BAC-PAC大型质粒提取试剂盒操作方法及步骤说明书

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BAC/PAC DNA Kit

BAC/PAC大型质粒提取试剂盒

目录号：PL2001

适用范围：

适用于BAC/PAC/P1/Cosmid等大型质粒制备

试剂盒组成、储存、稳定性：

试剂盒组成保存20次

RNaseA

-20℃ 1.3ml

（10mg/ml）

溶液P1 4℃130ml

溶液P2 室温100 ml

溶液PⅢ室温110 ml

杂质清除剂A 室温 3 ml

杂质清除剂B 室温30 ml

内毒素清除剂-20℃10 ml

本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。

储存事项:

1.第一次使用时，将试剂盒所带全部的RNase A加入溶液P1后（终浓度100μg /ml）

置于4℃保存。如果溶液P1中RNase A失活，提取的质粒可能会混杂有微量RNA 残留，在溶液P1中补加RNase A即可。

2.内毒素清除剂在4℃可保存一个月，如果要长期保存，建议保存在－20℃!

3.环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出出现浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热

几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。

4.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时

盖紧盖子。

产品介绍：

常规的离心柱型质粒抽提试剂盒并不适用于BAC/PAC/P1/Cosmid等大型质粒DNA的抽提。这主要是因为大型质粒DNA分子量很大，常常会超过100kb而且一般拷贝数低产量低，使用常规的离心柱吸附膜吸附效率和产量很低而且过膜会打断这些大分子量的质粒DNA。本试剂盒采用改进碱裂解法从培养菌中提取质粒DNA，采用独特的溶液配方和内毒素清除试剂，只需要几次简单离心去除蛋白质、多糖、内毒素、RNA等杂质，获得高质量的质粒DNA。纯化DNA的OD260/280通常在1.8左右，得到的质粒可直接应用于细胞转染甚至动物体内实验等对DNA纯度要求很高的工作中。纯化后期过程均在1.5ml离心管中操作，方法简单，不需特殊设备，无需过柱，不用酚氯仿抽提；基本可完全回收细菌裂解释放出的质粒，不必担心质粒DNA的丢失。本方法提取纯化质粒DNA，对质粒损伤小，即使是100kb甚至200kb以上的大型质粒或超大型BAC/PAC质粒，只要碱裂解法能够提取，就可以有效纯化。此外溶液型的试剂可以按照比例放大缩小进行小提/中提/大提，最后可选择任意小体积溶解质粒，浓度可高达3μg/μl。

产品特点：

1.不需要使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。快速、方便、从150

ml大肠杆菌LB((Luria-Bertani)培养液中，可快速提取典型产量30-50μg高纯度BAC质粒DNA，提取率达80-90 %。

2.获得的质粒产量高，超螺旋比例高，纯度好，可直接用于转染、测序、文库等各

种分子生物学实验。

3.内毒素含量极低（< 0.1 EU/μg DNA），可直接应用于细胞转染。

注意事项

1.提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝

质粒或大于10kb 的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加P1、P2、PⅢ的用量。

2.提取大质粒时操作动作要轻柔，应该使用剪大了开口的吸头，防止机械剪切对

DNA的损坏。

3.DNA沉淀液沉淀离心后，可能看不到明显沉淀。如未见沉淀，担心DNA丢失，

可保留上清液，待完成全部操作后电泳鉴定，以确定是否获得终产物（数百微克DNA离心沉淀在管的侧壁上，可能无法看到明显团块）。

4.得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260

值为1相当于大约50μg/ml DNA。电泳可能为单一条带，也可能为2条或者多条DNA条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过95%。

操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）

?提示：将RNase A全部加入溶液P1中，混匀，使用后置于2-8℃保存。

1.取过夜培养菌150 ml左右菌液（最大不超过180ml-200ml），装入合适的离心瓶

中，10,000 x g于4℃离心2 min沉淀菌体，完全弃除上清。

2.加入5 ml 溶液P1，充分混悬震荡菌体沉淀，使其完全分散开，至无絮块存在。

细菌悬液移入50 ml离心管中，室温放置3~5 min。

如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。

3.加入5 ml 溶液P2，轻轻颠倒离心管6~8次，室温放置4-5 min，使细菌完全裂解，

溶液透明。

温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂！所用时不应超过5分钟！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要准确的5分钟。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。

4.加5 ml溶液PⅢ，立即颠倒离心管6~8次，充分混匀，至白色絮状物产生。上述

裂解液于4℃ 12,000~16,000 x g离心10~15 min，小心吸出上清，移入新的50 ml 离心管中。

加入溶液PⅢ后应该立即混匀，以免产生SDS的局部沉淀。

5.加入10 ml 异丙醇，颠倒离心管，充分混匀。

注意：使用异丙醇沉淀，蛋白杂质和盐离子共沉淀较少，可能看不到明显的较大团块沉淀，但是质粒还是可以完全沉淀下来，不影响实际的质粒产量。如果你习惯看见较大的沉淀团块操作，可以选择2倍体积的无水乙醇沉淀。

