植物表达载体pCAMBIA230_省略__ros的构建及其在草莓上的验证_金万梅

基金项目：北京市重要农作物转基因技术创新研究(No.KJCX201102003)收稿日期：2013-11-01接受日期：2013-12-23

Online system:https://www.sodocs.net/doc/5f4423708.html,

农业生物技术学报

Journal of Agricultural Biotechnology

2014,22(3):389~396

DOI:10.3969/j.issn.1674-7968.2014.03.015

植物表达载体pCAMBIA2301-del -ros 的构建及其在草莓上的验证

金万梅*王华

北京市农林科学院林业果树研究所，北京100093*通讯作者，jwm0809@https://www.sodocs.net/doc/5f4423708.html,

摘要为了研究多基因互作，减少多次转化的不确定性，本研究在花青素合成调节基因del (delila )和ros

(rosea1)的上下游分别引入CaMV 35S 启动子和nos 终止子，以pBI121-del 和pCAMBIA1301-ros 做中间载体，并利用Bam H Ⅰ和Bgl Ⅱ产生相同4碱基末端的片段，在连接酶的作用下将CaMV 35S 启动子分别驱动的del 和ros 基因构建在同一个植物表达载体pCAMBIA2301上，利用所构建的载体pCAMBIA2301-del -ros 通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens )LBA4404介导的方法转化草莓(Fragaria ananassa Duch.)，并进行PCR 检测，获得转基因草莓。通过组织观察发现，转基因草莓的根和叶的颜色变成红紫色；实时RT-PCR 分析表明，在转基因草莓中花青素合成的结构基因花色素合成酶(anthocyanidinsynthase,ANS )、查尔酮异构酶(chalcone-flavanone isomerase,CHI )、查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS )、二羟黄酮醇-4-还原酶(dihydroflavonol-4-reductase,DFR )、黄烷酮-3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase,F3H )和类黄酮-3-O-葡糖基转移酶(UDP glucose-flavonoid 3-O-glcosyl-transferase,UFGT )在转基因株系中的表达均上调，这也进一步证实通过该方法构建的植物表达载体pCAMBIA2301-del -ros 可以用来转化植物。本研究结果表明，植物表达载体pCAMBIA2301-del -ros 成功构建，为多基因植物表达载体的构建提供了一种思路，也为在植物体内同时研究多个基因的互作提供借鉴。关键词植物表达载体，构建，草莓，转基因

Construction of Plant Expression Vector pCAMBIA2301-del -ros and Genetic Transformation in Strawberry(Fragaria ananassa Duch.)

JIN Wan-Mei *WANG Hua

Institute of Forestry and Pomology,Beijing Academy of Agriculture and Forestry Science,Beijing 100093,China *Corresponding author,jwm0809@https://www.sodocs.net/doc/5f4423708.html,

Abstract In order to study multi-gene interaction and reduce the blindness of many transformation,CaMV

35S promoter and nos terminator were added into gene del and ros upstream and downstream,respectively.del and ros genes can regulate anthocyanin synthesis.Intermediate vector pBI121-del and pCAMBIA1301-ros were constructed.Bam H Ⅰand BglⅡproduced the same end tetra-nucleotide segments.The CaMV 35S promoter separately driven del and ros genes were constructed in plant expression vector pCAMBIA2301under ligase.Strawberries(Fragaria ananassa Duch.)were treated by the constructed vector pCAMBIA2301-del -ros via Agrobacterium tumefaciens LBA4404mediated transformation method.Transgenic strawberry lines were screened by PCR analysis.Observed by organizations,the roots and leaves of transgenic strawberry

lines

became

reddish

purple.

The

expression

of

anthocyanin biosynthetic

genes

anthocyanidinsynthase(ANS ),

chalcone-flavanone

isomerase(CHI ),

flavanone

3-hydroxylase(F3H

),

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Journal of Agricultural Biotechnology

0引言

pCAMBIA系列载体是植物基因工程中最常用的植物双元表达载体之一(巩元勇等,2013)。pCAMBIA2301载体在GUS基因的上下游均有酶切位点，并且在CaMV35S的上游有一个多克隆位点(multiple cloning site,MCS)，这种结构比较利于改造；另外在细菌和植物转化时所用的选择标记都是卡那霉素(kanamycin)(Chauhan,Khurana,2011)。基于这点pCAMBIA2301在植物基因功能研究中，尤其是在双子叶植物研究中是一个非常有用的植物表达载体。

花青素(anthocyanin)是一类存在于草莓(Fragaria ananassa Duch.)、葡萄(Vitis vinifera L.)、苹果(Malus domestica Borkh.)等植物中的次生代谢物质，决定着花、种子和果实的颜色(Akifumi et al., 2008；Doshi et al.,2006)。另外，花青素可以对人体的许多疾病如癌症、心血管疾病和神经性疾病等起防御作用(Butelli et al.,2008)。

有关植物花青素合成已有很多研究，苯丙氨酸是花青素生物合成的直接前体，花青素属于类黄酮化合物，其基本结构是2-苯基苯丙呋喃。苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶、酸-4-羟化酶和CoA连接酶的作用下，生成香豆酰CoA，在苯丙氨酸解氨酶催化的基础上产生香豆醇、松柏醇、芥子醇及其他亚类的植物酚类物质，香豆酰CoA在查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)、查尔酮异构酶(chalcone-flavanone isomerase,CHI)、黄烷酮-3-羟化酶(flavanone3-hydroxylase,F3H)的催化下产生二氢黄酮醇，二氢黄酮醇有3条路径，最终在F3H、二羟黄酮醇-4-还原酶(dihydroflavonol-4-reductase, DFR)的催化下生成无色花青素，在花色素合成酶(anthocyanidinsynthase,ANS)、类黄酮-3-O-葡糖基转移酶(UDP glucose-flavonoid3-O-glcosyl-transferase,UFGT)作用下将无色花青素转变成蓝紫色或砖红色的葡糖苷(Quattrocchio et al.,1993；Butelli et al.,2008;Chiu,Li,2012)。

在花青素的生物合成中，一个结构基因的作用是有限的，因为花青素表达水平的提高需要整个生物合成路径结构基因都要高效表达；相比较而言，一两个调节基因就会影响整个花青素的合成(Quattrocchio et al.,1993)。转录因子是重要的调节基因，MYC或MYB类转录因子影响花青素合成调控，可以显著提高紫色花青素的含量。Delila(del)基因是MYC类的转录因子，是一个编码螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)的转录因子，其作用是调节花青素合成的结构基因的转录水平(Mooneyet al.,1995)。Rosea1(ros)基因是一个编码MYB类相关的转录因子，ros控制着花的紫色，对结构基因的调节作用显著(Schwinn et al.,2006)。del和ros二者互作，使紫色花青素结构酶基因高水平转录，从而使紫色花青素水平大大提高(Mathews et al.,2003;Butelli et al.,2008)。Maligeppagol等(2013)从金鱼草(Antirrhinum majus L.)中克隆了del和ros基因，将其构建在由果实专一性启动子驱动的载体上，利用根癌农杆菌介导的方法转化了番茄(Solanum lycopersicum L.)，获得了转基因番茄；与野生型对照相比，转基因番茄在成熟果实中积累了更多的花青素，而花青素丰富的番茄果实对其生命周期中的许多病害具有抵抗作用。

草莓是蔷薇科草莓属多年生草本植物，是一种世界各国广泛栽培的经济作物。我国草莓种植总面积已达到10多万hm2，成为世界草莓生产和消费第一大国。草莓是双子叶植物，对卡那霉素很敏感。草莓体内存在一条完整的花青素合成路径，采用转录因子的调控手段，将来自金鱼草的花青素调控基因del和ros一起转入草莓中，研究多个调节基因如何影响花青素的。一般情况下要研究del和ros基因互作，需要对这两个基因分别进行转化，费时而且工作量很大。本研究将这两个基因构建在同一个植物表达载体上，然后进行遗传转化，可以一次性将两个基因同时导入到植物中，为多基因改良植物材料提供便利。

dihydroflavonol-4-reductase(DFR)and UDP glucose-flavonoid3-O-glcosyl-transferase(UFGT)were all enhanced in transgenic strawberry plant.The results were further confirmed that the plant expression vector pCAMBIA2301-del-ros could be used to transform plants.Construction of plant expression vector pCAMBIA2301-del-ros can provides a good idea for constructing a multi-gene plant expression vector and a method for studying interaction of multiple genes.

