纤维素酶活力测定方法
土壤纤维素酶测定方法
纤维素酶 一、试剂： 1）醋酸缓冲液（pH 5.5）：164.08 g无水醋酸钠（C2H3O2Na）溶于700 ml去离子水，用醋酸（C2H4O2）调节pH至5.5，用去离子水稀释至1 L。 2）CMC溶液（0.7%，w:v）：7 g羧甲基纤维素钠盐溶于1 L醋酸缓冲液，45℃下搅拌2 h，此溶液在4℃下可存放7天。 3）还原糖试剂： 试剂A：16 g无水碳酸钠（Na2CO3）和0.9 g氰化钾（KCN）溶于去离子水并稀释至1 L。试剂B：0.5 g六氰铁钾（K4Fe（CN）6）溶于去离子水并稀释至1 L，贮于棕色瓶中。 试剂C：1.5 g 硫酸铁铵（NH4SO4Fe2(SO4)2·H2O）、1 g十二烷基硫酸钠（C12H25O4SNa）和4.2 ml浓硫酸溶于50℃去离子水，冷却后稀释至1 L。 4）水合葡萄糖溶液：28 mg水合葡萄糖溶于少量去离子水中，并定容至1 L。 二、仪器设备 恒温培养箱，水浴锅，分光光度计，搅拌器，三角瓶 三、操作步骤 取10.00 g（耕地）或5.00 g（林地）新鲜土壤（＜2 mm）于100 ml三角瓶中，加15 ml 醋酸缓冲液和15 ml CMC溶液，盖上塞子，于50℃下培养24 h，过滤。同时做空白对照，但在培养结束时才加入15 ml CMC溶液，并迅速过滤。 取2.00 ml滤液于50 ml容量瓶中，并用去离子水定容至刻度。吸取2.00 ml稀释液于20 ml试管中，加2.00 ml还原糖试剂A和2.00 ml还原糖试剂B，盖紧混匀，在100℃水浴中加热15 min 后，立即至于20℃水中冷却5 min。加10.00 ml还原糖试剂C，混匀，20℃下静置显色60 min，于690 nm波长处比色测定（要求在30 min内完成）。 标准曲线：吸取0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 ml水合葡萄糖溶液，用去离子水稀释至2 ml，同上加入还原糖试剂A、B、C后，比色测定还原糖含量。c) 空白： 无土空白：不加土样，其余操作与样品试验相同，整个试验设置一个，重复一次。 无基质空白：以等体积水代替基质，每个土样设置一个。 四、结果计算 土壤纤维素酶活性（μg·g-1·(24 h)-1）＝(C*V*f)/ dwt 式中C为样品的葡萄糖含量（μg·ml-1）；V为土壤溶液体积（30 ml）；f为稀释倍数（25）；
测定纤维素酶活实验方法总结及优化方案
DNS法测定酶活实验方法总结及优化方案 目前纤维素酶没有统一的测定方法，诸多因素影响纤维素酶酶活测定大小的比较。选择适宜的酶活测定条件，提高测定结果的准确性，可根据有关资料中采用的测定条件，以及通过控制变量法对酶活力测定中的主要影响因素进行研究。 目前实验室采用测酶活方法： 1、葡萄糖标准曲线制作： 530nm比色。 2、酶活测定方法：
考虑到酶液中培养基成分会对吸光值造成一定的影响，所以空白管0还是采用先将酶高温灭活的方法，后面保持实验条件一致，显色时间与标准曲线的显色时间保持一致。 单位酶活的计算：T n k OD ml U 1000 1 )/(???=酶活力 n ：稀释倍数； K ：曲线斜率； T ：反应时间，min ； 1000：mg 换算成ug. 以下是近期所做的实验结果： 葡萄糖标准曲线 两种产纤维素酶细菌不同测试结果
测定结果 实验结论：从以上几种对酶液的处理方法来看，183的酶活要比R2高，两种菌都是以胞外酶为主。目前尚没找到有关于加缓冲溶液并且超声破碎的文献，所得测量结果与前面三种方法均不符，这一步需另外探索。 根据《纤维素酶活力测定条件研究》（夏服宝等，《饲料工业》2005年第26卷第16期）和《影响纤维素酶活力测定的几个因素》（刘妙莲等，中国食品发酵工业研究所）这两篇文献，实验室可先从底物浓度、温度、DNS用量、显色时间以及对菌体的超声破碎时间这几方面进行探索，进而优化实验方法。 刚果红染色法：常用的刚果红染色法有两种， 一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板 时就加入刚果红。方法一在长出茵落的培养基上，覆盖质量浓度为1 mg ／mI。的CR溶液，10～15 min后，倒去CR溶液，加入物质的量浓度为l mol／I。的NaCI溶液，15 min后倒掉NaCl溶液，此时，产生纤维素酶的 茵落周围将会出现透明圈。 方法二配制质量浓度为10 mg／mI。的CR溶液，灭菌后，按照每200 mI。培养基加入1 mI。的比例加入CR溶液，混匀后倒平板。等培养基上长 出茵落后，产生纤维素酶的菌落周围将会出现明显的透明圈。 两种刚果红染色法的比较刚果红在筛选纤维素分解菌上的应用已经 有超过20年的历史，课本中给出了两种方法。 方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间 发生混杂；其优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。 方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺点是由于在纤维素 粉和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出
羧甲基纤维素酶测定原理
