抗氧化酶测定实验方法

植物组织中丙二醛（MDA）含量的测定

一、原理

植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。MDA从膜上产生的位置释放出后，可以与蛋白质、核酸反应，从而丧失功能，还可使纤维素分子间的桥键松驰，或抑制蛋白质的合成。因此，MDA的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害。

丙二醛(MDA)是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的三甲川(3，5，5—三甲基恶唑-2，4。二酮)，其最大吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，但532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中MDA—TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。低浓度的铁离子能够显著增加TBA与蔗糖或MDA显色反应物在532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、MDA与TBA显色反应中需一定量的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为每克千重100—300ug·g-1，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3+的终浓度为0．5umol·L-1。

二、方法直线回归法MDA与TBA显色反应产物在450nm波长下的吸光度值为零。不同浓度的蔗糖(0—25mmol·L-1)与TBA显色反应产物在

450nm的吸光度值与532nm和600nm处的吸光度值之差成正相关，配制一系列浓度的蔗糖与TBA显色反应后，测定上述三个波长的吸光度值，求其直线方程，可求算糖分在532nm处的吸光度值。UV-120型紫外可见分光光度计的直线方程为：

Y532＝-0．00198十0．088D450 (44—1)

D450、D532、D600分别代表450、532和600nm波长下的吸光度值。三、材料、仪器设备及试剂1、[仪器设备]紫外可见分光光度计1台；离心机1台；电子天平1台；10ml离心管4支；研钵2套；试管4支；刻度吸管：10ml1支，2ml1支；剪刀1把。

2、[试剂]

(1)10％三氯乙酸(TCA)；(2) 0．6％硫代巴比妥酸：先加少量的氢氧化钠(1mol·L-1)溶解，再用10％的三氯乙酸定容；石英砂。

四、步骤

1．实验材料受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片或衰老的植物器官。

2．MDA的提取称取剪碎的试材1g，加入2mll0％TCA和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8mlTCA研磨，匀浆在4000r·min-1离心10min，上清液为样品提取液。

3．显色反应和测定吸取离心的上清液2ml(对照加2ml蒸馏水)，加入2ml 0．6％TBA溶液，混匀物于沸水浴上反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液测定532、600和450nm 波长下的吸光度。

4．计算含量

(1)直线方程法按公式Y532= -0.00198十0.088D450 (44—1)

求出样品中糖分在532nm处的吸光度值Y532，用实测532nm的吸光度值减去600nm非特异吸收的吸光度值再减去Y532，其差值为测定样品中MDA—TBA反应产物在532nm的吸光度值。按MDA在532nm处的毫摩尔吸光系数为155换算求出提取液中MDA浓度。

MDA(mmol﹒g-1Fw)=[6.452×(D532-D600)-0.559×D450]×vt/(vs

×w)

式中，Vt：提取液总体积（mL）；

Vs：测定用提取液体积（ml）；

FW：样品鲜重（g）。

氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性

一、目的

学习和掌握氯化硝基四氮唑蓝（NBT）光化还原法测定SOD活力的方法和原理，并了解SOD的作用特性。

二、原理

SOD是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的SOD：Mn－SOD和Cu.Zn－SOD，它们都催化下列反应：

由于超氧自由基（O

2

.－）为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为间接方法。并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。核黄素在有氧条件下能产生

超氧自由基负离子O

2

.－，当加入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲月替（黄色），继而还原生成二甲月替，它是一种蓝色物质，在560nm波长

下有最大吸收。当加入SOD时，可以使超氧自由基与H+结合生成H

2O

2

和O

2

，从而

抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲月替生成速度减慢。通过在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值，抑制NBT 光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比，以酶液加入量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，在坐标纸上绘制出二者相关曲线，根据SOD 抑制NBT光还原相对百分率计算酶活性。找出SOD抑制NBT光还原相对百分率为50％时的酶量作为一个酶活力单位（U）。

三、实验材料、主要仪器和试剂

1．实验材料

小麦、玉米、水稻、棉花等新鲜叶片

2．主要仪器

（1）722型或其他型号的可见分光光度计（2）万分之一分析天平

（3）高速冷冻离心机（4）冰箱（5）光照箱：4 500Lux（6）带盖瓷盘 1个/处理（7）移液管架（8）研钵（9）离心管 5mL数个（10）微烧杯 10～15mL 8个/处理（11）移液管或加样器 0.5mL×4；1mL×2；2mL×2；5mL×1（12）微量进样器 50μL×2；100μL×2（13）烧杯 50mL×3；100mL×5；500mL ×1；1 000mL×2（14）量筒 50mL×1；100mL×2（15）容量瓶 50mL×1；100mL×5；250mL×1；1 000mL×2（16）细口瓶 125mL×5

3．试剂

（1）0.1 mol/L pH7.8磷酸钠（Na

2HPO

4

-NaH

2

PO

4

）缓冲液

A液（0.1 mol/L Na

2HPO

4

溶液）：准确称取Na

2

HPO

4

· 12H

2

O（MW=358.14）

3.5814g于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。

B液（0.1 mol/L NaH

2PO

4

溶液）：准确称取NaH

2

PO

4

· 2H

2

O （MW=156.01）

0.780g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入50mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。

取上述A液183mL与B液17mL充分混匀后即为0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液。4℃冰箱中保存备用。

（2）0.026 mol/L 蛋氨酸（Met）磷酸钠缓冲液

准确称取L-蛋氨酸（C

5H

11

NO

2

S，MW=149.21）0.3879g于100mL小烧杯中，用

少量0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液溶解后，移入100mL容量瓶中并用0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液定容至刻度，充分混匀（现用现配）。4℃冰箱中保存可用1～2d。

（3）7.5 × 10－4 mol/L NBT溶液

准确称取NBT（C

4OH

3

OCl

2

N

10

O

6

，MW=817.7）0.1533g于100mL小烧杯中，用少

量蒸馏水溶解后，移入250mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀（现配现用）。4℃冰箱中保存可用2～3d。

（4）含1.0μmol/L EDTA的2 × 10－5 mol/L核黄素溶液

A液：准确称取EDTA（MW=292）0.00292g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。

B液：准确称取核黄素（MW=376.36）0.0753g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。

C液：合并A液和B液，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，此溶液为含0.1mmol/L EDTA的2mmol/L 核黄素溶液。4℃冰箱中保存可用8～10d。该溶液应避光保存，即用黑纸将装有该液的棕色瓶包好，置于4℃冰箱中保存。

当测定SOD酶活时，将C液稀释100倍，即为含1.0μmol/L EDTA的2 × 10－5 mol/L 核黄素溶液。

（5）0.05 mol/L pH7.8磷酸钠缓冲液

取0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液50mL，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。

（6）石英砂。

四、操作方法和步骤

1．酶液的制备

按每克鲜叶加入3mL 0.05 mol/L pH7.8磷酸钠缓冲液，加入少量石英砂，于冰浴中的研钵内研磨成匀浆，定容到5mL刻度离心管中，于8 500 r/min（10 000g）冷冻离心30min，上清液即为SOD酶粗提液。

2．酶活力的测定

每个处理取8个洗净干燥好的微烧杯编号，按表1加入各试剂及酶液，反应系统总体积为3mL。其中4～8号杯中磷酸钠缓冲液量和酶液量可根据试验材料中酶液浓度及酶活力进行调整（如酶液浓度大、活性强时，酶用量适当减少）。

