开题报告-壳聚糖纳米粒子吸附铜离子的性能研究
毕业论文开题报告
高分子材料与工程
壳聚糖纳米粒子吸附铜离子的性能研究
一、选题的背景和意义
壳聚糖分子中含有羟基，乙酰基和氨基，这决定了壳聚糖可进行多功能基团的化学反应。作为自然界唯一带有阳离子的天然多糖，具有独特的生物性能，故在纳米载药、载基因体系中倍受青睐[7-8]。壳聚糖如此多的生物活性使它在医药和生物材料领域备受关注，正在作为一种新型的天然高分子材料应用于实践中。甲壳素和壳聚糖都可以形成分子内和分子间氢键。甲壳素分子内有-OH-和-CO-基团，分子链之间存在强烈的氢键，所以几乎不溶于水及一般的有机溶剂、稀酸、稀碱或浓碱。而壳聚糖分子内有-OH，-NH
2
，-O基团，也可以形成多种分子内氢键，但是与甲壳素不同的是其分子链的刚性和堆积密
度均小于甲壳素，所以其溶解性较甲壳素好。在稀酸中，壳聚糖的-NH
2被质子化为-NH
3
+，
破坏了原有的氢键和晶格结构，此时-OH与水分子结合，从而使壳聚糖溶解。壳聚糖为亲水性阳离子聚合物，在乙酸溶液中能产生聚电解质效应。在极稀的壳聚糖溶液中，壳聚糖的分子链充分伸直，类似刚性结构。甲壳素和壳聚糖是少数带正电荷的天然产物之一，具有许多独特的物理、化学性质和生物功能，又具有许多独特的生理活性，是一种非常有价值的新材料。
因CS本身所具有的特性，引起了人们的极大兴趣，在过去的30年中，其在农业、工业和医药领域中的应用发展迅速。在农业中，CS曾被用作一种抗病毒液添加到肥料中，帮助植物抵抗病毒侵害，以及作为重金属修复剂应用于农业和工业中。CS还曾作为一种化妆品添加剂和纺织品助染剂而广泛应用。在造纸的过程中也常加入CS作为加固剂。CS同时具有的生物活性、抗血凝成分和杀菌效果使其在外科手术中也有应用。。纳米粒子由于具有量子尺寸效应、小尺寸效应、表面效应、宏观量子隧道效应而显示出独特的物理化学特性，近年来, 以CS 为原料制备的纳米粒子由于其在药物运输、基因治疗、污水处理等方面具有广泛的用途而备受关注, 成为当前的研究热点。在水处理方面，壳聚糖可用作吸附剂、絮凝剂、重金属离子螯合剂等。其最大优点是不会产生二次污染，目前最大用量是作为无毒的阳离子絮凝剂处理有机废水和螯合废水中的有毒金属离子。相信结合两者的特性制备壳聚糖纳米粒子来处理有机废水和螯合废水中的有毒金属离子也是一种新的探索。
二、研究目标与主要内容（含论文提纲）
采用离子交联法制备壳聚糖纳米粒子, 即利用壳聚糖与三聚磷酸钠(TPP)分子之间的阴、阳离子的静电作用而生成纳米粒子.
聚乙二醇(PEG)是一种被广泛应用的生物材料, 具有亲水性、柔韧性、电中性及可生物降解等特性.
配制壳聚糖醋酸溶液,再滴加多聚磷酸钠（TPP），TPP上的磷酸盐负离子和壳聚糖上的氨基正离子发生分子间或分子内交联而形成纳米离子。改变TPP的浓度来改变纳米粒子的尺寸。通过滴加不同量的TPP来改变纳米粒子的尺寸大小，以此来研究不同尺寸的纳米粒子对金属离子的吸附能力，再用DSC检测来分析吸附和未吸附纳米粒子表征。
论文提纲：
1.概述
2.壳聚糖的性质
3.壳聚糖的应用
4.生化方面
5.医疗保健
6.纤维领域
7.化妆品行业
8.纳米粒子
9.实验部分
10实验药品与仪器设备
11.制备壳聚糖的醋酸溶液的配置
12.壳聚糖纳米粒子的制备
13.纳米粒子和金属溶液混合液的制备
14.硫酸铜溶液吸光度的测定
15.混合液离心
16.红外光谱分析
17.热分析
18.结果与讨论
19.铜离子的吸附率
20.样品的红外光谱分析
21.样品的DSC热分析
22.结论
三、拟采取的研究方法、研究手段及技术路线、实验方案等
采用离子交联法制备壳聚糖纳米粒子, 即利用壳聚糖与三聚磷酸钠(TPP)分子之间的阴、阳离子的静电作用而生成纳米粒子.
聚乙二醇(PEG)是一种被广泛应用的生物材料, 具有亲水性、柔韧性、电中性及可生物降解等特性.
配制壳聚糖醋酸溶液,再滴加多聚磷酸钠（TPP），TPP上的磷酸盐负离子和壳聚糖上的氨基正离子发生分子间或分子内交联而形成纳米离子。改变TPP的浓度来改变纳米粒子的尺寸。通过滴加不同量的TPP来改变纳米粒子的尺寸大小，以此来研究不同尺寸的纳米粒子对金属离子的吸附能力，再用DSC检测来分析吸附和未吸附纳米粒子表征。
壳聚糖醋酸溶液的配制
由于壳聚糖不容于水，所以用冰醋酸加以溶解。配制不同浓度的壳聚糖醋酸溶液，温度室温，搅拌4小时。反应液在室温下继续搅拌反应24h，反应结束后用1N NaOH溶液调制pH=9，反应液在透析袋中用乙醇透析5天，最后分别得产物LAC。
纳米粒子的制备
在壳聚糖醋酸溶液中，将0.8mL三聚磷酸钠（TPP）溶液（浓度分别是1.0，2.0，3.0，4.0，6.0 mg/mL）加入到上述10mL的壳聚糖，按照TPP用量的多少不同，可以依次出现三种不同的溶液，分别是澄清溶液、带蓝色荧光的乳浊液和沉淀。其中带蓝色荧光的乳浊液就是形成的纳米溶液。
壳聚糖纳米粒子和金属溶液的混合液的制备
在不同尺寸大小的纳米粒子溶液中，加入相同量的金属溶液，磁力搅拌3小时。
混合液离心
将不同的混合液装样，进行离心
DSC分析
差示扫描量热分析（DSC）采用的是Perkin-Elmer PYRIS I型差示扫描量热仪。精确称取2-7mg的样品，放入特制的铝锅中，封好口，N2保护下，升温速率为20℃/min，
N2不断的更换（20ml/min）。对吸附金属离子的纳米粒子做一次表征。
四、参考文献
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[10] 何强芳 ,李国明 ,巫海珍.应用化学 [ J ] ,2004, 21 (2) : 192
五、研究的整体方案与工作进度安排
第一阶段：2010.11.25~2010.12.5实验的准备。
第二阶段：2010.12.6~2011.1.10实验逐步展开。
第三阶段：2011.1.11~2011.1.28实验进入中后期,主要是样品的表征。
第四阶段：2011.1.21~2011.2.27实验进入完成阶段,主要是分析处理数据。
第五阶段：2011.2.28~2011.4.23论文修改和定稿。
六、研究的主要特点及创新点
探索壳聚糖纳米粒子吸附铜离子的吸附性能
纳米材料用TEM时铜网的选择
