑制剂所导致的白细胞减少,从而增强机体的抵抗力。2　溶菌酶在各领域的应用 211　溶菌酶在饲料工业中的应用　溶菌酶与聚合磷酸盐和甘氨酸等配合使用,具有良好的防腐作用,在饲料中添加溶菌酶可防止霉变,延长饲料的贮存期,减少不必要损耗。溶菌酶与葡萄糖氧化酶一起使用有增效作用,且加入花生四烯酸后抗酸作用更强。此外,溶菌酶与免疫球蛋白在功能上也有着紧密的联系,并能与其它生命活性物质互补增强抗体的活性,从而杀灭细菌,因为溶菌酶对引起仔猪腹泻的埃希大肠杆菌和轮状病毒具有较强的抑制作用[2]。在不用任何抗生素情况下,于饲料中添加饲用溶菌酶制剂,可促进饲料中营养物质的消化吸收,提高增重和饲料报酬,减少死亡。曹江山采用添加了溶菌酶的饲用酶制剂饲喂同一鸡舍的鸡,与对照组相比,产蛋数增加7104%,蛋重增加7106%,产蛋率提高5176%,饲料转化率提高6169%,比对照组增加收入0146元。 212　溶菌酶在食品工业上的应用　溶菌酶可用于水产类熟制品、肉类制品的防腐和保鲜。有人对冷却肉生产中溶菌酶、Nisin 、G ma 液保鲜效果的比较实验表明:当三种保鲜剂单独使用时溶菌酶明显地优于对照组,也显著地优于G ma 组,略优于Nisin 组[3]。溶菌酶还可以用于低温肉制品的保鲜,由湖南农业大学研制的 ? 64?

国内的溶菌酶的应用与发展 陈邱

国内的溶菌酶的应用与发展 溶菌酶,又称胞壁质酶。球蛋白G、N - 乙酰胞壁质聚糖水解酶。最早对溶菌酶的研究起于 N icolle 1907 年发表的枯草芽孢杆菌中的溶解子,1922年 Flem ing等发现,在人的唾液、眼泪中存在有能够溶解细胞壁杀死细菌的酶,因而被命名为溶菌酶 [1] 。1965年,英国的菲利普等用 X衍射法对溶菌酶进行研究分析,第一个完全弄清了溶菌酶的立体结构 [ 2 ]。此后人们发现溶菌酶广泛地存在于高等动物组织及分泌物，植物及各种微生物中,其中在新鲜的鸡蛋清中含量最高。溶菌酶可选择性地分解微生物细胞壁的同时不破坏其它组织,且本身无毒无害,因而它是一种天然的安全性能很好的杀菌剂,防腐剂,将可应用于食品防腐、医药制剂日用化工等行业。在我国,溶菌酶的应用范围和应用量还比较有限,但可以预计，溶菌将会是应用于我国食品工业中一种重要的功能性食品添加剂。 溶菌酶的结构特点和抗菌作用机制结构特点与复杂性 大多数鸡蛋清溶菌酶是由129个氨基酸组成的碱性球状蛋白 ,相对分子量在14000 ～18000。其等电点可达 10 7,存在 4 个二硫键。正常条件下溶菌酶作用的最适温度为45℃～50 ℃。蛋清溶菌酶在低温干燥下可长期保存。其纯品为白色粉末状结晶,无臭、味甜 ,易溶于低浓度的食盐水。在碱性条件下易被破坏,但在酸性溶液中其化学性质稳定,热稳定性很强 ,在 pH4 ～7 时,100℃下处理1m in 酶仍保持良好的活性,在pH3时,100℃加热处理 45m in 仍能保持活性{3}。溶菌酶在水溶液中6215 ℃下,维持30min则完全失活,在2015%

的乙醇中,在 6215 ℃下维持 20m in而不失活[4]。王玮等[5]研究表明。在一元醇和二元醇溶液中溶菌酶分子的稳定性均随着醇浓度的增大而提高。人溶菌酶分子量为14600,由130个氨基酸组成 ,也存在4个二硫键,其酶活性比鸡蛋清溶菌酶高2倍左右。在生产或应用溶菌酶时,由于工艺或环境的变化,极易造成酶的变性失活,因此必须采取一定的手段使蛋白复性，减少损失。史晋辉等[7]研究发现 ,当酶浓度较低时,017mol/L 的盐酸胍即可使溶菌酶完全复性。此外 , 溶菌酶和其它酶具有相似的性质 , Karupp iah等[8]研究表明,向复性溶液中加入适量的β- 环糊精,可使变性的碳酸脱水酶的复性率达到80% 。董晓燕等[9]利用β-环糊精和十六烷基三甲基溴化的联合作用,在适宜盐酸胍浓度下,溶菌酶可完全复性。王彦等利用离子交换色谱法研究发现,当复性缓冲液中不含其它盐类时,脲浓度为 210mol /L时复性产率最高,当脲浓度高时,硫酸铵能很好地提高溶菌酶的复性回收率。 溶菌酶的抗菌作用机制 目前已知的几种溶菌酶有:内- N -乙酰己糖胺酶、酰胺酶β-1,3、β-1,6葡聚糖酶和甘露聚糖酶、几丁质酶、磷酸甘露糖酶脱、乙酰壳多糖酶[11]。参与细菌细胞壁溶解作用的溶菌酶大致可分为作用于糖苷键和作用于肽和酰胺部分的两类。内- N -乙酰己糖胺酶、β- 1, 3、β 1, 6葡聚糖酶等主要作用于糖苷键,使糖苷键断裂,破坏细胞壁的分子结构,而酰胺酶等则主要作用于多肽,使多肽断裂。以内 - N - 乙酰己糖胺酶为例,内- N-乙酰己糖胺酶能够催化水解细胞壁肽聚糖分