各试剂全部加入后，充分混匀，取1号微烧杯置于暗处，作为空白对照，比色时调零用。其余7个微烧杯均放在温度为25℃，光强为4 500Lux的光照箱内（安装有3根20W的日光灯管）照光15min，然后立即遮光终止反应。在560nm 波长下以1号杯液调零，测定各杯液光密度并记录结果。以2、3号杯液光密度的平均值作为抑制NBT光还原率100％，根据其他各杯液的光密度分别计算出不同酶液量的各反应系统中抑制NBT光还原的相对百分率。以酶液用量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，作出二者相关曲线。找出50％抑制率的酶液量（μL）作为一个酶活力单位（U）。

表1 反应系统中各试剂及酶液的加入量（mL）

五、结果计算

1．560nm波长下各杯液的光密度（表2）

表2 测定数据列表

杯号123456782、3号平均值

酶液量（mL）0000.050.100.150.200.25—

光密度（OD560nm）0

抑制率（％）—100100100

以酶液加入量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，在坐标纸上绘制出二者相关曲线。找出50％抑制率的酶液量（μL）作为一个酶活力单位（U）。

2．SOD酶活力按下式计算

A＝V × 1000 × 60 B × W × T

式中各因子代表内容如下：

A：为酶活力（酶活力单位：U/g（FW）·h）；V：为酶提取液总体积（mL）；

B：为一个酶活力单位的酶液量（μL）；

W：为样品鲜重（g）；

T：为反应时间（min）；

1 000：为1mL = 1 000μL；

60：为1h = 60min。

3．抑制率按下式计算

抑制率= D

1

—D

2×100％D

1

D 1：为2、3号杯液的光密度平均值；D

2

：为加入不同酶液量的各杯液的光密

度值。

注：有时因测定样品的数量多，每个样品均按此法测定酶活力工作量将会很大，也可每个样品只测定1个或2个酶液用量的光密度值，按下式计算酶活力。

A＝(D

1

－D

2

) × V × 1000 × 60

D

1

× B × W × T × 50％

D 1：为2、3号杯液的光密度平均值；D

2

：为测定样品酶液的光密度；

50％：为抑制率50％；其它各因子代表的内容与上述SOD酶活力计算公式的各因子代表的内容相同。

六、注意事项

1．富含酚类物质的植物（如茶叶）在匀浆时产生大量的多酚类物质，会引起酶蛋白不可逆沉淀，使酶失去活性，因此在提取此类植物SOD酶时，必须添加多酚类物质的吸附剂，将多酚类物质除去，避免酶蛋白变性失活，一般在提取液中加1～4％的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。

2．测定时的温度和光化反应时间必须严格控制一致。为保证各微烧杯所受光强一致，所有微烧杯应排列在与日光灯管平行的直线上。

过氧化氢酶(CAT)活性

过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。

紫外吸收法

一、原理】

H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。

【仪器与设备与试剂】

1、材料

小麦叶片等。

2、仪器设备

研钵；离心机；250ml容量瓶；移液管（0.5ml、2ml各2支）；10ml试管3支；恒温水浴；紫外分光光度计；

3、试剂

0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）；

0.1mol/L H2O2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）。

【方法】

1.酶液提取：

称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm 下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。5℃下保存备用。

酶活性测定

取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表2-14-1顺序加入试剂。

将S0号管在沸水浴煮1min以杀死酶液，冷却。然后将所有试管在25℃预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色皿中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。

3.结果计算：

以每分钟A 240减少0.1的酶量为1个酶活单位（U ）。 过氧化氢酶活性U/(g.min)=

W

t V V A S T

?????1.0240

?A 240= A S0－

2

)

(21S S A A +

式中 A S0—加入煮死酶液的对照管吸光值； A S1, A S2—样品管吸光值； Vt —粗酶提取液总体积（ml ）； V 1—测定用粗酶液体积（ml ）； FW —样品鲜重（g ）；

0.1—A 240每下降0.1为1个酶活单位（u ）； t —加过氧化氢到最后一次读数时间（min ）。 【注】 所用H2O2溶液及KMnO 4一溶液临用前需重新标定。

【注意事项】

凡在240nm 下有强吸收的物质对本实验有干扰。

过氧化物酶（POD ）活性测定（愈创木酚比色法测定）

一、实验原理：

过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。

在有过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在 470 nm 处有最大吸收，可用分光光度计测量 470 nm 处的吸光度变化速率来测定过氧化物酶活性。

二、仪器、药品与材料

1）实验材料 新鲜植物组织。 2）仪器与用品

分光光度计，研钵，恒温水浴锅，100 mL 容量瓶，吸管，高速冷冻离心机，秒表，磁力搅拌器。

3）试剂

１．愈创木酚。 ２．30％过氧化氢。

３．100 mmol/L 磷酸缓冲液 pH 6.0 （见附录7）。

４．反应混合液：取100 mmol/L 磷酸缓冲液（pH 6.0）50 mL 于烧杯中，加入愈创木酚28 μL ，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入 30 % 过氧化氢 19 μL ，混合均匀，保存于冰箱中备用。 三、实验步骤

1．称取植物材料0.1 g ，剪碎，放入研钵中，加入适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，残渣再用5 mL 磷酸缓冲液提取一次，以4000 rpm 低温离心15 min ，上清液即为粗酶液，定容至10 mL刻度，贮于低温下备用。

2．取2支试管，于1只中加入反应混合液3 mL 和磷酸缓冲液1mL，作为对照，另1支中加入反应混合液3 mL和上述酶液1mL（如酶活性过高可稀释之）。迅速将两支试管中溶液混匀后，倒入比色杯，置于分光光度计样品室内，立即开启秒表记录时间，于470 nm 处测定吸光度（OD）值，每隔10S读数一次。

四、结果计算：

以每分钟OD变化值（ΔA470 / gFW min）表示酶活性大小，。也可以用每min

OD值变化0.01作为1个过氧化物酶活性单位（U）表示。

过氧化物酶活性（U/gFW·min）= ΔA470×VT/W×VS×0.01×t

式中：

ΔA470——反应时间内OD变化值。

VT ——提取酶液总体积（mL）。

W ——植物鲜重（g）。

Vs ——测定时取用酶液体积（mL）。

t ——反应时间（min）。

植物组织中蔗糖酶活力的测定DNS法（3,5-二硝基水杨酸）

一、原理

3，5-二硝基水杨酸3,5-Dinitrosalicylic acid ，简称DNS。在碱性条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸共热，3,5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质)，还原糖则被氧化成糖酸及其它产物。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度量呈一定的比例关系，在540nm波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线可求出样品中还原糖的含量。

二、仪器与用具：

25ml刻度试管；离心管；100ml玻璃烧杯；100ml三角瓶；刻度吸管1ml、2ml、10ml；沸水浴；离心机；电子天平；分光光度计；水浴锅；移液枪。

DNS试剂配制

（1）以称取3,5-二硝基水杨酸（C7H4N2O7）6.3 g，氢氧化钠21.0 g充分溶解于500 ml 蒸馏水中（水先煮沸10分钟后冷却）

（2）加入酒石酸钾钠（C4H4O6KNa·4H2O）182.0g，苯酚（在50℃水中融化）5.0 ml，偏重亚硫酸钠（NaS2O5）5.0g，搅拌至全溶，定容至1000 ml。