Keywords Plant expression vector,Construction,Strawberry,Genetic transformation

390

表1

载体构建与分子检测分析所需引物Table 1

Primers used for vectors construction and molecular analysis

基因

Genes del ros

CaMV35S nos actin ANS CHI CHS DFR F3H UFGT

引物序列(5'~3')Primers

CCGGATCCATGGCTACTGGTATCCA CGAGCTCTCAAGACTTCATAGTAAC TCCATGGATGGAAAAGAATTGTCGTGG TGGTAACCTTAATTTCCAATTTGTTG CGGTACCAGATTAGCCTTTTCAATTTC CAGATCTGATCTAGTAACATAGATGAC GTCGGTGACGAGGCTCAATC CTCATTGTAGAAGGTGTGAT CATCCATTGGTTCAAGAGTC TTCCTTCAAATCCTCCCTAC GACTTTGAGATTCCGAGTGC CCCATTGTCCATTGCTAAGA GAGAAGTTAGAAGCCACGAG GATACACTGTGAAGCACGAC CAACTCTTGTAATCGGTCCT TGTGATGAACAGATGTAGCG TGTGACCTACTTCTCATACCC CAATGCCTCCTTCTCTAAAC CAGATGGGACTAATGCTACC GTTTGTCAAGCCACGATAAG GenBank 登陆号Accession number M84913.1DQ275529.1AF485783.1AB116565.1AY695817.1AB437286.1AY997297.1AY695812.1AB201760.1AY575056.1

引物用途

Primer functions

基因克隆和载体构建

Gene clone and vector construction 基因克隆和载体构建

Gene clone and vector construction 载体构建

Vector construction 实时定量RT-PCR Real-time RT-PCR 实时定量RT-PCR Real-time RT-PCR 实时定量RT-PCR Real-time RT-PCR 实时定量RT-PCR Real-time RT-PCR 实时定量RT-PCR Real-time RT-PCR 实时定量RT-PCR Real-time RT-PCR 实时定量RT-PCR Real-time RT-PCR

扩增引物序列划线部分为添加的内切酶位点序列：Bam H Ⅰ，CGGATCC ；SacⅠ，GAGCTC ；KnpⅠ，GGTACC ；BglⅡ，AGATCT ；NcoⅠ，CCATGG ；Bst E Ⅱ，GGTAACC 。actin ，ANS ：花色素合成酶，CHI ：查尔酮异构酶，CHS ：查尔酮合酶，DFR ：二羟黄酮醇-4-还原酶，F3H ：黄烷酮-3-羟化酶，UFGT ：类黄酮-3-O-葡糖基转移酶，均为实时荧光定量RT-PCR 分析的基因Sequences under lines are restriction endonucleases:Bam H Ⅰ,CGGATCC;SacⅠ,GAGCTC;KnpⅠ,GGTACC;BglⅡ,AGATCT;Nco Ⅰ,CCATGG ;Bst E Ⅱ,GGTAACC.ANS :Anthocyanidinsynthase,CHI :chalcone-flavanone isomerase,CHS :chalcone synthase,DFR :dihydroflavonol-4-reductase,F3H :flavanone 3-hydroxylase,UFGT :UDP glucose-flavonoid 3-O-glcosyl-transferase,These genes are used for qRT-PCR analysis

1

材料与方法

1.1

材料

本研究所用的大肠杆菌(Escherichia coli )感受态细胞DH5a 购自鼎国生物公司，植物表达载体pBI121、pCAMBIA1301和pCAMBIA2301以及根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens )感受态细胞LBA4404均由本实验室保存；所需各类限制性内切酶、连接酶、高保真Taq DNA 聚合酶、反转录cDNA 合成试剂盒和质粒DNA 提取试剂盒购自大连宝生物工程公司；植物RNA 提取试剂盒购自华越洋生物公司；植物DNA 提取试剂盒购自Biomiga(美国)；胶回收试剂盒购自BBI(加拿大)。实时荧光定量PCR 反应的SYBgreen 试剂购自Bio-Rad(美国)。

构建及分子鉴定所需的各类引物由上海生工

合成(表1)。花青素合成相关的两个重要调节基因del 和ros 基因从金鱼草(Antirrhinum majus L.)紫色花器官中克隆得到。研究用植物材料草莓(Fragaria ananassa Duch.)哈尼采自本单位国家草莓资源圃。遗传转化过程中所使用的培养基主要有再生培养基M1(MS +6-BA 3.0mg /L +2,4-D 0.1mg /L)，分化培养基M2(MS +6-BA 3.0mg /L +2,4-D 0.1mg /L+头孢霉素400mg /L +卡那霉素5mg /L)，继代培养基M3(MS +6-BA 0.2mg /L +IBA 0.1mg /L)，生根培养基M4(1/2MS +IBA 0.2mg /L)。

PCR 扩增仪为PTC100(MJ Research,美国)，荧光定量PCR 仪为CFX96(Bio-Rrad)。1.2

方法

1.2.1基因del 和ros 克隆

参考金鱼草del 基因(GenBank 登录号:M84913.1)

植物表达载体pCAMBIA2301-del -ros 的构建及其在草莓上的验证

Construction of Plant Expression Vector pCAMBIA2301-del -ros and Genetic Transformation in Strawberry

391

农业生物技术学报

Journal of Agricultural Biotechnology

nos

terminator

NcoⅠ

Bst E Ⅱ(708)

pT-ros 3721bp

ros Hin d Ⅱ

35S promoter

gus nos terminator

Bst E Ⅱ(708)NeoⅠpCAMBLIA1301

11837bp

35S promoter

NeoⅠBst E Ⅱ(708)

pCAMBLIA1301-ros

10987bp

11

1

和ros 基因(GenBank 登录号:DQ275529.1)序列设计引物(表1)，用RNA 提取试剂盒分离金鱼草紫色花器官的RNA ，用反转录试剂盒对RNA 进行cDNA 合成。PCR 扩增方体系为取反转录cDNA 合成产物1μL 作为模板，

20μL 反应体系中含有：模板(50ng)1μL ，

10×缓冲液2μL ，Mg 2+2μL ，dNTPs 1μL ，引物(10pmol/L)各2μL ，

高保真Taq 酶1U ，以ddH 2O 补足体积。PCR 反应条件：94℃预变性5min ；92℃30s ，56℃40s ，72℃30s ，35个循环；72℃10min 。扩增结果在1.2%琼脂糖凝胶上电泳检查，对清晰条带进行胶回收。得到花青素合成相关的两个重要调节基因del 和ros 。1.2.2

表达载体pCAMBIA2301-del -ros 构建第一步，载体T-35S-del -nos 构建

在花青素调控基因del 两端引入Bam H Ⅰ和SacⅠ酶切位点，将扩增得到的del 基因插入到质粒pBI121中，通过PCR 加上KnpⅠ和Bg1Ⅱ，然后连接到T 载体上，示意图见图1。

第二步，pCAMBIA1301-ros 表达载体的构建在花青素调控基因ros 两端引入NcoⅠ和Bst E

Ⅱ酶切位点，将ros 基因的片段插入，得到CaMV 35S 驱动的ros 基因表达载体pCAMBIA1301-ros ，示意图见图2。

第三步，pCAMBIA2301-del -ros 表达载体的构建将质粒pCAMBIA2301用Hin d Ⅲ和Bst E Ⅱ酶切，将35s-ros 插入到pCAMBIA2301的Hin d Ⅲ和Bst E Ⅱ位点之间，得到pCAMBIA2301-35s-ros 表达载体，将片段35s-del -nos 插入到pCAMBIA2301-35s-ros 的Bam H Ⅰ和BglⅡ位点上，获得Kan 基因为筛选标记CaMV 35S 分别启动的del 、ros 基因表达载体pCAMBIA2301-del -ros ，示意图见图3。1.2.3

根癌农杆菌介导的叶盘法对草莓的遗传转化

将pCAMBIA2301-del -ros 转化根癌农杆菌菌株LBA4404感受态细胞，获得携带外源目标基因的根癌农杆菌LBA4404，并用此转化植物。

草莓品种哈尼取自本单位国家草莓种质资源圃。取当年生匍匐茎，剥取0.2~0.5mm 大小的茎尖进行培养，建立试管苗无性繁殖系(金万梅等,2007)。

采用叶盘法对草莓进行遗传转化。取继代25~30d 的无菌苗叶片，剪成3~5mm 2的叶盘作为外植体。携带目标基因的根癌农杆菌LBA4404，在28℃下在用含100mg /L 卡那霉素的LB 液体培养基中培养携带目标基因的根癌农杆菌LBA440416h ，备用。将叶盘放在上述含有携带载体pCAMBIA2301-del -ros 的根癌农杆菌的培养物中5