6.于4℃12,000~16,000 x g离心10 min，小心弃去上清，倒置于吸水纸上轻轻沥干

残余液体，加入3-5ml 70%乙醇漂洗一遍，最高速离心5分钟，弃上清，晾干沉淀。

DNA沉淀如果干燥过头，DNA将无法完全溶解，但是如果乙醇没有晾干挥发干净，残留太多，也会造成DNA无法完全溶解。

注意：异丙醇离心沉淀后，质粒纯度很高吸附在管底和侧壁可能看不见沉淀，但是不影响产量，后续步骤仔细吹打管底和沉淀所在的侧壁涮洗溶解质粒。

7.加入1.4 ml 溶液P1完全溶解沉淀团块，注意附着在管底和侧壁上的质粒沉淀虽

然可能看不见，也要吹打管底和沉淀所在的侧壁涮洗下来（大质粒可用宽口吸管轻轻吹打辅助溶解）。然后将质粒溶液转入2个新的1.5 ml离心管中（每个700μl）。

可选步骤（一般不需要）：如果菌株RNA丰富有微量RNA残留，可在此步骤后将质粒溶液60℃孵育15 min消化RNA。

8.每管加入55μl杂质清除液A，颠倒充分混匀后加入约0.1体积(约80μl)冰预冷的

内毒素清除剂，颠倒旋转7-10次（30秒左右）充分混匀，冰浴或者冰上放置>=5分钟，中间偶尔颠倒混匀几次。

内毒素清除剂加入上清后，上清会变得浑浊，但是冰浴后应恢复清亮。

注意：如果不需要去内毒素用于转染，可在此步骤只加入55μl杂质清除液A，充分混匀后冰上放置5分钟，离心后小心取上清转入一个新管，直接接步骤11。

9.42℃水浴，溶液又会变为浑浊，颠倒混匀后42℃温育5分钟。

10.室温14,000 x g离心5 min分相（温度低时，内毒素清除剂无法分相，因此必须

至少20℃以上室温离心或者保证冬季转头温度20℃以上）。上层水相含DNA，下层蓝色油状相含内毒素和其它杂质。将含DNA的上层水相转移到新管（注意不要吸到蓝色油状层，里面含内毒素等杂质），弃油状层。

溶液必须分为上下两相，否则应重复步骤9-10。

11.将上一步所得上层水相中加入等体积杂质清除液B（约750μl），轻柔混匀，4℃

14,000 x g离心10 min，弃上清（注意不要丢失DNA），轻轻加入1 ml 70%乙醇洗涤，离心弃上清，共两次，室温倒置晾干5~10 min使乙醇完全挥发。

12.每个离心管加适量TE或者纯水（50~100μl）溶解沉淀（可在37℃水浴中振荡以

辅助溶解）。要注意很多质粒DNA可能附着在离心管侧壁上，即使看不见，也应该充分吹打侧壁溶解回收质粒DNA。

最后沉淀可以根据需要选择任意小体积溶解，这样可以得到很高浓度的转染级质粒DNA（高达3-5μg/μl）。如果有需要，客户也可以选择更大体积溶解。

高纯度质粒小量快速提取试剂盒操作方法及步骤说明书

杭州昊鑫生物科技股份有限公司 htpp://https://www.sodocs.net/doc/279379430.html, HighPure Plasmid Mini Kit 高纯质粒小量快速提取试剂盒 目录号：PL03 试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成保存 50次 （PL0301） 100次 （PL0302） 200次 （PL0303） 平衡液室温5ml 10ml 20ml RNaseA（10mg/ml）-20℃150μl 250μl 500μl 溶液P1 4℃15 ml 25 ml 50 ml 溶液P2 室温15 ml 25 ml 50 ml 溶液P3 室温20 ml 35 ml 70 ml 去蛋白液PE 室温16ml 31.5 ml 63 ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 漂洗液WB 室温15 ml 25ml 50ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 洗脱缓冲液EB 室温10ml 15ml 20ml 吸附柱AC 室温50个100个200个 收集管（2ml）室温50个100个200个 本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。 储存事项: 1.第一次使用时，将试剂盒所带的全部RNase A加入溶液P1后（终浓度100ug/ml） 置于2-8℃保存。如果溶液P1中RNase A失活，提取的质粒可能会有微量RNA 残留，在溶液P1中补加RNase A即可。 2.环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分 钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。 3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时 盖紧盖子。 产品介绍：