溶菌酶

1922年，英国细菌学家Fleming发现人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶，因其具有溶菌用，故命名为溶菌酶。溶菌酶广泛地分布于自然界中，在人的组织及分泌物中可以找到，动物组织中也有，以鸡蛋清中含量最多。其他植物组织及微生物细胞中也存在[1]。它是由动物特定细胞内的核糖体上合成的一种蛋白酶，分泌到细胞外杀死细菌的。它存在于卵清、唾液等生物分泌液中，催化细菌细胞壁肽聚糖N-乙酰氨基葡糖与N-乙酰胞壁酸之间的1，4-β-糖苷键水解的酶。它可以溶解掉细菌的细胞壁，杀死细菌。 由于溶菌酶能够选择性地分解微生物的细胞壁，并且自身没有毒害，因此作为一种天然、安全的杀菌剂和防腐剂，在食品工业、医药制剂、日用化工等行业被普遍重视。随着开发和应用研究的进一步深入，溶菌酶的发展前景将会十分广阔。下面主要陈述溶菌酶的一些基本情况及其在食品工业中的应用。在食品工业中，溶菌酶是无毒的蛋白质，能选择性地使目标微生物细胞壁溶解而使其失去生理活性，而食品中的其他营养成分几乎不会造成任何损失。因此，它可以安全地替代有害人体健康的化学防腐剂(如苯甲酸及其钠盐等)，以达到延长食品货架期的目的，是一种很好的天然防腐剂。现已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐。 1 溶菌酶的分类 溶菌酶按其所作用的微生物不同分两大类，即细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁溶菌酶。真菌细胞壁溶菌酶包括酵母菌细胞壁溶解酶和霉菌细胞壁溶解酶。 1.1 细菌溶菌酶细菌溶菌酶通常可分为三大类：N-乙酰氨基己糖苷酶，它催化水解肽聚糖中糖骨架中的β(1→4)糖苷键；N-乙酰胞壁酰-丙氨酸酰胺酶，它催化裂解肽聚糖中糖基与肽基；内肽酶，它催化裂解肽聚糖肽桥中的肽键。 1.2 真菌溶菌酶真菌溶菌酶主要包括几丁质酶和β-葡聚糖酶。 1.2.1 几丁质酶 虽然一些外几丁质酶(exochitinases；EC3．2．1．30)也表现出抗真菌的特性，但抗真菌的几丁质酶主要是内几丁质酶(endochitinases；EC3．2．1．14)。人们已经研究了许多来自于植物和微生物的几丁质酶，并对有些几丁质酶抑制真菌生长/裂解真菌细胞的作用进行了研究。科学家们首先在植物中发现了几丁质酶的抗真菌作用，这类几丁质酶可以对抗侵入植物体的真菌病原体。微生物几丁质酶主要是由链霉菌属、杆菌和大多数真菌产生的。细菌分泌几丁质酶主要用于真菌细胞壁的降解和重组，但在大多数产几丁质酶的真菌中，此酶主要用于真菌细胞壁的成型过程。只有在一些特定的寄生霉菌中，如Trichodermaharzianum、APhanocladium album和Gliocladium vixens中，胞外几丁质酶和β-葡聚糖酶用来附着和降解目的菌丝。这些抗真菌的几丁质酶与植物几丁质酶相似，多为内几丁质酶。由于肽聚糖和甲壳质的糖骨架具有相似的结构，因此，一些几丁质酶也具有溶菌酶活性。 1.2.2 β-葡聚糖酶 β-葡聚糖酶(β-glucanases；EC 3．2．1．39)具有抗真菌作用主要是因为它能水解β(1→3)糖苷键。研究表明：β(1→3)葡聚糖酶对几丁质降解真菌细胞壁具有显著的协同作用。如将纯化的几丁质酶和β-葡聚糖酶合用，抗灰色葡萄孢(Botrytis cinera)的作用提高了10倍。内葡聚糖酶与外葡聚糖酶、不同内葡聚糖酶间也具有协同抗真菌作用。因为许多植物性食品中含有β-葡聚糖成分，它对维持产品的组织性、黏度和外观都有重要作用，将β-葡聚糖酶加入这类食品，可能会引起不良影响。真菌的细胞壁主要组分为几丁质和β-葡聚糖，但一些真菌和大多数酵母细胞壁含有其他类型的多糖(甘露聚糖、α-葡聚糖和纤维素)，因此，甘露聚糖酶、α-葡聚糖酶也可作为抗真菌的酶类应用于食品工业。 2 溶菌酶的结构