分享】纳米材料用TEM时铜网的选择已有4人参与 ★ 小木虫(金币+1):奖励一下，鼓励发有价值的话题 一般的纳米粉末分为纳米粒子，纳米棒，纳米线，纳米飘带，纳米纤维，纳米薄片等等，稍微做过一点纳米的同行应该都知道，这个应该是制样里面最方便的了，不过在选择铜网类型的时候有讲究：简单来说，一般的纳米粒子都比较均匀，用乙醇超声分散之后或者用滴管、毛细管滴加一滴到铜网上，或者用镊子夹了铜网到分散好的悬浊液里面提拉一下，就应该能保证有足够的粒子挂上。然后用红外灯烘烤一下，尽量除去乙醇，以保护机械泵的油少被污染，一般我建议烘烤5-10分钟，预抽真空的时间要10-15分钟最好（场发射的灯丝更要长，一般要半小时以上）。注意有些样品的烘烤是会损毁样品形貌的，这个就要较长时间的晾干，或者用反向镊夹住，用电吹风的冷风吹干。有人或许会建议用丙酮，但我觉得丙酮是一种诱癌物质，味道很大，同时因为丙酮对火棉胶或多或少的有溶解性，会影响观察。也有人说他们的样品如果用乙醇会团聚，观察效果不佳，必须用水或者THF 来做，我们试验过是可行的。水的分散因为一般的铜网都不浸润，所以挂的时候要多捞几次，或者用反向镊子提拉几次看到上面有水滴即可，实在捞不到水滴，其实也应该吸附了不少纳米粒子了。不过水分散的样品要长时间烘烤，否则抽真空的时间就会很长，而且会影响泵油的寿命。THF常用来分散CNT等碳材料，这个倒是没什么，只是要注意不要太多，另外也需要加大烘烤时间。 还有分散效果，多数样品如上处理就可以很容易找到分散比较好的区域，但是团聚比较厉害的样品如何处理呢？有做过的朋友建议使用少量聚乙二醇来分散，据说效果很好，不过需要考虑高分辨的衬度还有污染。 刚才讲了要注意选择铜网的类型。因为普通的纳米粒子因为很小，而微栅是不合适的，这个时候建议使用普通铜网，也就是没有微栅孔的那种，一般的高分辨用这个也能做的比较好了，有公司提供微栅上面再覆盖一层超薄碳膜的，但价格比较贵，效果比较好，观察的时候最怕的就是样品漂移，尤其是用底片，如果碰到漂移那就是浪费胶片的代名词，10张里能挑一张就算不错了，这个时候就必须耐心等待，因为样品漂移应该会慢慢减缓，稍微时间长点就行，还有可以提前加液氮到防污染罐，也是一种稳定样品的方法。但如果用CCD相机就很方便，直接修改曝光时间，连续拍照，等到最佳状态时记录即可。 对于一维的纳米材料比如棒、线之类的样品，微栅是必选的，因为可以让棒搭在孔上方，让高分辨的图片更加漂亮，同时建议您选择拍摄对象的时候尽量选取两头搭得或者搭的部分占整个比例较少的部位，否则样品在拍摄的时候容易发生抖动甚至倾斜，让本来转好的晶轴偏离，不仅加大了观察时间，还容易损伤样品的表层结构。不过要是用CCD相机记录，倒是可以有一个方法可以在抖动的情况下也能很好的记录高分辨图像。我用的是Gatan相机，里面有个shutter的选项，一般默认是0秒，你改成1s，应该就会比较好（道理或许跟拍照的快门优先差不多吧，欢迎指教），不过需要耐心等待最佳时机。两维的纳米材料一般就是薄片，寻找适当的薄区拍照即可，而且样品比较稳定，容易拍摄高分
拟南芥原生质体制备转化方法整理
溶液配制 1、纤维素酶解液：
2、PEG4000溶液（一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100μl PEG4000溶液，可根据实验样品量调整溶液配置总量）
3、W5 溶液 4、MM G溶液
5、WI溶液 拟南芥原生质体制备转化方法整理 一、土培室播种种植的拟南芥。 二、生长良好情况下在未开花前用于取材叶片制备原生质体。 三、剪取中部生长良好的叶片用刀片切成0.5 -1 mm宽的叶条。 四、将切好叶条掷入预先配置好的酶解液中（每5-10 ml酶解液大约需10-20片叶子）。并用镊子帮助使叶子完全浸入酶解液。
五、用真空泵于黑暗中抽30分钟。（此时可配制PEG4000溶液，200和1000 ul 枪头去尖使操作时吸打缓和。） 六、在室温中无须摇动继续黑暗条件下酶解至少3个小时。当酶解液变绿时轻轻摇晃培养皿促使原生质体释放出来。（此时预冷一定量W5溶液） 七、显微镜下检查溶液中的原生质体，拟南芥叶肉原生质体大小大约30-50 um。 八、在过滤除去未溶解的叶片前用等量的W5溶液稀释含有原生质体的酶液。 九、先用W5溶液润湿35-75 um的尼龙膜或60-100目筛子，然后用它过滤含有原生质体的酶解液。 十、用30毫升的圆底离心管100g，1-2分钟离心沉淀原生质体。尽量去除上清然后用10ml 冰上预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体。 十一、在冰上静至原生质体30分钟。 以下操作在室温23℃下进行
十二、100g离心八至十分钟使原生质体沉淀在管底。在不碰触原生质体沉淀的情况下尽量去除W5溶液。然后用适量MMG溶液（1m）重悬原生质体，使之最终浓度在2X105个/ml。 十三、加入10 ul DNA（10-20微克约5-10kb的质粒DNA）至2ml离心管中。 十四、加入100 ul原生质体（2x104个），轻柔混合。 十五、加入110 ul PEG溶液，轻柔拍打离心管完全混合（每次大约可以转化6-10个样品）。 十六、诱导转化混合物5-15分钟（转化时间视实验情况而定，要表达量更高也许需要更高转化时间）。 十七、室温下用400-440 ul W5溶液稀释转化混合液，然后轻柔颠倒摇动离心管使之混合完好以终止转化反应。 十八、室温下用台式离心机100g离心2分钟然后去除上清。再加入1ml W5溶液悬浮清洗一次，100g离心两分钟去上清。
原生质体制备
1.影响原生质体数量和活力的因素 （1）细胞壁降解酶的种类和组合 不同植物种类或同一植物种的不同器官以及它们的培养细胞，由于它们的细胞壁结构组成不同，分解细胞壁所需的酶类也不同。例如，叶片及其培养细胞用纤维素酶和果胶酶，根尖细胞以果胶酶为主附加纤维素酶或粗制纤维素酶（Driselase酶），花粉母细胞和四分体期小孢子用蜗牛酶和胼胝质酶，成熟花粉用果胶酶和纤维素醇。 （2）渗造压稳定剂 用酶法降解细胞壁前，为防止原生质体的破坏，一般需先用高渗液处理细胞，使细胞处于微弱的质壁分离状态，有利于完整原生质体的释放。这种高渗液称为渗透压稳定剂。常用的滲透压稳定剂有甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、盐类（KCI、MgSO4.7H2O）等。在降解细胞壁时，渗透压稳定剂往往和酶制剂混合使用。滲透压稳定剂中，用得最多的是甘露醇，常用于烟草、胡萝ト、柑橘、蚕豆原生质体制备；蔗糖常用于烟草、月季等；山梨醇常用于油菜原生质体制备。滲透压稳定剂种类及浓度的选择应根据植物种类而异，例如胡萝ト用0.56mol ／L甘露醇，月季用14％蔗糖，柑橘用0.8mol／L甘露醇，蚕豆用0.7mol／L甘露醇，烟草的四分体用7％熊糖，烟草的成熟花粉用13％甘露醇。 （3）质膜稳定剂 质膜稳定剂可以增加完整原生质体数量、防止质膜破坏，促进原生质体胞壁再生和细胞分裂形成细胞团。如在分离烟草原生质体时，在酶液中加人入葡聚糖硫酸钾，一旦洗净确液进行培养，原生质体很快长壁并持续细胞分裂形成细胞团。