本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。 产品特点： 1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附 量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。 2.独有的去蛋白液配方，可以高效去除残留的核酸酶，即使是核酸酶含量丰富的菌 株如JM系列、HB101也可以轻松去除。有效防止了质粒被核酸酶降解。 3.快速、方便，不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。获得的 质粒产量高、纯度好，可以直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。 注意事项 1. 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机， 如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。 2. 提取质粒的量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。一般高拷贝质粒，建议 接种单菌落于1.5-4.5 ml加合适抗生素的LB培养基，过夜培养14-16个小时，可提取出多达20μg的纯净质粒。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应适当加大菌体使用量，使用5-10 ml过夜培养物，同时按比例增加P1、P2、P3的用量，其它步骤相同。 3. 得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260 值为1相当于大约50μg/ml DNA。电泳可能为单一条带，也可能为2条或者多条DNA条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过90%。 4. 质粒DNA确切分子大小，必须酶切线性化后，对比DNA分子量Marker才可以知 道。处于环状或者超螺旋状态的的质粒，泳动位置不确定，无法通过电泳知道其确切大小。 5. 洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗 脱，但应该确保pH大于7.5，pH过低影响洗脱效率。用水洗脱质粒应该保存在－

质粒DNA的提取及检测实验报告

题目：质粒DNA的提取及检测 一．实验目的: 1.学习碱裂解法提取质粒的原理和方法； 2.学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。 二．实验原理 1. 质粒 (Plasmid)： 一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性，产生抗生素、限制酶、修饰酶等。 2.载体(Vector)： 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，转化到细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体。目前除了大肠杆菌中的质粒、λ噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒外，还有酵母人工染色体载体以及动、植物病毒载体等。 3.分离质粒DNA： （1）培养细菌使质粒扩增； （2）收集和碱裂解细菌； （3）分离和纯化质粒DNA。 4.碱裂解法 （1）溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，10mmol/EDTA-Na，25mmol/LTris-HCl 作用：分散细胞，螯合金属离子使酶失活，防止DNA的降解

（2）溶液Ⅱ：L NaOH，2% SDS，临用前1：1配制 作用：细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与染色体DNA发生变性 （3）溶液Ⅲ：5mol/L 醋酸钾60ml，冰醋酸，双蒸水 作用：酸性条件上质粒DNA复性，留在上清液。大肠杆菌DNA和蛋白质-SDS复合物等发生沉淀。 5.电泳 带电荷的物质，在电场中的趋向运动称为电泳。DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp至近50kb的DNA分子。DNA的迁移率（U）的对数与凝胶浓度（T）之间存在反平行线 性关系。因此，要有效地分离不同大小的DNA片段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。 6.提取质粒 在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、开环DNA 、 闭环超螺旋DNA 。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒 DNA泳动速度：闭环超螺旋〉线状〉 开环。但有时也有也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核酸染料 含量有关。 三．实验材料及设备 1.实验材料： （1）含质粒pUC18大肠杆菌，塑料离心管，EP管架，微量取液器和取液器吸头，常用玻璃器皿（如三角瓶、量筒、试剂瓶等）； （2）提取的pUC18，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲，封口膜，剪刀，取液器吸头。实验设备：

质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用

细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和 SDS 溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。 一、试剂准备 1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH ，10mM EDTA(pH ）。1M Tris-HCl[t1] (pH ），EDTA （pH ）10ml，葡萄糖，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。 任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。 50 mM葡萄糖最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I 中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA呢大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达 10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。 NaOH也使DNA变性，但只是个副产物，在溶液3加入后其中的醋酸和NaOH中和，质粒DNA 恢复活性 2. 溶液Ⅱ：NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置[t2] 。这是用新鲜的N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向 micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为 SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女孩子一样），不然基因组DNA也会断裂。基因组 DNA的断裂会带来麻烦。 3. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 。5M KAc 300ml，冰醋酸，加ddH2O至500ml。4℃保存备用。 溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。最容易产生的误解是，

