细胞增殖及细胞活力检测方法

细胞增殖及细胞活力检测方法

目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。另一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。显然，细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用方法一。

用于检测细胞增殖能力最经典的方法是用氚标记的胸腺嘧啶核苷处理细胞，再检测DNA链中氚含量。若细胞具有增殖能力，DNA合成过程中将会采用氚标记的胸腺嘧啶核苷作为合成原料，因此检测细胞DNA链内标记核苷酸的量可判断细胞是否进行DNA 的合成。

但更为常用的方法是BrdU检测法。用BrdU预处理的细胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量（如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定），从而判断细胞的增殖能力。Calbiochem/EMD公司提供一种BrdU检测试剂盒，以微孔板的形式，合并所有清洗、固定、变性的步骤以单一试剂当中。比色检测在一抗二抗标记后在450nm下读数，

所有操作在3小时内结束。而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。1000个细胞以上水平的检测只需用BrdU预孵育2小时，100个细胞则采用过夜预孵育，即可检测细胞的增殖能力。

BrdU法的一个缺点是需要固定和变性等破坏DNA的处理。有些情况下，研究者可能希望在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总DNA含量，然而，在变性条件下，DNA 的双链结构将被破坏，DAPI和Hoechest 33342等核酸标记探针就不再能识别DNA，因而也无法估计DNA总量。Molecular Probes公司的Click-iT EdU检测试剂盒可以解决这个问题。这种方法不需要变性步骤，因为荧光探针标记的叠氮化物小分子，而不是庞大的抗体分子，可以很轻易的识别并结合未变性DNA双链中的EdU分子。采用BrdU方法时，你必须非常小心的去对DNA进行变性，才能一方面使BrdU抗体进入细胞，另一方面又保留足够的双链DNA分子来进行细胞周期的分析。有了EdU 后则不同，由于你不再需要变性，这一切都很简单了；另外，常常用于DNA变性的HCl，可能破细胞内坏蛋白的抗原识别位点，因而限制了BrdU检测法中同时检测其他蛋白的应用，但这种情况在EdU法中不存在。

图1：EdU及BrdU原理示意图（摘至invitrogen说明书）

在一些情况下，细胞活力的检测相当于细胞增殖能力的测定。用于细胞活力检测的方法又很多，这些方法主要采用特殊的试剂来测定细胞的代谢活力，Alamar Blue，MTT及其他四唑盐。它们通过检测细胞的氧化还原活性来检测细胞增殖能力，所以这是一种间接的方法。

Calbiochem的快速细胞增殖试剂盒，或者，严格来说，叫细胞活力试剂盒，采用一

种四唑盐试剂WST-1来对细胞活力进行快速的检测。线粒体剪切WST－1试剂，产生一种水溶性的formazan盐，所以这是一种相对可靠的测定健康细胞活力的方法。一种类似的但更为灵敏的方法是Calbiochem公司的超敏细胞增殖试剂盒，采用calcein-AM（一种荧光探针）来标记细胞。这种增加的灵敏度来自于额外的检测步骤，即采用PBS替代培养基或血清来减小背景。

Invitrogen公司还提供了一种采用荧光素酶检测细胞内ATP水平的方法。健康细胞中荧光素激发出的光可以很容易读出，并且具有非常小的背景。无荧光信号表明细胞线粒体不在产生ATP。因此，这些方法当然也可用于细胞毒性检测实验。

自由基（Free Radical, FR）是含有孤电子的原子或原子团，活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）是指化学性质活跃的含氧原子或原子团，包括超氧阴离子自由基、过氧化氢（H2O2）、单线态氧、羟自由基（HO·）、烷过氧化自由基、脂过氧化自由基等。

FR和ROS在细胞内可通过酶反应和非酶反应产生。其中线粒体是细胞内FR和ROS产生的主要来源，约占细胞内FR和ROS总量的98%左右[1]，由于线粒体内超氧化物歧化酶(SOD)浓度较高，大部分O2·-歧化为H2O2，后者可穿过线粒体膜进入胞浆。细胞内膜系统如滑面内质网及过氧化物酶体里含有一些酶, 如细胞色素p-450和b3家族、乙醇酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶、尿酸氧化酶等，这些酶对脂溶性药物、不饱和脂肪酸、抗生素及其它代谢产物的氧化，亦可产生H2O2和O2·-等[2，3]。除此以外，一些可溶性氧化酶、吞噬细胞NADP氧化酶、磷脂酶A2(PLA2)等催化的反应，以及某些小分子的自氧化均是内源性ROS产生的重要来源[1]，配体反应也可介导产生FR和ROS[4]。

衰老的自由基学说认为，随着细胞复制衰老或生物整体衰老，FR和ROS在衰老的细胞和组织内累积，损伤生物大分子如蛋白质、脂类、核酸等，造成其结构改变和功能丧失，甚至引起基因突变、DNA复制停止等，最终引起复制衰老和整体衰老，FR和ROS经由哪些途径引起衰老的呢？

1．FR和ROS可改变细胞的氧化还原状态。细胞内的氧化还原状态主要由谷胱甘肽(GSH)和硫氧还蛋白(TRX)两对缓冲对进行调节，FR和ROS可氧化GSH和TRX，改变细胞内相对稳定的氧化还原状态，进而影响信号传导[5]。

2．FR和ROS通过氧化蛋白质侧链上关键的氨基酸残基，如丝氨酸的羟基和半胱氨酸巯基，进而改变蛋白质的结构、影响蛋白质多聚化、蛋白质与Fe-S或其它金属离子的结合等。如被氧化修饰的-OH或-SH位于酶的催化中心，则酶的催化活性丧失；如被氧化修饰的氨基酸残基位于DNA结合域，则转录因子失去了与DNA结合及调控转录的能力；而蛋白质若不能与Fe-S结合，则呼吸链电子传递及氧化磷酸化受阻。另外，损伤的蛋白质半寿期延长，而衰老的细胞中蛋白质合成速率下降，导致受损伤的蛋白质更新率下降[6]。