而未加葡聚糖硫酸钾的对照，原生质体经一周培养即解体。常用的原生质膜稳定剂有葡聚糖硫酸钾、MES、氯化钙、磷酸二氢钾等。 （4）pH的影响 分离原生质体时，酶液的pH是值得注意的问题。因为降解酶的活力和细胞活力最适pH是不一致的低pH时（＜4.5），酶的活力强，原生质体分离速度快，但细胞活力差，破坏的细胞较多；pH偏高时，酶活力差，原生质体分离速度慢，完整的原生质体数目较多。分离原生质体时，酶液的pH因植物种类不同而有差异，如胡萝ト为5.5、月季为5.5～6.0、烟草为5.4～5.8、柑橘为5.6、蚕豆为5.6～5.7。 （5）温度影响 制备生质体时，一般在26土1℃条件下酶解。 （6）植物材料的生理状态 一般应选择植物体细胞分裂旺盛的部分进行取材。采用那些颗粒细小、疏松易碎的胚性愈伤组织和由其建立的胚性悬浮细胞系，更容易获得高质量的原生质体。要得到良好的供体材料，必要时应对材料进行预处理及预培养。 2.植物原生质体的纯化 材料经过一段时间的酶解后，需要将酶解混合物中破碎的原生质体、未去壁的细胞、细胞器及其他碎片去除出去。纯化原生质体的常用方法有过滤、离心、飘浮法，在实际操作中一般联合运用这三种方法。 1）过滤法用滤网过滤酶解混合物，滤去未被酶解的细胞、细胞团及组织块 2）离心法利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中，先进行过滤然后低速离心，使纯净完整的原生质体沉积于离心管底部。 3）飘浮法采用比原生质体比重大的高渗溶液（如蔗糖、Ficoll溶液），使原生质体漂浮在溶液表面。
水稻原生质体分离及转化
水稻原生质体分离及转化 作者：植物逆境与光合实验室|发表日期：2014-04-11 实验目的：用于做荧光定位、BIFC、Co-IP实验 实验材料和试剂： 生长8-10 d的水稻组培幼苗、酶解液、mmg溶液、PEG-CaCl2溶液、W5溶液、5 mL移液枪、5 mL枪头、12 mL BD管、1.5 mL EP管、100 mL锥形瓶、圆形培养皿、滤网（20 mm×20 mm）、离心机、摇床等。 溶液的配制： 母液的配制： 1、0.2 M MES(pH 5.7) 2、0.8 M Mannitol(甘露醇) 3、1 M CaCl2 4、2 M KCl 5、2 M MgCl2 6、10% BSA [Fluka PEG 4000 81240] 以下如有上述母液，则都是使用的母液 酶解液：20 mL ×2 MES 0.5
mL 1 mL Mannitol 7.5 mL 15 mL Cellucose（纤维素酶）0.15 g 0.3 g Macerozyme（离析酶）0.075 g 0.15 g ddH2O 1.8 mL 3.6 mL 55℃10 min 冷却至RT后加入200 uL CaCl2 加入200 uL 10% BSA Mmg: 20 mL ×2 MES 0.2 mL 0.4 mL Mannitol 5 mL 10 mL MgCl2 0.075 mL 0.15 mL ddH2O 4.725 mL 9.45 mL
PEG-CaCl2: 20 mL ×2 Mannitol 2.5 mL 5 mL CaCl2 1 mL 2 mL PEG4000 4 g 8 g ddH2O 3 mL 6 mL W5: 200 mL MES 2 mL NaCl 1.8 g CaCl2?2H2O 3.67525 g KCl 0.5 mL ddH2O 197.5 mL 具体实验步骤： 1、从培养基上切取培养8-10 d的水稻幼苗，去除幼苗外层包裹的叶子。 2、用干净的刀片将幼苗切成很细的粉末状碎片（越细越好，有利于酶解），大概切到水稻幼苗茎秆的中间段即可（剩余未切割的部分可以扔掉）。
壳聚糖抗菌保健整理薄型精纺毛织品融资投资立项项目可行性研究报告(中撰咨询)
壳聚糖抗菌保健整理薄型精纺毛织品立 项投资融资项目 可行性研究报告 (典型案例〃仅供参考) 广州中撰企业投资咨询有限公司
地址：中国〃广州
目录 第一章壳聚糖抗菌保健整理薄型精纺毛织品项目概论 (1) 一、壳聚糖抗菌保健整理薄型精纺毛织品项目名称及承办单位 (1) 二、壳聚糖抗菌保健整理薄型精纺毛织品项目可行性研究报告委托编制单位 (1) 三、可行性研究的目的 (1) 四、可行性研究报告编制依据原则和范围 (2) （一）项目可行性报告编制依据 (2) （二）可行性研究报告编制原则 (2) （三）可行性研究报告编制范围 (4) 五、研究的主要过程 (5) 六、壳聚糖抗菌保健整理薄型精纺毛织品产品方案及建设规模 (6) 七、壳聚糖抗菌保健整理薄型精纺毛织品项目总投资估算 (6) 八、工艺技术装备方案的选择 (6) 九、项目实施进度建议 (6) 十、研究结论 (7) 十一、壳聚糖抗菌保健整理薄型精纺毛织品项目主要经济技术指标 .. 9项目主要经济技术指标一览表 (9) 第二章壳聚糖抗菌保健整理薄型精纺毛织品产品说明 (15) 第三章壳聚糖抗菌保健整理薄型精纺毛织品项目市场分析预测 (15) 第四章项目选址科学性分析 (15) 一、厂址的选择原则 (16) 二、厂址选择方案 (16) 四、选址用地权属性质类别及占地面积 (17) 五、项目用地利用指标 (17) 项目占地及建筑工程投资一览表 (18)
六、项目选址综合评价 (19) 第五章项目建设内容与建设规模 (20) 一、建设内容 (20) （一）土建工程 (20) （二）设备购臵 (20) 二、建设规模 (21) 第六章原辅材料供应及基本生产条件 (21) 一、原辅材料供应条件 (21) （一）主要原辅材料供应 (21) （二）原辅材料来源 (21) 原辅材料及能源供应情况一览表 (22) 二、基本生产条件 (23) 第七章工程技术方案 (24) 一、工艺技术方案的选用原则 (24) 二、工艺技术方案 (25) （一）工艺技术来源及特点 (25) （二）技术保障措施 (25) （三）产品生产工艺流程 (25) 壳聚糖抗菌保健整理薄型精纺毛织品生产工艺流程示意简图 (26) 三、设备的选择 (26) （一）设备配臵原则 (26) （二）设备配臵方案 (27) 主要设备投资明细表 (28) 第八章环境保护 (28) 一、环境保护设计依据 (29) 二、污染物的来源 (30) （一）壳聚糖抗菌保健整理薄型精纺毛织品项目建设期污染源 (31)
水稻原生质体制备及转化方法