纤维素酶活力的测定 一、目的 学习和掌握3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定纤维素酶活力的原理和方法，了解纤维素酶的作用特性。 二、原理 纤维素酶是一种多组分酶，包括C1 酶、CX 酶和β-葡萄糖苷酶三种主要组分。其中C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，CX 酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维寡糖，β-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在540nm 波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1．实验材料 （1）纤维素酶制剂 500mg （2）新华定量滤纸 50mg / 份× 4 （3）脱脂棉花 50mg / 份× 4 （4）羧甲基纤维素钠（CMC） 510mg （5）水杨酸苷 500mg 2．主要仪器 （1）722 型或其他型号的可见分光光度计 （2）恒温水浴2 台 （3）沸水浴锅 （4）电炉子 （5）剪刀 （6）万分之一分析天平 （7）恒温干燥箱 （8）冰箱 （9）试管架 （10）胶头滴管 （11）具塞刻度试管20mL×24 （12）移液管或加液器0.5 mL×3；2mL×7 （13）容量瓶100 mL×6；1000 mL×3 （14）量筒50 mL×2；100 mL×1；500 mL×1 （15）烧杯100 mL×6；500mL×3；1 000 mL×1 3．试剂（均为分析纯）
（1）浓度为1mg/mL 的葡萄糖标准液 将葡萄糖在恒温干燥箱中105℃下干燥至恒重，准确称取100mg 于100mL 小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL 容量瓶中用蒸馏水定容至100mL，充分混匀。4℃冰箱中保存（可用12～15 天）。（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）溶液 准确称取DNS 6.3g 于500mL 大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，加入2mol/L NaOH 溶液262mL，再加到500mL 含有185g 酒石酸钾钠（C4H4O6KNa · 4H2O，MW=282.22）的热水溶液中，再加5g结晶酚（C6H5OH，MW=94.11）和5g无水亚硫酸钠（Na2SO3，MW=126.04），搅拌溶解，冷却后移入1 000mL 容量瓶中用蒸馏水定容至1 000mL，充分混匀。贮于棕色瓶中，室温放置一周后使用。 （3）0.05 mol/L pH4.5 的柠檬酸缓冲液A 液（0.1 mol/L 柠檬酸溶液）：准确称取C6H8O7 · H2O （MW=210.14）21.014g 于500mL大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入1 000mL 容量瓶中用蒸馏水定容至1 000mL，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。
土壤纤维素酶活性测定(3,5- 二硝基水杨酸比色法)
土壤纤维素酶活性测定（3,5-二硝基水杨酸比色法） 一、原理 纤维素是植物残体进入土壤的碳水化合物的重要组分之一。在纤维素酶作用下，它的最初水解产物是纤维二糖，在纤二糖酶作用下，纤维二糖分解成葡萄糖。所以，纤维素酶是碳素循环中的一个重要的酶。纤维素酶解所生成的还原糖与?3,5-二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关，因而可 用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。 二、试剂 1）甲苯 2）1%羧甲基纤维素溶液：1g羧甲基纤维素钠，用50%的乙醇溶至100ml。 3）pH5.5醋酸盐缓冲液： 0.2mol/L醋酸溶液11.55ml95%冰醋酸溶至1L； 0.2mol/L醋酸钠溶液16.4gC2H3O2Na或27.22gC2H3O2Na.3H2O溶至1L； 取11ml0.2mol/L醋酸溶液和88ml0.2mol/L醋酸钠溶液混匀即成PH5.5醋酸盐缓冲液。4）3,5-二硝基水杨酸溶液：称1.25g二硝基水杨酸，溶于50ml2mol/LNaOH和125ml 水中，再加75g酒石酸钾钠，用水稀释至250ml（保存期不过7天）。 5）葡萄糖标准液（1mg/mL） 预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。 若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。 三、操作步骤 葡萄糖标准曲线：分别吸1mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL 于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS溶液3ml混匀，于沸腾水浴中加热5min，
产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定模板
本科开放项目 题目：产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定 学生姓名： 指导教师： 学院： 专业班级： 2016年3月