3． FR和ROS可氧化DNA，使其断裂或突变，DNA复制和转录受阻[7，8]。如果FR 和ROS 导致的DNA单链断裂发生于染色体端区末端，则端区缩短加快。在正常培养条件下，人二倍体成纤维细胞的端区缩短速率主要取决于细胞内的氧化压力[9]。

4． FR和ROS加速了细胞内非酶糖基化反应，以及大分子如蛋白质之间的交联[10]。

5． FR和ROS损伤端区，可能引发了衰老相关基因如p16和p21的过表达。

MTT法测定细胞相对数和相对活力

一、原理

噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的Formazan结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。

细胞活性测定方法有台盼蓝染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性

同位素掺入法、MTT法等。其中MTT法以其快速简便，不需要特殊检测仪器、

无放射性同位素、适合大批量检测的特点而得到广泛的应用。但MTT法形

成的Formazan为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，由于在去上清操作时会有可能带走小部分的Formazan，故有时重复性略差。为了解决这个问题，研究人员又开发了很多种水溶性的四氮唑盐类：如XTT、CCK-8（WST-8）等。

现就这三种四氮唑盐类方法作一个简单介绍：

1.MTT法

MTT：化学名： 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。

缺点：由于MTT经还原所产生的甲产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。

2.XTT法

XTT：化学名：2,3-

bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]

-2H-tetrazolium hydroxide，作为线粒体脱氢酶的作用底物，被活细胞还原成水溶性的橙黄色甲产物。当XTT与电子偶合剂（例如PMS）联合应用时，其所产生的水溶性的甲产物的吸光度与活细胞的数量成正比。

优点：1、使用方便，省去了洗涤细胞；2、检测快速；3、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；4、重复性优于MTT。

缺点：XTT水溶液不稳定，需要低温保存或现配现用。

https://www.sodocs.net/doc/0b2189111.html,K-8法或称WST-8法

CCK-8试剂中含有WST–8：化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐]，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲产物（Formazan）。生成的甲物的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。

优点：1、使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；2、检测快速；3、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；4、重复性优于MTT；5、对细胞毒性小；6、为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。

缺点:1、与MTT相比，CCK-8和XTT的价格比较贵。2、CCK-8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多

加。

三种方法的比较

MTT法XTT法CCK-8法（WST-8法）甲物水溶性难溶性水溶性水溶性

检测波长490 nm450nm450nm

性状粉末2瓶溶液1瓶溶液

配成溶液后使

使用方法

现配现用毋需预制

用

DMSO或其它溶

使用有机溶剂

——

剂

方便性++++++

检测速度++++++

重复性+++++

稳定性+++++

工作量------

对细胞毒性------

对人体毒性-----

一、简介流式细胞仪

（一）流式细胞仪概念

流式细胞术（Flow Cytometry ，FCM）是一种对处在液流中的细胞或其它生

物微粒（如细菌）逐个进行多参数的快速定量分析和分选的技术。

简言之，流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单

个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质，如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等进行快速测量并可分类收集的高技术，FCM 以其快速、灵活、大量、灵敏和定量的特色，广泛应用于基础研究和临床实践各个方面，包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学

等，在各学科领域发挥着重要的作用。

（二）原理

待测样本的细胞悬液，在鞘液的包围和约束下，细胞排成单列高速由流动室

喷嘴喷出，形成细胞液柱。当液柱通过检测区，在入射的激光束照射下产生前向

散射光（FSC）和侧向散射光（SSC），它们分别反映细胞大小和颗粒度，根据这

些特性可以将细胞分类。经一种或几种特殊荧光标记的样本，在激光束的激发下

所产生的特定荧光，可被光学系统检测并输送到计算机进行分析，得到细胞相应

的各种特性。

（三）流式细胞仪检测的细胞特性

细胞结构组成细胞功能

大小细胞表面、胞浆、核特异性抗原

粒度细胞活性

DNA、RNA 含量胞内细胞因子

蛋白质含量激素结合位点

钙离子、pH 值、膜电位酶活性

人体抑癌基因。该基因编码一种分子量为53kDa的蛋白质，命名为P53。p53基因的

失活对肿瘤形成起重要作用。但是事物必然有它的两个方面，p53是一个重要的抗癌基因使癌细胞自杀，防止癌变；还具有帮助细胞基因修复缺陷的功能。这种功能对于受化疗药物作用而受伤的癌细胞，则起修复作用，而不是使癌细胞自杀。造成被修复的癌细胞在治疗后成为新的肿瘤。

领导这一研究的是麻省大学医学院Joel D. Richter教授，这位科学家对于发育与疾病过程中的调控机制十分感兴趣，至今已发表相关研究成果多项，尤其是有丝分裂，减数分裂过程中的机制。

mRNA的3’端被一段“非模板”的腺嘌呤（即polyA尾端）所覆盖，其作用是增强它们的翻译。polyA聚合酶Gld2被序列特异性CPEB蛋白引导到3’端未翻译的区域。在这篇文章中，研究人员发现p53肿瘤抑制因子不只是简单地被Gld2多聚腺苷酰化。而是Gld2可以将一个A添加到miR-122小RNA上，从而使其稳定。这种腺苷酰化的miR-122/RISC复合物然后通过在其3’端未翻译区域结合目标点来抑制CPEB的表达。如果CPEB不被miR-122抑制，那么CPEB将与p53的3’端未翻译区域结合，并结合一种不同的polyA聚合酶，即Gld4。这些数据反映了p53 mRNA的翻译控制的一个以前人们不知道的层级关系，这一层级关系导致细胞衰老。