原生质体制备及转化 1.去皮的日本晴种子在75%的酒精中消毒1 min。然后用 2.5%的次氯酸钠消毒20 min。用无菌水洗至少5次，然后在1/2 MS培养基上，12 h光照（大约150umol m-1 s-1）十二小时黑暗，26 ℃培养7-10天，提前一天烧好去尖的黄蓝枪头备用。 2.取40-60棵水稻幼苗的茎和叶鞘的绿色组织。 3.将一捆水稻植株（大概10棵幼苗）用剃刀一起切成大约0.5 mm的小段。 4.将小片段立刻放进0.6 M的甘露醇中，黑暗中放置10 min。 5.用100目钢制滤网去掉甘露醇，将小片段放在加入15mL酶液的25mL锥形瓶中， （1.5% Cellulase RS，0.75% Macerozyme R-10，0.6 M甘露醇，pH5.7的10mM MES，10mM CaCl2，0.1% BSA），28℃摇床中轻轻摇晃（50rpm），黑暗孵育4-6 h。 6.此时配置40%的PEG4000，酶消化后，分三次加入等体积15mL的W5溶液（154 mM NaCl，125mM CaCl2,5 mM KCl，pH 5.7的2mM MES）。用手充分摇晃10s。 7.用400目钢制滤网过滤得到原生质体在圆底管中。 8.80g离心（升降速度设为1档）5min，缓慢吸走上清液。 9.沿壁缓慢加入4mL W5溶液，轻轻悬浮，再离心80g，5min，弃上清 10.沿壁缓慢加入4mL Mmg溶液，离心80g，5min，弃上清 11.再加Mmg溶液，补至每个样品100μl原生质体 12.分装2mL离心管，每100μl原生质体，加入20μl质粒和120μl新鲜制备的 40%的PEG4000，混匀 13.28℃避光静置转化20--25min 14.加1.5 mL W5溶液混匀，80g离心3min，弃上清。 15.重复步骤14 16.加2mL W5溶液重悬，轻轻混匀，移到细胞培养板，锡箔纸包裹避光28℃避 光静置培养15-20小时 17.培养完成后，将培养板中沉淀的原生质体轻轻混匀，吸到2 mL离心管中，80g 离心3min，弃上清，保留100μl上清液 18.共聚焦显微镜观察拍照 配制溶液方法：
壳聚糖衍生物抗菌性质
壳聚糖和壳聚糖衍生物的抑菌作用 摘要：壳聚糖是一类有着广谱抑菌活性的天然多糖，其生物相容性好、易降解、无毒，因而作为一种可再生资源在抑菌领域受到了越来越多的关注。本文通过对壳聚糖来源、性质、壳聚糖衍生物的化学改性的方法和抑菌作用的分析，并对今后壳聚糖衍生物抑菌情况进行了初步的展望。为研制和开发新型的高抑菌活性的壳聚糖衍生物的开发提供理论参考。 关键词：壳聚糖；衍生物；抑菌；机理 引言 壳聚糖是无毒、无污染，具有可再生、无毒副作用，生物相容性和降解性良好的天然氨基多糖。目前已被广泛应用于医药[1-2]、农业[3]、食品[4-5]等领域，并成为最近生物新材料研究的热点[6-7]。壳聚糖具有抗菌活性，对多种植物病原细菌和真菌均抑制作用[8]。但由于其不溶于水和大多数有机溶剂，只溶于稀酸，在很大程度上限制了其应用范围。壳聚糖通过化学改性，可以得到具有一定官能团的壳聚糖衍生物。与壳聚糖相比，这些衍生物的性能往往有较明显的改善。对于壳聚糖的化学修饰研究较多的有壳聚糖的酰基化、烷基化、羟基化、醛亚胺基化、硫酸酯化、羧甲基化、季铵化等，其中季铵化、羧甲基化和硫酸酯化的产物由于具有良好的水溶性而备受重视[9]。有关壳聚糖的结构修饰和构效关系的研究已成为研究热点[10],因此，研究开发具有更高抗菌活性的壳聚糖衍生物，对于改善人们的生活质量具有重要意义。 1壳聚糖的来源和性质 1.1壳聚糖的来源 壳聚糖是自然界唯一的碱性天然多糖，壳聚糖的历史得追随到19世纪，当时Rouget 在甲壳素的天然聚合物中发现了其脱乙酰化的形式[11]。壳聚糖是白色或淡黄色无定型、半透明、略有珍珠光泽的固体。由于其原料和制备方法的不同，其分子量也有所不同，可以从数十万到数百万不等。甲壳素在浓碱中加热处理后，就可以脱去部分乙酰基，得到壳聚糖，反应路线如下。 通常所说的壳聚糖并不是甲壳素完全脱去N-乙酰基。脱去40%以上的甲壳素就可以称之为壳聚糖[12]。它的化学名称是 -2-氨基-2-脱氧-(1,4)-D葡聚糖，C2有一个氨基，C3和C6分别有一个羟基，结构式如图1-1。因此，甲壳素和壳聚糖的差别就在于葡萄糖的糖残基上的N-脱乙酰度。
植物组织培养 第十章 原生质体培养
第十章原生质体培养 ?教学目的与要求： ?深入了解植物细胞结构功能与细胞全能性表达的关系，掌握原生质体的分离以 及培养过程中渗透压和激素的调控原理与技术。 第一节、原生质体研究概况 一、原生质体的概念 ?原生质体(p r o t o p l a s t)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露 细胞。 二、原生质体研究进展 ?据统计，目前已有49个科，146个属的320多种植物经原生质体培养得到了再 生植株（1993）。其趋势仍以农作物和经济作物为主，但从一年生向多年生、草本向木本、高等植物向低等植物扩展。 三、原生质体研究的意义 ?1、除去了细胞壁为植物细胞之间的融合扫平了障碍，同时叶为制造新杂种开辟 了道路。2、原生质体可摄入外源D N A，细胞器、细菌或病毒颗粒，这些特性与植物全能性相结合为高等植物的遗传饰变打下基础。3、获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料。 第二节、原生质体的制备 1、用于分离原生质体的材料准备 ?无菌试管苗叶片 ?上胚轴和子叶 ?培养细胞 2、酶处理 ?原生质体分离常用的商品酶 ?纤维素酶类 ?果胶酶类 ?半纤维素酶 酶溶剂及其渗透压 ?酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制。 ?渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。 ?酶浓度及酶解时间 ?酶解时间 ?酶浓度酶解温度 3、原生质体的收集和纯化 ?飘浮法：常用的飘浮剂有蔗糖、P e r c o l l、F i c o l l。 ?P e r c o l l是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低(<20m o s m／k g H2O), 粘度也很小，可形成高达1.3g／m l密度，采用预先形成的密度梯度时可在低离心力(200～1000g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于P e r c o l l 扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。此外，P e r c o l l不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。
制纳米铜报告