图1

载体T -35S -del -nos 构建

Figure 1

Construction of vector T -35S -del -nos

Bam H Ⅰ

1

del

SacⅠ

pT-del

4962bp

Hin d Ⅱ

35S promoter

Bam H Ⅰgus SacⅠ

nos terminator

Eco R ⅠpBI12114758bp

35S promoter

Bam H Ⅰdel SacⅠ

nos terminator

Eco R ⅠpBI121-del 14758

11

1

KnpⅠ

Bg1Ⅱ

T-35s-del -nos

5986

图2

pCAMBIA1301-ros 表达载体构建

Figure 2Construction of expression vector pCAM ?BIA1301-ros

392

min ，然后将叶盘接种在于再生培养基M1上，在黑暗条件下培养1d ；然后转接在含400mg /L 头孢霉素和5mg /L 卡那霉素的再生培养基M2上，在温度(25±1)℃、光周期为16h 光照/8h 黑暗、光照强度为30μmo/m·s 的条件下培养30d ，可获得小芽；小芽在M3培养基上经过30d 的培养，进一步生长为3~5cm 植株。

1.2.4草莓转化植株的鉴定

取转化株系和野生型对照的新鲜叶片，放入研钵中，立即加入液氮研磨，植物基因组DNA 提取试剂盒提取植物总DNA ，PCR 扩增鉴定del 和ros 基因。PCR 反应体系(20μL)：模板DNA 3.5μL ，其余混合液16.5μL (1.5mmol/L MgCl 2,1×U Taq DNA 聚合酶,200μmol/L dNTP,1Taq polymerase buffer,1pmol/L 引物)。PCR 扩增程序：94℃预变性5min ；92℃30s ，50℃40s ，72℃30s ，35个循环；72℃10min 。扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶上EB 染色检测，紫外灯下观察照相。

转基因材料的组织观察，将转基因材料和对照

接种在同一种继代培养基M3上，1个月后观察转基因植株和对照植株的根、叶正面和叶背面。1.2.5

花青素相关结构基因的表达

以M3上培养生长1个月的转基因与野生型对照叶片为材料，使用RNA 提取试剂盒分离RNA ，反转录试剂盒对RNA 进行cDNA 合成。荧光定量PCR 反应体系参考说明书，10μL 的体系中含cDNA 合成产物(50ng)1μL ，7μL mix buffer ，上下游引物(10pmol/L)各1μL 。花青素合成相关结构基因的引物见表1。反应程序，95℃预变性3min ；95℃5s ，60℃10s ，40个循环。每个反应重复3次。实验数据以Actin 基因作为内参基因，熔解温度作为阈值，使用CFX96荧光定量数据管理软件进行分析。

2

结果与分析

2.1

基因del 和ros 获得

由图4可知，PCR 扩增产物电泳出现大小与参

图3pCAMBIA2301-del -ros 表达载体构建

Figure 3

Construction of plant expression vector pCAMBIA2301-del -ros

LB npt Ⅱ35S promoter

Bam H Ⅰ

KnpⅠHin d Ⅱ

NcoⅠgus

Bst E Ⅱnos terminator

RB 35S promoter pCAMBIA2301

11633bp

Hin d Ⅱ

NcoⅠ

Bst E Ⅱ

nos terminator

35S promoter ros

LB

npt Ⅱ35S promoter

Bam H ⅠKnpⅠ

NcoⅠ

Bst E Ⅱ

nos terminator RB 35S promoter

ros

Bg1Ⅱ

KnpⅠLB npt Ⅱ

35S promoter

Bam H ⅠⅡ

NcoⅠ

Bst E Ⅱnos terminator RB

35S promoter ros

nos terminator del

nos terminator pCAMBIA1301-ros

10987bp

pCAMBIA2301

10238bp

T-35s-del -nos 5986bp

pCAMBIA2301-del -nos

13654bp

11111

植物表达载体pCAMBIA2301-del -ros 的构建及其在草莓上的验证

Construction of Plant Expression Vector pCAMBIA2301-del -ros and Genetic Transformation in Strawberry

393

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Journal of Agricultural Biotechnology 考序列大小一致的条带，测序结果正确。说明已从金鱼草紫色花中成功克隆到del 和ros 基因。2.2植物表达载体pCAMBIA2301-del -ros 的构建

通过在del 基因上下游分别引入Bam H Ⅰ和Sac Ⅰ酶切位点，完成了CaMV 35S 驱动del 基因的pBI121-del 载体构建。在ros 基因两端引入Nco Ⅰ和Bst E Ⅱ酶切位点，完成了CaMV 35S 驱动ros 基因的pCAMBIA1301-ros 载体构建。通过利用pCAMBIA2301的多克隆位点，将CaMV 35S-ros -nos 序列连接到pCAMBIA2301；将CaMV 35S-del -nos 序列连接到pCAMBIA2301上，酶切鉴定正确(图5)，完成了pCAMBIA2301-del -ros 表达载体的构建。2.3转化草莓的获得

草莓叶盘外植体经农杆菌侵染后，在M2培养

基上培养2周后，开始有抗性愈伤组织的出现，愈伤组织质地致密，呈淡绿色。非抗性愈伤组织颜色发暗，在培养过程中逐渐褐化死亡。抗性愈伤组织在选择培养基上生长正常，逐渐长大。4周后，从部分愈伤组织上分化出绿色的不定芽(图6A)。将转化芽接种在继代培养基中，待其长到3~4cm 时，转入生根培养基M4中，大部分抗性芽能够诱导生根，长成完整植株。由于外源基因主要调节花青素合成，通过对这些转基因材料各组织器官的观察发现，转基因材料与对照材料相比，转基因草莓的根、叶片的颜色比非转基因材料要更红更紫一些(图6B 、C 和D)。2.4

转化草莓的分子鉴定

对获得的抗性植株，经过继代培养增殖后，以

图6

转化草莓抗性芽和转del 和ros 基因的草莓与对照的比较

Figure 6Kanamycin resistance shoots of transformed

strawberry and contrast characters in transgenic plant and control

A ：转化草莓的抗性芽，转基因材料携带卡那霉素抗性标记基因，可以在附加卡那霉素的培养基上正常生长；

B ：转基因草莓(T)和对照草莓植株(CK)，转基因材料的根和叶背面出现明显紫红色；

C ：转基因草莓(上)和对照草莓(下)叶片正面呈现绿色；

D ：转基因草莓(上)呈现紫红色，而对照草莓(下)叶片背面依然是绿色

A:Kanamycin resistance shoots of transformed strawberry

grow normally because of having npt Ⅱgene;B:Transgenic strawberry (T)are more purple than control (CK);C:Adaxial leaves from transgenic strawberry (upper)and adaxial leaves from control (lower)are green;D:Abaxial leaves from trans-genic strawberry (upper)are purple and and abaxial leaves from control (lower)are green

T

CK

200015001000700400200100

bp M

1

2

A

5000bp M

1

2

300020001500800500

B

图4

花青素合成调节基因del 和ros 的克隆

Figure 4

Genes del and ros were cloned

A ：从金鱼草cDNA 中克隆获得ros 基因。M ：DNA 分子标准；1和2：ros 基因。

B ：从金鱼草cDNA 中克隆获得del 基因。M ：DNA 分子标准；1和2：del 基因。下同

A:ros gene from cDNA of Antirrhinum majus .M:DNA mark-

er;1and 2:ros gene.B:del gene from cDNA of Antirrhinum majus .M:DNA marker;1and 2:del gene.The same

below

M

1

2

ros 5000

30001500600400200bp

A

500030001500600400200

bp 1

2

M

del

B

图5

植物表达载体pCAMBIA2301-del -ros 的酶切验证

Figure 5

Plant expression vector pCAMBIA2301-del -ros

confirmed by restriction endonuclease

A ：酶切pCAMBIA2301-del -ros 验证ros 基因；

B ：酶切pCAM-BIA2301-del -ros 验证del 基因

A:Restriction endonuclease confirmed ros gene from pCAM-BIA2301-del -ros ;B;Restriction endonuclease confirmed del gene from pCAMBIA2301-del -ros

394

叶片为材料，提取基因组DNA ，经PCR 扩增检测外源基因片段，同时以农杆菌质粒pCAMBIA2301-del -ros 为阳性对照，以野生型为阴性对照。共对26个株系进行了检测，其中19个株系的DNA 经扩增后产生了与阳性对照相同的特异扩增带，而且这些转基因株系中两个目标基因都存在，del 基因片段大小约为1900bp(图7A)，ros 基因大小约为700bp (图7B)，与阳性对照大小一致。以上结果表明，外源基因已整合进草莓基因组中。2.5