这种小RNA：miR-122具有许多重要的作用，之前的研究发现肝癌组织miR-122的表达与肝癌细胞周期调控密切相关，最近的研究又显示，miR-122可以通过影响p53蛋白的稳定性和转录活性，调节细胞周期蛋白Cyclin G的表达，从而降低癌细胞的侵袭性。这些都说明了这种小分子与p53的关系密切。这对于深入了解p53的作用具有重要的意义。

除此之外，有关p53，近期布鲁塞尔自由大学的研究人员也获得了新进展，他们证实一个重要的肿瘤抑制因子p53的某些突变可导致蛋白质发生错误折叠从而在细胞内积聚。这不仅破坏了正常p53的保护功能，同样还可累积其他相关蛋白，从而导致癌症的发生。

过去的研究表明大约有一半的癌症中都存在p53基因突变，从而科学家们将其视为开发新型癌症治疗的重要靶点。而这项研究揭示了突变p53在癌症中一个新的作用机制：p53突变使得p53蛋白丧失了它的保护性功能，并导致这些蛋白质改变形状，相互之间发生聚合，开始在细胞内积聚。研究结果表明大约1/3的p53突变细胞存在这样的作用机制。

研究人员还发现突变可能导致p53获得了完全不同的特性，进而从抑癌因子转变成为了加速肿瘤生长的物质。在进一步的研究中，研究人员发现突变p53似乎还与细胞内的调控分子p63和p73形成了积聚物，从而导致这些调控分子丧失了自身的功能。

美国Brown大学最新研究发现，即使在果蝇神经细胞中的瘤抑制蛋白p53的活性降低的情况下，果蝇仍然能健康存活很长时间。论文发表在最新一期的国际生物学期刊《Current Biology》中，研究结果为p53的功能研究提供了重要的信息，"基因组的守护神"——p53对抗衰老药物的研究也具有一定的参考价值。P53基因在体内具有重要的地位。它通过产生一种能引发细胞调亡的蛋白质来保护人类细胞，或是在DNA受到严重损伤时促使细胞自杀，这样便可以阻止遗传突变的扩展和癌症的形成。当p53受损或缺失时，就会导致癌症。实际上，有53％的癌症患者携带有p53突变体。然而，当人类的守护基因p53极度活跃，瘤抑制蛋白比正常

水平更高的时候，老鼠的衰老进程就会加速并且寿命缩短。生物学家Stephen Helfand等的研究显示，p53基因中存在一个“临界点”。如果p53蛋白的含量低于这个"临界点"，尤其是神经细胞中的p53，便能延长果蝇的健康生存时间。因此， p53活性的降低对衰老会产生重大的影响。美国康涅狄格大学的研究人员发现对p53蛋白进行修饰可以延长寿命，Brown大学的Helfand教授等用果蝇进行了检测试验。因为果蝇中有数千个基因与人类相似，并且它也表达p53基因。试验中用的果蝇携带有p53的突变体，当突变基因表达后，会产生一个突变体进而形成新的p53蛋白，该蛋白会使正常的p53蛋白失活，不过这种影响只发生在神经细胞中。为什么挑选神经细胞来做试验呢？因为成熟的神经细胞不会分裂，这样发展为癌症的几率就比较小。研究结果显示，携带成熟突变体的果蝇中58％都会长寿，平均寿命为60天，而正常情况下果蝇的平均寿命为38天。与此同时，果蝇还会健康生长，还会继续取食、运动以及繁殖后代。但是，目前的试验还不能解释为什么p53活性的降低能延长寿命。有现象暗示这是卡路里限制的原因，这一生化机理可以延缓衰老。为了检验这个设想，研究人员不进行卡路里限制，饲养了一些果蝇，发现果蝇不再长寿，这表明了该途径是存在的。

p53和pRB蛋白是两种关键的肿瘤抑制因子，在诱导衰老方面有着决定性的作用，一般我们说的两条衰老信号通路是指pRB信号通路和p53信号通路。

人类的细胞衰老通路表现为两条平行的（与小鼠的一条形成对比）通路，这样将使得细胞不容易绕过衰老过程，从而抑制了肿瘤的发生。但是这种设想受到了近年来的一些实验的挑战，如人的肺成纤维细胞，通过体细胞同源重组技术，使得p53或PRB失活，可以避开衰老过程，这就有些像小鼠身上的单线状的衰老通路(Wei et al.,

2003)；而且，与小鼠形成对照的是，通过同源重组导致的p21的失活足以避开衰老过程，表明了p21作为p53和PRB两通路的联系者的身份(Brown et al., 1997a)。关于p53和PRB蛋白的作用，现在有一种比较认可的看法是：p53通路介导的是端粒功能异常、DNA损伤引起的衰老过程；p16/pRB通路介导的是致癌基因的表达、染色质断裂、多种多样的胁迫等等引起的衰老过程(Wright and Shay, 2002; Collins and Sedivy, 2003; Ben Porath and Weinberg, 2004)。但是现在这两条通路的标志性分子尚未找到，并且在不同种、组织的细胞中两条通路的重要性又有所不同，所以对于衰老通路的理解正处于不断深化的过程中。

下面简单看一下两个通路情况：

(一) p53通路

p53蛋白可以激活下游分子，如p21CIP1/WAF1(Kulju and Lehman, 1995)，或是其他的蛋白分子来激活pRB实现衰老过程（小鼠）；而且，在人身上，可以不依赖PRB激活衰老。p53的失活会导致一些复制型衰老的细胞彻底地逆转衰老过程(Gire and Wynford-Thomas, 1998)。类似地，p21（p53的转录激活的靶子，是一种细胞周期循环的抑制分子）的失活，会使得细胞绕过端粒依赖的复制型衰老，进入一种危机状态(Brown et al., 1997b)。

p53的激活是通过磷酸化（ATM/ATR，Chk1/Chk2蛋白分子的功劳），p19(ARF)(抑制Mdm2)的激活来实现。p53在细胞对DNA损伤反应（包括衰老反应）过程中是一个关键性的调节因子(Wahl and Carr, 2001)。在人的细胞中，p53的缺失会延迟或是阻断复制型衰老(Itahana et al., 2001)。