蒸汽冷凝法制备纳米颗粒 物理学院 111120174 杨峻 一、实验目的： 学习和掌握利用蒸汽冷凝法制备金属纳米微粒的基本原理和实验方法，研究微粒尺寸与惰性气体气压之间的关系。 二、实验原理： 1、微粒制备 利用宏观材料制备微粒，通常有两条路径。一种是由大变小，即所谓粉碎法；一种是由小变大，即由原子气通过冷凝、成核、生长过程，形成原子簇进而长大为微粒，称为聚集法。由于各种化学反应过程的介入，实际上已发展了多种制备 方法。 （一）粉碎法左图示意几种最常见的粉碎 法。实验室使用得最多的是球磨粉碎。球磨 粉碎一开始粒径下降很快，但粉碎到一定程 度时，由冷焊或冷烧结引起的颗粒重新聚集 过程与粉碎过程之间达到动态平衡，粒径不 再变小。进一步细化的关键是阻止微晶的冷 焊，这往往通过添加助剂完成。1988年，Shingu等利用高能球磨法成功地制备了Ａｌ-Ｆｅ纳米晶。发展至今，对于bcc 结构的材料（如Cr、Fe、W等）和ｈｃｐ结构的材料（如Zr、Ru等）的纳米微粒较易制备，但具有fcc的材料（如Cu）难以形成纳米微晶。球磨粉碎法的缺点是微粒尺寸的均匀性不够，同时可能会引入杂质成分。但相对而言工艺较简单，产率较高，而且还能制备一些其它方法无法制备的合金材料。 （二）化学液相法 化学液相法制备纳米微粒获得很大的进展，目前已发展成共沉淀法、水热法、冻结干燥法、溶胶—凝胶法等。利用化学液相法已制备成许多种类的纳米金属、 非金属单晶微粒及各种氧化物、非氧化物以及合金（如CoFeO 4， BaTio 3 ）、固
溶体（如Al 2O 3- TiO 2 ）。 （三）气相法（聚集法） 气相法制备纳米微晶可以追溯到古代， 我们的祖先就曾利用蜡烛火焰收集炭黑制 墨。文献记录表明，1930年代，Rufud为了 研究红外吸收，在空气中制备了Ｎ i 等１１ 种金属的纳米微粒。1962年，由于日本物理 学家Kubo（久保）提出量子尺寸效应，引起 了物理学工作者的极大兴趣，促进了纳米微 粒的制备及检测。1963年kimoto等在稀薄 氩气氛的保护下利用金属加热蒸发再冷凝， 成功地制备了20多种金属材料的纳米微粒。 时至今日，除了在加热方法上已发展了电阻 加热法、等离子喷射法、溅射法、电弧法、激光法、高频感应法及爆炸法等各种方法，在制备原理上亦已发展了ＣＶＤ法、热解法及活性氢—熔融金属反应法等。它们为不同的用途，提供各自适宜的制备方法。 在各类制备方法中，最早被采用并进行较细致实验研究的是蒸汽冷凝法。图8.4-4显示蒸气冷凝法制备纳米微粒的过程。首先利用抽气泵对系统进行真空抽吸，并利用惰性气体进行置换。惰性气体为高纯Ａｒ、Ｈｅ等，有些情形也可以 考虑用Ｎ ２ 气。经过几次置换后，将真空反应室内保护气的气压调节控制至所需的参数范围，通常约为0.1ｋＰａ至10ｋＰａ范围，与所需粒子粒径有关。当原材料被加热至蒸发温度时（此温度与惰性气体压力有关，可以从材料的蒸汽压温度相图查得）蒸发成气相。气相的原材料原子与惰性气体的原子（或分子）碰撞，迅速降低能量而骤然冷却。骤冷使得原材料的蒸汽中形成很高的局域过饱和，非常有利于成核。图8.4-5显示成核速率随过饱和度的变化。成核与生长过程都是在极短的时间内发生的，图8.4-6 给出总自由能随核生长的变化，一开始自由能随着核生长的半径增大而变大，但是一旦核的尺寸超过临界半径，它将迅速长大。首先形成原子簇，然后继续生长成纳米微晶，最终在收集器上收集到纳米粒
棉织物的抗菌整理
1.摘要 棉织物为大多数消费者所喜爱，但是棉织物在服用过程中，特别容易被细菌侵蚀，不仅会影响织物的强力，而且会对人们的健康造成不利影响。当今人们对环境卫生与自我健康日益重视，抗菌卫生纺织品正逐渐受到消费者喜爱。由此可见,抗菌织物的研究与开发有着极其重要的意义。目前，棉织物的抗菌处理主要是通过后整理方法达到，例如用硅氧烷季铵盐类，有机卤素类和壳聚糖类等后整理。本文研究的是壳聚糖整理棉织物的抗菌性能。 关键字：棉织物细菌抗菌壳聚糖
1.摘要 (1) 2.绪论 (4) 3.理论部分 (5) 3.1国内抗菌整理剂的发展状况 (5) 3.2壳聚糖抗菌整理剂 (5) 3.2.1壳聚糖的结构特征 (5) 3.2.2整理剂的溶解 (5) 3.2.3整理剂的制备 (6) 3.3壳聚糖抗菌整理技术的作用原理 (6) 4.实验部分 (6) 4.1整理工艺 (6) 4.2抗菌率的测定 (7) 5.结果与讨论 (7) 5.1抗菌性能的影响因素 (7) 5.1.1壳聚糖浓度对抗菌性能的影响 (7) 5.1.2壳聚糖脱乙酰度对抗菌性的影响 (7) 5.1.3壳聚糖分子量对抗菌效率的影响 (8) 5.1.4有机酸对壳聚糖溶解性的影响 (8) 5.2 抗菌性试验 (9) 5.3耐洗涤实验 (9) 6.结论 (9) 7.参考文献 (10)
2.绪论 在自然界的物质循环过程中,细菌无处不在,人们日常使用的各种纺织品,如被褥、内衣裤、鞋袜、衣服、毛巾等都是细菌滋生繁衍和传播的适宜场所。各种细菌在条件适宜时会迅速繁殖,不仅会使纤维制品变色、发霉、降解等,还会对人体皮肤产生异常的刺激并诱发各种皮肤病,形成对人类生活的种种危害。因此,对棉织物进行抗菌整理是十分必要的[1]。 壳聚糖具有优异的广谱抗菌性,同时具有吸湿性、透气性、降解性、生物活性、螯合性以及酶固定化作用等特性,其资源丰富、无毒、无污染,非常适合作抗菌剂,已广泛应用于天然纤维织物的抗菌整理中,是一种新型的绿色环保型抗菌整理剂国内外均有一些关于壳聚糖在织物功能整理中的应用及其用于棉织物抗菌整理的报道[2]。 针对壳聚糖在棉织物抗菌整理中的应用本文通过壳聚糖溶解、改性、复配等技术研制了一种高效的壳聚糖抗菌整理剂,并通过特殊的加工整理方法,将壳聚糖抗菌整理剂整理到棉织物上,克服了以往产品不耐洗涤的短处,增强了产品的时效性[3]。
纳米铜微粒制备实验
纳米铜微粒制备 （物教101林晗） 摘要 纳米科技正是指在纳米尺度上研究物质的特性和相互作用以及利用这些特性的科学技术。经过近十几年的急速发展，纳米科技已经形成纳米物理学、纳米化学、纳米生物学、纳米电子学、纳米材料学、纳米力学和纳米加工学等学科领域。 本实验用冷凝法制备纳米颗粒铜，不同压力下颗粒大小和色泽是不同的，对结果做了一些讨论分析。 关键字：纳米颗粒铜蒸汽冷凝法 引言 20世纪80年代末以来，一项令世人瞩目的纳米科学技术正在迅速发展。纳米科技将在21世纪促使许多产业领域发生革命性变化。关注纳米技术并尽快投入到与纳米科技有关的研究，是本世纪许多科技工作者的历史使命。 在物理学发展的历史上，人类对宏观领域和微观领域已经进行了长期的、不断深入的研究。然而介于宏观和微观之间的所谓介观领域，却是一块长期以来未引起人们足够重视的领域。这一领域的特征是以相干量子输运现象为主,包括团簇、纳米体系和亚微米体系，尺寸范围约为1~1000nm。 但习惯上人们将100~1000nm范围内有关现象的研究，特别是电输运现象的研究领域称为介观领域。因而1~100nm的范围就特指为纳米尺度，在此尺度范围的研究领域称为纳米体系。