（3）充分溶解后盛于棕色瓶中，放置10天后便可使用。平时盛一小瓶放在外面使用，

其它储于冰箱中。此溶液每月配制一次。

注意：DNS一定要在配制结束后立即转移到小棕色瓶中，同时，使用过程中尽量减少与空气接触。

三、试剂：

1. 2mg/ml葡萄糖标准液：准确称取100mg分析纯葡萄糖（预先在80℃烘至恒重），在小烧杯中用蒸馏水溶解后定容至100ml，摇匀，冰箱中保存备用。

2. 3,5－二硝基水杨酸(DNS)：含有将185g酒石酸钾钠溶于300ml的热水中，配成大约500ml的溶液，将6.3g 3,5－二硝基水杨酸和262ml 2mol/lNaOH加入该热溶液，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌微热溶解。冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶备用。

四、实验步骤：

1．可溶性糖的提取：准确称取烟叶样品0.100g，置于离心管中，加入8ml80%乙醇，于80℃水浴浸提30min，冷却后于4000转离心5min收集上清液，残渣再加入8ml80%乙醇，再次浸提，重复两次，将三次提取的上清液合并于100ml容量瓶中并用蒸馏水定容至100ml。

2．还原糖的测定：取提取液1ml于试管中（空白中用1ml蒸馏水代替），加入DNS 试剂1.5ml，摇匀，于沸水浴中加热5min，取出后立即浸入冷水冷却至室温定容至25ml，摇匀，然后在540nm波长处比色。

3．标准曲线的绘制：取干洁25ml试管6支，依次加入葡萄糖标准液（1mg/ml）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml和蒸馏水1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0ml，再分别加入DNS试剂1.5ml，于沸水浴中加热5min，取出后立即浸入冷水冷却至室温，再用蒸馏水定容至25ml刻度处，摇匀，然后在540nm波长处比色。

4．计算：还原糖（％）=〔（C×V/a）/(W×1000)〕×100

C—标准曲线方程求得的还原糖含量mg数； V－提取液的体积（ml）；

W—样品重量（g）; a —显色时吸取样品液体积（ml）

几种抗氧化酶的作用

一.超氧化物歧化酶(SOD): 超氧化物歧化酶，是一种新型酶制剂，是生物体重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体，如动物，植物，微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物体清除自由基的首要物质。SOD在生物体的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标；现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞。由于现代生活压力，环境污染，各种辐射和超量运动都会造成氧自由基大量形成；因此，生物抗氧化机制中SOD的地位越来越重要！ 超氧化物歧化酶(SOD)按其所含金属辅基不同可分为三种，第一种是含铜（Cu）锌（Zn）金属辅基的称（Cu.Zn—SOD），最为常见的一种酶，呈绿色，主要存在于机体细胞浆中；第二种是含锰（Mn）金属辅基的称（Mn—SOD），呈紫色，存在于真核细胞的线粒体和原核细胞；第三种是含铁（Fe）金属辅基的称（Fe—SOD），呈黄褐色，存在于原核细胞中。 SOD是一种含有金属元素的活性蛋白酶。超氧化物岐化酶（SOD）能催化如下的反应：O2-+H+→H2O2+O2，O2-称为超氧阴离子自由基，是生物体多种生理反应中自然生成的中间产物。它是活性氧的一种，具有极强的氧化能力，是生物氧毒害的重要因素之一。SOD是机体天然存在的超氧自由基清除因子，它通过上述反应可以把有害的超氧自由基转化为过氧化氢。尽管过氧化氢仍是对机体有害的活性氧，但体的过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶（POD）会立即将其分解为完全无害的水。

这样，三种酶便组成了一个完整的防氧化链条。 目前，人们认为自由基（也称游离基）与绝大部分疾病以及人体的衰老有关。所谓的自由基就是当机体进行代时，能夺去氧的一个电子，这样这个氧原子就变成自由基。自由基很不稳定，它要在身体组织细胞的分子中再夺取电子来使自己配对，当细胞分子推出新一个电子后，它也变成自由基，又要去抢夺细胞膜或细胞核分子中的电子，这样又称会产生新的自由基。如，超氧化物阴离子自由基、羟自由基、氢自由基和甲基自由基，等等。在细胞由于自由基非常活泼，化学反应性极强，参与一系列的连锁反应，能引起细胞生物膜上的脂质过氧化，破坏了膜的结构和功能。它能引起蛋白质变性和交联，使体的许多酶及激素失去生物活性，机体的免疫能力、神经反射能力、运动能力等系统活力降低，同时还能破坏核酸结构和导致整个机体代失常等，最终使机体发生病变。因此，自由基作为人体垃圾，能够促使某些疾病的发生和机体的衰老。虽然自由基会对机体产生诸多危害，但是在一般的条件下人体细胞也存在着清除自由基、抑制自由基反应的体系，它们有的属于抗氧化酶类，有的属于抗氧化剂。像SOD就是一种主要的抗氧化酶，能清除超氧化物自由基，在防御氧的毒性、抑制老年疾病以及预防衰老等方面起着重要作用。 SOD能专一地清除体有害的自由基，以解除自由基氧化体的某些组成成分而造成的机体损害。如氧中毒、急性炎症、水肿、自身免疫性疾病、辐射病等疾病都与活性氧的毒性有关。实验证明，SOD能够清除自由基，因此可消除上述疾病的病因。此解毒反应过程是两步：

SOD酶活性测定方法

SOD酶活性测定 所需药品： （1）0.1mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液： A液：0.1mol/l磷酸氢二钠液 B液：0.1mol/l磷酸二氢钠液 1毫升B+10.76毫升A （2）0.026mol/l蛋氨酸液（Met）：现用现配 称取0.3879克蛋氨酸，用1号液定容至100毫升。 （3）75*10-5mol/l氯化硝基四氮唑蓝（NBT）液：现用现配 称取0.1533克NBT，先用少量蒸馏水溶解，然后定容至250毫升。 （4）1umol/lEDTA-2钠和2*10-5mol/l核黄素混合液 （5）0.05mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液 （6）石英砂 实验步骤： 1.酶液制备：称取0.5克鲜叶，放入研钵中，加入3毫升5号液和少量石英砂，于冰浴中研成匀浆。然后用5号液定容至8毫升，于0～4℃、13000g时离心15分钟，上清液即为酶提取液。酶液可在低于0℃下的环境中保存。 2.按下表加入试剂： 试剂摇匀后，迅速遮光处理1号杯，其余杯在25℃、光强为4000勒克司的条件下照光处理15分钟，然后立即遮光。接着在560nm下，以1号杯作为空白测定其余杯中溶液的光密度。假定2、3号杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率为100%，然后按下式分别计算其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率。 M/N=100/X M——2、3号杯中溶液的光密度的平均值 N——其余杯中溶液的光密度值 X——其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率 然后以酶液量为横坐标，以其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率（X）为纵坐标制作曲线，根据线性好的曲线所得出的函数关系计算抑制NBT光还原的相对百分率为50%时所加入的酶液量，以该酶液量作为1个酶活单位。 结果计算：SOD活力按下式计算： A=V*1000*60/（B*W*T）