致癌基因RAS的表达通过ROS来实现，而ROS是在促有丝分裂以及促细胞衰老的过程中是必需的。RAS的过量表达，可能会通过p53依赖的损伤反应（即产生大量的DNA损伤的ROS）来导致衰老反应；同时RAS也会诱导p16的表达，p16是pRB的激活剂(Ferbeyre et al., 2000; Pearson et al., 2000; Serrano et al., 1997)。两个蛋白都能阻碍潜在的肿瘤细胞的增殖。

总之，在一些细胞中，DNA损伤引起的衰老感应，端粒异常，以及一些致癌性基因的表达会通过p53通路来导致细胞衰老，p53通路在当中起的作用不仅是必要而且还是充分条件。

（二）pRB通路

p53对于一些细胞逆转衰老抑制非常有效，但也不竟然(Beausejour et al., 2003c; Herbig et al., 2004b; Sakamoto et al., 1993)。有些细胞在p53敲除后，还能呈现衰老状态。这种细胞往往或多或少地表达细胞周期的抑制因子p16。

小鼠体内的研究表明p16阻碍了自发性的恶性肿瘤的发生(Sharpless et al., 2001)。细胞培养的研究表明，p16阻止了由p53失活引起的逆转衰老的现象；并且对RAS引导的衰老过程是必需的(Beausejour et al., 2003b; Benanti and Galloway, 2004a; Brookes et al., 2004)。

p16的表达通过胁迫刺激来实现，如过量表达致癌基因RAS，或是相对艰苦的培养环境(Lowe and Sherr, 2003)；可以被p21,或是p16ink4a蛋白分子激活。p16是pRB的正向调节分子，而且还能通过自己的信号通路来实现作为肿瘤抑制剂的功能(Sherr and McCormick, 2002)。值得一提的是，p21在抑制细胞周期依赖的激酶方面，是比

p16更普遍的抑制剂，它可以导致磷酸化的程度降低，促进pRB的激活。在人的成纤维细胞中，如果p53失活，p21表达，细胞增殖过程仍可继续；但是如果p16表达了，那么增殖过程就会停止了。并且，在人的成纤维细胞中，p21和p16，一般是两者择其一表达，很少有两个都表达的(Herbig et al., 2004a)。

pRB蛋白在衰老的过程中是以低磷酸化的活性状态体现活性的，通过结合E2F蛋白家族的成员来抑制目标基因的表达(Narita et al., 2003)。有趣的是，一旦pRB通路启动了之后（尤其是被p16启动的），就算是p53失活，p16沉默，或pRB失活都不能逆转衰老过程的发生(Beausejour et al., 2003a)。这个过程被认为是pRB在转录因子的目标基因或者是其他的基因池上，形成抑制性的染色质之后，维持异染色质的过程不需要p16或是pRB的参与。

pRB通路在诱导有关衰老基因的表达方面鲜为人知。因为pRB/E2F并不直接调控那些在衰老细胞中高表达的基因，而是间接地控制这些基因（如沉默那些抑制因子，等等）。

小鼠和人的细胞衰老途径有些不同。以前认为小鼠细胞的复制型或是端粒依赖型的衰老过程是主要通过p53来实现的(Harvey et al., 1993; Smogorzewska and de Lange, 2002b)。但是，后来发现，小鼠细胞的这种衰老反映可能是由于氧毒害引起的（人为），然而，人的细胞对于氧的毒害反映比较轻(Smogorzewska and de Lange, 2002a; Parrinello et al., 2003)。除了这个区别外，小鼠细胞还能逆转由pRB引起的衰老状态(Sage et al., 2003b)，但人的细胞是不是也能适应高浓度的p16还不清楚。同时，在人的细胞中，p16在数量上似乎有一个“度”的概念，超过了这个度，将会使人的细胞对RAS诱导的衰老更加敏感，同时细胞也不再增殖

细胞增殖及细胞活力检测方法

细胞增殖及细胞活力检测方法 目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。另一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。显然，细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用方法一。 用于检测细胞增殖能力最经典的方法是用氚标记的胸腺嘧啶核苷处理细胞，再检测DNA链中氚含量。若细胞具有增殖能力，DNA合成过程中将会采用氚标记的胸腺嘧啶核苷作为合成原料，因此检测细胞DNA链内标记核苷酸的量可判断细胞是否进行DNA 的合成。 但更为常用的方法是BrdU检测法。用BrdU预处理的细胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量（如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定），从而判断细胞的增殖能力。Calbiochem/EMD公司提供一种BrdU检测试剂盒，以微孔板的形式，合并所有清洗、固定、变性的步骤以单一试剂当中。比色检测在一抗二抗标记后在450nm下读数，