溶菌酶的提纯结晶和活力测定.实验报告doc

溶菌酶的提纯结晶和活力测定 姓名：学号： 班级：指导老师： 一、实验前言 1.实验背景 溶菌酶（lysozyme）是一种能够水解细胞壁成分中N- 乙酰胞壁酸与N- 乙酰葡萄糖胺之间的β- 1，4 糖苷键的酶，被广泛应用于医药、食品工业、生物工程等方面，现从鸡蛋蛋清中提取溶菌酶已达到工业化生产水平。蛋清中的溶菌酶含量越高，酶活力越强，越有利于鸡蛋的保存，因此测定鸡蛋蛋清中的溶菌酶对我国溶菌酶生产、禽蛋产品加工有重要的指导作用，也为蛋品质评定提供了一个重要参数。 活力测定的基本原理是用一种细菌悬液作为基质,加入待测标本后保持一定时间,如样 品中含有溶菌酶则细菌被溶解,即其细胞壁不溶性多糖变成可溶性粘肤。测定方法很多:如平皿测定法、光电比浊法、粘度测定法、分解产物测定法(因为底物往往过量,通常不用底物)、化学滴定法、分光光度法及同位素技术,其中以平皿测定法和比浊法最为常用。 溶菌酶分布很广,而且不是单独存在的,往往是和许多因子共同作用、相互协调。同时,可以直接或间接地通过酶的分解产物而起作用。在这里许多问题正处于摸索阶段,有些方面通过特定的实验,预测其应用。而这些特定的实验往往对某种或某一个动物而言,还有其局限性。未定论的问题很多,许多应用尚未大面积使于临床,但是溶菌酶必将越来越引起人们的重视,特别是其广布于人体,在医药、科研方面的作用尤为重要. (l)抗菌 溶菌酶不但作用于革兰氏阳性细菌,而且它作为一种非特异性免疫,即对所有的病原微 生物都有一定程度的抵抗力,没有特殊的选择性,对身体的自然防御起很大作用.如鼻粘膜,口

腔中含有一些溶菌酶,临床用于治疗副鼻窦炎和龋齿;眼泪和白血球中溶菌酶含量最高,因此在干燥综合症诊断上,认为泪液溶菌酶值的下降可以提供敏感可靠的指标,并能反映泪腺受损程度;在白血病患者的尿中,含有大量溶菌酶,临床上可有效地诊断白血病。白血球中的溶菌酶在脱颗粒过程中被排列到噬菌体内,噬菌体感染宿主(抗原)后,诱导产生溶菌酶(抗体),这种溶菌酶是噬菌体染色体组,通过细胞壁分解酶和膜多糖分解酶的作用而表现,其主要功能一是使噬菌体产生吸附作用,二是使噬菌体向宿主菌体内注入DNA,溶菌酶在噬菌体侵入宿主菌细胞和溶菌的整个过程中都起着重要作用,此溶菌酶(抗体)和补体共同作用,使某些微生物敏感,因此,溶菌酶可能和噬菌体内其他抗微生物系统有协同作用,主要作用是消化细菌,而不是杀死细菌。普遍认为,这种白细胞具有抗肿瘤作用和治疗由细菌、病毒引起的炎症。以上这种抗原—抗体反应也可以在体外进行溶菌反应,即血清学反应,可解析细菌表层结构和作为研究分子生物学的材料,通过它寻找新酶类,也可用做病毒性传染病的诊断。 (2)抗病毒 一方面如流行感冒和腺病毒,可能它的蛋白质外壳具有溶菌酶的作用点,现已证明,腺病毒在人体内引起呼吸道炎症,在实验动物中引起肿瘤。因此,用溶菌酶可以治疗呼吸道疾患,抗动物肿瘤。另一方面溶菌酶作用的细菌产物可诱发产生干扰素,而干扰素主要功能是抗病毒。 (3)提高抗菌素疗效 因为抗菌素是微生物合成的代谢产物,通过抑制细菌细胞壁肤聚糖及核酸和蛋白质的合成,影响细胞膜,因而具有抑制或致死其他微生物的作用。而溶菌酶也作用于细胞膜,与抗菌素合用可提高疗效。 (4)组织修复

溶菌酶溶液配制及应用

溶菌酶溶液 简介： 华越洋溶菌酶溶液是浓度分别为10mg/ml的蛋清型溶菌酶溶液，可以用于下列分子生物学实验： 1.核酸纯化 2.包涵体蛋白纯化 3.质粒DNA纯化 4.几丁质的水解 5.细胞壁的水解 运输及保存： 低温运输，-20℃保存，有效期一年。 ============================================================= 溶菌酶存在于卵清、唾液等生物分泌液中，催化细菌细胞壁肽聚糖N-乙酰氨基葡糖与N-乙酰胞壁酸之间的1，4-β-糖苷键水解的酶。 溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。