抗氧化实验方法

1还原力的测定 样品2ml加到2ml 0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.6）和2ml 1%的铁氰化钾溶液的混合液中。混合物在50℃保温20min，然后在反应混合物中加入2ml 10%的TCA，混合后以3000rpm 离心10min，取上清液2ml与2ml蒸馏水以及0.4ml 0.1%氯化铁在反应试管中反应，10min 后测定其在700nm处的吸光值。吸光值越大表明还原力越强。 注意：建议蛋白浓度以5mg/ml左右变化，例如2.5，5之类变化。但具体情况应根据吸光值大小而定。 0.2mol/L pH6.6的磷酸盐缓冲液的配制见附表。 铁氰化钾溶液应盛装在棕色瓶中。 比色皿的用法：可见光(>400nm)用玻璃比色皿（即没有标字母或者标G的比色皿），紫外光时（<400nm）用石英比色皿（即标Q字比色皿）。 2 DPPH自由基清除活性的测定 将1.5ml样品液添加到1.5ml含0.1 mmol/L DPPH的95％乙醇中，混合，振荡，在 室温下放置30min，然后在波长517nm处检测（Ai）。清除率计算公式为： 空白为1.5 ml 95%的乙醇加入1.5 ml蒸馏水调零。 式中：Ac——对照为1.5 ml DPPH溶液加上1.5 ml蒸馏水在517nm处的吸光值；Aj——1.5ml样品液加上1.5 ml 95%的乙醇在517nm处的吸光值； Ai——1.5ml样品液加上1.5 ml DPPH溶液在517nm处的吸光值； 注意：建议酶解液蛋白浓度以2mg/ml 左右变化，如0.5,1,2,2.5之类变化，但是具体情况应视清除率而定，最终结果应有清除率大于50%和小于50%的情况。 DPPH样品有毒，需戴口罩和手套进行操作。而且DPPH试剂很昂贵，用时注意节约。0.1m mol/L DPPH 乙醇溶液的配制：准确称取0.00395gDPPH，用95%的乙醇溶液溶解并定容到100ml。 3 在卵黄磷脂体系中抗氧化能力的测定 以卵黄脂蛋白为底物的LPO模型反应体系包括:体积比为1:25稀释的卵黄悬液(卵黄用等体积的pH7.45，0.lmol/LPBS配成，使用前磁力搅拌10min)0.2 mL、一定浓度的样品溶液0.lmL、25m moll/LFeSO4溶液0.2mL，用PBS缓冲液补足至2.0mL。对照管除不加样液外其他试剂同前。将上述2种试管同时置37℃恒温水浴锅中保温培养1h。取出后，加入20%TCA0.5mL，静置10 min后，与对照管于3500r/min离心10min，取2.0mL上清液，分别加入质量分数为0.8%硫代巴比妥酸(TBA)溶液1.0mL，加塞于100℃水浴15min，取出冷却。空白管以2.0mLPBS溶液代替，在532nm下测定吸光度，样品对卵黄脂蛋白LPO的抑制率表示为: SA(%)=(Ac一AS)/A C×100 式中:Ac一不加样品的吸光度 As一加入样品的吸光度 注意：卵黄溶液不用时应放置冰箱保存。 酶解液蛋白浓度以5mg/ml左右调整，但具体应视清除率大小而定，对酶解液蛋白浓度

抗氧化酶活性等测定方法

叶绿体得提取 一、试剂配置 １、PＢS提取液:每L水依次加入MES(１9５.2×0。05=９、7６g)、山梨糖醇(0。33×182。2＝60。1２6g)、ＮaCｌ(０、０10×58.5=0、５85g)、MgCｌ(０.002×95=0、19g)、EDＴA(292、２5×０.0０２=０、５84５g)、KH2PO４(２00×0.0005=０、１g);使用时加入ASＡ—Nａ(１98。1×0、00２=0、３962g); 2、悬浮液:将ＰBS提取液中得MES换为238。３×0.05＝１１、９15g得HEＰＥS(238、3×０。05=11。915ｇ); ３、8０%Pｅrｃoｌ:8０ml原液+２0ml水;40％Perｃol:４0ｍl原液＋60ml水; 实际配制: PBS提取液2000ｍl(3个处理*2个品种＊３个重复＊20ml＊３次=1０80mｌ), 悬浮液100ml(３个处理＊2个品种＊3个重复*1mｌ＊3次＝5４ml); 8０％Percol ２０0ml;40%Percｏl 200ml。(3个处理*2个品种*3个重复*3mｌ＊3次=162ｍl) 二、提取步骤 1、10g鲜样加20ｍl提取ＰＢS(50mM MES PH６、1,含0、３3M山梨糖醇,10mM NaＣl,2mMＭgCｌ２,２ｍM EＤTA,０.5 mMKH2PＯ４,2mM ASA—Ｎa,ASＡ—Na使用前现配现加) 2、快速研磨,使叶片碎成绿豆粒大小,４层纱布过滤,去除残渣(注意过滤时不可用力挤压,以免叶绿体膜破碎) 3、滤液20００g ３ｍin,小心倒出上清液,将离心管放入离心机后,使离心机得加速很快上升到预定值(水平转头,加速度调到9),约经30s后很快使其下降停止,整个离心持续大约2—3ｍｉｎ左右完成; 4、沉淀用１ml提取液漂洗表面悬浮物; 5、用1ml悬浮液(５０mM HＥPＥS pＨ7。6,含０、３３mM山梨糖醇,１０mM NaＣl,2mM MgＣl2,2mM EDTA,0。5mMKH2PＯ４,2mM ASA－Ｎａ,ASＡ-Na使用前现配现加)将沉淀悬浮,在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷,或者用手握住离心管在冰块之间搅动,使叶绿体由于震动分散开来,不要用棉球吸滤,以防被膜压破。叶绿体悬浮时要浓点,含叶绿素２ｍg、ml-1以上,这样有利于保持活性。 6、２000g 1min; 7、沉淀再用悬浮液悬浮;(悬浮液同5,可以不做) 8、用Ｐｅrcol试剂进行梯度离心(将3ml含有80％Peｒcｏl(原液按100％算)铺在１0mｌ离心管下层,再把３ｍl 40％Perｃol铺在离心管中层,然后将1mｌ叶绿体悬浮液轻轻铺在离心管上层)１500ｇ2-3mｉn(用

抗氧化活性测定方法的比较

抗氧化活性测定方法的比较 人体衰老和多种疾病均与自由基有关，寻找天然抗氧化剂具有重要意义。黄酮、多糖、多肽、酚类等生物活性成分均具有抗氧化活性，抗氧化活性的筛选方法可分为体外和体内2种测试体系。 体外：抗氧化活性可以用在特定条件下，样品对检测体系中自由基的清除能力、抗油脂过氧化能力及样品的还原能力、总抗氧化能力等来衡量和表征。常用的方法有羟基自由基（·OH）清除能力法、1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH法）、2,2-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐（ABTS 法）、超氧阴离子自由基法（O2-·）、邻苯三酚自氧化法、β-胡萝卜素漂白法、硫代巴比妥酸法、铁离子还原能力测定（FRAP法）、总酚测定法、ORAC法等方法。体内：主要有DNA氧化损伤法、蛋白质氧化损伤法、线粒体氧化损伤法。 其中DPPH法和ABTS法操作较简单便捷，不需要特殊的检测设备，只在需固定时间下记下其紫外分光光度测量值后计算其自由基清除率，缺点是不同物质具有组成和结构的差异，与DPPH·、ABTS+·的反应速率不同，反应到达平衡的时间不同，将反应时间固定在某一值时，可能对抗氧化剂的抗氧化性评价带来错误的判断，且DPPH自由基会和其他自由基发生反应。邻苯三酚自氧化法缺点是检测波长、缓冲液的组成及ｐＨ值、邻苯三酚浓度等关键测定条件存在