产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定 摘要 纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是高等植物细胞壁的主要成分，是公认的自然界数量最丰富、最廉价的可再生有机物质资源。据估计，纤维素生成量每年高达1000亿吨。我国每年农作物秸秆总产量为7亿吨左右，仅农业生产中形成的农作物残渣（如稻草、玉米秸、麦秸等），每年就有5亿吨之多。纤维素的降解是自然界碳素循环的中心环节。但由于纤维素的结构特点，对纤维素的利用仍然非常有限。目前仅有20%的纤维素物质被开发利用，大量的纤维素物质因无法分解利用而废弃，不仅造成资源浪费，而且污染环境。随着人口数量的不断增长和人民生活水平的不断提高，能源危机、食物短缺、环境污染等问题日益严重，寻找利用可再生资源、节省粮食、减少环境污染的有效途径显得日趋重要。采用微生物技术处理秸秆是当前研究最多的一种秸秆处理方法,纤维素酶能将天然纤维素降解,生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖,然而目前制约纤维素材料转化为乙醇并实现产业化的关键因素之一是纤维素酶效率低下,从而造成生产成本过高。因此,筛选具有高活性纤维素酶的秸秆降解微生物菌株以及相关研究是当前研究的热点和难点。 关键词：纤维素降解高活性纤维素酶微生物菌株
目录 第1章绪论 (1) 1.1 实验原理 (1) 1.2 实验仪器及试剂 (1) 1.2.1 实验材料 (1) 1.2.2 实验仪器 (1) 1.2.3 培养基 (2) 第2章实验步骤 (3) 2.1 采样培养 (3) 2.2 初筛 (3) 2.3 复筛 (3) 2.4 酶活的测定 (3) 2.4.1原理 (3) 2.4.2溶液配制 (3) 2.4.3实验步骤 (4) 第3章实验结果 (6) 3.1 标准曲线的绘制 (6) 3.2 菌株复筛结果 (6) 3.3 测定纤维素酶活力结果 (7) 结束语 (8) 参考文献 (9)
纤维素酶活力测定
山东大学实验报告2011年4月20日 姓名张行润系年级2009级生科4班学号200900140177 同组者于潜科目生物化学实验题目纤维素酶活力测定—3,5-二硝基水杨酸法仪器编号105 一、实验目的 1、学会并掌握用3、5—二硝基水杨酸法测定酶活力方法 2、巩固使用分光光度计 二、实验原理 纤维素酶是一种多组分酶，包括C1酶、CX酶和β-葡萄糖苷酶三种主要组分。其中C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，CX酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维寡糖，β-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在550nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。 酶活力（enzyme activity）也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适。 本实验中酶活力定义：1mg酶每分钟水解生成1微克葡萄糖的量定义为一个活力单位。由此定义我们可以计算本实验中的纤维素酶活力。 三、实验器材 （1）722型分光光度计（2）恒温水浴 （3）沸水浴锅 （4）电炉子 （5）剪刀 （6）分析天平（7）试管架 （8）胶头滴管 （9）具塞比色管（25mL×10）（10）移液管（2mL；5mL）（11）烧杯（500mL×3）（12）洗耳球 四、实验材料 （1）纤维素酶：0.05g酶溶解定容至50ml，取1ml再定容至100ml待测（用PH4.5乙酸-乙酸钠缓冲液配制）； （2）3、5—二硝基水杨酸显色液； （3）0．5%羧甲基纤维素钠水溶液（CMC）：用0.1mol/LPH4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液配置；（4）标准葡萄糖溶液（1mg/mL）； （5）蒸馏水。 五、实验操作 1.空白管的测定：
纤维素酶的检测方法
纤维素CMC酶、FPA酶和半纤维素酶测定 1.纤维素CMC酶 1.0标题 用3.5一二硝基水杨酸法测定纤维素CMC酶活性单位。 2.0范围 生产分析和质量控制部门适用。 3.0原理 纤维素CMC酶（EC3.2.1.4）水解羧基纤维素分子中β－1.4葡萄糖苷键,释放出的还原糖(以葡萄糖计)与3.5二硝基水杨酸(DNS)反应,产生颜色变化,这种颜色变化与释放还原糖(以葡萄糖计)的量成正比关系,即与酶样品中的酶活性成正比。通过在550nm的光吸收值查对标准曲线(以葡萄糖为标准物)可以确定还原糖产生的量,从而确定出酶的活力单位。 4.0试剂 4.1无水醋酸钠(分析纯) 4.2冰醋酸(分析纯) 4.3 3.5－二硝基水杨酸 4.4无水葡萄糖 4.5四水酒石酸钾钠(分析纯) 4.6氢氧化钠(分析纯) 4.7重蒸苯酚(分析纯) 4.8无水亚硫酸钠(分析纯) 4.9叠氮化钠(分析纯) 4.10羧甲基纤维素钠 5.0仪器 5.1水浴锅(恒温)50±1℃ 5.2电热干燥箱80±1℃ 5.3 722型分光光度机计 5.4分析天平感量0.1㎎ 5.5一级玻璃制品 5.6电冰箱 6．0试剂的准备 6．1乙酸－乙酸钠缓冲溶液（PH=4.8） 溶液A：量取冰醋酸6ml，定容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。 溶液B：称取8.2g醋酸钠，溶解后容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。 以A：B=4：6的比例混合，低温冷藏备用。 6.2 DNS试剂: 溶液A:称分析纯NaOH 104g溶于1300ml水中,加入30g分析纯3.5一二硝基水杨酸。 溶液B:称分析纯酒石酸钾钠910g，溶于2500ml热水中，再称取25g重蒸苯酚和25g无水亚硫酸钠加入酒石酸钾钠溶液。 将A、B溶液混合，定容至5000ml，贮存于棕色瓶中，暗处放置一星期后可使用。 6.3 CMC溶液：用羧甲基纤维素钠（CMC）以PH4.8醋酸缓冲液配成1%的溶液。 7．0标准曲线制作： 7.1无水葡萄糖80℃烘干至恒重。 7.2准确称取1.000g溶于1000ml水中，加10mg叠氮化钠防腐，4℃冷藏备用。 7.3标准葡萄糖曲线制作