质粒提取试剂盒-说明书-翻译

精品文档 。 1欢迎下载 E.Z.N.A.? 质粒小提试剂盒操作规程（英文版译文） （适用于No. D6942, D6943 & D6944） 1. 自新鲜划痕选择培养板中分离单菌落，接种含适当选择性抗生素的1-5ml 的LB 培 养基进行培养。37℃强力摇动（~300rpm ）孵育12-16h 。使用10-20ml 培养管或容量至少4倍于培养容积的培养瓶。强烈推荐使用endA 阴性大肠杆菌菌株进行常规质粒分离。此类菌株包括DH5α和JM109。 2. 将1.5-5.0ml 细菌室温10,000 x g 离心1min 。轻轻倒出或吸走培养基并丢弃。 3. 加入250μl 的溶液I/Rnase A 重悬沉淀，涡旋或用移液器反复吹打。充分重悬沉 淀对于获得高质量的DNA 非常重要。 4. 加入250μl 溶液II ，倒置、转动试管数次使之轻轻混匀，得到透明的裂解产物。 可能需要孵育2min 。不要用力混合，以免使染色体DNA 断裂，减低质粒的纯度。该步反应不要超过5min 。溶液II 不用时要拧紧瓶盖，以免试剂被空气中的CO2酸化。 5. 加入350μl 溶液III ，立即倒置试管数次混匀，直至白色絮状沉淀物形成。为避免 形成局部沉淀，加入溶液III 后应立即、充分混匀溶液。 6. 室温≥10,000 x g 离心10分钟。白色沉淀物形成，立即进行下一步操作。 7. 小心翼翼．．．． 的吸取上清液，加入装配在2ml 收集管中的小量纯化柱I 中。确保离心沉淀未受扰动，确保没有细胞碎片加入到柱子中。室温下10,000 x g 离心1分钟，使裂解液完全通过柱子。 8. 丢弃滤过液，重新使用2ml 收集管；加入500μl HB 缓冲液清洗柱子，室温10,000 x g 离心1分钟，使溶液完成通过柱子。该步操作需确保残余的蛋白质污染被去除，以保证获得高品质的DNA 以适合于下游的应用。 9. 丢弃滤过液，重新使用2ml 收集管；加入700μl 用无水乙醇稀释的DNA 清洗液清 洗柱子，室温10,000 x g 离心1分钟，使溶液完全通过柱子，丢弃滤过液。 注意：DNA 清洗液的浓缩液使用前必须用无水乙醇稀释（5倍稀释），如果DNA 清洗液稀 释液经过冷藏，则使用之前必须置于室温。 10. 可选步骤：重复清洗，加入另外的700μl 用无水乙醇稀释的DNA 清洗液。 11. 将空柱子≥13,000 x g 离心2min ，使柱子的基质干燥。此步骤为关键操作，不可 遗漏。 12. 将柱子放入干净的1.5ml 微量离心管中。将30-50μl （取决于终产物的期望浓度） 洗脱液或无菌去离子水直接加入柱子基质上，使之于室温下静置1-2min 。≥13,000 x g 离心1min 洗脱DNA 。可以进行二次洗脱，以收集残存的DNA 。 13. DNA 的产量和质量：分别在波长260nm 和280nm 处测定样品适当稀释液的吸光度。DNA 的浓度计算如下： DNA 浓度=A 260×50×（稀释倍数）μg/ml A 260/A 280的比率可以反映核酸的纯度。比值大于1.8表明核算的纯度在90%以上。或者，DNA 的产量（及质量）有时可以通过琼脂糖胶/溴乙锭电泳与已知浓度的DNA 样品相比较更好的予以确定。通常情况下洗脱的大部分DNA 是超螺旋单体形式，但也可能存在串联体形式。 张小强 翻译

质粒DNA的提取和纯化实验报告

质粒DNA的提取和纯化实验报告

实验一、质粒DNA的提取和纯化 一、实验目的： 1、学习并掌握碱裂解法小量制备质粒DNA的方法。 2、初步了解DNA纯化的原理。 二、实验原理 1、细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 2、质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。 3、碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 4、纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。 三、实验步骤 1、挑取单菌落接种到含Amp的LB液体培养基试管内（3.5ml/管） 2、将试管放入恒温震荡培养箱中，37℃，200r/min培养12-16h。 3、将菌落转入1.5ml离心管中（尽量倒满）1200r/min，离心30s（沉淀菌体） 4、重复一次第三步的过程 5、弃掉上清液并扣干，加入预冷的Solution1 100微升，剧烈震荡打散菌体

大量全血基因组DNA提取试剂盒操作方法及步骤说明书

大量全血基因组DNA提取试剂盒 目录号：DN04 DN0401 16次×10ml DN0402 32次×10ml DN0403 96次×10ml 适用范围： 适用于快速提取各种动物全血基因组DNA 试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成保存16次×10ml 32次×10ml 96次×10ml 10x红细胞裂解液室温50 ml 100 ml 300 ml 细胞核裂解液室温180 ml 180×2 ml 250 m l×4 蛋白沉淀液室温55 ml 110 ml 330 ml DNA溶解液室温15 ml 30 ml 90 ml 本试剂盒在室温储存18个月不影响使用效果。 储存事项: 1.环境温度低时细胞核裂解液中某些去污剂成份会析出出现浑浊或者沉淀，可在 37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。 2.蛋白沉淀液可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，如果不 能完全溶解，也不影响使用效果，直接取用上层溶液即可。

3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时 盖紧盖子。 产品介绍： 本试剂盒根据全血特点采用几个快速步骤提取基因组DNA。首先红细胞裂解液裂解去除不含DNA的红细胞，细胞核裂解液裂解白细胞释放出基因组DNA，然后蛋白沉淀液选择性沉淀去除蛋白，最后纯净的基因组DNA通过异丙醇沉淀并重溶解于DNA 溶解液。 产品特点： 1.从十几个配方中优选出的红细胞裂解液配方，裂解快速完全。 2.不需要使用有毒的苯酚等试剂。 3.快速，简捷，单个样品操作一般可在1小时内完成。 4.结果稳定，产量高（典型的产量10ml全血可提取出150-500μg），OD260/OD280 典型的比值达 1.7～1.9，长度可达50kb-150kb，可直接用于构建文库、PCR、Southern-blot和各种酶切反应。 注意事项 1.所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到2,500 x g，并配备容纳50ml心 管转头的传统台式离心机。 2.用户需自备异丙醇和70％乙醇。 3.典型的产量10ml全血可提取出150-500μg基因组DNA（不同样品尤其疾病样品中 中白细胞数量差异可能非常大，因此产量的个体差异也可能非常大）。 4.本试剂盒为溶液型，可以很容易的按照比例扩大或者缩小每次处理的全血量 （20μl-10ml），请联系我们索取其它处理量的操作手册。

