黄芩苷地提取分离及结构鉴定
黄芩苷的提取分离及结构鉴定
概论
黄芩及其有效成分黄酮类化合物具有广泛的药理活性,除了传统意义上的抗炎、抗变态、抗病毒等生物活性之外,近年来对其抗氧化、抗肿瘤和抗HIV21病毒的研究日趋深入,开发黄芩及其活性成分作为抗血栓、降血压、治疗冠心病和糖尿病以及防治肿瘤和艾滋病药物的前景十分广阔。
目前，国对黄芩苷提取工艺有较多报道，其提取方法主要有温浸法、煎煮法、微波法、超滤法，超声法等，但如何提高黄芩苷收率和纯度一直是实际生产中存在的问题，缺乏对整个工艺条件进行全面研究，因此，有必要对影响黄芩苷提取工艺及其影响因素作一全面探讨。本实验拟对水提酸沉法进行探讨，研究黄芩苷的提取工艺，并对其稳定性进行考察，旨在为生产实践规模提取生产黄芩苷提供理论基础。
一、文献综述
1.1 黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）
基源：唇形科植物黄芩的干燥根。
产地：产于、、、、、、等。
功能主治：味苦、性寒，能清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎。主治温热病、上呼吸道感染、肺热咳嗽、湿热黄胆、肺炎、痢疾、咳血、目赤、胎动不安、高血压、痈肿疖疮等症。
化学成分:含多种黄酮类化合物,主要为黄芩苷,黄芩素,汉黄芩苷,汉黄芩素,黄芩新素Ⅰ,Ⅱ,去甲汉黄芩素,7-甲氧基黄芩素,7-甲氧基去甲基汉黄芩素,等.此外还有挥发油,苯乙醇糖苷类成分等.其成分含量与根的新老及不同炮制方法有关。
临床应用：呼吸道感染、急性扁桃体炎、急性咽炎、肺炎及痢疾等病。
1.2 黄芩苷（Baicalin）
图一黄芩苷分子式
分子式：C
21H
18
O
11
分子量：446.37
熔点：223-225℃
理化性质：本品为淡黄色结晶粉末,易溶于N,N-二甲基甲酰胺、吡啶。微溶于热水、碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠。难溶于甲酸、乙酸、丙酮，几乎不溶于水、乙醚、苯、氯仿等。在植物中以盐的形式存在，含量约4.0%～5.2%黄芩苷为淡黄色晶体，熔点223℃，不溶于水，难溶于甲醇、乙醇、丙酮，可溶于热醋酸，易溶于二甲基甲酰胺、吡啶等碱性溶液。黄芩苷在一定温度和湿度下能酶水解成黄芩素及葡萄糖醛酸。黄芩素分子中具有临三酚羟基，性质不稳定，在空气中易氧化成醌式结构显绿色。所以在储藏、加工炮制及提取过程中应注意防止黄芩苷的酶解、氧化，以减少有效成分的破坏。
药理作用：具有显著的生物活性，具有抑菌、利尿、抗炎、抗变态及解痉作用，并且具有较强的抗癌反应等生理效能。
功能主治：泻实火，除湿热，止血，安胎。治壮热烦渴，肺热咳嗽，湿热泻痢，黄疸，热淋，吐、衄、崩、漏，目赤肿痛，胎动不安，痈肿疔疮。
近年来,国外学者对其进行了大量的研究,且达到了较高的水平。现就近几年来有关黄芩化学成分及药理活性的研究进展做一简要综述。
二、实验
2.1 提取
2.1.1 实验目的
（1）掌握从黄芩中提取、精制黄芩苷的原理、方法及操作要点。
（2）掌握黄芩苷的结构鉴定原理及方法。
（3）为深入研究黄酮类化合物提取纯化提供参考，并为生产实践规模提取生产黄芩苷提供理论基础。
2.1.2 实验原理：
黄芩苷分子中连葡萄糖醛酸，有多个酚羟基、羧基，显酸性，在植物中常以镁盐的形式存在，故能溶于水。但药材含有水解酶，当其与冷水后发生水解而使黄芩苷质量浓度下降，而水解酶在高温下被破坏失活，故用沸水法提取。黄芩苷在热水中溶解度大，在强酸性条件下易析出沉淀，利用此性质，从黄芩中提取粗品黄芩苷。黄芩苷和黄芩素在95％乙醇中溶解度不同，可据此分离二者。
2.1.3 实验试剂及仪器
（1）仪器