纤维素酶活力测定方法_张瑞萍
测试与标准 纤维素酶活力测定方法 张瑞萍 南通工学院(226007) 摘 要 用DN S 为显色剂,分别以滤纸和CM C 为底物,以滤纸糖酶活性(FP A )和羧甲基纤维素酶活性(CM C a se )表征纤维素酶活力。确定酶活测定用波长为530nm,参比溶液应为失活酶、底物和DN S 等共热的反应物;比较了两种底物的酶活力测定方法。结果表明,CM C a se 比FP A 高,说明酶对水溶性底物有较高的活力,也表明吸附对酶的活性部位与纤维素分子链段的结合及催化均有很大影响;对于不同牌号的纤维素酶,织物的酶减量率与CM C 酶活力关系密切。 叙 词: 测试 纤维素酶 活度中图分类号: TS197 纤维素酶是多组分复合物,各组分的底物专一性不同。纤维素酶作用的底物比较复杂,反应产物不同,致使纤维素酶活力测定方法很多,各国的方法亦不统一。我们选择滤纸、CM C 为底物,原理系利用纤维素酶催化水解纤维素,产生纤维多糖、二糖及葡萄糖等还原糖,与显色剂反应,求出还原糖的浓度,间接求出酶的活力。由不同底物测得的酶活力分别称作FPA (滤纸糖酶活力)和CM C ase (羧甲基纤维素酶酶活力)。本文分析确定酶活力测定的主要条件,比较两种底物的酶活力测定方法的结果,探讨纤维素酶活力与织物减量率的关系,为酶在生产中的利用提供依据。 1 实验方法 1.1 化学药品、材料 纤维素酶(工业品),DNS 试剂(自配),冰醋酸,醋酸钠,葡萄糖(均为分析纯),滤纸(定性),羧甲基纤维素酶CM C (试剂级),纯棉针织物半制品(南通针织厂)。 1.2 FPA 滤纸酶活力和CMC 酶活力的测定 取适当稀释的酶液,分别以滤纸或1%的CM C 溶液为底物,于50℃恒温水解反应1h ;然后加入显色剂DNS,沸水浴中煮沸5min;再加入蒸馏水,于530nm 测定吸光度OD 值。 酶活可定义为:每毫升酶液1min 产生1mg 葡萄糖为一个单位( )。 1.3 针织物酶减量率的测定 将酶处理前后的试样在烘箱中105℃烘至恒重。减量率= 处理前织物干重-处理后织物干重 处理前织物干重 ×100% 2 结果与讨论 2.1 显色剂的选择 选用DNS ,在碱性条件下与还原糖反应,生成有色化合物,用分光光度计比色,确定低分子糖含量。 碱性条件下DNS 与还原糖共热反应如下: O 2N OH O 2N CO OH +还原糖 H 2N OH CO OH O 2N DN S(黄色) 3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色) 生成的棕红色氨基化合物系比色法测定基础。2.2 最大吸收波长的确定 选取490～580nm 波长对显色液进行比色。由图1可知,不同浓度的葡萄糖溶液在490～500nm 处有最大吸收,DNS 在此波长下也有较明显的吸收。为了排除DNS 的干扰,选择在波长 530nm 处进行测定,此波长下的葡萄糖吸收虽有所降低,然而符合“吸收最大、干扰最小”的原则。 图1 D NS 与葡萄糖的吸收曲线 2.3 底物及酶本身含糖量的影响 在实验过程中发现,底物特别是滤纸,也含有一定的还原糖,在碱性的DNS 试剂中也会发色。而且,试验所用的纤维素酶是一种工业级的复合酶,品种不同,其本身含糖量也不同。为了排除这类还原糖的干扰,参比溶液取失活后的酶、底物、DNS 等共热的反应物。2.4 葡萄糖标准曲线 用不同浓度的葡萄糖溶液作为标准溶液,与DNS 共热反应显色后,测出其吸光度OD 值(见图2)。标准曲线的线性相关系数R 2为0.9991(见图2),线性相当好,可以用于酶活力的测定。 38 印 染(2002No .8) www .cdfn .com .cn
纤维素酶活力的测定Measurement of Cellulase Activities
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纤维素酶活力的测定
β-糖苷酶活力的测定(CＭC) 一目的: 掌握CMC酶活力测定纤维素酶的原理及测定方法。 原理: 纤维素酶能从底物羧甲基纤维素钠(CMＣ-Nａ)中分解出还原糖,还原糖又同3,５－而硝基水杨酸发生反应,产生一种黄橙混合色,用分光光度计可测定其色度,计算酶活力。 二试剂: 1.3,5-而硝基水杨酸显色剂(又称DNS试剂): 称取10g3,5-而硝基水杨酸,溶于蒸馏水中,加入20g分析纯NaOH,２00g酒石酸钾钠,加税5０0mｌ,升温溶解后,加入重蒸酚2ｇ,无水亚硫酸钠0、5g,加热搅拌,待全部溶解后,定容至1000mｌ。贮存于棕色瓶中,室温保存,放置一周后使用。 ２.０、1moｌ／ＬｐH4、5醋酸－醋酸钠缓冲液:称取结晶醋酸钠(CＨ3COOＮａ、3 Ｈ2Ｏ)13.６１g,醋酸(ＣH３COOH)6、０0g,用蒸馏水溶解,并定容至1００0 ml,配好后用pH计矫正。 3、1mg/ml葡萄糖标准溶液:准确称取10０mｇ分析纯葡萄糖(预先在70℃、60０nm汞柱下干燥5h至恒重),用少量蒸馏水溶解并定容至100ｍl,冰箱中保存备用。 ４.代测酶液:称取酶粉1、0ｇ(或吸取酶液1、０0ml),先用少量的０、05ｍoｌ／L pＨ４、5醋酸-醋酸钠缓冲液溶解,并用玻璃棒捣研,然后将上清液小心倾入适当的容量瓶中,沉渣部分再加上述缓冲液溶解,如此反复捣研３－4次,最后全部移入容量瓶中,用缓冲液定容至刻度,４0℃水浴锅中浸提1h,用四层纱布或脱