用途用于生化研究，临床上用于急慢性咽喉炎、扁平苔癣、扁平疣等疾病的治疗。 生产 以蛋清为原料，在pH6.5条件下用弱酸性阳离子交换树脂732吸附后，再用硫酸铵洗脱，经透析后冷冻干燥得产品。 制备 溶菌酶是采用生物工程技术进行克隆、提取而制取,它是一种天然酶，安全绿色的添加剂，无抗药性。该酶广泛存在于人体多种组织中，鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液以及微生物中也含此酶，其中以蛋清含量最为丰富。从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由18种129个氨基酸残基构成的单一肽链。它富含碱性氨基酸，有4对二硫键维持酶构型，是一种碱性蛋白质，其N端为赖氨酸，C端为亮氨酸。可分解溶壁微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰阳性菌。 优点 1．溶菌酶是很稳定的蛋白质，有较强的抗热性。蛋清溶菌酶是C型，是已知的最耐热的酶；2．溶菌酶不会因为有机溶剂的处理而失活，当转移到水溶液中时，溶菌酶的活力可全部恢复；3．溶菌酶可被冷冻或干燥处理，且活力稳定；4．溶菌酶适宜pH5.3~6.4，可用于低酸性食品防腐；5．溶菌酶生产成本较低；6．溶菌酶的抗菌谱较广，不仅局限于G+ 菌，对部分G­ 菌也有抑制效果；7．溶菌酶作为防腐剂安全性高。溶菌酶是一种天然蛋白质，1992年FAO/WTO 的食品添加剂协会已经认定溶菌酶在食品中应用是安全的。 应用 医学应用 可作为一种具有杀菌作用的天然抗感染物质。有抗菌、抗病毒、止血、消肿止痛及加快组织恢复功能等作用。临床用于慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、口腔溃疡、水痘、带状疱疹和扁平疣等。也可与抗菌药物合用治疗各种细菌和病毒感染。口服和肌注均有效。口服，3～5片/次(肠溶片含10mg)，3次/日。口含，1片/次(口含片含20mg)，4～6次/日。外用：以1%～2%溶液滴注、涂擦或直接喷粉。肌注，50mg～100mg/次，1～2次/日。滴眼：用2%溶液。副作用偶有较轻的过敏反应。氯化溶菌酶医疗效果更广，有浓痰分散、出血抑制、组织修复、消炎镇痛、抗过滤性病毒等作用，因而用氯化溶菌酶的制药有消炎消痔、治感冒、皮肤病及眼、鼻、喉等用药. 食品应用 可作为防腐剂，它的主要功用是水解细菌细胞壁，在细胞内，则对吞噬后的病原菌起破坏作用.该酶对革兰氏阳性菌中的枯草杆菌、耐辐射微球菌有分解作用。对大肠杆菌、普通变形菌和副溶血性弧菌等革兰氏阴性菌也有一定程度溶解作用，其最有效浓度为0.05%。与植酸、聚合磷酸盐、甘氨酸等配合使用，可提高其防腐效果。