电子天平、1000mL三口圆底烧瓶、球形冷凝柱、温度计、铁架台、铁夹、双拧丝、布氏漏斗、抽滤瓶、玻璃棒、250mL/500mL/1000mL/5000mL烧杯各一、250mL/500mL锥形瓶各一、500mL三角具塞瓶，10mL/100mL量筒各一、滴管、PH试纸、滤纸、硅胶CMC-Na 薄层板、展开缸
（2）药品
黄芩饮片200g、镁粉、锌粉、活性炭、5%二氧化锆、2%三氯化铝、35%盐酸、40%氢氧化钠、95%乙醇、2%枸橼酸试剂、冰醋酸、苯、甲酸乙酯、甲酸、正丁醇1%三氯化铝、三氯化铁乙醇试剂、1%黄芩标准品、95%乙醇
（3）设备
粉碎机、电热套、循环水抽滤泵、旋转蒸发仪、紫外分光光度计
2.1.4 分离方法创新之处
黄芩苷是极细的微粒，致抽滤过程中速度很慢，滤液难以流下。在抽滤之前，使用旋转蒸发仪浓缩液体，大大提升抽滤效率。同时液体过多导致黄芩苷难以沉淀，浓缩液体后，使少量溶于液体的黄芩苷析出，提高产率。
2.1.5 自创实验条件
由于回流装置数量不能满足需求，我们使用水煎方法代替第一次回流。电磁炉和不锈钢盆很好地解决了问题，但是因其开口较大，水分蒸发较快，在煎煮过程中需不断补充水分以保持水量的恒定。
2.1.6 实验操作方法及流程
（1）操作方法
①黄芩苷的提取
取黄芩饮片200g，粉碎。加8倍量水，回流1h，用多层纱布过滤。药渣再用6倍
及4倍量的水同法分别回流1h。合并三次滤液，滤液浓缩至适量，加35%盐酸调PH至1~2，80℃水域保温30min，静置，抽滤。
②黄芩苷的精制
沉淀用少量50％、95％乙醇依次洗涤，抽干，滤饼经40℃干燥，粉碎成细粉，即得到精制黄芩苷。计算得率。用于片剂的原料。
（2）流程
图二流程图
2.2 产物鉴定
2.2.1 定性鉴别
（1）盐酸-镁粉反应：取黄芩苷少许置于试管中，以乙醇1ml水域微温振摇溶解，加镁粉适量，滴加浓盐酸数滴，观察现象。
（2）锆-枸橼酸反应：取黄芩苷少许置于试管中，加水2ml置水浴上温热至溶解，加数滴5%二氧化锆溶液，振荡后，观察现象。再加2%枸橼酸试剂，观察现象。
（3）三氧化铝反应：取黄芩苷少许置于试管中，加水2ml置水浴上温热至溶解，加入2%三氧化铝甲醇溶液数滴，溶液产生鲜黄色，在紫外光下观察。
2.2.2 纯度检验
（1）测熔点
用数字熔点仪分别测定黄芩苷粗品和各步精制所得产品的熔点，记录结果
（2）薄层色谱法
吸附剂：硅胶G薄层板
样品：自制黄芩苷乙醇溶液
对照品：标准黄芩苷乙醇溶液
展开剂：乙酸乙酯:甲酸:甲醇:水（7:2:0.5:0.5）
显色剂：1%三氯化铁-乙醇溶液
方法：点样，在展开剂中展开，吹干，喷显色剂，即显色。
2.2.3 结构鉴定
紫外光谱法
样品在紫外条件下得到的紫外光谱图与黄芩苷的标准光谱图进行对比。
三、结果与分析
3.1 结果
3.1.1 产率
黄芩苷提取率＝[精制黄芩苷（g）/黄芩粗粉(g)]%
实验的黄芩苷共计：0.47g
黄芩粗粉：100.0g
提取率：0.47%
3.1.2 定性反应
（1）盐酸-镁粉反应：取黄芩苷少许置于试管中，以乙醇1ml水域微温振摇溶解，加镁粉适量，滴加浓盐酸数滴，溶液产生樱红色。
（2）锆-枸橼酸反应：取黄芩苷少许置于试管中，加水2ml置水浴上温热至溶解，加数滴5%二氧化锆溶液，振荡后，显黄色并有黄绿色荧光。再加2%枸橼酸试剂，黄色和荧光褪去。
（3）三氧化铝反应：取黄芩苷少许置于试管中，加水2ml置水浴上温热至溶解，加入2%三氧化铝甲醇溶液数滴，溶液产生鲜黄色，在紫外光下显黄绿色荧光。
3.1.3 薄层色谱
利用薄层色谱法鉴定实验所得产品的纯度如下图
图三薄层色谱（左边的点为产品，右为标准品）3.1.4 紫外图谱
利用紫外光谱仪测得的紫外数据及图谱如下
图四紫外图谱（一）
图五紫外图谱（二）
图六黄芩苷紫外标准图谱3.2 结果分析
由产量和产率知，我们所得的黄芩苷产率偏低，可能由于粗粉未浸泡，PH调节不合适，也可能是由于在提取分离的过程中，我们多次过滤，使许多产物粘在漏斗和滤纸上，造成损失。