脂棉过滤,滤液供测定用。 5、底物:０.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液,配制方法为城区0、5000g 羧甲基纤维素钠(Ｓigmａ公司生产),准确至０、0０1g,用上述缓冲液溶解定容至100ml,冰箱中保存,有效期3d。 三仪器: 分析天平、变温电炉、恒温水浴锅、分光光度计、秒表等。 四方法步骤: 1．标准曲线的绘制 分别吸取0.２, 0.４, 0、6, ０、8, 1.0, 1.2, １.4ｍl的1ｍg／ml葡萄糖液于７支20ｍl的比色管中,分别用蒸馏水补充体积至2、ｏml,各加３,５-而硝基水杨酸1、5ml,在沸水浴中煮沸5ｍiｎ,冷却后分别用蒸馏水定容至２0ｍl,摇匀。以2ml蒸馏水加DNS溶液１、5mｌ,按上述同样操作为空白调零,在５40ｎm处比色。标准曲线绘制个试管所含物质的体积见下表。以吸光度A值为纵坐标,葡萄糖毫克数Ｗ(mg)为横坐标绘制出标准曲线(理论上此线应过原点)。 标准曲线绘制各试管所含物质的体积
纤维素酶活力的测定
β-糖苷酶活力的测定（CMC） 一目的： 掌握CMC酶活力测定纤维素酶的原理及测定方法。 原理： 纤维素酶能从底物羧甲基纤维素钠（CMC-Na）中分解出还原糖，还原糖又同3，5-而硝基水杨酸发生反应，产生一种黄橙混合色，用分光光度计可测定其色度，计算酶活力。 二试剂： 1．3，5-而硝基水杨酸显色剂（又称DNS试剂）：称取10g3,5-而硝基水杨酸，溶于蒸馏水中，加入20g分析纯NaOH，200g酒石酸钾钠，加税500ml,升温溶解后，加入重蒸酚2g,无水亚硫酸钠0.5g,加热搅拌，待全部溶解后，定容至1000ml。贮存于棕色瓶中，室温保存，放置一周后使用。 2．0.1mol/L pH4.5醋酸-醋酸钠缓冲液：称取结晶醋酸钠（CH3COONa.3 H2O）13.61g，醋酸（CH3COOH）6.00g，用蒸馏水溶解，并定容至1000 ml，配好后用pH计矫正。 3．1mg/ml葡萄糖标准溶液：准确称取100mg分析纯葡萄糖（预先在70℃、600nm汞柱下干燥5h至恒重），用少量蒸馏水溶解并定容至100ml，冰箱中保存备用。 4．代测酶液：称取酶粉1.0g（或吸取酶液1.00ml），先用少量的0.05mol/L pH4.5醋酸-醋酸钠缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，然后将上清液小心倾入适当的容量瓶中，沉渣部分再加上述缓冲液溶解，如此反复捣研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，40℃水浴锅中浸提1h，用四层纱布或脱脂
棉过滤，滤液供测定用。 5．底物：0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液，配制方法为城区0.5000g 羧甲基纤维素钠（Sigma公司生产），准确至0.001g,用上述缓冲液溶解定容至100ml,冰箱中保存，有效期3d。 三仪器： 分析天平、变温电炉、恒温水浴锅、分光光度计、秒表等。 四方法步骤： 1．标准曲线的绘制 分别吸取0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4ml的1mg/ml葡萄糖液于7支20ml的比色管中，分别用蒸馏水补充体积至2.oml,各加3，5-而硝基水杨酸1.5ml,在沸水浴中煮沸5min，冷却后分别用蒸馏水定容至20ml，摇匀。 以2ml蒸馏水加DNS溶液1.5ml,按上述同样操作为空白调零，在540nm 处比色。标准曲线绘制个试管所含物质的体积见下表。以吸光度A值为纵坐标，葡萄糖毫克数W(mg)为横坐标绘制出标准曲线（理论上此线应过原点）。 标准曲线绘制各试管所含物质的体积 2．酶样测定
纤维素酶活力的测定
实验二十纤维素酶活力的测定 一、目的 学习和掌握3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定纤维素酶活力的原理和方法，了解纤维 素酶的作用特性。 二、原理 纤维素酶是一种多组分酶，包括C 酶、C 酶和 |?-葡萄糖苷酶三种主要组分。其中C 1 X 1 酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，C 酶的作用是将无定形纤维素继续水解成 X 纤维寡糖，|?-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤维素产生的 纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红 色的氨基化合物，在540nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜 色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1．实验材料 （1）纤维素酶制剂 500mg （2）新华定量滤纸 50mg / 份 4 （3）脱脂棉花 50mg / 份 4 （4）羧甲基纤维素钠（CMC） 510mg （5）水杨酸苷 500mg 2．主要仪器 （1）722 型或其他型号的可见分光光度计 （2）恒温水浴 2 台 （3）沸水浴锅 （4）电炉子 （5）剪刀 （6）万分之一分析天平 （7）恒温干燥箱 （8）冰箱 （9）试管架