浅谈溶菌酶的研究进展

期 引言 英国细菌学家弗莱明最早在人体的唾 液、眼泪等分泌物中发现了溶菌酶，因为它 能溶解细菌，故称为溶菌酶，它的作用机制 是破坏细菌细胞壁肽聚糖层的N-乙酰胞 壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4 糖苷键，使细胞壁破裂，使细菌溶解。溶菌 酶作为安全的抑菌剂已被应用于食品加 工、疾病治疗等方面，需求量大，所以利用 生物技术大量生产迫在眉睫。此外，关于 “淀粉样纤维”形成基于溶菌酶的研究较为 热门，因此本文将从这两方面进行叙述。 1溶菌酶的结构及其与病理学相关 的研究 溶菌酶是蛋白质，具有高级结构，依靠 疏水作用、氢键等次级键折叠形成一定的 构象，发挥特殊功能。目前，人类最了解的 溶菌酶是鸡蛋清溶菌酶(HEWL)，它包含一 条肽链，129个氨基酸。4对半胱氨酸残基 间形成4个二硫键，具有大量的α螺旋结 构。HEWL在体外一定条件的诱导下可以 形成“淀粉样纤维”，研究人员发现PH值较 低时，蛋白质逐渐去折叠，随着去折叠蛋白 质浓度的增大，蛋白质之间的疏水作用加 大，逐渐出现“淀粉样纤维”，具有成核效 应。另外在蛋白质变性剂的存在下，溶菌酶 的二级结构发生变化，可能出现“淀粉样纤 维”，但是不同浓度的变性剂对“淀粉样纤 维”的作用也不同，研究还有待深入。陕西 理工大学白瑜博士利用溶菌酶与朊蛋白结 构上的相似性来研究淀粉样纤维的形成机 制，为神经退行性疾病的研究带来福音[1]。 溶菌酶是一种小分子碱性蛋白，材料 易取，一直被作为一种模型体系，用于研究 蛋白质的空间构象、酶动力学及其与分子 进化、分子免疫间的关系。为优化食品加工 过程、提高食品质量提供理论指导，并为神 经系统等疾病建立了相关蛋白质模型。 目前有研究人员利用溶菌酶为模型 研究盐浓度对蛋白质聚集的影响，对人类 疾病的研究具有重要意义。 2基因工程载体表达溶菌酶的新进展 溶菌酶的用处广泛，但直接从生物体 内提纯效率低，所以其基因的重组和表达 也成为研究热点。鸡溶菌酶的外显子及内 含子序列已经确定，人的溶菌酶基因也逐 渐被解析清楚，为重组表达载体的构建和 优化提供契机。溶菌酶的外源表达包括原 核表达和真核表达，王赞等人通过PCR获 得美洲大鲵i型溶菌酶的基因，并通过构建 原核表达栽体pET28a-pal，诱导表达了美 洲大鲵i型溶菌酶pal蛋白，并通过West- ern-blot和ELISA进行了验证，出现了特异 性条带和免疫反应[2]。李云龙等通过人工合 成奶牛LYZ基因的CDS序列，由于序列较 短，合成片段容易，且保真度较高，所以避 免了RT-PCR中可能会出现的问题，构建 重组表达载体pET32T，PCR克隆筛选出了 阳性菌株，并利用酶切验证成功地构建了 表达载体，SDS-PAGE实验分析重组蛋白 证明已成功实现了溶菌酶大肠杆菌的原核 表达。重组蛋白的表达形式以包涵体的形 式存在，避免了对大肠杆菌的毒性[3]。 考虑到原核表达系统缺少了翻译后修 饰等过程，重组蛋白表达形式为包涵体，其 变性和复性的过程较麻烦，且容易影响蛋 白质的功能，所以目前多使用真核表达系 统，溶菌酶的真核表达体系局限于酵母表 达系统，付世新等人做了牛乳溶菌酶在毕 赤酵母表达方面的分析，他实验已经涉及 了对溶菌酶的基因进行密码子优化，并且 他们进行了牛乳溶菌酶对乳房致病菌的抑 菌分析，实验证明重组牛乳溶菌酶对这些 致病菌均具有抑制作用[4]。宋增健等人利用 NCY-2型毕赤酵母发酵生产溶菌酶，以价 格低廉、营养丰富且稳定性好的麦芽汁为 发酵液，通过探究发酵温度，外加氮源以及 甲醇的添加方式等优化了毕赤酵母的发酵 条件，以期为溶菌酶的工业化生产做出贡 献[5]。黄鹏等人在前人的基础上又做了改 进，他们通过组成型启动子甘油醛三磷酸 脱氢酶（GAP）来代替诱导型醇氧化酶启动 子，获得了高纯度和高活性的rh LysG2，避 免了使用甲醇，因此可以避免碳源间的相 互转化，提高了产量和效率，其中rhLysG2 的酶学性质与普通的C型溶菌酶不同，弥 补了在高渗条件下不能发挥作用的缺陷， 其开发为新型抗耐药菌药物奠定了基础[5]。 根据表达载体的密码子偏好性，以密 码子优化的方法来加强转基因动物的外源 基因表达是新的研究热点。考虑到蛋白质 分泌的“信号假说”，信号肽的翻译和切除 对蛋白的表达也有影响，已有科研人员通 过对信号肽和人溶菌酶基因的整体优化， 在溶菌酶基因的分泌量方面也有所提升。 3结果与展望 溶菌酶是一种结构清楚、化学性质稳 定、来源广泛的酶，已成为一种模式蛋白用 于研究生理条件的变化对于蛋白质结构功 能的影响，并逐渐应用于人类疾病的研究 上。基于基因工程的溶菌酶的生产目前已 有很多报道，通过将强启动子或者增强子 等调控原件与溶菌酶重组，构建新的表达 载体，或利用乳腺等生物反应器的方法来 扩大溶菌酶的生产有待进一步深入研究。 参考文献： [1]本刊编辑部.蛋清溶菌酶作为朊蛋 白错误折叠和淀粉样纤维形成机制的蛋 白模型研究[J].陕 [2]王赟等.美洲大蠊i型溶菌酶的原 核表达及多克隆抗体制备[J].生物技术通 报,2016,32(01):138~143. [3]李云龙等.奶牛溶菌酶基因的构建、 表达及活性研究[J].家畜生态学报,2018,39. [4]付世新等.牛乳溶菌酶在毕赤酵母 中的分泌表达及活性分析[J].中国预防兽 医学报,2010,32(06):428~431+454. [5]宋增健等.基因重组毕赤酵母产蛋 清溶菌酶发酵工艺及表达条件的优化[J].中 国酿造,2018,37(10):20~24. [6]黄鹏等.利用GAP启动子在毕赤 酵母中组成型表达人鹅型溶菌酶2[J].中 国生物工程杂志,2018,38(10):55~63. 浅谈溶菌酶的研究进展 河南师范大学生命科学学院王佳雯 摘要：溶菌酶作为一种天然的抗菌剂，广泛存在于人及哺乳动物等的多种组织器官中，良好的杀菌作用使其成为医疗、食品保鲜界的宠儿，应用广泛，为了高效表达溶菌酶，有关利用基因工程技术构建其基因表达载体的研究较多；鸡卵清溶菌酶的结构研究较为清晰，所以目前将其作为一种模式蛋白研究蛋白质的变性、聚集等特性上的报道较多，具有病理学上的意义。 关键词：溶菌酶；淀粉样纤维；原核表达；真核表达 HEBEINONGJI 62 2019年第8

溶菌酶结晶实验的步骤及其注意事项 (1)

溶菌酶晶体培养实验 获得质量较好的晶体是开展X-射线衍射技术的前提。溶菌酶结晶实验就是要让学生亲自动手实验来获得实实在在的晶体。溶菌酶易于结晶，结晶条件简单，通常被选来作为蛋白晶体入门教学。 原理和方法： 溶菌酶（lysozyme）是由129个氨基酸组成的，分子量为14307Da的较稳定的无毒的碱性球蛋白。 蛋白质结晶通常是利用气相扩散（Vapor Diffusion）的原理来完成：也就是将含有高浓度的蛋白质（5-50mg/ml）溶液加入合适的溶剂，慢慢降低蛋白质的溶解度，使其接近自发性的沉淀状态时，蛋白质分子将整齐的堆积形成晶体，包含纯化蛋白、缓冲液和沉淀剂的小液滴，与大样品池中相似缓冲液和更高浓度的沉淀剂之间形成平衡。起初，蛋白质溶液中的小液滴包含了低浓度的沉淀剂，随着水分的蒸发并转移到大样品池中，沉淀剂浓度也增大到最合适蛋白结晶的水平。当系统处于平衡状态，这种最佳条件就继续维持直至晶体产生。 利用气相扩散原理获得晶体的实验操作方法有两种，分别是：悬滴法和座滴法。此次实验采用的是悬滴法。 下面是模式图：