所有操作在3小时内结束。而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。1000个细胞以上水平的检测只需用BrdU预孵育2小时，100个细胞则采用过夜预孵育，即可检测细胞的增殖能力。 BrdU法的一个缺点是需要固定和变性等破坏DNA的处理。有些情况下，研究者可能希望在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总DNA含量，然而，在变性条件下，DNA 的双链结构将被破坏，DAPI和Hoechest 33342等核酸标记探针就不再能识别DNA，因而也无法估计DNA总量。Molecular Probes公司的Click-iT EdU检测试剂盒可以解决这个问题。这种方法不需要变性步骤，因为荧光探针标记的叠氮化物小分子，而不是庞大的抗体分子，可以很轻易的识别并结合未变性DNA双链中的EdU分子。采用BrdU方法时，你必须非常小心的去对DNA进行变性，才能一方面使BrdU抗体进入细胞，另一方面又保留足够的双链DNA分子来进行细胞周期的分析。有了EdU 后则不同，由于你不再需要变性，这一切都很简单了；另外，常常用于DNA变性的HCl，可能破细胞内坏蛋白的抗原识别位点，因而限制了BrdU检测法中同时检测其他蛋白的应用，但这种情况在EdU法中不存在。 图1：EdU及BrdU原理示意图（摘至invitrogen说明书） 在一些情况下，细胞活力的检测相当于细胞增殖能力的测定。用于细胞活力检测的方法又很多，这些方法主要采用特殊的试剂来测定细胞的代谢活力，Alamar Blue，MTT及其他四唑盐。它们通过检测细胞的氧化还原活性来检测细胞增殖能力，所以这是一种间接的方法。 Calbiochem的快速细胞增殖试剂盒，或者，严格来说，叫细胞活力试剂盒，采用一

细胞凋亡试验常用的方法

细胞凋亡试验常用的方法（MTT法、荧光法、DNA琼脂糖凝胶电泳法与流式细胞仪检测法） （一）药物对肿瘤细胞的抑制效应的MTT法： 用培养基将肿瘤细胞调整至2 X108个/L，在96孔板中每孔加入100ul细胞悬液于37℃、5% CO2下培养过夜。 次日每孔加入不同浓度的药物100mg/L作为试验组，设加完全培养基不加药物的阴性对照，并用功能明确的药物为阳性对照和0.5%的乙醇溶剂对照，每组均设4-6个复孔（平行孔）、37℃、5% CO2继续培养。 培养至12h、24h、48h、实验终止前4-6h加入10ulMTT（5g/L），培养4-6h后，阴性对照孔中已形成明显的蓝紫色颗粒结晶时加100ul/孔SDS-HCl终止反应，于37℃存放过夜。 用酶标仪在A570波长下测吸光度值，按下式计算抑制率 抑制率（%）=（1-试验组平均吸光度值/阴性对照组平均吸光度值）x 100%。 （二）荧光法： 选用上述最佳浓度作用于肿瘤细胞，培养细胞48h后，收货细胞用PBS洗2-3次后用0.4%多聚甲醛室温下固定30min。 弃去固定液，并用PBS洗2次后，用1%Triton X-100作用4min加入适量的0.5mg/L DAPI 荧光染色60min，用PBS冲洗3次，取10ul滴片，干燥后于荧光显微镜下检测断裂的颗粒和片状荧光。 （三）DNA琼脂糖凝胶电泳法： 1、DNA提取： 用大方瓶培养肿瘤细胞，每瓶10ml，细胞浓度为3 x 108个/ml，每隔药物浓度、作用时间均设2瓶，共分3个时间段，4个药物浓度。共培养26瓶细胞。 分别于细胞中加入不同浓度的药物，于37℃、5% CO2中分别培养12h、24h、48h，收货细胞，用PBS洗2-3次。 于-20℃将细胞冷却处理10min后将细胞收集至离心管中，加1ml细胞裂解液，再加蛋白酶K，轻轻振摇使悬液混匀，成黏糊状，50℃过夜。 冷却后加入等体积的饱和酚溶液，混合后10000r/min离心10min，吸出上层水相，移至另一离心管中，再加入等体积饱和酚溶液重复抽提一次，直到无蛋白为止。 吸上清加入氯仿/异戊醇（24：1）按上述方法再抽提一次。 吸取水相层加入1/10体积的3mol/L的醋酸钠溶液，混匀。 再加入2.5倍体积冷无水乙醇，混合置-20℃处理30min后，10000r/min离心10min，沉淀部分为提供的DNA，弃去无水乙醇后用70%乙醇漂洗2次，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干乙醇。 加入200ulTE缓冲液融解DNA，再加入25ul的RNA酶，置37℃作用30min，置4℃冰箱保存。 2、琼脂糖凝胶电泳： TBE缓冲液配制1.8%琼脂糖凝胶。在微波炉内煮沸至琼脂糖融解，待冷却至60℃时，加入溴化乙锭，使其终浓度为0.5mg/ml，混匀后灌胶。 待凝胶固定后放入含TBE电泳液的电泳槽内，使TBE电泳液盖过凝胶。 取10-15ul提取的各组DNA样品液与上样缓冲液按4：1比例混匀后点样。 60V电泳1h，用紫外透射仪观察梯形条带。