高纯度质粒小提试剂盒使用说明书

高纯度质粒小提试剂盒 Pure Mini Plasmid Kit (目录号：HS0103) 产品包装 试剂盒成分 50 preps Buffer P1 15 ml Buffer P2 15 ml Buffer P3 20 ml Buffer PD 30 ml RNase A(10 mg/ml) 150 ul Buffer PW 60 ml Buffer EB 10 ml Spin Columns PA 50个 Collection Tubes (2 ml) 50个 （注意：使用前将全部RNase A 溶液加到Buffer P1中混合均匀，2 ~ 8℃保存） 保存条件 本试剂盒在室温(15 ~ 25℃)干燥条件下，可保存12个月；更长时间的保存可置于2 ~ 8℃。若溶液产生沉淀，应在使用前置于37℃下溶解沉淀。单独包装的RNase A 在室温可稳定保存12个月。加入RNase A 后的Buffer P1应置于2 ~ 8℃保存，可稳定保存6个月。 产品简介 本试剂盒用于高纯度质粒DNA 的小量制备与纯化。菌体经碱裂解、高盐、低pH 处理，质粒可从菌体中释放出来，并特异、高效地被离心柱硅胶膜（Spin Columns PA ）吸附。通过去蛋白液（Buffer PD ）和漂洗液（Buffer PW ）的清洗可去除蛋白及其他杂质，在低盐、高pH 条件下洗脱，最后得到高纯度的质粒DNA 。 北京厚生博泰科技有限公司 Beijing Hooseen Biotech Co., Ltd.

使用本试剂盒可从1 ~ 5 ml过夜培养的菌液中纯化得到高达20 ug的高纯度质粒DNA，可在30 min之内完成提取任务。所得质粒可直接用于酶切、转化、PCR、测序、低敏感细胞株的转染等各种常规分子生物学操作。 产品特点 1. 快速：步骤少，操作简便，节约时间。 2. 简便：离心吸附柱不需要预平衡，漂洗液Buffer PW 和去蛋白液Buffer PD不需要另加乙醇，即开即用。 3. 纯度高：所得质粒可直接用于酶切、转化、PCR、测序、低敏感细胞株的转染等各种常规分子生物学操作。 操作步骤 1. 取1 ~ 5 ml过夜培养的菌液，室温12,000 rpm离心1 min，尽量将上清去除干净。 （注意：根据菌液的浓度决定取液量，浓度高时取1 ml菌液离心即可，浓度低时可多收集一次） 2. 加入250 ul Buffer P1，用枪头充分吹打使菌体重悬均匀。 （注意：是否将RNase A溶液加到Buffer P1中并混合均匀；菌体沉淀是否悬浮充分，如有未彻底悬浮的菌块会影响裂解，导致提取的质粒浓度及纯度降低） 3. 加入250 ul Buffer P2，温和颠倒混匀6 ~ 8次，直到溶液变得清亮粘稠。 （注意：不可剧烈震荡，以免造成基因组DNA片段的污染，所用时间不要超过5 min，以免质粒受到破坏，如未完全变得清亮，可能是菌体太多，可增加Buffer P2的用量，在后续的操作中Buffer P3的用量也要相应增加） 4. 加入350 ul Buffer P3，立即温和颠倒混匀6 ~ 8次，可见白色沉淀物产生，室温静置2 min，然后12,000 rpm离心3 ~ 5 min。 （注意：Buffer P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀，如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清） 5. 小心将上清液转移到离心吸附柱Spin Columns PA中，静置2 min，让质粒DNA与吸附柱中的硅胶膜充分结合。12,000 rpm离心0.5 ~ 1 min，弃收集管中的废液。 6. 向吸附柱中加入500 ul去蛋白液，12,000 rpm离心1 min，弃收集管中废液。 （注意：如果宿主菌是endA-，如DH5α若TOP10，此步骤可省略。如果宿主菌是endA+，如TG1、BL21、HB101、JM101等，此步骤不可省略，因这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒。如果提取低拷贝质粒

质粒DNA提取方法与原理

质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用 细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA 发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。 一、试剂准备 1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl (pH 8.0）1 2.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。 任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。50 mM葡萄糖最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达 10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。 NaOH也使DNA变性，但只是个副产物，在溶液3加入后其中的醋酸和NaOH中和，质粒DNA恢复活性 2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。 这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向 micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS 也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为 SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS 呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女孩子一样），不然基因组DNA也会断裂。基因组 DNA 的断裂会带来麻烦。 3.溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存备用。 溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。如果你这样怀疑，往1%的 SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是

OMEGA小提试剂盒提取质粒步骤(无内毒)