花青素相关结构基因的表达

由图8可知，用Actin 基因做参考，花青素合成的结构基因ANS ，CHI ，CHS ，DFR ，F3H 和UFGT 在转基因株系中的表达均上调，其中CHI 基因的表达水平达到3.51倍之多；DFR 的表达水平也是比较高的，达到正常表达水平的2.49倍；F3H 和UFGT 表达水平分别为1.63和1.57倍；而ANS 和CHS 基因表达虽然有所上调，但表达水平仅为1.31和1.46倍。而在野生型对照中各结构基因的表达基本稳定在正常表达水平上。由此可证实，花青素调节基因del 和ros 确实具有调节花青素合成相关结构基因的表达水平。

3讨论

选择合适的植物表达载体对研究基因在植物

中的表达或功能尤为重要。pCAMBIA 系列载体是植物基因工程中最常用的植物双元表达载体之

一。植物表达载体中的筛选标记基因有卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、除草剂抗性基因等。双子叶植物一般对卡那霉素比较敏感，可以选择具有该抗性的植物表达载体如pCAMBIA2301等。而单子叶植物一般对潮霉素敏感，可以选择潮霉素抗性基因的植物表达载体，如pCAMBIA1301等。有时为了便于田间应用，可以选择除草剂抗性基因的植物表达载体。本研究选择pCAMBIA2301作为植物表达载体进行构建，在构建过程中，并不是所有载体都有合适的内切酶可以利用，解决的办法，一方面采用PCR 添加内切酶位点的方法，另一方面采用不同内切酶可以切出相同末端核苷酸序列的方法，最终将del 和ros 两个基因构建在pCAMBIA2301。

Akifumi 等(2008)在研究葡萄MYB 类基因时发现，其对葡萄花青素的合成起调节作用；Zhou 等(2008)将拟南芥(Arabidopsis thaliana )PAP1基因/MYB 转入烟草中，结果发现，转基因烟草的愈伤组织中的花青素含量比对照高，而且光照、氮素营养以及生长素等均影响转基因烟草中的花青素含量，证实该基因调节花青素的合成。del 编码基本的helix-loop-helix 转录因子，ros 属于MYB 类转录因子，del 和ros 二者互作，使紫色花青素结构酶基因高水平转录，从而显著提高紫色花青素生物合成水平(Mathews et al.,2003;Butelli et al.,2008)。Butelli 等(2008)用番茄果实专一性启动子E8分别驱动del 和ros 基因，构建植物表达载体，利用叶盘法转化番茄，这两个转录因子相互作用可以诱导花

7000

1500

bp 1

2

3

4

5

6

7

8

9

M

A

bp 1

2

3

4

56

7

8

9

M

700

B

图7

转化草莓的分子鉴定

Figure 7

Molecular analysis of transgenic strawberry lines

A ：PCR 检测del 基因。M ：

DNAmarker 。1：阳性对照；2~8：阳性材料；9：阴性对照；B ：PCR 检测ros 基因。M ：

DNAmarker ；1：阳性对照；2~8：阳性材料；9：阴性对照

A:PCR analysis del gene of transgenic lines.M:DNA marker;1:Positive;2~8:Independent transgenic strawberry lines;9:Wild-type as negative control;B:PCR analysis ros gene of trans-genic lines.M:DNA marker;1:Positive;2~8:Independent transgenic strawberry lines;9:Wild-type as negative control

基因表达量

G e n e e x p r e s s i o n l e v e l

ANS

CHI

CHS

DFR F3H UFGT

转基因株系Transgenic line

对照CK

1234

图8草莓中花青素合成结构基因ANS 、CHI 、CHS 、DFR 、

F3H 和UFGT 的表达Figure 8

The expression of anthocyanin biosynthetic

genes ANS ,CHI ,F3H ,DFR and UFGT in strawberry plant

内参基因：Actin ；n =3Reference gene:Actin ;n =3

植物表达载体pCAMBIA2301-del -ros 的构建及其在草莓上的验证

Construction of Plant Expression Vector pCAMBIA2301-del -ros and Genetic Transformation in Strawberry

395

农业生物技术学报

Journal of Agricultural Biotechnology

青素的生物合成水平，获得了4个转基因株系，转基因材料的遗传稳定性在后代中也没有丢失，其中获得高表达花青素的番茄株系，其果实颜色为紫色。由于使用了组织特异性启动子，del/ros的转基因番茄在生长和发育阶段与对照没有差异，茎杆和叶片也没有异常，花青素的含量积累与对照相比并不高。转基因番茄的果实开始发育与对照相比并无异常，只是在果实发育绿熟期后期转基因果实的颜色快速变深，而且果肉的颜色也与果皮颜色一致。另外还发现，del/ros的转基因番茄具有延长货架期的作用(Zhang et al.,2013)。在本研究中，在CaMV35S启动子驱动下利用del和ros基因的互作，结果发现，其具有调节转基因草莓中的花青素的作用，转基因草莓的根、叶等组织明显变红变紫。del和ros基因如何调控花青素的结构基因，目前正在进一步研究。

4结论

本研究通过酶切连接的方法在花青素合成调节基因del和ros的上下游分别引入CaMV35S启动子和nos终止子，构建了植物表达载体pCAMBIA2301-del-ros通过根癌农杆菌LBA4404介导的方法，利用叶盘法转化草莓，PCR检测，获得转基因草莓，通过组织观察发现转基因草莓的根、叶的颜色变成红紫色。实时RT-PCR分析表明，在转基因草莓中花青素合成的结构基因ANS、CHI、CHS、DFR、F3H和UFGT在转基因株系中的表达均上调。该研究为多基因植物表达载体的构建提供了一种思路，也为植物花青素改良提供借鉴。

参考文献

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(责任编辑靳晓霞)

396

pCambia1391Z 植物表达载体

北京华越洋?生物?首页关于我们新闻中?心产品展?示在线留?言加?入我们 联系我们 pCambia1391Z pCambia1391Z 产品编号载体名称北京华越洋?生物VECT0010 pCambia1391Z pCambia 1391Z 载体基本信息 出品公司:Cambia 载体名称: pCambia1391Z, pCambia 1391Z 质粒类型: 植物表达载体?高拷贝/低拷贝:低拷贝启动?子:CAMV 35S 克隆?方法 :多克隆位点，限制性内切酶 载体?大?小: 11227 bp 5' 测序引物及序列:M13-F: TGTAAAACGACGGCCAGT 3' 测序引物及序列 : M13-R: CAGGAAACAGCTATGAC 载体标签: GusA 载体抗性: 卡那和潮霉素筛选标记: HPTII 详情产品分类 ?生化试剂 精细化学品 中间体/标准品 病理实验试剂 其他关键词：　 热线电话：400-818-1148150  1148  1284

备注:-- 产品?目录号:1391Z 稳定性:稳定表达 组成型:?非组成型 病毒/?非病毒:?非病毒 pCambia 1391Z载体质粒图谱和多克隆位点信息 pCambia 1391Z载体序列 LOCUS pCAMBIA1391Z 11227 bp ds-DNA circular SYN DEFINITION Agrobacterium binary vector for plant transformation, with hygromycin- and kanamycin-resistance and LacZ-GUS genes plus the pUC9 MCS. ACCESSION AF234312 VERSION . KEYWORDS pCAMBIA1391Z SOURCE synthetic DNA construct ORGANISM synthetic DNA construct REFERENCE 1 (bases 1 to 11227) AUTHORS Cambia TITLE Direct Submission JOURNAL Exported from SnapGene Viewer COMMENT The GenBank record was corrected by inserting a G at position 4743. FEATURES Location/Qualifiers