（10）胶头滴管 （11）具塞刻度试管 20mL24 （12）移液管或加液器 0.5 mL3；2mL7 （13）容量瓶 100 mL6；1000 mL3 （14）量筒 50 mL2；100 mL1；500 mL1 （15）烧杯 100 mL6；500mL3；1 000 mL1 3．试剂（均为分析纯） （1）浓度为 1mg/mL的葡萄糖标准液 将葡萄糖在恒温干燥箱中105℃下干燥至恒重，准确称取100mg 于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至 100mL，充分混匀。4℃冰箱 中保存（可用 12～15 天）。 （2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）溶液 准确称取DNS 6.3g于500mL大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，加入2mol/L NaOH 溶 液 262mL，再加到 500mL含有 185g酒石酸钾钠（C H O KNa ! 4H O，MW=282.22）的热 4 4 6 2 水溶液中，再加5g结晶酚（C H OH，MW=94.11）和5g无水亚硫酸钠（Na SO ，MW=126.04）， 6 5 2 3 搅拌溶解，冷却后移入1 000mL容量瓶中用蒸馏水定容至1 000mL，充分混匀。贮于棕色 瓶中，室温放置一周后使用。 （3）0.05 mol/L pH4.5 的柠檬酸缓冲液 A 液（0.1 mol/L 柠檬酸溶液）：准确称取C H O ! H O（MW=210.14） 21.014g于 500mL 6 8 7 2 大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入1 000mL容量瓶中用蒸馏水定容至 1 000mL，充分 混匀。4℃冰箱中保存备用。 B 液（0.1 mol/L 柠檬酸钠溶液）：准确称取Na C H O ! 2H O（MW=294.12）29.412g 3 6 5 7 2 于500mL 大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入1 000mL 容量瓶中，然后用蒸馏水定容 至 1 000mL，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。
土壤纤维素酶测定方法
纤维素酶活性测定 一、试剂： 1）醋酸缓冲液（pH 5.5）：164.08 g无水醋酸钠（C2H3O2Na）溶于700 ml去离子水，用醋酸（C2H4O2）调节pH至5.5，用去离子水稀释至1 L。 2）CMC溶液（0.7%，w:v）：7 g羧甲基纤维素钠盐溶于1 L醋酸缓冲液，45℃下搅拌2 h，此溶液在4℃下可存放7天。 3）还原糖试剂： 试剂A：16 g无水碳酸钠（Na2CO3）和0.9 g氰化钾（KCN）溶于去离子水并稀释至1 L。试剂B：0.5 g六氰铁钾（K4Fe（CN）6）溶于去离子水并稀释至1 L，贮于棕色瓶中。 试剂C：1.5 g 硫酸铁铵（NH4SO4Fe2(SO4)2·H2O）、1 g十二烷基硫酸钠（C12H25O4SNa）和4.2 ml浓硫酸溶于50℃去离子水，冷却后稀释至1 L。 4）水合葡萄糖溶液：28 mg水合葡萄糖溶于少量去离子水中，并定容至1 L。 二、仪器设备 恒温培养箱，水浴锅，分光光度计，搅拌器，三角瓶 三、操作步骤 取10.00 g（耕地）或5.00 g（林地）新鲜土壤（＜2 mm）于100 ml三角瓶中，加15 ml 醋酸缓冲液和15 ml CMC溶液，盖上塞子，于50℃下培养24 h，过滤。同时做空白对照，但在培养结束时才加入15 ml CMC溶液，并迅速过滤。 取2.00 ml滤液于50 ml容量瓶中，并用去离子水定容至刻度。吸取2.00 ml稀释液于20 ml试管中，加2.00 ml还原糖试剂A和2.00 ml还原糖试剂B，盖紧混匀，在100℃水浴中加热15 min 后，立即至于20℃水中冷却5 min。加10.00 ml还原糖试剂C，混匀，20℃下静置显色60 min，于690 nm波长处比色测定（要求在30 min内完成）。 标准曲线：吸取0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 ml水合葡萄糖溶液，用去离子水稀释至2 ml，同上加入还原糖试剂A、B、C后，比色测定还原糖含量。c) 空白： 无土空白：不加土样，其余操作与样品试验相同，整个试验设置一个，重复一次。 无基质空白：以等体积水代替基质，每个土样设置一个。
纤维素酶活的测定