OMEGA小提试剂盒提取质粒步骤(中文翻译版) 1、将携带目的质粒的大肠杆菌接种于含10~15ul基础培养基/氨苄西林培养介质的50ml培养瓶中。 2、室温下500×g离心10min。 3、弃去上清，剩余沉淀物中加入500ul的SolutionⅠ/RNase A，彻底混匀。 4、将混悬液移至新的2ml离心管中，加入500ul SolutionⅡ，轻柔彻底混匀，可得清亮的细菌裂解物，室温下孵育2min（混匀时用力过大，可破碎出染色体DNA，使目的质粒纯度下降）。 5、向4中液体加入250ul预冷的Buffer N3，轻柔、彻底混匀，直到出现白色絮状沉淀，4℃≥12000×g离心10min（可室温，最好4℃）（Buffer应彻底混匀，若混合物粘稠呈棕色或呈球状，应多混匀几次以中和溶液，溶液的彻底中和对于获得好的产出是必要的）。 6、小心吸取并将上清液转移进新的1.5ml离心管1：0.1的比例向上清液中加入ETR Solution 混匀溶液并于冰上孵育10min，孵育过程中颠倒几次以混匀（加入ETR Solution后，细菌裂解物将出现浑浊，但冰上孵育后将变澄清）（勿用2ml离心管收集上清，因为2ml离心管中有太多液体时，ETR Solution将悬浮于溶液中）。 7、将6中液体于42℃孵育5min，溶液将再次变浑。室温下12000×g离心3min，ETR Solution 将于离心管底部形成蓝色层。 8、将上层水相转移入新的2ml离心管中，按1：0.5的比例加入无水乙醇（室温，96~100％），轻柔混匀，室温下孵育1~2min。 9、将8中的溶液取700ul到柱子中，组装收集管，室温下1000×g离心1min，弃去收集管中通过柱子的液体，柱子和收集管重复利用。 10、重复9中步骤，直到收集的细菌裂解物全部用完。 11、将500ul Buffer HB加入柱子中，室温下1000×g离心1min，弃去收集管中废液（目的：将残存的蛋白污染物除去，是获得高质量DNA所必需的）。 12、向柱子中加入混有乙醇的700ulDNA Wash Buffer，室温下1000×g离心1min，弃去收集管中液体。 13、重复12中的步骤。 14、弃去收集管中液体，空管在最大转速（≥13000×g）离心3min以干燥柱子（对于移除柱子中残留的乙醇是必须的）。 15、将柱子放入新的 1.5ml离心管中，直接向柱子中的白色网状物上加入Endotoxin-Free Elution Buffer 80~100ul（依终产物浓度而定，可每次30ul×2次），室温下放置2min，≥13000×g离心1min，以洗提DNA（将提取约70~85％柱子中收集的DNA，可再重复一次以提取完全，但因再次加入洗提液，会使终产物浓度下降）。 声明：文档为自己翻译后逐字打出来的，有不妥之处望各位同行不吝赐教，以方便大家实验参考，谢谢。

质粒提取试剂盒 说明书 翻译

E.Z.N.A.?质粒小提试剂盒操作规程（英文版译文） （适用于No. D6942, D6943 & D6944） 1. 自新鲜划痕选择培养板中分离单菌落，接种含适当选择性抗生素的1-5ml的LB培养基进行培养。37℃强力摇动（~300rpm）孵育12-16h。使用10-20ml培养管或容量至少4倍于培养容积的培养瓶。强烈推荐使用endA阴性大肠杆菌菌株进行常规质粒分离。此类菌株包括DH5α和JM109。 2. 将1.5-5.0ml细菌室温10,000 x g离心1min。轻轻倒出或吸走培养基并丢弃。 3. 加入250μl 的溶液I/Rnase A重悬沉淀，涡旋或用移液器反复吹打。充分重悬沉淀对于获得高质量的DNA非常重要。 4. 加入250μl溶液II，倒置、转动试管数次使之轻轻混匀，得到透明的裂解产物。可能需要孵育2min。不要用力混合，以免使染色体DNA断裂，减低质粒的纯度。该步反应不要超过5min。溶液II不用时要拧紧瓶盖，以免试剂被空气中的CO2酸化。 5. 加入350μl溶液III，立即倒置试管数次混匀，直至白色絮状沉淀物形成。为避免形成局部沉淀，加入溶液III后应立即、充分混匀溶液。 6. 室温≥10,000 x g离心10分钟。白色沉淀物形成，立即进行下一步操作。 7. 小心翼翼 ．．．．的吸取上清液，加入装配在2ml收集管中的小量纯化柱I中。确保离心沉淀未受扰动，确保没有细胞碎片加入到柱子中。室温下10,000 x g离心1分钟，使裂解液完全通过柱子。 8. 丢弃滤过液，重新使用2ml收集管；加入500μl HB缓冲液清洗柱子，室温10,000 x g离心1分钟，使溶液完成通过柱子。该步操作需确保残余的蛋白质污染被去除，以保证获得高品质的DNA以适合于下游的应用。 9. 丢弃滤过液，重新使用2ml收集管；加入700μl用无水乙醇稀释的DNA清洗液清洗柱子，室温10,000 x g离心1分钟，使溶液完全通过柱子，丢弃滤过液。 注意：DNA清洗液的浓缩液使用前必须用无水乙醇稀释（5倍稀释），如果DNA清洗液稀释液经过冷藏，则使用之前必须置于室温。 10. 可选步骤：重复清洗，加入另外的700μl用无水乙醇稀释的DNA清洗液。 11. 将空柱子≥13,000 x g离心2min，使柱子的基质干燥。此步骤为关键操作，不可遗漏。 12. 将柱子放入干净的1.5ml微量离心管中。将30-50μl（取决于终产物的期望浓度）洗脱液或无菌去离子水直接加入柱子基质上，使之于室温下静置1-2min。≥13,000 x g离心1min洗脱DNA。可以进行二次洗脱，以收集残存的DNA。 13. DNA的产量和质量：分别在波长260nm和280nm处测定样品适当稀释液的吸光度。DNA的浓度计算如下： DNA浓度=A260×50×（稀释倍数）μg/ml A260/A280的比率可以反映核酸的纯度。比值大于1.8表明核算的纯度在90%以上。或者，DNA的产量（及质量）有时可以通过琼脂糖胶/溴乙锭电泳与已知浓度的DNA样品相比较更好的予以确定。通常情况下洗脱的大部分DNA是超螺旋单体形式，但也可能存在串联体形式。 张小强翻译