T24膀胱癌细胞ARID1A基因的表达与细胞增殖活力相关性研究

基金项目：深圳市科技计划项目（编号２０１１０３０３６）＊通讯作者 文章编号：１００７－４２８７（２０１２）０５－０７９２－０３ Ｔ２４膀胱癌细胞ＡＲＩＤ１Ａ基因的表达 与细胞增殖活力相关性研究 吴金斌１＊，漆正宇２，晏耀明１，翟庆娜１，余振东１ （１．北京大学深圳医院检验科，２．北京大学深圳医院男性生殖与遗传重点实验室，广东深圳５１８０３６）摘要：目的　探讨ＡＴ丰富结合域１Ａ（ＡＲＩＤ１Ａ）基因的表达与膀胱癌细胞Ｔ２４增殖活力的关系，为进一步基因功能研究提供基础。方法　利用梯度稀释法分离获得膀胱移行癌细胞系Ｔ２４的高增殖亚克隆细胞株，体外评价细胞株和亲代细胞系增殖活力差异，检测细胞周期调控基因ＣＣＮＤ１和膀胱癌肿瘤干细胞标志因子ＣＤ４４。检测染色质重建复合物ＳＷＩ／ＳＮＦ亚基基因ＡＲＩＤ１Ａ在亚克隆和亲代细胞系的转录表达水平差异。结果　分离得到６５个Ｔ２４的亚克隆细胞株，其中Ｔ２４－９亚克隆细胞株不同于亲代的梭形形态，呈细小的圆形形态，增殖能力明显强于亲代，ＣＣ－ＮＤ１、ＡＲＩＤ１Ａ和ＣＤ４４的ｍＲＮＡ表达量均有增加。结论　Ｔ２４细胞系中的含有高增殖活力的干细胞细胞亚群，染色质重建复合物基因ＡＲＩＤ１Ａ转录活跃，可能增加ＡＲＩＤ１Ａ突变的风险。 关键词：膀胱移行细胞癌；Ｔ２４；ＡＲＩＤ１Ａ；增殖；亚克隆细胞株中图分类号：Ｒ７３７．１４ 文献标识码：Ａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＡＲＩＤ１Ａｉｎ　Ｔ２４－９ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ＷＵ　Ｊｉｎ－ｂｉｎ１ ，ＱＩ　Ｚｈｅｎｇ－ｙｕ２，ＹＡＮ　Ｙａｏ－ｍｉｎｇ１ ，ｅｔ　ａｌ．（１．Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　 ｏｆ　Ｐｅｋｉｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｓｈｅｎｚｈｅｎ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ；２．Ｍａｌｅ　ＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅＭｅｄｉｃｉｎｅ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　 ｏｆ　Ｐｅｋｉｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｓｈｅｎｚｈｅｎ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ５１８０３６，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＡＲＩＤ１Ａｇｅｎｅ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｈｕ－ｍａｎ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ　ｃｅｌｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｌａｄｄｅｒ（ＴＣＣＢ）ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　Ｔ２４．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｃｅｌｌ　ｍｏｎｏｃｌｏｎｅｓ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐｒｏｌｉｆ－ｅｒａｔｉｖｅ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅｉｒ　ｐａｒｅｎｔａｌ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　Ｔ２４ｂｙ　ｌｉｍｉｔｉｎｇ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ．Ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ｓｕｂｃｌｏｎｅ－ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｘ－ｐａｎｓｉｏｎ，ｗｅｒｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉａ　ｂｉｏｌｏｇｙ　 ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｔｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｐａｔｔｅｒｎｓ　ｏｆ　ｃｌｏｎａｌ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｐｒｏ－ｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｋｉｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ，ｗｅ　ｅｍｐｌｏｙｅｄ　ｔｈｅ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）ａｎａｌｙｓｉｓ　ｆｏｒ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｕｂｃｌｏｎｅｓ　ｗｉｔｈ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ＣＣＮＤ１，ＣＤ４４ａｎｄ　ＡＲＩＤ１Ａ．Ｑｕａｎｔｉｔａ－ｔｉｖｅ　ｄａｔａ　ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｔ　ｔｅｓｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ａ　ｓｕｂｅｌｏｎｅ　ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ　ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ　Ｔ２４－９ｆｒｏｍ　Ｔ２４ｗａｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ．Ｔｈｅ　ｓｕｂｃｌｏｎｅ　ｗａｓ　ｓｐｈｅｒｏｉｄａｌ－ｌｉｋｅ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ｗｉｔｈ　ｓｍａｌｌｅｒ　ｔｈａｎ　Ｔ２４ｗｈｉｃｈ　ｉｓ　ｓｐｉｎｄｌｅ－ｓｈａｐｅｄｗｉｔｈ　ｌｏｎｇ　ｐｓｅｕｄｏｐｏｄｉｕｍ．Ｔｈｅ　ｃｌｏｎａｌｉｔｙ　ｏｆ　Ｔ２４－９ｗａｓ　ｓｔｒｏｎｇｅｒ　ｔｈａｎ　ｐａｒｅｎｔａｌ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　Ｔ２４．Ｇｒｏｗｔｈ　ａｓｓａｙ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔＴ２４－９ｇｒｅｗ　ｆａｓｔｅｒ　ｔｏ　ａ　ｈｉｇｈｅｒ　ｃｅｌｌ　ｄｅｎｓｉｔｙ　 ｔｈａｎ　ｔｈｅ　ｐａｒｅｎｔａｌ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　Ｔ２４ｉｎ　７ｄａｙｓ．ＲＴ－ｑＰＣＲ　ｓｈｏｗｅｄ　ａ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐ－ｔｉｏｎａｌ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ｔｈｒｅｅ　ｇｅｎｅｓ　ＣＣＮＤ１，ＣＤ４４ａｎｄ　ＡＲＩＤ１Ａｉｎ　Ｔ２４－９ｔｈａｎ　Ｔ２４．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｂｌａｄｄｅｒ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　Ｔ２４Ｃｏｎｔａｉｎｓ　ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　ｗｈｉｃｈ　ｃｈｒｏｍａｔｉｎ　ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｓｕｂｕｎｉｔ　ＡＲＩＤ１Ａｇｅｎｅ　ｉｓｍｏｒｅ　ａｃｔｉｖｅ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐ ｔｉｏｎ．Ｋｅｙ　 ｗｏｒｄｓ：ＴＣＣＢ；Ｔ２４；ＡＲＩＤ１Ａ；ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ；Ｓｕｂｃｌｏｎｅ（Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｌａｂ　Ｄｉａｇ ｎ，２０１２，１６：０７９２） 膀胱癌是一类常见的泌尿系统恶性肿瘤， 其中移行细胞癌占膀胱癌发病率的９０％以上［１］ 。染色质重建复合物ＳＷＩ／ＳＮＦ亚基ＡＴ丰富结合域１Ａ基因（ＡＴ　ｒｉｃｈ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ　ｄｏｍａｉｎ　１Ａ，ＡＲＩＤ１Ａ）是近两年来肿瘤研究关注的一个重要基因， 膀胱移行细胞癌中ＡＲＩＤ１Ａ高比率突变［２］， 但我们前期测序发现在膀胱癌细胞系Ｔ２４中ＡＲＩＤ１Ａ可以正常表 达。ＡＲＩＤ１Ａ作为一个染色质重建复合物亚基基 因，跟细胞增殖密切相关［ ３］ 。本研究通过有限稀释方法分离出膀胱移行细胞癌细胞系Ｔ２４的高增殖 活力亚克隆细胞株，体外评价ＡＲＩＤ１Ａ表达与细胞增殖转移潜能关系，并为进一步研究ＡＲＩＤ１Ａ基因功能提供目的细胞。１　材料和方法 １．１　材料 基础培养基Ｈ－ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ　 ＵＳＡ），１０％胎牛血清（ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ，Ｇｉｂｃｏ　 ＵＳＡ），左旋— ２９７—Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｌａｂ　Ｄｉａｇｎ，Ｍａｙ ，２０１２，Ｖｏｌ　１６，Ｎｏ．５