纤维素酶活的测定 一纤维素酶活力单位定义 在37℃、pH值为5.50的条件下，每分钟从浓度为4mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液中降解1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。 二测定原理 纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原集团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应，反应颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中的纤维素酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中的纤维素酶的活力。 三试剂与溶液 除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的三级水。 3.1 葡萄糖溶液，c（C6H12O6）=10.0mg/ml 称取无水葡萄糖1.000g，加水溶解，定容至100ml。 3.2 乙酸溶液，c(CH3COOH)=0.1mol/L 吸取冰乙酸0.60ml，加水溶解，定容至100ml。 3.3 乙酸钠溶液，c（CH3COONa）=0.1 mol/L 称取三水乙酸钠1.36g，加水溶解，定容至100ml。 3.4 氢氧化钠溶液，c（NaOH）=200g/L 称取氢氧化钠20.0g，加水溶解，定容至100ml。 3.5 乙酸-乙酸钠缓冲溶液，c（CH3COOH-CH3COONa） 称取三水乙酸钠11.57g，加入冰醋酸0.85ml，加水溶解，定容至1000ml，测定溶液的pH值，如果pH偏离5.50，用乙酸溶液（3.2）或乙酸钠溶液（3.3）调至5.50. 3.6 羧甲基纤维素钠溶液，0.8%（w/v） 称取羧甲基纤维素钠（Sigma C5678）0.40g，加入到盛有30ml3.5缓冲溶液的烧杯中，磁力搅拌，同时缓慢加热，直至羧甲基纤维素钠完全溶解（在搅拌加热过程中可以补加适量的缓冲液，但是溶液的总体积不能超过50ml），停止搅拌，用3.5缓溶将其定容至50ml，羧甲基纤维素钠溶液能立即使用，使用前适当摇匀。4℃避光保存，有效期为3天。 3.7 DNS试剂 称取3，5-二硝基水杨酸（化学纯）3.15g，加水500ml，搅拌5min，水浴至45℃，然后逐步加入100ml 氢氧化钠溶液（3.4），同时不断搅拌，知道溶液清澈透明（在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃）.再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g，继续45℃水浴加热，同时补加水300ml，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解，停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000ml，用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储存在棕色试剂瓶中，避光保存，室温下可以存放7天后可以使用，有效期为6个月。 四仪器与设备 4.1 实验室用样品粉碎机或碾钵。 4.2分样筛：口径为0.25mm（60目）。 4.3分析天平：精确至0.001g。 4.4 pH计：精确至0.01. 4.5磁力搅拌器：附加热功能。 4.6振荡器
纤维素酶活力的测定
实验5纤维素酶活力的测定 一、原理： 纤维素酶水解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，能将3、5-二销基水杨酸中销基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量来表示酶的活力。 二、试剂： 1、3、5—二销基水杨酸显色液：称取10克3、5-二销基水杨酸，溶入蒸馏 水中，加入20克分析纯氢氧化钠，200克酒石酸钾钠，加水500毫升，升温溶解后，加入重蒸酚2克，无水亚硫酸钠0.5克。加热搅拌，待全溶后冷却，定容至1000毫升。存于棕色瓶中，放置一周后使用。 2、0.1摩尔PH4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液。 3、0．5%羧甲基纤维素钠水溶液，溶解后成胶状液，静置过夜。使用前摇匀。 4、标准葡萄糖溶液：称取干燥至恒重的葡萄糖100毫克，溶解后定容至100 毫升，此溶液含葡萄糖1.00毫克/毫升。 三、测定方法： 1、标准曲线的绘制：分别吸取0. 2、0.4、0.6 、0.8.0、1.0毫升的葡萄糖于5 支试管中,均用蒸馏水稀释至1毫升,加3.5-二销基水杨酸显色剂3毫升, 在沸水浴中煮沸显色10分钟,冷却,加蒸馏水21毫升,摇匀.以1毫升蒸馏 水代替糖作空白管,在550nm处比色。以光密度为纵坐标，以葡萄糖微克 数为横坐标，绘出标准曲线。 2、样品的测定：取0.5%羧甲基纤维素钠溶液3毫升，酶液1毫升,于40度 水浴中糖化30分钟,取出,立即于沸水浴中煮沸10分钟使酶失活,得糖化 液。取糖化液１毫升，按制标准曲线时一样加显色液比色。同时以１毫 升煮沸的酶液代替酶做一空白对照。 四、计算： 在上述条件下，1毫克酶每分钟催化纤维素水解生成１微克葡萄糖的酶量定为一个活力单位。 N *OD值对应的葡萄糖量 纤维素酶活力单位＝—————————————— ３０*１N---酶液的稀释倍数 ３０――糖化所用时间 １――反应酶液毫升数
土壤纤维素酶活性测定(3,5- 二硝基水杨酸比色法)