叶绿体表达载体--如何构建载体

如何构建载体 1 启动子的选用和改造 外源基因表达量不足往往是得不到理想的转基因植物的重要原因。由于启动子在决定基因表达方面起关键作用，因此，选择合适的植物启动子和改进其活性是增强外源基因表达首先要考虑的问题。 目前在植物表达载体中广泛应用的启动子是组成型启动子，例如，绝大多数双子叶转基因植物均使用CaMV35S启动子，单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和来自水稻的Actinl启动子。在这些组成型表达启动子的控制下，外源基因在转基因植物的所有部位和所有的发育阶段都会表达。然而，外源基因在受体植物内持续、高效的表达不但造成浪费，往往还会引起植物的形态发生改变，影响植物的生长发育。为了使外源基因在植物体内有效发挥作用，同时又可减少对植物的不利影响，目前人们对特异表达启动子的研究和应用越来越重视。已发现的特异性启动子主要包括器官特异性启动子和诱导特异性启动子。例如，种子特异性启动子、果实特异性启动子、叶肉细胞特异性启动子、根特异性启动子、损伤诱导特异性启动子、化学诱导特异性启动子、光诱导特异性启动子、热激诱导特异性启动子等。这些特异性启动子的克隆和应用为在植物中特异性地表达外源基因奠定了基础。例如，瑞士CIBA-GEIGY公司使用PR-IA启动子控制转基因烟草中Bt毒蛋白基因的表达，由于该启动子可受水杨酸及其衍生物诱导，通过喷酒廉价、无公害的化学物质，诱导抗虫基因在虫害重发生季节表达，显然是一个十分有效的途径。 在植物转基因研究中，使用天然的启动子往往不能取得令人满意的结果，尤其是在进行特异表达和诱导表达时，表达水平大多不够理想。对现有启动子进行改造，构建复合式启动子将是十分重要的途径。例如，Ni等人将章鱼碱合成酶基因启动子的转录激活区与甘露碱合成酶基因启动子构成了复合启动子，GUS表达结果表示：改造后的启动子活性比35S启动子明显提高。吴瑞等人将操作诱导型的PI-II基因启动子与水稻Actinl基因内含子1进行组合，新型启动子的表达活性提高了近10倍（专利）。在植物基因工程研究中，这些人工组建的启动子发挥了重要作用。 2 增强翻译效率 为了增强外源基因的翻译效率，构建载体时一般要对基因进行修饰，主要考虑三方面内容：2.1添加5｀-3｀-非翻译序列 许多实验已经发现，真核基因的5｀-3｀-非翻译序列（UTR）对基因的正常表达是非常必要的，该区段的缺失常会导致mRNA的稳定性和翻译水平显著下降。例如，在烟草花叶病毒（TMV）的126kDa蛋白基因翻译起始位点上游，有一个由68bp核苷酸组成的Ω元件，这一元件为核糖体提供了新的结合位点，能使Gus基因的翻译活性提高数十倍。目前已有许多载体中外源基因的5｀-端添加了Ω翻译增强序列。Ingelbrecht等曾对多种基因的3｀-端序列进行过研究，发现章鱼碱合成酶基因的3｀-端序列能使NPTII基因的瞬间表达提高20倍以上。另外，不同基因的3｀-端序列增进基因表达的效率有所不同，例如，rbcS3｀-端序列对基因表达的促进作用比查尔酮合酶基因的3｀-端序列高60倍。 2.2 优化起始密码周边序列 虽然起始密码子在生物界是通用的，然而，从不同生物来源的基因各有其特殊的起始密码周边序列。例如，植物起始密码子周边序列的典型特征是AACCAUGC,动物起始密码子周边序列为CACCAUG，原核生物的则与二者差别较大。Kozak详细研究过起始密码子ATG周边碱基定点突变后对转录和翻译所造成的影响，并总结出在真核生物中，起始密码子周边序列为ACCATGG时转录和翻译效率最高，特别是-3位的A对翻译效率非常重要。该序列被后人称

几种新型植物基因表达载体的构建方法

几种新型植物基因表达载体的构建方法 摘要:利用基因工程技术手段研究基因功能过程中，构建基因表达载体处于转基因植物的主导地位，采用合适的构建方法会使实验效果事半功倍。植物基因表达载体的构建方法除了传统构建法、Gateway 技术、三段T-DNA 法、一步克隆法等，还有近年来出现的几种新型的载体构建方法：基于竞争性连接原理快速构建小片段基因表达载体；Micro RNA 前体PCR 置换法适用于构建小分子RNA 表达载体；重组融合PCR 法特别适用于插入片段中含有较多限制性酶切位点的载体构建；利用In-Fusion 试剂盒可以将任何目的片段插入一个线性化载体的某个区域；构建多片段复杂载体可采用不依赖序列和连接的克隆方法(Sequence and ligation-independent cloning, SLIC) 法；Gibson 等温拼接法。本文将在总结分析前人工作的基础上，分析这6种新方法的特点，期望通过这几种新的方法给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。 关键词: Micro RNA 前体PCR 置换法，In-Fusion 试剂盒法，重组融合PCR 法，Gibson 等温拼接法，Golden Gate 拼接法 基因克隆、载体构建是植物功能基因组研究中的常规步骤[ 1 ]。而载体构建是基因工程和分子生物学研究中常用的基础技术。随着植物基因工程技术的发展，适合于不同研究目的各种载体系统应运而生，其中在转基因植物中最常用的是质粒载体。传统的载体构建方法在进行构建多片段拼接的复杂载体时，需要精心选择酶切位点[ 2 ]，有时还需要构建多个中间载体，操作比较麻烦，费时费力，因此寻找简单、高效、快捷的载体构建方法具有重要的现实意义。从1969 年Arber 等发现了限制性内切酶，载体的构建方法逐步发展，从传统构建方法到

植物表达载体 Pcambia1302 序列图谱

载体质粒图谱和多克隆位点信息 载体简介 载体序列 LOCUS AF234298 10549 bp DNA circular SYN 24-APR-2000 DEFINITION Binary vector pCAMBIA-1302, complete sequence. ACCESSION AF234298 VERSION AF234298.1 GI:7638073

KEYWORDS . SOURCE Binary vector pCAMBIA-1302 ORGANISM Binary vector pCAMBIA-1302 other sequences; artificial sequences; vectors. REFERENCE 1 (sites) AUTHORS Hajdukiewicz,P., Svab,Z. and Maliga,P. TITLE The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation JOURNAL Plant Mol. Biol. 25 (6), 989-994 (1994) PUBMED 7919218 REFERENCE 2 (bases 1 to 10549) AUTHORS Roberts,C., Rajagopal,S., Smith,L.M., Nguyen,T.A., Yang,W., Nugrohu,S., Ravi,K.S., Vijayachandra,K., Harcourt,R.L., Dransfield,L., Desamero,N., Slamet,I., Hadjukiewicz,P., Svab,Z., Maliga,P., Mayer,J.E., Keese,P.K., Kilian,A. and Jefferson,R.A. TITLE A comprehensive set of modular vectors for advanced manipulations and efficient transformation of plants JOURNAL Unpublished REMARK Full description of constructs REFERENCE 3 (bases 1 to 10549) AUTHORS Roberts,C., Rajagopal,S., Smith,L.M., Nguyen,T.A., Yang,W., Nugrohu,S., Ravi,K.S., Vijayachandra,K., Harcourt,R.L., Dransfield,L., Desamero,N., Slamet,I., Hadjukiewicz,P., Svab,Z., Maliga,P., Mayer,J.E., Keese,P.K., Kilian,A. and Jefferson,R.A. TITLE Direct Submission