OMEGA小提试剂盒提取质粒步骤(中文翻译版)

质粒提取（小提，mini kit） 1、将携带目的质粒的大肠杆菌接种于含10~15ul基础培养基/氨苄西林培养介质的50ml培养瓶中。 2、室温下5000×g离心10min。 3、弃去上清，剩余沉淀物中加入500ul的SolutionⅠ/RNase A，彻底混匀。 4、将混悬液移至新的2ml离心管中，加入500ul SolutionⅡ，轻柔彻底混匀，可得清亮的细菌裂解物，室温下孵育2min（混匀时用力过大，可破碎出染色体DNA，使目的质粒纯度下降）。 5、向4中液体加入250ul预冷的Buffer N3，轻柔、彻底混匀，直到出现白色絮状沉淀，4℃≥12000×g离心10min（可室温，最好4℃）（Buffer应彻底混匀，若混合物粘稠呈棕色或呈球状，应多混匀几次以中和溶液，溶液的彻底中和对于获得好的产出是必要的）。 6、小心吸取并将上清液转移进新的1.5ml离心管1：0.1的比例向上清液中加入ETR Solution 混匀溶液并于冰上孵育10min，孵育过程中颠倒几次以混匀（加入ETR Solution后，细菌裂解物将出现浑浊，但冰上孵育后将变澄清）（勿用2ml离心管收集上清，因为2ml离心管中有太多液体时，ETR Solution将悬浮于溶液中）。 7、将6中液体于42℃孵育5min，溶液将再次变浑。室温下12000×g离心3min，ETR Solution将于离心管底部形成蓝色层。 8、将上层水相转移入新的2ml离心管中，按1：0.5的比例加入无水

乙醇（室温，96~100％），轻柔混匀，室温下孵育1~2min。 9、将8中的溶液取700ul到柱子中，组装收集管，室温下1000×g 离心1min，弃去收集管中通过柱子的液体，柱子和收集管重复利用。 10、重复9中步骤，直到收集的细菌裂解物全部用完。 11、将500ul Buffer HB加入柱子中，室温下10000×g离心1min，弃去收集管中废液（目的：将残存的蛋白污染物除去，是获得高质量DNA所必需的）。 12、向柱子中加入混有乙醇的700ulDNA Wash Buffer，室温下10000×g离心1min，弃去收集管中液体。 13、重复12中的步骤。 14、弃去收集管中液体，空管在最大转速（≥13000×g）离心3min 以干燥柱子（对于移除柱子中残留的乙醇是必须的）。 15、将柱子放入新的1.5ml离心管中，直接向柱子中的白色网状物上加入Endotoxin-Free Elution Buffer 80~100ul（依终产物浓度而定，可每次30ul×2次），室温下放置2min，≥13000×g离心1min，以洗提DNA（将提取约70~85％柱子中收集的DNA，可再重复一次以提取完全，但因再次加入洗提液，会使终产物浓度下降）。 声明：文档为自己翻译后逐字打出来的，有不妥之处望各位同行不吝赐教，以方便大家实验参考，谢谢。