细胞凋亡实验步骤及注意事项

细胞凋亡实验步骤及注意事项 一、实验目的 1、掌屋凋亡细胞的形态特征 2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞与坏死 细胞的方法 二、实验原理 细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡与坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界,在生物个体与生存中起着非常重要的作用。它就是细胞在一 定生理条件下一系列顺序发生事件的组合,就是细胞遵循一定规律自己结束生命 的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学与生物化学特征。 在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触,细胞变园,细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网与细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体,凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外,不会影响其它细胞,因而不引起炎症反应。 在生物化学上,多数细胞凋亡的过程中,内源性核酸内切酶活化,活性增加。核DNA 随机地在核小体的连接部位被酶切断,降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳,可显示以180-200bp为基数的DNA ladder(梯状带纹)的特征。 相比之下,坏死就是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期 即丧失质膜完整性,各种细胞器膨胀,进而质膜崩解释放出其中的内容物,引起炎症反应,坏死过程中细胞核DNA虽也降解,但由于存在各种长度不等的DNA片断,不能形成梯状带纹,而呈弥散状。 一些温与的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡,通常这些因素在诱导凋亡的同时,也可产生细胞坏死,这取决于损伤的剧烈程度与细胞本身对刺激的敏感 程度。 三尖杉酯碱(HT)就是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病,急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0、02~5μg/ml范围内作用2小时,即可诱导HL-60细胞凋亡,并表现出典型的凋亡特征。本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡,同时也有少数细胞发生坏死。用 Hoechst33342与碘化丙啶(propidium iodide,PI)对细胞进行双重染色,可以区别凋亡、坏死及正常细胞。 细胞膜就是一选择性的生物膜,一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时,质膜不完整,PI就进入细胞内部,它可嵌入到DNA或RNA中,使坏死细胞着

常用细胞凋亡检测方法(图)

常用细胞凋亡检测方法（图） 转载请注明来自丁香园 发布日期：2012-02-16 13:41 文章来源：丁香通 关键词：丁香园生物专题义翘神州细胞培养点击次数：951 一、细胞凋亡的形态学检测 1、光学显微镜和倒置显微镜 ①未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 ②染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。 2、荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA 特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释，终浓度为10 ug/ml。DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为10 ug/ml。结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。 3、透射电子显微镜观察 结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。 碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细核红染。因此将Annexin-V 与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。 方法

CCK8法检测细胞增殖预实验

SRT-1720, EX527 —定要应用在白血病细胞株起作用的浓度方可比较对 293T细胞和白血病细胞株的不同影响，请重复实验。 实验日期：2015/08/22-2015/08/27 实验项目：CCK8法检测细胞增殖 实验地点：广西医科大学药基楼14楼生物靶向中心 实验人员：高宗燕、宁海萍、李登峰 实验目的：检测SRT-1720/EX527刺激293T细胞后对细胞增殖的影响 主要试剂：SRT-1720,EX527,CCK8试剂盒 主要仪器：酶标仪 实验步骤： 一、制作标准曲线（测定细胞具体数量时） 1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞至96孔板。 2、设置4个细胞浓度梯度：0, 2000，4000，8000,每组4个复孔。 3、接种后培养24小时使细胞贴壁，然后加CCK试剂培养4小时后测定OD值，制作出一条以细胞数量为 横坐标（X轴），OD值为纵坐标（Y轴）的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（试用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入CCK后的培养时间。） 图一、标准曲线 二、细胞增殖检测 1、在96孔板中配置100卩泊勺细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24小时（在37C, 5% CO2的条件下）。 2、向培养板加入10 ^L SRT-1720（终浓度3um）, EX527 （终浓度100um）。 3、将培养板在培养箱孵育约24h 4、每孔加入10卩L CCK溶液（注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。

5、将培养板在培养箱内孵育2小时。

6、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。 图二、3um SRT1720刺激293T细胞后的细胞增殖曲线。该曲线呈S形，符合细胞正常生长情况。 图三、100um EX527刺激293T细胞后的细胞增殖曲线。该曲线前部分呈S形，符合细胞正常生长情况，但 在进入对数期之后曲线有下滑，之后进入平台期。 分析： SRT1720为SIRT1特异性活化剂，在前期实验中对白血病细胞株的生长表现出抑制作用，此次实验中SRT1720对正常细胞（293T）的生长无明显抑制作用。暗示SIRT1的活化对正常细胞的生长可能无明显影 响。 小剂量EX527为SIRT1特异性抑制剂，在前期实验中大剂量EX527对白血病细胞株的生长表现出抑制作用，而小剂量EX527无此效应，此次实验中大剂量EX527对正常细胞（293T）的生长可能有轻度抑制作用。但不能以一次实验结果做出肯定的结论，该实验还需重复。