植物细菌诱导型表达载体的构建

收稿日期:2006-11-01 基金项目:广东省科技攻关项目(2002A2070402,2006B20101011);广东省自然科学基金资助项目(5011730). 作者简介:曾骥(1983— ),男,湖南湘潭人,湛江师范学院助理研究员,从事植物基因工程研究.3通讯作者 2006年12月第27卷第6期湛江师范学院学报JOURNA L OF ZH AN J I ANG NORM A L C O LLEGE Dec 1,2006Vol 127　No 16 植物细菌诱导型表达载体的构建 曾　骥1,黄真池23,刘　媛2,黄永莲2 (1.湛江师范学院自然科学与技术研究中心,广东湛江524048;2.湛江师范学院生命科学与技术学院,广东,湛江524048) 摘　要:根据G enBank 中细菌诱导型启动子的碱基序列设计一对引物,通过PCR 扩增出启动子PPP3 (AF469483,220bp ).经分子操作将启动子和质粒pUC18连接后转化E .coli DH5 α,经蓝白筛选和PCR 检测筛选阳性菌落,测序结果与G enebank 中的碱基序列完全相同.对扩增到的PPP3片段和含目的基因(hrap 或p flp )的pBI121质 粒进行双酶切,分别回收PPP3片段和含目的基因的pBI121大片段,连接后转化E .coli DH5 α,通过卡那霉素抗性筛选和PCR 检测,表明细菌诱导型启动子和目的基因已正确连接.用重组质粒转化农杆菌,经卡那霉素抗性筛选和PCR 检测,证明植物细菌诱导型表达载体构建成功. 关键词:细菌诱导型启动子;hrap ;p flp ;植物细菌诱导型表达载体 中图分类号:Q946 文献标识码:A 文章编号:1006-4702(2006)06-0071-04 目前,世界上已经报道的植物细菌性病害有500多种,对农林业生产造成了巨大损失[1] .传统育种方法虽然能利用作物本身或亲缘种的抗性基因选育抗病品种,但存在着可利用的抗性品种资源少,选育时间长,耗资大等缺点;施用化学药剂来防治细菌病害并非完全有效,而且污染环境.近年来植物基因工程技术的不断发展以及对植物和病原物相互作用的深入了解使得将外源抗性基因导入植物来提高抗病性成为一条有效途径.通过转基因技术可以打破传统育种中的种间不亲和现象,消除杂交障碍,极大地拓宽了抗性基因的来源和应用.目前利用基因工程技术提高作物抗病性的研究主要集中在阻碍病原菌间的信号交流,通过RNA 干涉抑制病原菌关键致病基因的表达,转入无毒基因或无毒基因簇,利用强启动子或转录因子促进抗病相关 基因的表达等来提高植物抗病力[2-5].但实践证明,抗性基因的高效表达虽然提高了植物的抗病力,但由于 外源基因在植物体内的持久的高水平表达,植株会因能量过多耗损、而生长缓慢、畸变,甚至死亡[1,4-6].为了 避免这些不足,在转基因中使用诱导型启动子是理想的基因工程策略. 病原微生物侵染植物后,通常会引起植物体内活性氧的爆发,进而诱发超敏反应.超敏反应是一种快速 的局部组织坏死,从而阻止病原物的传播、扩散[7-9].据一系列文献报道,从甜椒中克隆到的p flp 基因能改变 植物细胞中活性氧的水平,hrap 基因能协助一些超敏反应激发子增强超敏反应,而两种基因同时表达可以 大大提高植物的抗病力[10-11].彭建令等[12-13]报道从烟草中克隆到3个细菌诱导型启动子PPP1、PPP2、PPP3, 这些启动子受亲和性病原细菌(青枯菌)、水杨酸、超敏反应激发子harpin 等的诱导.本研究试图构建诱导型启动子和p flp 基因或hrap 基因相连的植物表达载体,期望在转基因植物的生长过程中,病原微生物侵染可作为诱导信号,作用于诱导型启动子引发p flp 基因或hrap 基因的表达从而增强抗病能力.1　材料和方法 1.1　材料

pCambia35s-ECFP植物表达载体

pCambia35s--‐ECFP 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT1010 pCambia35s--‐ECFP pCambia35s--‐ECFP载体基本信息 出品公司: --‐--‐ 载体名称: pcambia35s--‐ECFP 质粒类型: 植物双元表达载体 高拷贝/低拷贝: --‐--‐ 启动子: --‐--‐ 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: --‐--‐ 5' 测序引物及序列: --‐--‐ 3' 测序引物及序列: --‐--‐ 载体标签: ECFP 载体抗性: --‐--‐ 筛选标记: --‐--‐ 备注: --‐--‐ 产品目录号: --‐--‐ 稳定性: --‐--‐ 组成型: --‐--‐ 病毒/非病毒: --‐--‐ 其他植物载体质粒： pBI101 pDF15 pBI121 pEarleyGate 100 pBI221 pEarleyGate 101 pBI221--‐GFP pEarleyGate 102 pBin19 pEarleyGate 103 pBINPLUS pEarleyGate 104 pCambia0105.1R pEarleyGate 201 pCambia0305.1 pEarleyGate 202 pCambia0305.2 pEarleyGate 203 pCambia0380 pEarleyGate 204 pCambia0390 pEarleyGate 205 pCambia1105.1 pEarleyGate 301 pCambia1105.1R pEarleyGate 302 pCambia1200 pEarleyGate 303 pCambia1201 pEarleyGate 304 pCambia1281Z pFGC5941 pCambia1291Z pGA643 pCambia1300 pGreen

表达载体的构建方法及步骤

表达载体的构建方法及步骤 一、载体的选择及如何阅读质粒图谱 目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。一个合格质粒的组成要素： （1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而 真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。 （2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ （3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 （4）P/E 启动子/增强子 （5）Terms 终止信号 （6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目 的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点： 【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。【2】.载体的类型： （1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质粒。（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。

（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。 综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求： （1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载 体）； （2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。 （3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； （4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。 无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA 进行切割，获得线性载体分子，以便于与目的基因片段进行连接。 如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori 的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 （1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活

pCambia1291Z植物表达载体

pCambia1291Z VECT0110 pCambia1291Z pCambia 1291Z : Cambia : pCambia1291Z, p Cambia 1291Z : /: : CAMV 35S : : 11379 b p 5' : M13-F: T GTAAAACGACGGCCAGT 3' : M13-R: C AGGAAACAGCTATGAC : GusA : : HPTII : -- : 1291Z : : /: pCambia 1291Z

pCambia 1291Z LOCUS pCAMBIA1291Z 11379 b p d s-DNA circular S YN DEFINITION Agrobacterium b inary v ector f or p lant t ransformation, w ith hygromycin- a nd c hloramphenicol-resistance a nd L acZ-GUS g enes plus the p UC9 M CS. ACCESSION AF234295 VERSION . KEYWORDS pCAMBIA1291Z SOURCE synthetic D NA c onstruct ORGANISM synthetic D NA c onstruct COMMENT This f ile i s c reated b y V ector N TI COMMENT The G enBank r ecord w as c orrected b y i nserting a G a t p osition 4743. FEATURES Location/Qualifiers source 1..11379 /organism="synthetic D NA c onstruct" /lab_host="Plant C ells" /mol_type="other D NA" CDS join(2..16,207..2024)

几种新型植物基因表达载体的构建方法

几种新型植物基因表达载体的构建方法 文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-

几种新型植物基因表达载体的构建方法 摘要:利用基因工程技术手段研究基因功能过程中，构建基因表达载 体处于转基因植物的主导地位，采用合适的构建方法会使实验效果事半 功倍。植物基因表达载体的构建方法除了传统构建法、Gateway 技术、 三段T-DNA 法、一步克隆法等，还有近年来出现的几种新型的载体构建 方法：基于竞争性连接原理快速构建小片段基因表达载体；Micro RNA 前体 PCR 置换法适用于构建小分子 RNA 表达载体；重组融合 PCR 法特 别适用于插入片段中含有较多限制性酶切位点的载体构建；利用 In-Fusion 试剂盒可以将任何目的片段插入一个线性化载体的某个区域；构建多片段复杂载体可采用不依赖序列和连 接的克隆方法 (Sequence and ligation-independent cloning, SLIC) 法；Gibson 等温拼接法。本文将在总结分析前人工作的基础 上，分析这 6种新方法的特点，期望通过这几种新的方法给植物基因工 程表达载体的构建提供新的思路。 关键词: Micro RNA 前体 PCR 置换法，In-Fusion 试剂盒法，重组融合PCR 法，Gibson 等温拼接法，Golden Gate 拼接法 基因克隆、载体构建是植物功能基因组研究中的常规步骤[ 1 ]。而载 体构建是基因工程和分子生物学研究中常用的基础技术。随着植物基因 工程技术的发展，适合于不同研究目的各种载体系统应运而生，其中在 转基因植物中最常用的是质粒载体。传统的载体构建方法在进行构建多 片段拼接的复杂载体时，需要精心选择酶切位点[ 2 ]，有时还需要构建多 个中间载体，操作比较麻烦，费时费力，因此寻找简单、高效、快捷的