这次实验所用的为5mg/ml,10mg/ml,20mg/m,30mg/ml的溶菌酶溶液（已经在实验前准备好了）。 池液：A液0%(M/V)的NaCl溶液，pH=4.8 B液30%(M/V)的NaCl溶液，pH=4.8 实验步骤： 1.将16孔板向下轻磕几下，将孔内可能存在的杂物磕出来，并用洗耳球吹几次。 2.向针管中装填真空脂。 3.用针管在16孔板的边缘涂真空脂，确保均匀。 4.向16孔板中的每个孔按照一定的比例加入A液和B液，总体积为300微升， 接着用移液枪将池液吹打混合均和。下附参考的池液混合比例表（也可自行安 排混合比例，标准的生长溶菌酶的条件：20mg/ml的溶菌酶溶液和10%的 NaCl溶液。过高浓度可能会发生沉降，过低浓度可能会生长的晶体太小，但 是作为探究性试验，可以在标准的附近拉一下梯度。） 5.取出一个硅化好的玻璃片，确保光滑面朝上，用洗耳球吹干净其表面。

溶菌酶综述

溶菌酶综述 溶菌酶(Lysozyme，EC3.21.17)又称为胞壁质酶(Murami dase)．化学名称为N一乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-Acety1 muramidi Glrcanohy．dralase)。它于1922年由英国细菌学家费莱明(A，Fleming)在人类的鼻粘液(有的材料为眼泪)中发现的，随后并给它命名为溶菌酶。1963年由乔利斯和坎菲尔德研究了溶菌酶的一级结构。1965年英国菲利普及其同事门用x衍射法解析了溶菌酶，是全世界第一个完全弄清了立体结构的酶，是近代酶化学研究的最太成果之一。它广泛存于鸟类、家禽的蛋清和哺乳动物的眼泪、唾液、血液、鼻涕、尿液、乳汁及组织细胞中(如肝、肾、淋巴组织、肠道等)，从术瓜、芜青、大麦、无花果和卷心菜、萝卜等植物中也分离出溶菌酶，其中，以蛋清中含量为最高．约含0.3％．而人乳、眼泪、唾液中的溶菌酶活性远高于蛋清中的溶菌酶的活力。 溶菌酶是一种碱性球蛋白，其分子由129个氨基酸组成，2200个原子，分子量 14388-18000(14388、14500、18000)，等电点为10.7-11.0，分子内有4个二硫键交联，化学性质非常稳定，对热也极为稳定，Sbaharu等报告牛奶中的溶菌酶分子量为18000，一级结构尚未清楚。人乳中的溶菌酶和a-La的一级结构有74％是相同的。Ⅱ一La是人乳中含量较多的蛋白质。它对于乳腺中乳糖的合成是必不可少的．是乳糖合成酶的辅酶。溶菌酶和d-La在生物学上是同源的，但它们的三级结构有很大的区别。它可溶解许多细菌的细胞膜．使细胞膜的糖蛋白类多糖发生加水分解作用。分子中碱性氨基酸、酰氨残基及芳香族氨基酸较高，如色氨酸的比例较高。酶的活性中心是天门冬氨酸和谷氨酸，溶菌酶通过其肤键中第35位的谷氨酸和第52位的天门冬氨酸构成的活性部位水解破坏组成徽生物细胞壁的N_一乙酰葡萄糖胺与N一乙酰胞壁质酸间的B一(1，4)糖苷键，使菌体细胞壁溶解而起到杀死细菌(尤其是球菌)的目的。 因此，溶菌酶是一种无毒、无害．安全性很高的高盐基蛋白质．且具有一定的保健作用。它不仅能选择性地分解微生物，而且又不作用于其它物质。该酶对革兰氏的枯草杆菌、耐辐射微球菌有强力分解作用，对大肠杆菌、普通变球菌和副溶血性弧菌等革兰氏阴性菌也有一定程度的溶解作用．其最有效浓度为0.05％。其同植酸、聚合磷酸盐、甘氨酸等结合使用，可大大提高其防腐效果。由于溶菌酶对多种微生物有很好地抑菌作用，溶菌酶在食品保藏中的作用引起了广泛的重视，尤其是在日本、加拿大、美国等。 溶菌酶的分类： 溶菌酶的底物特异性很强，不同来源溶菌酶作用的底物不同。按溶菌酶的来源可分为蛋清溶菌酶、动物溶菌酶、植物溶菌酶、微生物溶菌酶和细菌噬菌体溶菌酶。按作用细胞壁不同分为细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁溶菌酶。细菌细胞壁溶菌酶又细分为两种，一种是作用于β-1,4糖苷键的细胞壁溶解酶，另一种是作用于肽链“尾”端和酰胺部分的细胞壁溶解酶。真菌细胞壁溶菌酶包括酵母菌细胞壁溶解酶和霉菌细胞壁溶解酶。溶菌酶大体分为5种：(1)内N-乙酰己糖胺酶，此酶同于鸡蛋清溶菌酶，破坏细菌细胞壁肽聚糖中的β-1,4糖苷键。(2)酰胺酶,切断细菌细胞壁肽聚糖中N-乙酰氨基葡萄糖胺与肽“尾”之间的N乙酰胞壁酸- L-丙氨酸键。(3)内肽酶,使肽“尾”及肽“桥”内的肽键断裂。(4)β-1,3、β-1,6葡聚糖酶和甘露聚糖酶,此酶分解酵母细胞的细胞壁。(5)壳多糖酶,这是分解霉菌细胞壁的一种溶菌酶。 溶菌酶的应用： 溶菌酶作为一种存在于人体正常体液及组织中的非特异性免疫因素，具有多种药理作用，它具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效，目前日本已生产出医用溶菌酶，其适应症为出血、血尿、血痰和鼻炎等。 溶菌酶具有破坏细菌细胞壁结构的功能，以此酶处理G+细菌得到原生质体，因此，溶菌酶是基因工程、细胞工程中细胞融合操作必不可少的工具酶。 溶菌酶是一种无毒、无副作用的蛋白质，又具有一定的溶菌作用，因此可用作食品防腐剂。现已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐；还可以添入乳粉中，使牛乳人乳化，以抑制肠道中腐败微生物的生存，同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖。此外，还能利用溶菌酶生产酵母浸膏和核酸类调味料等。