由所薄层显示的颜色及紫外最大吸收波长可知，我们组所得的黄芩苷纯品的纯度较高，因为黄芩苷易溶于热水难溶于酸很适合于水提酸沉这种提取方法，同时在操作过程中我们也注意使其免受其他试剂的污染，在精制时，使用易挥发的无水乙醇，使得其纯度较高。
四、结论
4.1黄芩苷在一定温度和湿度下能酶水解成黄芩素及葡萄糖醛酸。黄芩素分子中具有临三酚羟基，性质不稳定，在空气中易氧化成醌式结构显绿色。所以在储藏及提取过程中应注意防止黄芩苷的酶解、氧化以减少有效成分的破坏。
4.2黄芩苷为葡萄糖醛酸苷,具有弱酸性,其可在碱性溶液中溶解,形成钠盐,而在酸性条件下黄芩苷分子就被还原析出来。利用这一特性可以通过对提取的溶剂的PH值调整以达到较好的提取效果。试验过程中发现,当溶液pH值调节至1时,所得产品量少且为棕黑色,分析可能是强酸使部分黄芩苷水解所致;当溶液pH值为3时,溶液为黄色乳浊液,极难过滤且产品量少,分析原因可能是酸沉不完全,或根据黄芩苷在趋碱性溶液中极不稳定的性质,在pH>3时稳定性也有所下降所致,当溶液pH为2时,所得产品量多且为黄色。因此我们采用了在pH为1～2的条件下使之形成黄芩苷沉淀析出,同时也与溶液中共存的水溶性杂质分离。
4.3 酸沉反应必须在较高的温度下方可顺利进行,在低温条件下非常缓慢。因而黄芩苷滤液加酸后加热保温是非常重要的条件,它会直接影响到黄芩苷的得率。试验过程中,当保温温度为70℃时,得到的粗粉量较少,可能是由于保温温度过低而没有达到黄芩苷充分酸沉的温度;当保温温度为80℃时,酸沉所得的黄芩苷粗粉的量较多;考虑到保温温度过高达到90℃时,可能由于保温温度过高,黄芩苷在此条件下会发生一定程度的水解,因此会导致粗粉中黄芩苷的纯度降低。综合考虑产率以及黄芩苷纯度,我们采用了将溶液加热至80℃后,调节其pH为1～2保温的方法。
4.4 从黄芩中提取黄芩苷使用溶剂提取加酸沉的方法及其改进工艺已较为成熟,而且考虑到生产成本和生产效率,我们在文献方法的基础上选用了水回流提取、酸沉的实验方法,该方法有快速、简便、低成本、易操作、高产率并且对环境无危害等特点。
4.5合理利用实验室所提供的仪器也是很必要的，实验室老师给我们圆底烧瓶规格是
1000ml，这样就不能将所有的黄芩粗粉一次性装入圆底烧瓶进行蒸馏，所以我们分三批进行蒸馏。
五、在所完成实验的基础上提出一个新的研究课题
水提酸沉法提取黄芩苷的工艺优化
具体：液固比对黄芩苷收率的影响
提取时间对黄芩苷收率的影响
加酸时温度对黄芩苷收率的影响
酸沉保温时间对黄芩苷收率的影响
酸沉静置时间对黄芩苷收率的影响
洗涤方法对黄芩苷收率的影响
六、合理化建议
为了避免实验过程中的交叉污染及仪器乱用现象，希望能尽量满足每一组有一套仪器，同时也希望各位实验成员在借用其他组的仪器的时候要告知对方，并及时归还。
七、致
本次实验是在孔阳老师的悉心指导下完成的，非常感这段时间给我们的指导与教诲。您严肃的科学态度，严谨的治学精神，精益求精的工作作风，深深地感染和激励着我，是我们学的榜样！答辩时老师对我们的方案耐心的指导，以及在实验开始前的答疑解惑，让我们对实验更加有把握。在实验期间，老师多次帮助我分析思路，开拓视角，在我遇到困难想放弃的时候给予我最大的支持和鼓励，才使得本实验得以顺利的完成，在此谨向老师表示忠心的感和崇高的敬意。
其次还要感施春阳老师、曾桥老师，两位老师非常的认真、负责。给我们在实验过程中提供各种仪器与试剂，为我们实验的成功做出了很大的努力、提供了很多方便。同时也感和我一组的搭档，正是由于搭档的不断补充完善，才有成型的方案，我才能克服一个一个的困难和疑惑，直至本文的顺利完成。
最后感学校、学院给我们提供这次实验的机会。
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