着较大差异。β-胡萝卜素漂白法的缺点是β-胡萝卜素本身有抗氧化活性，对样品活性的测定结果有影响。FRAP法主要用于食品业，优点是简单易操作、可以重复，缺点是无法测定硫醇化合物的还原能力。ORAC法是国际上通用的评价食品氧化的标准方法，缺点是仪器成分较复杂，检测成本较高。 目前普遍使用的体外抗氧化活性指标一般都采用分光光度法，使用分光光度计测量各种颜色成分含量的变化。分光光度法操作较简单、便捷，不需要特殊的检测设备，只在需固定时间下记下其紫外-可见分光光度测量值后计算其活性大小，具有成本低、效率高、样品量少等优点。分光光度法缺点是会受到样本自身颜色和浑浊度的影响和限制，颜色深的样品测得的数据误差大，甚至得到错误的结果；不同物质组成和结构存在差异，与各种自由基的反应速率不同，反应到达平衡的时间不同，将反应时间固定在某一值时，可能对抗氧化剂的抗氧化性评价带来错误的判断。外界环境因素对实验结果也存在一定程度的影响，有些抗氧化活性实验在冬天低温时不易成功，测得的数据往往没有规律。 我觉得在测定样品的抗氧化活性时，各种方法都有自己的优缺点，要根据需测物质来决定用什么方法，比如DPPH 法的自由基选择性强，不和只有一个羟基的芳香酸、无羟基的类黄酮反应，这类物质需用其他方法测定。若对检测结果

抗氧化酶SODPODCAT活性测定方法

抗氧化酶 S O D P O D C A T活性测 定方法 集团文件版本号：（M928-T898-M248-WU2669-I2896-DQ586-M1988）

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法 酶液制备：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液 （pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。 一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法） 1、试剂的配制 （1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)： A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na 2HPO 4 ·12H 2 O（分子量 358.14）71.7g； B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH 2PO 4 ·2H 2 O（分子量 156.01）31.2g。 分别用蒸馏水定容到1000ml。 0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na 2HPO 4 ) 228.75ml，B母液(NaH 2PO 4 ) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。 参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。 （2）130mM甲硫氨酸溶液：取1.9399g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。 （3）100μM EDTA-Na 2溶液：取0.03721gEDTA-Na 2 用磷酸缓冲液定 容至1000ml。 （4）20μM核黄素溶液：取0.0753g核黄素用蒸馏水液定容至1000ml，避光保存。 （5）750uM 氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.06133g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。 2、酶活性测定 （1）取10ml试管（要求透明度好）

抗氧化功能评价方法

附件1： 抗氧化功能评价方法 试验项目、试验原则及结果判定 Items, Principles and Result Assessment 1 试验项目 1.1 动物实验 1.1.1 体重 1.1.2 脂质氧化产物：丙二醛或血清8-表氢氧异前列腺素（8-Isoprostane） 1.1.3 蛋白质氧化产物：蛋白质羰基 1.1.4 抗氧化酶：超氧化物歧化酶或谷胱甘肽过氧化物酶 1.1.5 抗氧化物质：还原性谷胱甘肽 1.2 人体试食试验 1.2.1 脂质氧化产物：丙二醛或血清8-表氢氧异前列腺素（8-Isoprostane） 1.2.2 超氧化物歧化酶 1.2.3 谷胱甘肽过氧化物酶 2 试验原则 2.1 动物实验和人体试食试验所列的指标均为必测项目。 2.2 脂质氧化产物指标中丙二醛和血清8-表氢氧异前列腺素任选其一进行指标测定，动物实验抗氧化酶指标中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶任选其一进行指标测定。 2.3 氧化损伤模型动物和老龄动物任选其一进行生化指标测定。 2.4 在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。 3 结果判定 3.1 动物实验：脂质氧化产物、蛋白质氧化产物、抗氧化酶、抗氧化物质四项指标中三项阳性，可判定该受试样品抗氧化功能动物实验结果阳性。 3.2 人体试食试验：脂质氧化产物、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶三项指标中二项阳性，且对机体健康无影响，可判定该受试样品具有抗氧化功能的作用。

抗氧化功能检验方法 Method for the Assessment of Antioxidative Function 1 动物实验 1.1 实验动物 选用10月龄以上老龄大鼠或8月龄以上老龄小鼠，也可用氧化损伤模型鼠。单一性别，小鼠每组10－15只，大鼠8－12只。 1.2 剂量分组及受试样品给予时间 实验设三个剂量组和一个溶剂对照组，以人体推荐量的10倍（小鼠）或5倍（大鼠）为其中的一个剂量组，另设两个剂量组，高剂量一般不超过30倍，必要时设阳性对照组、空白对照组。受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天。 1.3 实验方法 1.3.1 老龄动物 选用10月龄以上大鼠或8月龄以上小鼠，按血中MDA水平分组，随机分为1个溶剂对照组和3个受试样品剂量组。3个剂量组给予不同浓度受试样品，对照组给予同体积溶剂，实验结束时处死动物测脂质氧化产物含量、蛋白质羰基含量、还原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。 1.3.2 D－半乳糖氧化损伤模型 1.3. 2.1原理 D-半乳糖供给过量，超常产生活性氧，打破了受控于遗传模式的活性氧产生与消除的平衡状态，引起过氧化效应。 1.3. 2.2造模方法 选25-30g健康成年小鼠，除空白对照组外，其余动物用D-半乳糖40mg－1.2g/kg BW 颈背部皮下注射或腹腔注射造模，注射量为0.1mL/10g，每日1次，连续造模6周，取血测MDA，按MDA水平分组。随机分为1个模型对照组和3个受试样品剂量组，3个剂量组经口给予不同浓度受试样品，模型对照组给予同体积溶剂，在给受试样品的同时，模型对照组和各剂量组继续给予相同剂量D-半乳糖颈背部皮下或腹腔注射，实验结束处死动物测脂质氧化产物含量、蛋白质羰基含量、还原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。 1.3.3 乙醇氧化损伤模型 1.3.3.1原理

抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法 一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法） 1、试剂的配制 （1）L磷酸缓冲液(PBS，： A母液：L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量）71.7g； B母液：L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量）31.2g。 分别用蒸馏水定容到1000ml。 L PBS（）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) ，B母液(NaH2PO4) ，用蒸馏水定容至1000ml。参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。 （2）甲硫氨酸溶液：取 Met用磷酸缓冲液（）定容至1000ml。 （3）30μM EDTA-Na2溶液：取用磷酸缓冲液定容至100ml。 （4）60μM核黄素溶液：取核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。 （5）氮蓝四唑(NBT)溶液：取 NBT用PBS定容至100ml，避光保存。 酶液制备：取（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。 2、酶活性测定 （1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液，磷酸缓冲液，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀； （2）分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中 （3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min； 同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。 （4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测OD560(出现颜色即可测定)。 （5）酶活性计算：SOD活性单位以抑制NBT光化还原50％所需酶量（测的样品值要在

土壤酶活性测定方法综合

土壤酶活性测定方法 1、土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法） 一、原理 脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。 土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚—次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。 二、试剂 1）甲苯 2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。 3）柠檬酸盐缓冲液（）：184g柠檬酸和氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至，用水稀释定容至1000ml。 4）苯酚钠溶液（L）：苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和丙酮，用乙醇稀释至100ml （A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。