质粒抽提原理和详细操作步骤

质粒抽提,实验室必备技能之一 质粒 质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA 分子。 质粒抽提 从细菌中分离质粒DNA的方法包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用强碱液、加热或溶菌酶（主要针对革兰氏阳性细菌）可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）和 TritonX-100（一般很少使用）可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS或 Triton X-100处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，简称cccDNA）的两条链不会相互分开。当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。 质粒抽提最常用的方法是碱裂解法，它具有得率高、适用面广、快速和纯度高等特点。当然，碱裂解法也有缺陷：容易导致不可逆的变性。要降低不可逆的变性，就要控制好碱裂解的时间。 碱裂解法抽提质粒需要用到以下三种溶液 溶液Ⅰ 50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0），10 mmol/L EDTA（pH 8.0），在15 psi 压力下蒸汽灭菌15 min，4℃保存。 溶液Ⅱ 0.2 mmol/L NaOH（从10 mmol/L 贮存液中现用现稀释），10 g/L SDS（室温保存）。 溶液Ⅲ

微量临床样品基因组DNA快速提取试剂盒操作方法及步骤说明书

微量临床样品基因组DNA快速提取试剂盒 目录号：DN25 目录编号包装单位 DN2501 50次 适用范围： 适合于从微量血液、法医材料、干血点、药签等微量样品中分离纯化基因组DNA。 试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成保存50次 裂解液ML 室温11 ml 结合液CB 室温15 ml 抑制物去除液IR 室温25 ml 漂洗液WB 室温15ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 Poly Carrier -20℃200 μl 洗脱缓冲液EB 室温10 ml 蛋白酶K粉（可选） 20mg/ml -20℃20 mg 吸附柱AC和收集管室温50套本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果储存事项：

1.结合液CB或者抑制物去除液IR低温时可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分 钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。 2.为避免降低活性，方便运输，提供蛋白酶K为冻干粉状，收到后，可短暂离心后， 加入1毫升灭菌水溶解。因为反复冻融可能会降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量(20微升)分装冻存，－20℃保存。 3.避免试剂长时间暴露于空气中发生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖 紧盖子。仔细阅读注意事项4。 4. 产品介绍： 本试剂盒采用特制的进口DNA吸附柱和独特的缓冲液系统，特别适合于从微量血液、法医材料、干血点、药签、口香糖、尿液等微量样品中分离纯化基因组DNA。各种来源样品裂解消化处理后DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜（特别配备了Poly Carrier可以从体系中轻松捕获微量核酸），再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，将盐、细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净的基因组DNA 从硅基质膜上洗脱。纯化后的DNA无杂质和PCR抑制剂，可直接适用于PCR分析。 产品特点： 1.不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。 2.节省时间，简捷，单个样品操作一般可在20分钟内完成。 3.配备了Poly Carrier用于充分收集特别微量DNA。 4.多次柱漂洗确保高纯度，提取的DNA 纯度高，质量稳定可靠，可适用于各种常规 操作，包括PCR、酶切、测序、Southern 杂交等。

质粒提取试剂盒说明书

质粒抽提： 质粒抽提方法即去除RNA，将质粒与细菌基因组DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。 实验原理： 提取质粒DNA的方法有很多种，从提取产量上分可分为微量提取、中量提取、大量提取，从使用仪器上分可分为一般提取和试剂盒方法提取，从具体操作方法分可以分为碱裂解法、煮沸法、牙签法等，各种不同的方法各有其优缺点，根据不同的实验目的可以采用合适的提取方法。详细内容请参考《分子克隆实验指南》。另外，复旦大学生化与分子生物学实验室一篇文章，提供了质粒提取机理的详细解说。 碱裂解法 人们使用碱与SDS裂解法从E. coli（大肠杆菌）中分离制备质粒DNA已有30多年的历史。将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。 尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏，闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离，这因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。只要OH-处理的强度和时间不要太过，当pH值恢复到中性时，DNA双链就会再次形成。在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包盖。当用

K+取代Na+时，复合物会从溶液中有效地沉淀下来，离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。 在SDS存在的条件下，碱水解是一项非常灵活的技术，它对E. coli的所有菌株都适用，并且其细菌培养物的体积可以从1-500mL 以上。 煮沸法 煮沸法是将细菌悬浮于含有Triton X-100和能消化细胞壁的溶菌酶的缓冲液中，然后加热到100℃使其裂解。加热除了破坏细菌外壁，还有助于解开DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体DNA 变性。但是。闭环质粒DNA链彼此不会分离，这是因为它们的磷酸二酯骨架具有互相缠绕的拓扑结构。当温度下降后，闭环DNA的碱基又各就各位，形成超螺旋分子，离心除去变性的染色体DNA和蛋白质，就可从上清中回收质粒DNA。煮沸裂解法对于小于15kb的小质粒很有效，可用于提取少至lmL（小量制备），多至250mL（大量制备）菌液的质粒，并且对大多数的大肠杆菌菌株都适用。但对于那些经变性剂、溶菌酶及加热处理后能释放大量碳水化合物的大肠杆菌菌株，则不推荐使用该法。这是因为碳水化合物很难除去，会抑制限制酶和聚合酶活性。若碳水化合物的量很大，在CsCl-溴化乙锭梯度离心中会使超螺旋质粒DNA带变得模糊不清。大肠杆菌菌株HBl01及其衍生菌株（其中包括TGl）能产生大量的碳水化合物，不适于用煮沸法裂解。 质粒小提试剂盒