植物乳杆菌高表达组成型表达载体构建

2018年第5期 吉林畜牧兽医·实验研究· ShiYan YanJiu 植物乳杆菌高表达组成型表达载体构建 王 雪，尚晓敏，李桂玲,刘 琼* 吉林工程技术师范学院食品工程学院，吉林长春 130052 摘 要：乳酸菌宿主对表达载体的启动子具有高度的选择性，本研究利用PCR技术扩增嗜酸乳杆菌表面蛋白SlpA 基因启动子，以诱导型表达载体pSIP409为基本框架删除其诱导型启动子，采用能快速连接的无缝克隆技术将SlpA 基因启动子连接到gusA基因上游，获得重组质粒409SlpA电转化至植物乳杆菌NC8中，Western Blot定性测定的gusA表达情况，同时利用MRS-X-gluC培养基特异性显色反应来鉴定阳性重组子表达gusA的活性，为利用该启动 子表达外源蛋白研制新型基因工程微生态制剂奠定基础。 关键词：嗜酸乳杆菌；启动子；组成型表达载体； Construction of constitutive Expression Vector Base on SlpA Gene Promoter and the Function Analysis Wang Xue, Shang Xiao-min，Li Gui-ling，Liu Qiong* College of Food Engineering Jilin Engineering Normal University, Changchun, Jilin, 130052 Abstract: Lactobacillus hosts have a high selectivity for the promoter of the expression vector. In this study, the promoter of the SlpA gene from Lactobacillus acidophilus was amplified by PCR, and the expression vector pSIP409 was used as the base frame to remove its inducible promoter. The promoter of the SlpA gene was ligated upstream of thegusAgene by Seamless Assembly Cloning technology and the recombinant plasmid 409SlpA was transformed into Lactobacillus plantarumNC8 by electrotransformation. The positive colony was screened by MRS-X-gluC medium and the specific colony was screened, and the complex steps of detecting the activity of expressed proteins were avoided. This study lays the foundation for further application of SlpA gene constitutive promoter. Keywords: Lactobacillus acidophilus; promoter; constitutive expression vector 乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是一群革兰氏阳性、能够发酵碳水化合物、以乳酸为主要代谢产物的各类细菌统称，是人与大多数动物肠道内常见优势菌群。由于乳酸菌在医药、食品、饲料生产等相关领域具有较高的应用价值，被公认为安全级微生物(generally recognized as safe，GRAS)[1]。构建乳酸菌工程菌株最重要的是高效稳定表达，而启动子是决定外源基因表达效率的关键遗传组件[2]，且乳酸菌属的启动子对宿主有着高度的选择[3]。因此，在LAB表达系统中很少使用外源启动子。目前可用于构建LAB表达载体的启动子主要有lac A、lac R、lacS、nisA/nisZ、nisF和usp等[4]，启动子数量偏少，并且大多数属于诱导型启动子[5]。组成型乳酸菌表达载体在不添加诱导物情况下可以不断地表达目的蛋白，在饲料生产、食品 基金项目：吉林省教育厅科技研究项目（2016120）； 吉林工程技术师范学院（2016）校科研发展基金项目。 作者简介：王 雪（1995-），女，本科，生物工程专业， 河北省阜城，E-mail:7107172322@https://www.sodocs.net/doc/5f4423708.html,. *通讯作者：刘 琼（1980-）,女,实验师，研究方向为 动物微生态与黏膜免疫学。 E-mail:liuqiong@https://www.sodocs.net/doc/5f4423708.html,. 6

pFGC5941植物表达载体

pFGC5941 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT0360 pFGC5941 pFGC5941载体基本信息 出品公司: --‐--‐ 载体名称: pFGC5941 质粒类型: 植物表达载体；植物干扰载体 高拷贝/低拷贝: --‐--‐ 启动子: --‐--‐ 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 11405 b p 5' 测序引物及序列: --‐--‐ 3' 测序引物及序列: --‐--‐ 载体标签: --‐--‐ 载体抗性: 羧苄西林 筛选标记: --‐--‐ 备注: --‐--‐ 产品目录号: --‐--‐ 稳定性: --‐--‐ 组成型: --‐--‐ 病毒/非病毒: --‐--‐ 载体质粒图谱和多克隆位点信息

其他植物载体质粒： pBI101 pDF15 pBI121 pEarleyGate 100 pBI221 pEarleyGate 101 pBI221--‐GFP pEarleyGate 102 pBin19 pEarleyGate 103 pBINPLUS pEarleyGate 104 pCambia0105.1R pEarleyGate 201 pCambia0305.1 pEarleyGate 202 pCambia0305.2 pEarleyGate 203 pCambia0380 pEarleyGate 204 pCambia0390 pEarleyGate 205 pCambia1105.1 pEarleyGate 301

pCambia1105.1R pEarleyGate 302 pCambia1200 pEarleyGate 303 pCambia1201 pEarleyGate 304 pCambia1281Z pFGC5941 pCambia1291Z pGA643 pCambia1300 pGreen pCambia1300GFP pGreen 0029 pCambia1301 pGreen0029 pCambia1302 pGreen029 pCambia1303 pGreenII pCambia1304 pGreenII 0049 pCambia1305.1 pGreenII 0179 pCambia1305.2 pGreenII 0229 pCambia1380 pGreenII 0579 pCambia1381 pHANNIBAL pCambia1381Xa pHELLSGATE pCambia1381Xb pHELLSGATE 12 pCambia1381Xc pHELLSGATE 4 pCambia1381Z pHELLSGATE 8 pCambia1390 pKANNIBAL pCambia1391 pPZP100 pCambia1391Xa pPZP101 pCambia1391Xb pPZP102 pCambia1391Xc pPZP111 pCambia1391Z pPZP112 pCambia2200 pPZP121 pCambia2201 pPZP122 pCambia2300 pPZP200 pCambia2301 pPZP201 pCambia2301--‐101 pPZP202 pCambia3200 pPZP211 pCambia3201 pPZP212 pCambia3300 pPZP221 pCambia3301 pPZP222 pCambia35s--‐ECFP pPZp--‐RCS2--‐Bar pCambia35s--‐EGFP pRI 101--‐AN pCambia35s--‐EYFP pRI 101--‐ON pCambia5105 pRI 201--‐AN pSB1 pRI 201--‐ON pSB11 pRI 909 pSoup pRI 910 pSPYCE(MR) pRI101 pTCK303 pSAT1--‐cCFP--‐C Super1300 pSAT1--‐cCFP--‐N

单子叶植物表达载体pUN3300的构建

龙源期刊网 https://www.sodocs.net/doc/5f4423708.html, 单子叶植物表达载体pUN3300的构建 作者：孙萍等 来源：《山东农业科学》2013年第01期 摘要：植物双元表达载体在植物基因工程研究中具有重要作用，表达载体所包含的结构元件，如启动子、多克隆位点、筛选标记等，对植物遗传转化效率、外源基因表达强度及遗传稳定性等具有重要影响。本研究中，为提高目的基因对单子叶植物的遗传转化效率，对植物表达载体pCAMBIA3300进行改造，在原有以bar基因作为选择标记的基础上，采用不完全酶切的方法添加了Ubiquitin启动子，经酶切、测序表明，植物双元表达载体pUN3300构建成功。该载体对于研究外源基因功能、植物性状改良及新品种的培育，具有重要的价值。 关键词：单子叶植物；表达载体；pUN3300；Ubiquitin启动子；bar基因 中图分类号：Q781文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）01-0034-04 植物双元表达载体是植物基因工程研究的重要组成部分。通过植物表达载体，外源目的基因可进入宿主细胞并高效表达，为阐明基因功能、利用基因资源改良作物种质奠定了基础[1～3]。获得稳定、高效的植物双元表达载体是进行遗传转化研究的重要内容之一。目前，虽已有pBR121、pCAMBIA等系列的商业化表达载体出售，但并不能完全满足实验需求，因此，必须根据实际需要对表达载体进行改造。表达载体上携带的抗性标记基因是筛选转化体的有效手段，但同时也带来了生态环境及食品安全方面的潜在隐患，影响了大众对转基因植物的接受。而以除草剂抗性bar 基因作为筛选标记，具有一定的生物安全性，客观上可消除人们的顾虑[4]。因此本研究中，选取以bar 基因为筛选标记的商业化表达载体pCAMBIA3300为基础，通过不完全酶切等方法添加了单子叶植物高效、专一性启动子Ubiquitin，构建并获得了适于单子叶植物遗传转化的表达载体pUN3300，为外源目的基因对单子叶植物的遗传转化提供了有力 的分子生物学工具。 1材料与方法 11试验材料 植物表达载体pCAMBIA3300、含有Ubiquitin启动子的植物表达载体pUN1301由本实验室保存。大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京全式金公司，各种限制性内切酶、琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒、T4 DNA连接酶购自大连宝生物工程有限公司，其他各种试剂均为国产分析纯产品。PCR引物由上海生物工程有限公司合成。 12试验方法

pGreen 0029植物表达载体

pGreen 0029 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT0340 pGreen 0029 pGreen 0029载体基本信息 出品公司: --‐--‐ 载体名称: pGreen 0029 质粒类型: 植物表达载体 高拷贝/低拷贝: --‐--‐ 启动子: --‐--‐ 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: --‐--‐ 5' 测序引物及序列: --‐--‐ 3' 测序引物及序列: --‐--‐ 载体标签: --‐--‐ 载体抗性: --‐--‐ 筛选标记: --‐--‐ 备注: --‐--‐ 产品目录号: --‐--‐ 稳定性: --‐--‐ 组成型: --‐--‐ 病毒/非病毒: --‐--‐ 载体质粒图谱和多克隆位点信息