目录 摘要 (1) 引言 (1) 1.纳米微粒的制备 (2) 1.1纳米微粒制备方法 (2) 1.2本实验的蒸汽冷凝法 (3) 2.实验仪器 (4) 2.1实验总设备 (4) 2.2实验仪器部件 (4) 3.实验内容 (5) 3.1准备工作 (5) 3.2制备铜纳米微粒 (5) 4实验现象的记录与分析 (6) 4.1实验现象 (6) 4.2实验现象分析 (6) 总结 (7) 参考文献 (7) 1.纳米微粒的制备 1.1纳米微粒制备方法 利用宏观材料制备微粒，通常有两条路径。一种是由大变小，即所谓粉碎法；一种是由小变大，即由原子气通过冷凝、成核、生长过程，形成原子簇进而长大为微粒，称为聚集法。由于各种化学反应过程的介入，实际上已发展了多种制备方法。 微粒制备通常有以下几种方法：（1）粉碎法（2）化学液相法（3）气相法
拟南芥原生质体的制备及转化
拟南芥原生质体制备转化操作流程 主要试剂 1. 纤维素酶解液： 试剂 15ml酶液体系 1．1-1.5﹪Cellulase R10 (YaKult Honsha)0.225g干粉 2．0.2-0.4﹪Mecerozyme R10 (YaKult Honsha)0.045g干粉 3．0.4M mannitol1.09g干粉 4．20mM KCl1 ml 0.3 M KCl母液 5．20mM MES,pH5.7，1 ml 0.3 M MES,pH5.7母液 6．加入10ml 水 7．55℃水浴加热10分钟（钝化酶，提高酶的可溶性），冷却至室温后加入以下试剂8．10mM CaCl，1 ml 0.15M CaCl2 9．5 mM β-Mercaptoethanol（可选用）1ml 75mM β-Mercaptoethanol母液(Sigma A-6793) 10．0.1﹪BSA，1 ml 1.5﹪BSA（4℃保存） 11．用0.45μm滤膜过滤后使用，酶液是淡棕色的澄清溶液。 2. PEG溶液（40%, v/v）（一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100ul PEG4000溶液，可根据实验样品量调整溶液配置总量） PEG4000( Fluka, #81240)……………1g………………………………….4g 水…………………………………………………0.75ml…………………………..3g 0.8 M Mannitol…………………………..0.625ml…………………………2.5ml 1 M CaCl2或Ca(NO3)2………………..0.25ml………………………….1ml 约1.2ml 3. W5 溶液（1000ml） 154mM NaCl, NaCl9g 125mM CaCl2, CaCl2.H2O18.4g 5mM KCl, KCl0.37g 2mM MES（PH 5.7），MES0.39g pH to 5.8 with KOH，高温高压灭菌20分钟，室温保存。 4. MMG溶液 MaMg溶液（500ml） 15mM MgCl2，MgCl0.71g 4 mM MES(PH5.7)MES0.39g 0.4 M mannitol，Mannitol36.5g 用KOH调pH 5.7，高温高压灭菌20分钟，室温保存。 5. WI溶液 WI(200ml) 0.5M mannitol，mannitol18.217g 4mM MES,pH5.7，MES0.156g
原生质体制备
原生质体的制备： 1、选取3-4周长势良好的植株的展开叶片（通常选取第5~7片真叶）。 2、用新的锋利的刀子从叶片的中部切0.5-1 mm叶条，比较理想的情况下，每克新鲜叶片中大约含有107个原生质体（大约100-150个叶条在5-10 ml酶溶液中消化）。对于常规实验，10-20个叶条消化在5-10 ml酶溶液中将得到0.5-1×106个原生质体，足够25-100个样品使用。 3、快速而温柔的转移叶条到准备好的酶溶液中（10-20叶条在5-10 ml酶液中），用平头镊子将叶条完全淹没。 4、用真空泵将叶条在黑暗中真空30 min。 5、室温下在黑暗中至少消化3 h（继续消化，不要摇晃）。经过轻微转动后酶溶液应该变成绿色，这表明原生质体已经被释放。 6、用显微镜检查原生质体的释放（拟南芥叶肉的原生质体的大小大约为30-50μm）。 7、用等体积的W5溶液稀释酶溶液，通过过滤去除没有消化的叶片组织。 8、用水洗去75 μm尼龙过滤器中的酒精（通常浸泡在95%乙醇中）并去除过量的水，用W5溶液润洗过滤器后过滤原生质体。 9、将原生质体溶液转移到30 mL圆底离心管中，100×g离心5 min，尽可能的去除上清液。 10、用计数板进行细胞计数，每2×105个原生质体加入1 mL W5溶液，在冰，上静置30 min。 11、室温下沉降原生质体15 min，去除W5溶液，每2×105个原生质体加入1 mL MMG溶液重悬浮。 12、在2 mL离心管中分别加入10 mL DNA（5-10 kb的质粒DNA 10-20 mg）和100 mL原生质体（2×104个原生质体细胞），轻轻混匀。 13、加入110 mL PEG溶液，轻弹试管完全混匀。 14、室温下孵育转染混合物15 min（反应5 min足够）。 15、室温下，用400-440 mL W5溶液稀释转染混合物，轻轻摇动或倒置离心管混匀来停止转染过程。 16、室温下，100×g离心2 min，去除上清液。 17、在六孔板中，每孔用1 mL WI溶液重悬浮原生质体。 18、室温下（20-25℃）孵育原生质体一段时间。 19、重悬浮，通过100×g离心2 min收获原生质体。 20、去除上清液并观察GFP成像。
植物原生质体培养