土壤纤维素酶活性测定（3,5- 二硝基水杨酸比色法） 一、原理 纤维素是植物残体进入土壤的碳水化合物的重要组分之一。在纤维素酶作用下，它的最初水解产物是纤维二糖，在纤二糖酶作用下，纤维二糖分解成葡萄糖。所以，纤维素酶是碳素循环中的一个重要的酶。纤维素酶解所生成的还原糖与 3,5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。 二、试剂 1）甲苯 2）1%羧甲基纤维素溶液：1g 羧甲基纤维素钠，用50%的乙醇溶至100ml。 3）pH5.5醋酸盐缓冲液： 0.2mol/L 醋酸溶液11.55ml 95% 冰醋酸溶至1L； 0.2mol/L 醋酸钠溶液16.4g C2H3O2Na或27.22g C2H3O2Na.3H2O溶至1L； 取11ml 0.2mol/L 醋酸溶液和88ml 0.2mol/L 醋酸钠溶液混匀即成PH 5.5醋酸盐缓冲液。4）3,5-二硝基水杨酸溶液：称1.25g二硝基水杨酸，溶于50ml 2mol/LNaOH和125ml水中，再加75g酒石酸钾钠，用水稀释至250ml（保存期不过7天）。 5）葡萄糖标准液（1mg/mL） 预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。 三、操作步骤 葡萄糖标准曲线：分别吸1mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS溶液3ml混匀，于沸腾水浴中加热5min，取出立即泠水浴中冷却至室温，以空白管调零在波长540nm处比色，以OD值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。 称10g土壤置于50ml三角瓶中，加入1.5ml甲苯，摇匀后放置15min，再加5ml 1%羧甲基纤维素溶液和5ml pH5.5醋酸盐缓冲液，将三角瓶放在37℃恒温箱中培养72h。培养结束后，过滤并取1ml滤液，然后按绘制标准曲线显色法比色测定。（为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照；如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样。） 四、结果计算 纤维素酶活性以72h，1g干土生成葡萄糖毫克数表示。 纤维素酶活性=（a样品－a无土－a无基质）×n／m 其中：a样品、a无土、a无机质分别表示其由标准曲线求的葡萄糖毫克数；n为分取倍数；m表示烘干土重
两种常用纤维素酶活力测定方法---滤纸酶活-CMC酶活
检测纤维素酶酶活力—滤纸酶活力(FPA) 滤纸酶活力代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。 采用3，5一二硝基水杨酸法测定酶活：(简称DNS法) 1、原理：纤维素经纤维素酶水解后生成还原糖，还原糖能将3，5一二硝基水杨酸中硝基还原成氨基，溶液变为橙色的氨基化合物，即：3一氨基一5二硝基水杨酸，在一定的还原糖浓度范围内，橙色的深度与还原糖的浓度成正比，据此可以推算出纤维素酶的活力。 2、采用的滤纸酶活单位定义： 滤纸酶活反映了纤维素酶的3种水解酶，即内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β葡聚糖苷酶组成的诱导复合酶系的协同水解纤维素能力。是该菌株整个纤维素酶系的酶活力水平的综合体现。代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。在此滤纸酶活单位定义为：以滤纸为底物，在一定反应条件(pH4.8，50℃，恒温lh)下，以水解反应中，1ml纤维素酶液1min催化纤维素生成lug葡萄糖为1个滤纸酶活单位，以U表示。 3、滤纸酶活力(FPA)的测定： ①取0．5ml适当稀释的酶液，加入PH值为4.8，0.1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液lml或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液lml； ②再加入50±0.5mg滤纸(1cmx6cm)一条，于50℃保温酶解反应1小时，(先预热5分钟)； ③加入DNS显色液3ml(标准曲线用量是1.5ml)，放入已沸腾的水中沸水浴lOmin，流水冷却后在540nm下测吸光度； ④同时用100℃煮沸lOmin后失活的酶液做对照，扣除本底； ⑤根据吸光度从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算出酶活值。 滤纸酶活按下面公式计算： X=（WxNxlOOO）／（TxM） X:为滤纸酶酶活力，单位U／mL。 W：为从葡萄糖标准曲线中查得的葡萄糖的浓度。 N：为酶液稀释总倍数。 T：为反应时间。 M：为样品的体积。 4、葡萄糖标准曲线绘制方法 标准曲线绘制：取25ml具塞刻度试管6支，加入1.0 mg /ml的葡萄糖标准溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml,加蒸馏水2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0.0ml,加DNS试剂1.5 ml，混匀后在沸水浴中加热5分钟，取出立即用冷水冷却，用水定容至25 ml，摇匀，测吸光度A，以吸光度为纵坐标，葡萄糖的含量为横坐标，绘制标准曲线。 5、3，5二硝基水杨酸（DNS）试剂 称取6.3克3,5-二硝基水杨酸用水溶解，加入21.0克NaOH，182克酒石酸钾钠，加500ml 水，加热溶解后再加入5.0克重蒸酚和5.0克亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却，定容至1000ml，存于棕色瓶中，放置7天后使用。