工程菌人溶菌酶的纯化和性质_叶军

＊ “八五”国家科技攻关项目(No .85-722-05-02) 收稿日期:1997-07-18,修回日期:1997-12-25 工程菌人溶菌酶的纯化和性质＊ 叶　军　钱世钧 (中国科学院微生物研究所　北京　100080) 提　要　将人溶菌酶工程菌株在发酵培养、菌体经超声破碎、变性和复性后所得的粗酶液经Ex press -Ion S 阳离子交换柱层析,得到电泳纯的酶,比活达到48000u /mg 。此酶的最适pH 为6.5;等电点为8.91;对溶壁微球菌的米氏常数K m =0.0311mg /m L ;60℃保温30min ,酶活力剩余48.3%。N 末端氨基酸序列除了第一个M et ,其余4个与预期相符。一些重金属离子对酶的活性影响不尽相同,在0.01mol /L 的浓度下Cu 2+可使该酶完全失活。关键词　重组人溶菌酶,纯化,性质 分类号　Q55　文献标识码A 文章编号　0001-6209(1999)01-0055-59 天然人溶菌酶主要存在于人奶、人胎盘和唾液等中,不易提取,且价格昂贵。而通过人工合成基因,用微生物发酵法生产人溶菌酶将为其在食品、医药等方面的广泛应用提供 有利条件。本实验室已经成功地合成了人溶菌酶基因并构建重组质粒[1～2],在E .coli 中得到了高水平表达[3]。本文在此基础上对该酶进行了纯化,得到SDS -PAGE 纯的酶,并对其性质作了一些研究。 1　材料和方法 1.1　菌种 工程菌株JBP -H LY ,由本课题组构建。1.2　仪器和试剂 Ex press -Ion S 阳离子交换剂、卵清溶菌酶、溶壁微球菌(M icrococcus lysodeikticus )均为Sigma 公司产品。测定等电点的标准蛋白及电泳装置为Pharmacia 公司产品,Ampho -line 为LKB 公司产品。其它试剂均为国产分析纯试剂。1.3　菌体制备、粗酶液的提取及酶活性的测定方法见参考文献[3～4]。1.4　人溶菌酶的纯化 将粗酶液经冷冻干燥浓缩,对0.01moL /L ,pH5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液透析,再通过经上述缓冲液平衡的Express -Ion S 阳离子交换柱,用0～1moL /L NaCl 进行梯度洗脱。收集活性部分的下柱液,用聚乙二醇反透析浓缩,利用SDS -PAGE 检查纯度。1.5　蛋白含量和等电点测定 蛋白含量用Folin -phenol 法测定[5]。等电点测定参照文献[6]进行。 39卷　1期1999年2月微生物学报Acta Microbiologica Sinica Vol .39February No .1 1999 DOI :10.13343/j .cn ki .wsxb .1999.01.009