载体序列 AGCCTGGCGAACAGTTCGGCTGGCGCGAGCCCCTGATGCTCTTCGTCCAGATCATCCT GATCGACAAGACCGGCTTCCAT CCGAGTACGTCCTCGCTCGATGCGATGTTTCGCTTGGTGGTCGAATGGGCAGGTAGCC GGATCAAGCGTATGCAGCCGCC GCATTGCATCAGCCATGATGGATACTTTCTCGGCAGGAGCAAGGTGAGATGACAGGA GATCCTGCCCCGGCACTTCGCCC AATAGCAGCCAGTCCCTTCCCGCTTCAGTGACAACGTCGAGCACAGCTGCGCAAGGAA CGCCCGTCGTGGCCAGCCACGA TAGCCGCGCTGCCTCGTCTTGGAGTTCATTCAGGGCACCGGACAGGTCGGTCTTGACA AAAAGAACCGGGCGCCCCTGCG CTGACAGCCGGAACACGGCGGCATCAGAGCAGCCGATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATA GCCGAATAGCCTCTCCACCCAA GCGGCCGGAGAACCTGCGTGCAATCCATCTTGTTCAATCATGCCTCGATCGAGTTGAG AGTGAATATGAGACTCTAATTG GATACCGAGGGGAATTTATGGAACGTCAGTGGAGCATTTTTGACAAGAAATATTTGC TAGCTGATAGTGACCTTAGGCGA CTTTTGAACGCGCAATAATGGTTTCTGACGTATGTGCTTAGCTCATTAAACTCCAGA AACCCGCGGCTGAGTGGCTCCTT CAACGTTGCGGTTCTGTCAGTTCCAAACGTAAAACGGCTTGTCCCGCGTCATCGGCGG

植物表达载体转化农杆菌操作步骤

第一部分：农杆菌介导转化水稻 1、农杆菌选择：LBA4404、EHA105、GV3101 2、农杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线（或加或不加抗生素，LBA4404:Rif或Str；EHA 105：Rif或Str；GV3103：庆大霉素。如果不加抗生素就有可能造成这些菌株的Ti质粒丢失，导致农杆菌缺乏侵染性），抗生素浓度为：50μg/m l。28℃培养。 3、农杆菌感受态细胞的制备： 1）挑取单菌落接种于3ml LB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养至OD600 =0.5。 2）吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min； 3）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液； 4）沉淀用1.5 ml 0.5M NaCl悬浮,冰浴20min； 5）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液； 6）每管用100μl 20mMCaCl2悬浮，用于转化； 制备好的感受态细胞可马上使用，也可按每管200ul分装于无菌离心管中，于4℃保存48小时内使用，长期贮存时必须在液氮中速冻后转一70℃保存。使用时从一70℃取出，置冰上融化后使用。 4、DNA直接转化农杆菌： 1）50μl农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1～1μg（5－10ul），之后冰浴30 min； 2）放入液氮中5min（或1min），然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min； 3）取出离心管，加入0.5mlLB，28℃、220rpm振荡培养3～5hr； 4）取出菌液于含相应抗生素的LB平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养。2天左右菌落可见。（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str） 5、重组农杆菌鉴定： 1）挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。 （pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str） 2）小量提取质粒DNA，加GTE同时加5μL溶菌酶（50μg "ml -1，贮藏浓度为50mg/ml或10mg/ml）。3）质粒酶切或PCR鉴定。 6、三亲交配法： 参考一： 1）接种含重组质粒的大肠杆菌于含的LB平板，于37℃培养； （pEmu载体：50μg"ml -1AMP；pK载体：50μg"ml -1Kan；pTCK载体：50μg"ml -1Kan） 2）接种含动员质粒pRK2013的大肠杆菌于不含抗生素的LB平板上，于37℃培养； 3）接种受体农杆菌EHA105/LBA4404于50μg"mL-1 Rif/Str的LB平板上28 ℃培养； 4）分别挑取上述平板单菌落，分别于LB液体培养基中震荡培养； 5）待三种菌生长到对数期时，各取50μL，混匀，涂布于无抗生素的LB 平板上，28℃培养过夜； 6）挑取长出的小块菌，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养24h； （pEmu载体：50μg"ml -1AMP＋50μg"mL-1 Rif/Str；pK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1 Rif/Str；pT CK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1 Rif/Str） 7）用接种环将上述培养液划线于含相应抗生素的LB平板，28℃培养至长出单菌落； （pEmu载体：50μg"ml -1AMP＋50μg"mL-1 Rif/Str；pK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1 Rif/Str；pT CK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1 Rif/Str） 8）随机挑取若干克隆，于含相应抗生素的LB液体培养基振荡培养； 9）小量提取质粒DNA进行PCR鉴定。

叶绿体表达载体--如何构建载体

如何构建载体 1启动子的选用和改造 外源基因表达量不足往往是得不到理想的转基因植物的重要原因。由于启动子在决定基因表达方面起关键作用，因此，选择合适的植物启动子和改进其活性是增强外源基因表达首先要考虑的问题。 目前在植物表达载体中广泛应用的启动子是组成型启动子，例如，绝大多数双子叶转基因植物均使用CaMV35S启动子，单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和来自水稻的Actinl启动子。在这些组成型表达启动子的控制下，外源基因在转基因植物的所有部位和所有的发育阶段都会表达。然而，外源基因在受体植物内持续、高效的表达不但造成浪费，往往还会引起植物的形态发生改变，影响植物的生长发育。为了使外源基因在植物体内有效发挥作用，同时又可减少对植物的不利影响，目前人们对特异表达启动子的研究和应用越来越重视。已发现的特异性启动子主要包括器官特异性启动子和诱导特异性启动子。例如，种子特异性启动子、果实特异性启动子、叶肉细胞特异性启动子、根特异性启动子、损伤诱导特异性启动子、化学诱导特异性启动子、光诱导特异性启动子、热激诱导特异性启动子等。这些特异性启动子的克隆和应用为在植物中特异性地表达外源基因奠定了基础。例如，瑞士CIBA-GEIGY公司使用PR-IA启动子控制转基因烟草中Bt毒蛋白基因的表达，由于该启动子可受水杨酸及其衍生物诱导，通过喷酒廉价、无公害的化学物质，诱导抗虫基因在虫害重发生季节表达，显然是一个十分有效的途径。 在植物转基因研究中，使用天然的启动子往往不能取得令人满意的结果，尤其是在进行特异表达和诱导表达时，表达水平大多不够理想。对现有启动子进行改造，构建复合式启动子将是十分重要的途径。例如，Ni等人将章鱼碱合成酶基因启动子的转录激活区与甘露碱合成酶基因启动子构成了复合启动子，GUS表达结果表示：改造后的启动子活性比35S启动子明显提高。吴瑞等人将操作诱导型的PI-II基因启动子与水稻Actinl基因内含子1进行组合，新型启动子的表达活性提高了近10倍（专利）。在植物基因工程研究中，这些人工组建的启动子发挥了重要作用。 2增强翻译效率 为了增强外源基因的翻译效率，构建载体时一般要对基因进行修饰，主要考虑三方面内容：2.1添加5｀-3｀-非翻译序列 许多实验已经发现，真核基因的5｀-3｀-非翻译序列（UTR）对基因的正常表达是非常必要的，该区段的缺失常会导致mRNA的稳定性和翻译水平显著下降。例如，在烟草花叶病毒（TMV）的126kDa蛋白基因翻译起始位点上游，有一个由68bp核苷酸组成的Ω元件，这一元件为核糖体提供了新的结合位点，能使Gus基因的翻译活性提高数十倍。目前已有许多载体中外源基因的5｀-端添加了Ω翻译增强序列。Ingelbrecht等曾对多种基因的3｀-端序列进行过研究，发现章鱼碱合成酶基因的3｀-端序列能使NPTII基因的瞬间表达提高20倍以上。另外，不同基因的3｀-端序列增进基因表达的效率有所不同，例如，rbcS3｀-端序列对基因表达的促进作用比查尔酮合酶基因的3｀-端序列高60倍。 2.2优化起始密码周边序列 虽然起始密码子在生物界是通用的，然而，从不同生物来源的基因各有其特殊的起始密码周边序列。例如，植物起始密码子周边序列的典型特征是AACCAUGC,动物起始密码子周边序列为CACCAUG，原核生物的则与二者差别较大。Kozak详细研究过起始密码子ATG周边碱基定点突变后对转录和翻译所造成的影响，并总结出在真核生物中，起始密码子周边序列为ACCATGG时转录和翻译效率最高，特别是-3位的A对翻译效率非常重要。该序列被后人称