5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为%，溶液稳定。 6）氮的标准溶液：精确称取硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取10ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（ml）。 三、操作步骤 称取5g土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，15min后加10ml10% 尿素溶液和20ml PH 柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱培养24小时。培养结束后过滤，过滤后取1ml滤液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计与578nm波长处比色。（靛酚的蓝色在1h内保持稳定）。 标准曲线制作：在测定样品吸光值之前，分别取0、1、3、5、7、9、11、13ml 氮工作液，移于50ml容量瓶中，然后补加蒸馏水至20ml。再加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计上于578nm波长处比色。然后以氮工作液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。 注意事项: 1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作 与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。 2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验 试剂纯度和基质自身分解。

抗氧化酶测定实验方法

植物组织中丙二醛（MDA）含量的测定 一、原理 植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。MDA从膜上产生的位置释放出后，可以与蛋白质、核酸反应，从而丧失功能，还可使纤维素分子间的桥键松驰，或抑制蛋白质的合成。因此，MDA的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害。 丙二醛(MDA)是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的三甲川(3，5，5—三甲基恶唑-2，4。二酮)，其最大吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，但532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中MDA—TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。低浓度的铁离子能够显著增加TBA与蔗糖或MDA显色反应物在532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、MDA与TBA显色反应中需一定量的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为每克千重100—300ug·g-1，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3+的终浓度为0．5umol·L-1。 二、方法直线回归法MDA与TBA显色反应产物在450nm波长下的吸光度值为零。不同浓度的蔗糖(0—25mmol·L-1)与TBA显色反应产物在 450nm的吸光度值与532nm和600nm处的吸光度值之差成正相关，配制一系列浓度的蔗糖与TBA显色反应后，测定上述三个波长的吸光度值，求其直线方程，可求算糖分在532nm处的吸光度值。UV-120型紫外可见分光光度计的直线方程为： Y532＝-0．00198十0．088D450 (44—1) D450、D532、D600分别代表450、532和600nm波长下的吸光度值。三、材料、仪器设备及试剂1、[仪器设备]紫外可见分光光度计1台；离心机1台；电子天平1台；10ml离心管4支；研钵2套；试管4支；刻度吸管：10ml1支，2ml1支；剪刀1把。

抗氧化酶的作用

重要的抗氧化酶和抗氧化剂的作用 超氧化物歧化酶（SOD）是美国的McCord和Fridovich在1969年发现的一种清除超氧阴离子自由基的酶。SOD是一种广泛存在于生物体内的金属酶，按金属辅基的成分不同主要分成三类,第一类含铜和锌，称为CuZn-SOD，是最常见的一种，呈蓝绿色，主要存在于真核细胞的细胞浆内。第二类含锰，称为Mn-SOD，呈粉红色，主要存在于原核细胞体、真核细胞的细胞浆和线粒体内。第三类含铁，称为Fe-SOD，呈黄褐色，主要存在于原核细胞中。另外，在牛肝中还发现一种CoZn-SOD[8]。 正常生理状态下，机体产生的自由基和清除自由基的速率处于动态平衡状态。但当机体内自由基产生增多，就会对机体的蛋白质、脂质和DNA造成损伤，导致机体疾病的发生。SOD是生物体内对抗氧自由基的一种最重要的抗氧化酶，是专门清除超氧阴离子自由基的。它的作用是将氧自由基歧化，发生2O2- +2H+ SOD H2O2 + O2的反应。由于H2O2 在SOD活性部位生成，会对SOD本身产生杀伤。催化产生的H2O2 如果不被及时清除，它会与O2-反应生成毒性更大的羟基自由基。衰老自由基学说认为，代谢产生的自由基对机体造成的损害可引起衰老，SOD可有效的清除自由基，在一定程度上延缓衰老。此外，SOD还具有增强机体免疫力，提高机体对自由基引发的疾病的抵抗力，消除运动性疲劳等生理功能[3]。 过氧化氢酶（CAT）是一种末端氧化酶，广泛存在于动植物和微生物体内，酶分子结构中含有铁卟啉环，1个分子酶蛋白中含有四个铁原子[9]。CAT的生物学功能是催化过氧化氢分解为水和氧，2 H2O2 CAT 2H2O + O2 。过氧化氢酶（CAT），广泛存在于动植物和微生物体内的一种末端氧化酶。它的生物功能是催化细胞内的过氧化氢分解，起抗氧化作用，即2H2O2 2H2O+O2，它可防止过氧化氢含量过高对机体组织造成损伤，对细胞起到保护作用。 本研究结果显示，力竭运动后，大鼠的心组织、肝组织和肺组织中CAT活性均表现出升高，这可能是由于运动应激造成大鼠组织过氧化物质增多，使得组织CAT活性对应升高。同时，结果显示，联合补充谷氨酰胺和番茄红素对力竭运动大鼠肝组织和肺组织的抗氧化能力提高的效果最为明显，而单纯补充番茄红素对心脏

纤维素酶活力测定方法_张瑞萍

测试与标准 纤维素酶活力测定方法 张瑞萍 南通工学院(226007) 摘　要　用DN S 为显色剂,分别以滤纸和CM C 为底物,以滤纸糖酶活性(FP A )和羧甲基纤维素酶活性(CM C a se )表征纤维素酶活力。确定酶活测定用波长为530nm,参比溶液应为失活酶、底物和DN S 等共热的反应物;比较了两种底物的酶活力测定方法。结果表明,CM C a se 比FP A 高,说明酶对水溶性底物有较高的活力,也表明吸附对酶的活性部位与纤维素分子链段的结合及催化均有很大影响;对于不同牌号的纤维素酶,织物的酶减量率与CM C 酶活力关系密切。 叙　词:　测试　纤维素酶　活度中图分类号:　TS197 纤维素酶是多组分复合物,各组分的底物专一性不同。纤维素酶作用的底物比较复杂,反应产物不同,致使纤维素酶活力测定方法很多,各国的方法亦不统一。我们选择滤纸、CM C 为底物,原理系利用纤维素酶催化水解纤维素,产生纤维多糖、二糖及葡萄糖等还原糖,与显色剂反应,求出还原糖的浓度,间接求出酶的活力。由不同底物测得的酶活力分别称作FPA (滤纸糖酶活力)和CM C ase (羧甲基纤维素酶酶活力)。本文分析确定酶活力测定的主要条件,比较两种底物的酶活力测定方法的结果,探讨纤维素酶活力与织物减量率的关系,为酶在生产中的利用提供依据。 1　实验方法 1.1　化学药品、材料 纤维素酶(工业品),DNS 试剂(自配),冰醋酸,醋酸钠,葡萄糖(均为分析纯),滤纸(定性),羧甲基纤维素酶CM C (试剂级),纯棉针织物半制品(南通针织厂)。 1.2　FPA 滤纸酶活力和CMC 酶活力的测定 取适当稀释的酶液,分别以滤纸或1%的CM C 溶液为底物,于50℃恒温水解反应1h ;然后加入显色剂DNS,沸水浴中煮沸5min;再加入蒸馏水,于530nm 测定吸光度OD 值。 酶活可定义为:每毫升酶液1min 产生1mg 葡萄糖为一个单位( )。 1.3　针织物酶减量率的测定 将酶处理前后的试样在烘箱中105℃烘至恒重。减量率= 处理前织物干重-处理后织物干重 处理前织物干重 ×100% 2　结果与讨论 2.1　显色剂的选择 选用DNS ,在碱性条件下与还原糖反应,生成有色化合物,用分光光度计比色,确定低分子糖含量。 碱性条件下DNS 与还原糖共热反应如下: O 2N OH O 2N CO OH +还原糖 　H 2N OH CO OH O 2N DN S(黄色) 3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色) 生成的棕红色氨基化合物系比色法测定基础。2.2　最大吸收波长的确定 选取490～580nm 波长对显色液进行比色。由图1可知,不同浓度的葡萄糖溶液在490～500nm 处有最大吸收,DNS 在此波长下也有较明显的吸收。为了排除DNS 的干扰,选择在波长 530nm 处进行测定,此波长下的葡萄糖吸收虽有所降低,然而符合“吸收最大、干扰最小”的原则。 图1　D NS 与葡萄糖的吸收曲线 2.3　底物及酶本身含糖量的影响 在实验过程中发现,底物特别是滤纸,也含有一定的还原糖,在碱性的DNS 试剂中也会发色。而且,试验所用的纤维素酶是一种工业级的复合酶,品种不同,其本身含糖量也不同。为了排除这类还原糖的干扰,参比溶液取失活后的酶、底物、DNS 等共热的反应物。2.4　葡萄糖标准曲线 用不同浓度的葡萄糖溶液作为标准溶液,与DNS 共热反应显色后,测出其吸光度OD 值(见图2)。标准曲线的线性相关系数R 2为0.9991(见图2),线性相当好,可以用于酶活力的测定。 38 印　染(2002No .8) www .cdfn .com .cn