综述—试论述噬菌体溶菌机制的研究进展

试论述噬菌体溶菌机制的研究进展 姓名：caohaichuan 学号：专业：微生物学 摘要：噬菌体（bacteriophage，简称phage）主要通过抑制宿主细胞细胞壁的合成导致宿主菌溶解及通过溶解酶作用破坏宿主细胞壁，以大肠杆菌单链RNA噬菌体Qβ，真菌线状单链DNA（ssDNA）微小病毒φX174噬菌体和单链DNA噬菌体MS2及大肠杆菌λ噬菌体为例，分别论述噬菌体的两种溶菌机制。λ噬菌体S和R基因分别编码穿孔素（holin）和内溶素（endolysin），形成穿孔素-内溶素（holin-endolysin）系统达到溶解宿主菌的目的。进一步揭示该系统溶解基因的协调作用及相关基因的调控机制。 关键词：噬菌体；溶解酶；细胞壁；穿孔素；内溶素 噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，因部分能引起宿主菌裂解，故称为噬菌体。它在宿主菌内可高效复制,迅速地形成数百个子代噬菌体颗粒,每一个子代颗粒具备相同的侵袭、繁殖能力,重复4个感染周期后,一个噬菌体颗粒可杀灭数10 亿个细菌,这是噬菌体极具特色的一种生物学特性。其溶菌机制主要包括两个方面，一个是通过抑制宿主细胞细胞壁的合成导致宿主菌溶解；另外一个方面是通过溶解酶作用导致宿主细胞壁的破坏。这两个方面都能够有效的进行破坏宿主菌细胞壁的合成，从而达到溶菌的目的。基于噬菌体溶菌机制，在治疗细菌感染、消毒以及反生物武器等领域具有良好应用前景，本文从以下几个方面综述其最新研究进展。

1. 噬菌体溶菌机制的研究 噬菌体包括两种类型，温和噬菌体和烈性噬菌体。其中具有溶菌作用的是烈性噬菌体，亦称毒性噬菌体。噬菌体对其宿主菌的溶解是由专一溶解基因编码的特异性蛋白或噬菌体自身蛋白介导的溶解系统统一完成的，这一溶解系统具有一套完整、精密的调节机制和控制体系，而且其作用基质多集中宿主菌的细胞壁上，噬菌体蛋白通过不同的途径影响和破坏宿主菌胞壁质的生物合成及正常结构，从而导致噬菌体宿主菌细胞损伤、死亡。烈性噬菌体成功吸附宿主菌后，就开始穿入溶菌过程，因其结构和基因控制的不同而显示出不同的溶菌机制。 1.1.通过抑制宿主细胞细胞壁的合成导致宿主菌溶解 该机制实际上是小基因组噬菌体的溶菌机制。缺乏溶壁酶的小基因组噬菌体利用多肽在不同阶段抑制宿主菌的胞壁质合成酶，从而在不同阶段溶解宿主菌。例如大肠杆菌单链RNA噬菌体Qβ没有独立的溶解基因，主要利用衣壳蛋白A2参与宿主菌的溶解。A2蛋白是一种多功能的单拷贝蛋白质, 有吸附性菌毛、保护噬菌体RNA抵抗外部核糖核酸酶( RNA酶)、溶解宿主菌的作用。A2蛋白抑制宿主菌胞壁质生物合成关键步骤的催化剂MurA，通过靶向正常细胞胞壁生物合成途径中的不同阶段的酶而导致新合成的肽聚糖降解，从而逐渐使宿主细胞溶解。 此外，真菌线状单链DNA（ssDNA）微小病毒φX174噬菌体只含有10个基因，其溶菌机制是产生单一的溶解蛋白E。蛋白E由必须基因D

人源溶菌酶在毕赤酵母中的高效表达

人源溶菌酶在毕赤酵母中的高效表达 人溶菌酶(hLYZ)作为一种天然的抑菌活性物质,在畜牧、医药及食品等行业具有潜在的应用价值。但由于制备材料来源有限,产物分离纯化费用高等因 素,hLYZ的应用受到了极大的限制。本论文旨在利用毕赤酵母系统表达具有生物活性且易于纯化的hLYZ,以期降低生产成本解决溶菌酶应用受限的问题。 主要研究内容如下:(1)将α信号肽和hLYZ基因作为整体进行密码子优化,并将其插入pPICZαA空载体,构建重组表达载体pPICZ-OptαF+hLYZ。通过转化筛选,获得一株稳定性较好的重组子K1。K1摇瓶表达发酵液总蛋白浓度为260 mg·L-1,总酶活为12,937 U·mL-1。 在5 L发酵罐中培养K1,细胞密度达到50 g-DCW·L-1开始诱导,甲醇浓度控制于5 g·L-1,最终的总蛋白浓度为1.71 g·L-1,总酶活达到262,152 U·mL-1。 (2)对α信号肽做了进一步的优化处理,新插入39个碱基,构成包含增长的信号肽和hLYZ基因的新序列将其插入pPICZαA空载体,构建得到另一表达载体pPICZ-EhnαF+hLYZ,通过转化筛选获得重组子K4。K4摇瓶表达发酵液总蛋白浓度为320 mg·L-1,总酶活为16,974 U·mL-1,均优于K1。 在5 L发酵罐中采用与K1相同的诱导策略,最终发酵液中的总蛋白浓度可达到2.54 g·L-1,比K1提高48.5%,但总酶活为258,712 U·mL-1,比 K1 略低。 (3)考察了 K4在高细胞密度(～100 g-DCW·L-1)下起始诱导的hLYZ表达性能。进行纯甲醇诱导,并将甲醇浓度控制于5 g·L-1,诱导54 h发酵液中的总蛋白浓度为3.02 g·L-1,但随后发生严重降解,诱导68 h后仅剩2.07 g·L-1。 采用甲醇/山梨醇共混流加策略,优先将甲醇浓度控制于5 g·L-1,不控制溶解氧浓度,诱导68 h总蛋白浓度可达到2.88 g·L-1,未出现明显的蛋白降解现