原生质体的培养 1. 原生质体的分离与纯化 原生质体培养的意义 (1)再生植株由原生质体再生生成植株，不论在进行有关细胞生物学或生物合成和代谢的实验研究上，还是在组织培养实践中，都有一定的优点：①可利用均一的分化细胞群体； ②因无细胞壁，试剂对细胞作用更为直接，其反应能直接测量，以使反应产物能较快的分离出来；③在理论和实践中，可极大节省空间，如在一个三角瓶就能培养210个细胞，但在大田种植需要4亩地；④可缩短实验周期，如悬浮培养时仅需1～2个小时。 原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补，不亲和性，连锁群和基因鉴定，分析基因的激活和失活水平的研究。在研究分化问题时，用一个均一的原生质体群体可以筛选数以千计的不同。营养和激素条件，探索诱导单细胞的分化条件等。 (2)用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。这是一种新的远缘杂交方法，为人们提供新的育种方法。两个亲缘关系较远的植株用一般杂交方法是不容易成功的，而用细胞融合的方法却成为可能。首先，两个原生质体融合形成异核体，异核体再再生细胞壁，进行有丝分裂，发生核融合，产生杂种细胞，由此可培养新的杂种。 一、原生质体(protoplast)的分离 （一）材料来源 原生质体是通过质壁分离与细胞壁分开的部分，是能存活的植物细胞的最小单位。自从1960年用酶法制备大量植物原生质体首次获得成功以来，原生质体培养成为生物技术最重要的进展之一。通过大量的试验表明，没有细胞壁的原生质体仍然具有"全能性"，可以经过离体培养得到再生植株。原生质体的分离研究较早，1892年Klereker首先用机械的方法分离得到了原生质体，但数量少且易受损伤。1960年，英国植物生理学家Cocking首先用酶解法从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功。他使用一种由疣孢漆斑菌培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液降解细胞壁。然而，直至1960年纤维素酶和离析酶成为商品酶投入市场以后，植物原生质体研究才成为一个热门的领域。至今从植物体的几乎每一部分都可分离得到原生质体。并且能从烟草、胡萝、矮牵牛、茄子、番茄等70种植物的原生质体再生成完整的植株。此外，原生质体融合，体细胞杂交的技术也得到广泛的应用。 （二）分离方法 1.机械分离法 1982年，Klercker第一次用机械方法从Stratiots aloides中获得原生质体.他们的做法是首先使细胞发生质壁分离,然后切开细胞壁释放出原生质体. 2.酶法分离 (1)酶的种类及特点 构成植物细胞壁的三个主要成分是： ①纤维素酶类：占细胞壁干重的25％至50％不等。 ②半纤维素酶类：平均约占细胞壁干重的53％左右。 ③果胶酶类：一般占细胞壁的5％。分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素 酶和果胶酶。
原生质体的制备
拟南芥原生质体转化实验 每次做大反应（用于CO-IP）最多做8管，每管需3 ml 原生质体溶液，浓度为106 ，10 ml 酶液需要40片叶子。小反应用于用于做蛋白定位，每管需200 μl 原生质体溶液 叶片的选取：，取刚刚完全展开，叶面光滑，非凹凸不平的，最上面最中间的叶片，依次向下选取，取瘦长的，叶缘尖锐的叶片为佳。每四棵苗取8-10片叶子。 1．打开水浴锅，TM=55o C 2. 配40 ml酶解液(8种试剂) Cellulose R10 0.6 g 不要粘在管壁上 Macrozyme R10 0.16 g Mannitol(4 o C) 20 ml KCl 0.4 ml MES 4 ml 55 o C，10 min(严格，前边摇2-3次，待管壁不再粘有酶，溶液澄清就不用摇) 待酶液自然降至室温，加入0.4 mL CaCl2 母液以及15.2 mL DDW ，0.04 g BSA，放置于3．将0.4 M mannitol 滴至一次性培养皿上，将叶片切成细丝，一刀一刀断开切，忌来回蹭。4．23 o C酶解2 h (或3 h，放置时间较长的酶液)，40 rpm。收获前75 rpm，摇1 min。5．配PEG 100 ml用Mannitol(4 o C) PEG 4000 40 g DDW 30 ml Mannitol 25 ml CaCl2 10 ml 6．提前将BD 50 ml 离心管置于冰上，尼龙膜过滤收集原生质体，100 g，3min，23 o C，升速3，降速3离心 7．用5 ml 大枪头吸除酶液，原生质体多则把酶液吸净，少则留一点酶液，加入W5 10-20 ml （依量而定）洗涤。100 g，3min，23 o C，升速3，降速3离心 8．吸去上清，再加入W5 20 ml，轻摇离心管重悬原生质体。100 g，3min，23 o C，升速3，降速3离心。 9．加入3-9 ml Mmg重悬,使原生质体浓度达到106，冰上放置。 10．取50 ml离心管（大反应），每管加入120 μg 质粒/每一种，然后用枪吸打混匀，阴性对照加一种质粒，然后用水补齐使总体积一致，然后用枪吸打混匀。冰上放置。 11．50 ml离心管中加入3 ml 原生质体溶液，沿管壁缓慢加入，充分摇匀。 12．每次室温摇匀后随即每50 ml离心管加入3 ml PEG溶液，轻柔颠倒混匀，不要有PEG 溶液一点一点，而应是充分均匀的溶液。加完PEG后每管室温放置6 min。（PEG刚加入时要分层，否则转化效率不好）。
原生质体制备方法
原生质体制备方法 培养基： ①PDA：200g土豆、20g葡萄糖、20g琼脂、1L水 ②MYG液体培养基：5g麦芽糖、5g酵母提取物、10g葡萄糖、1L水、 ③MYG液体再生培养基：5g麦芽糖、5g酵母提取物、10g葡萄糖、蔗糖、1L水、 ④MYG软再生培养基：5g麦芽糖、5g酵母提取物、10g葡糖糖、8g琼脂粉、蔗糖、试剂： ①1mol/L MgSO4 ②L MgSO4 ③STC：山梨醇、50mM Tris-Hcl（）、50mM CaCl2 ④肝素 ⑤SPTC：山梨醇、40% PEG、50mM Tris-Hcl（）、50mM CaCl2 ⑥无菌水 操作步骤： ①倒若干PDA平板，将GF-WT接入PDA平板，23℃，活化5-7days ②用无菌黄枪头在GF-WT平板上打孔，用长牙签挑出4个菌饼接入50ml/瓶的MYG 液体培养基中，120rmp，28℃，12h ③以10%的接种量接5瓶以上50ml/瓶的MYG液体培养基中，60rpm，28℃，16h ④混有大量悬浮菌丝的培养基用无菌的带有三层擦镜纸的漏斗过滤下来，用无菌 水和1mol/L MgSO4各冲洗三次，菌丝发白即可，冰上备用 ⑤酶解体系的配制：取Dryslase 45mg+Yartlase105mg至无菌量管中，用10ml 1mol/L MgSO4溶解彻底，用无菌滤头和针筒过滤除菌，滤液保存于冰上 ⑥1g菌丝加入到10ml酶解体系中，于无菌三角瓶中进行酶解反应，30℃，60rpm， 3h ⑦用带有无菌滤布的漏斗过滤酶解液，滤液用无菌50ml大管收集，用20ml L MgSO4 冲洗三角瓶和漏斗，3500rpm，10min，取上清
一种快速高效的水稻原生质体制备和转化方法的建立