酶活性测定方法

酶活性测定 1、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase) 试剂：0.1% p-nitrophenylphosphate disodium salt（P-硝基苯磷酸二钠） 0.2mol/L 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲溶液(pH: 9.6)——buffer 0.2mol/L NaOH 测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% P-硝基苯磷酸二钠及buffer 37°C孵化30 min； (2) 1mL污泥样品+1mL0.1% P-硝基苯磷酸二钠+2mL buffer 37°C孵化30 min； (3) 加入2mL 0.2mol/L NaOH终止反应； (4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。 计算： 每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。 [(S1- S0)+(S2- S0)]/2*0.704 (Eu) 2、酸性磷酸酶(Acid phosphatase) 试剂：0.1% p-nitrophenylphosphate disodium salt（P-硝基苯磷酸二钠） 0.2mol/L HAc/Ac缓冲溶液(pH: 4.8)——buffer 0.2mol/L NaOH 测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% P-硝基苯磷酸二钠及buffer 37°C孵化30 min； (2) 1mL污泥样品+1mL0.1% P-硝基苯磷酸二钠+2mL buffer 37°C孵化30 min； (3) 加入2mL 0.2mol/L NaOH终止反应； (4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。 计算： 每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。 [(S1- S0)+(S2- S0)]/2*0.719 (Eu) 3、a-葡萄糖甘酶(a-glucosidase) 试剂：0.1% p-nitrophenyl a-D glucopyranoside（p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷） 0.2mol/L Tris-HCl (pH: 7.6) 测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷及Tris-HCl 37°C 孵化30 min； (2) 1mL污泥样品+1mL 0.1% p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷+2mL Tris-HCl 37°C孵化

氧化实验步骤

3．3氧化实验 从钮扣状样品上线切割下尺寸为10×IOX3mm的片状试样，首先将试样双面在金相预磨机上水磨，水磨砂纸从粗到细，一直到1000#Ah03水磨砂纸，然后在金相砂纸上从1#到5#进行细磨：最后在高速抛光机上抛光，使用的是Cr203磨料和水的乳液。腐蚀剂选用氢氟酸和水溶液，浓度和腐蚀时间随材料的不同而变化。将腐蚀好的试样在丙酮和酒精中清洗，再在烘箱中烘干后，用螺旋测微器测量试样尺寸，并用精度为0．1mg的电子天平称试样的原始重量。制备好的试样，其中每种成分、每个氧化温度下取三个试样在实验室静止空气中进行恒温氧化试验，以便进行氧化动力学分析。氧化温度分别为823、873和923K非连续恒温氧化300 h，每恒温氧化2，5，10，15，20，50，100，200，300 h后将坩埚从炉中取出，在干燥室中冷却至室温，连同坩埚用精度为O．1mg的电子天平称重，每一样品称重三次，取平均值，然后放入炉中继续氧化。

3．4试样截面金相分析 金相分析实验是研究金属材料热处理质量常用的分析手段，它能反映出金属 材料中的显微组织。钢铁热处理时的氧化往往伴随着表面脱碳现象的发生，表面 脱碳现象将给钢铁材料的机械性能和耐腐蚀性能带来不良影响。根据显微组织的 差别可以判断金属材料脱碳层深度，从而对比其表面质量的好坏。因此该实验可 以间接反映出涂层的保护效果。 2.3 高温氧化试验 2.3.1 试样制备 将烧结体线切割成5×5×30mm 的块状毛坯，经砂轮打磨、研磨、抛光，再 用酒精在超声波清洗器中清洗30min，之后置于80℃干燥箱中干燥，每隔5 个 小时，在AY-120(精度为万分之一克)分析天平上称量一次，直至前后称量差别不超过0.0001g。 2.3.2 坩锅的焙烧 准备坩锅若干只，用清洁纱擦净，并标记。放入普通箱式电阻炉中，在 1000℃下焙烧5 小时后取出。冷却至室温后，再次放入炉中焙烧5 小时，照此方法操作4 次。 2.3.3 实验过程 将试样分别放进事先作好标记的坩锅内，采用分析天平称量不同时间内试 样的氧化增重质量。 本实验采用恒温氧化法，在750℃静态空气中氧化，恒温氧化实验依据 GB/T13303-91《钢的抗氧化性能测定方法》及参考HB5258-2000《钢及高温合 金抗氧化性能测定试验方法》标准进行。高温氧化性能试验在高温箱式加热电阻炉8X-4-11 内进行。当温度升高至750℃时开始计时，并在0h、5h、10h、 15h、20h、25h、30h、40h、50h、60、80h、100h 时间点取出试样，冷却室温后称量试样质量。 赵能伟,郑勇,刘林艳等.Ti(C，N)基金属陶瓷力学性能和高温抗氧化性能的研究[J].硬质合金,2007,24（3）. 文研究了加不同比例的TaC、NbC对Ti(C，N)一NiMo系金属陶瓷的力学性能的影响及在750℃空气中的氧化行为．测定并计算了恒温氧化增重与时问的函数关系及氧化速率常数。结果表明，这类陶瓷材料的氧化为“钝性氧化。 2．2高温氧化试验 图4表示1450℃烧结温度下所得试样A1、A2、A3、A4在750℃空气中氧化100 h单位面积氧化增重曲线。从图中可以看出，试样A1、A2、A3、A4在氧化前20 h内，氧化增重较明显，后80 h氧化增 重较为缓慢，氧化增重与氧化时间的平方根成正比，即Am与时间t之间符合抛物线规律，说明这类材料的氧化为“钝性氧化”，即氧化初期氧化速度较快，增重较为明显，随着氧化膜的形成和膜厚度的增加，氧化速率趋于缓慢。经比较可以看出，试样A2的单位面积氧化增重明显低于其他试样的氧化增重，说明TaCfNbC质量比为4：3时有助于提高Ti(C。N)