植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (3): 351~357351 收稿 2013-11-21 修定 2014-01-12 资助 国家重点基础研究发展计划(2012CB944803)、浙江省青年科学基金(LQ13C020002)和浙江省博士后项目择优资助(Bsh1202082和Bsh1202081)。 * 通讯作者(E-mail: yzhu1974@https://www.sodocs.net/doc/491838691.html,; Tel: 0571-********)。 一种快速高效的水稻原生质体制备和转化方法的建立 段炼1,2, 钱君2, 郭小雨2, 朱英2,* 1 浙江师范大学化学与生命科学学院, 浙江金华321004; 2浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所, 浙江省植物有害生物防控重点实验室, 省部共建国家重点实验室培育基地, 杭州310021 摘要: 在模式植物拟南芥中, 原生质体瞬时表达技术已被广泛地应用到功能基因组学的研究中, 但水稻原生质体因其制备过程相对繁琐, 转化效率偏低, 尚未在基因功能研究中获得广泛应用。本研究在拟南芥原生质体制备和转化的基础之上, 对水稻原生质体的制备和转化方法进行改良优化。以水稻幼茎为起始材料, 采用纤维素酶R-10和果胶酶R-10, 对水稻组织进行消化并利用蔗糖密度梯度自沉降的方法分离原生质体, 获得了高纯度的原生质体。对质粒转化原生质体时的转化方法、转化时间及质粒浓度进行探索, 在缩短原生质体分离时间的同时, 大大提高了转化效率。用较少量的质粒DNA 即可获得外源基因在原生质体内高效的表达, 且转化效率可达70%。我们建立的这种快速有效的水稻原生质体制备和转化方法, 可为水稻功能基因组学研究提供技术支持。关键词: 水稻; 原生质体; 自沉降法 A Rapid and Efficient Method for Isolation and Transformation of Rice Protoplast DUAN Lian 1,2, QIAN Jun 2, GUO Xiao-Yu 2, ZHU Ying 2,*1 College of Chemistry and Life Science, Zhejiang Normal University, Jinhua, Zhejiang 321004, China; 2State Key Laboratory Breeding Base for Zhejiang Sustainable Pest and Disease Control, Institute of Virology and Biotechnology, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China Abstract: Transient gene expression in protoplast is a common approach for studying subcelluar localization, promoter activities and protein complexes in model plant, Arabidopsis. However, protoplast isolation, transformation and as well as downstream analyses in rice are often hampered by a number of factors such as time-consuming, cost-intensive and low transformation efficiency. In this study, we reported a rapid and efficient method for isolation and transformation of rice protoplast, based on the recently published procedure for Arabidopsis protoplast preparation. 10-to-14-days stem tissues but not leaf tissues were digested by proper cellulase R-10 and mecerozyme R-10. Pure protoplasts without cell debris were isolated from the interphase of sucrose gradient after natural sink. This method was also very time-efficient, large amount of protoplasts could be obtained within one day. The transformation efficiency was pretty high (70%) with little amount of DNA. The method we presented here should be valuable for the functional genomics research in rice.Key words: rice (Oryza sativa ); protoplast; the self-settlement method 植物原生质体(protoplast)是指通过质壁分离能够分开的那部分细胞物质。离体的原生质体在适当的条件下具有繁殖、分化、再生成完整植株的能力(张红梅和王俊丽2002)。近年来, 原生质体瞬时表达技术被广泛应用于基因功能研究, 其原因除了原生质体易于制备外, 还与其本身可以摄取外源细胞器、病毒、质粒以及DNA 等各种大分子物质有关(An 等2005)。在双子叶植物中, 重组质粒转化原生质体的相关技术已经十分纯熟, PEG 法介导的原生质体转化是实现该技术的重要手段之一。早在1989年, 就有Damm 等(1989)成功将外源基因转入了模式植物拟南芥的原生质体中。此后, 关于拟南芥的原生质体的相关报道层出不穷。拟南芥原生质体除了被用于胞内运输机制(Chen 和Halkier 2000; Wolfenstette 等2012)的探索、蛋白的亚细胞定位、蛋白-蛋白互作、DNA 与蛋白质的相互反应(Faraco 等2011; Yoo 等2007)外, 还被用作反向遗传学研究的受体(Zhai 等2009)。