抗坏血酸过氧化物酶(ascorbateperoxidase ,APX)活性测定试剂盒 使用说明

抗坏血酸过氧化物酶（ascorbateperoxidase ，APX）活性测定试剂盒使用说明 微量法100T/96S 产品简介： APX 是植物清除活性氧的重要抗氧化酶之一，也是抗坏血酸代谢的关键酶之一。APX 具有多种同功酶，分别定位于叶绿体、胞质、线粒体、过氧化物和乙醛酸体，以及过氧化体和类囊体膜上。APX 催化H 2O 2氧化AsA，是植物AsA 的主要消耗者。APX 的活性直接影响到AsA 的含量，在胁迫和解胁迫条件下，APX 与AsA 具有一定的负相关性。 APX 催化H 2O 2氧化AsA，通过测定AsA 的氧化速率，可计算得APX 活性。 试验中所需的仪器和试剂： 低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、移液枪、研钵、冰和蒸馏水。 产品内容： 试剂一：液体×2瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加3mL 蒸馏水充分溶解。 试剂三：液体×1支，4℃保存。 操作步骤： 一、粗酶液提取： 称取约0.1g 样品，加1mL 试剂一，冰上充分研磨，13000g 4℃离心20min，取上清液。 二、测定操作表： 1.分光光度计预热30min 以上，调节波长到265nm，用蒸馏水调零。 2.试剂一在25℃中预热30min 以上。 3.空白管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL 蒸馏水、140μL 预热的试

剂一、20μL试剂二和20μL试剂三，迅速混匀后在265nm测定10s和130s光吸收。 4.测定管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、140μL预热的试剂 一、20μL试剂二和20μL试剂三，迅速混匀后在265nm测定10s和130s光吸收。 APX活力计算： a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下 （1）按蛋白浓度计算 活性单位定义：每毫克蛋白每分钟氧化1μmol AsA为1U。 APX(U/mg prot)=(△A测定管-△A空白管)÷(ε×d）×V反总×106÷(Cpr×V样)÷T=0.0924×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr （2）按样本鲜重计算 活性单位定义：每克样品每分钟氧化1μmol AsA为1U。 APX(U/g鲜重)=(△A测定管-△A空白管)÷(ε×d）×V反总×106÷(V样÷V样总×W)÷T=0.0924×(△A测定管-△A空白管)÷Wε：AsA在265nm处摩尔吸光系数为5.42×104L/mol/cm；d：比色皿光径（cm），1cm；V反总：反应体系总体积（L），200μL=2×10-4L；106：1mol=1×106μmol；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒；W：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积（mL），20μL=0.02mL；V样总：提取液体积，1mL；T：催化反应时间（min），2min。 b.使用96孔板测定的计算公式如下 （1）按蛋白浓度计算 活性单位定义：每毫克蛋白每分钟氧化1μmol AsA为1U。 APX(U/mg prot)=(△A测定管-△A空白管)÷(ε×d）×V反总×106÷(Cpr×V样)÷T=0.1848×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr （2）按样本鲜重计算 活性单位定义：每克样品每分钟氧化1μmol AsA为1U。

酶活性测定方法

一、过氧化物酶（POD）活性的测定 POD测定参照李合生等（2003）的愈创木酚法方法进行测定，略加改动。 测定：称取样品0.5g，加入5mL 1／15mol／L PH=7.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成匀浆，4℃条件下12000r/min离心15min，上清液为粗酶液。然后在试管中加pH 7.0的磷酸缓冲液2 ml，愈创木酚（0.2%）0.5ml，浓度为0.15%的H2O2 0.5ml，取0.3ml的酶提取液加入到试管中，空白以缓冲液代替。在470nm下测定其吸光度，加入酶液时开始计时，每隔30s读数一次，连续记录5分钟。以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位。 △470 ×V T POD活性= 0.01×t×Vs×W 式中：△470----反应时间内吸光度值的变化； V T ----提取酶液的总体积（ml） t----反应的时间（min） Vs ----测定时取用酶液体积（ml） W----样品鲜重（g） 二、多酚氧化酶（PPO）活性的测定 多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的方法，略加改动。 酶液制备：称取样品0.5g，加入5mL 0.1mol／L PH=6.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成浆，4℃条件下12000r/min离心15min后上清液即为粗酶液。 PPO活性测定：反应试管中分别加入0.1 mL酶液+3.9 mL磷酸缓冲液+ 1 mL 1m mol／L的邻苯二酚。混匀后于30℃保温10 min，迅速加入2 mL质量分数为20％的三氯乙酸终止反应，立即于525nm下测定其吸光度值，计算酶活。 PPO活性= O D×V T 0.01×t×0.5g×V s = O D×V T 0.005 OD——反应时间内吸光值的变化； V T ----提取酶液的总体积（ml） Vs ----测定时取用酶液体积（ml） T———反应时间(min)；

抗氧化实验方法

2.2.3 香青兰挥发油抗氧化活性的检测 2.2. 3.1 有机自由基DPPH ·清除能力的测定 （1）实验试剂的配制 DPPH ·无水乙醇溶液：称取19.72mg DPPH ，用无水乙醇定容至500ml ，得到浓度为0.1mmol/L 的DPPH 溶液。 样品：吸取30μl 的挥发油，加入3.56ml 无水乙醇溶解挥发油；再将此溶液按照2倍梯度稀释至28倍。 （2）有机自由基DPPH ·清除能力的测定 向100μl DPPH ·乙醇溶液中加入不同浓度的香青兰挥发油及无水乙醇使总体积达到200μl 。振荡器混匀后，室温，避光放置30min 后，在518nm 处测定吸光度，平行测定3次，计算清除率。 %100) (0210?--=A A A A 清除率 式中：A 0--DPPH ·溶液100μl +无水乙醇100μl 的吸光度 A 1--DPPH ·溶液100μl +样品溶液100μl 的吸光度 A 2--样品溶液100μl +无水乙醇100μl 的吸光度 公式中引入A 2是为了消除样品溶液本身颜色对实验测定的干扰。 2.2. 3.2 超氧阴离子O 2-·清除能力测定 （1）实验试剂的配制 Tris-HCl 缓冲液：量取2.1ml 浓HCl ，加蒸馏水定容到250ml ，得到0.1mol/LHCl 溶液；称取三羟甲基氨基甲烷3.0285g ，加蒸馏水溶解，再加入114.5ml 0.1mol/LHCl 溶液，用蒸馏水定容至500ml 得pH=8.2浓度为50mmol/L 的Tris-HCl 缓冲液液。 邻苯三酚溶液：称取37.833mg 邻苯三酚，用0.01mol/LHCl 溶液溶解定容至500ml ，得浓度为0.3mmol/L 的邻苯三酚溶液。 样品：吸取挥发油100μl ，加3.0ml 无水乙醇稀释，再将此溶液按2倍梯度稀释25倍。 （2）清除超氧阴离子O 2-·能力测定 邻苯三酚自氧化速率V 0的测定：在试管中加入5ml pH 值为8.2的Tris-HCl 缓冲液，加入2ml 蒸馏水，于25℃恒温水浴中放置20分钟，再加入0.5ml 邻苯三酚溶液，立即混匀倒入比色杯中，用紫外分光光度计在325nm 处测定A 值，每反应30s 记录一组，共反应5min 。将记录的数据以时间为横坐标，吸光值为纵坐标，作直线回归得到的斜率表示邻苯三酚自氧化速率V 0。 挥发油清除超氧阴离子速率V 1的测定：在试管中加入5ml pH 值为8.2的Tris-HCl 缓冲液，加入1.8ml 蒸馏水，0.2ml 不同浓度的挥发油于25℃恒温水浴中放置20分钟，再加入0.5ml 邻苯三酚溶液，立即混匀倒入比色杯中，用紫外分光光度计在325nm 处测定A 值，每反应30s 记录一组，共反应5min 。将记录的数据以