细胞凋亡检测方法

细胞凋亡检测方法 一、细胞凋亡的形态学检测 1 光学显微镜和倒置显微镜 （1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，全面皱缩，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体，凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 （2）染色细胞： 姬姆萨（Giemsa）染色、瑞氏染色等：正常细胞核色泽均一；凋亡细胞染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态；坏死细胞染色浅或没染上颜色。 苏木素-伊红（HE）染色：细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色（凋亡细胞），正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色，坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失。 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的DNA特异性染料有：Hoechst 33342，Hoechst 33258，DAPI。三种染料与DNA 的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，能进入正常细胞膜而对细胞没有太大细胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高。 DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。 PI和Hoechst33342双标：PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA（或RNA）结合。但PI不能通过正常细胞膜，Hoechst则为膜通透性荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期调

亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色。正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色，但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。故PI着色为坏死细胞；亮兰色，或核呈分叶状，边集的Hoechst着色的为调亡细胞。 凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。 3 透射电子显微镜观察 凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜内侧，但在细胞凋亡早期，PS可从细胞膜内侧翻转到细胞膜表面，暴露在细胞外环境中。磷脂酰丝氨酸的转位发生在凋亡早期阶段，先于细胞核的改变、DNA断裂、细胞膜起泡。体内的吞噬细胞可通过识别

实验14-细胞凋亡的诱导和检测

实验14 细胞凋亡的诱导和检测 20世纪60年代人们注意到细胞存在着两种不同形式的死亡方式：凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）。细胞坏死指病理情况下细胞的意外死亡，坏死过程细胞膜通透性增高，细胞肿胀，核碎裂，继而溶酶体、细胞膜破坏，细胞容物溢出，细胞坏死常引起炎症反应。 细胞凋亡apoptosis一词来源于古希腊语，意思是花瓣或树叶凋落，意味着生命走到了尽头，细胞到了一定时期会像树叶那样自然死亡。凋亡是细胞在一定生理或病理条件下遵守自身程序的主动死亡过程。凋亡时细胞皱缩，表面微绒毛消失，染色质凝集并呈新月形或块状靠近核膜边缘，继而核裂解，由细胞膜包裹着核碎片或其他细胞器形成小球状凋亡小体凸出于细胞表面，最后凋亡小体脱落被吞噬细胞或邻周细胞吞噬。凋亡过程中溶酶体及细胞膜保持完整，不引起炎症反应。细胞凋亡时的生化变化特征是核酸切酶被激活，染色体DNA被降解，断裂为50～300 kb长的DNA片段，再进一步断裂成180～200bp整倍数的寡核苷酸片断，在琼脂糖凝胶电泳上呈现“梯状”电泳图谱(DNA Ladder)。细胞凋亡在个体正常发育、紫稳态维持、免疫耐受形成、肿瘤监控和抵御各种外界因素干扰等方面都起着关键性的作用。 1．细胞凋亡的检测方法 凋亡细胞具有一些列不同于坏死细胞的形态特征和生化特征，据此可以鉴别细胞的死亡形式。细胞凋亡的机制十分复杂，一般采用多种方法综合加以判断，同时不同类型细胞的凋亡分析方法有所不同，方法选择依赖于具体的研究体系和研究目的（表？）。

形态学观察方法：利用各种染色法可观察到凋亡细胞的各种形态学特征： （1）DAPI时常用的一种与DNA结合的荧光染料。借助于DAPI染色，可以观察细胞核的形态变化。 （2）Giemsa染色法可以观察到染色质固缩、趋边、凋亡小体形成等形态。 （3）吖啶橙(AO)染色，荧光显微镜观察，活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 （4）吖啶橙(A())／溴化乙啶(EB)复染可以更可靠地确定凋亡细胞的变化，AO只进入活细胞，正常细胞及处于凋亡早期的细胞核呈现绿色；EB只进入死细胞，将死细胞及凋亡晚期的细胞的核染成橙红色。 （5）台盼蓝染色对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助，如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。使用透射电镜观察，可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 （6）木精-伊红（HE）染色是经典的显示细胞核、细胞质的染色方法，染色结果清晰。发生凋亡的细胞经HE染色后，其细胞大小的变化及特征性细胞核的变化：染色质凝集、呈新月形或块状靠近核膜边缘，晚期核裂解、细胞膜包裹着核碎片“出芽”凸出于细胞表面形成凋亡小体等均可明显显示出来。 DNA凝胶电泳：细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞小分子 质量DNA片段增加，高分子DNA减少，胞质出现DNA片段。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180～200 bp DNA片段，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片段，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。

细胞增殖及细胞活力检测方法

细胞增殖及细胞活力检 测方法 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT

细胞增殖及细胞活力检测方法 目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。另一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。显然，细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用方法一。 用于检测细胞增殖能力最经典的方法是用氚标记的胸腺嘧啶核苷处理细胞，再检测DNA 链中氚含量。若细胞具有增殖能力，DNA合成过程中将会采用氚标记的胸腺嘧啶核苷作为合成原料，因此检测细胞DNA链内标记核苷酸的量可判断细胞是否进行DNA的合成。 但更为常用的方法是BrdU检测法。用BrdU预处理的细胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量（如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定），从而判断细胞的增殖能力。 Calbiochem/EMD公司提供一种BrdU检测试剂盒，以微孔板的形式，合并所有清洗、固定、变性的步骤以单一试剂当中。比色检测在一抗二抗标记后在450nm下读数，所有操作在3小时内结束。而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。1000个细胞以上水平的检测只需用BrdU预孵育2小时，100个细胞则采用过夜预孵育，即可检测细胞的增殖能力。 BrdU法的一个缺点是需要固定和变性等破坏DNA的处理。有些情况下，研究者可能希望在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总DNA含量，然而，在变性条件下，DNA的双链结构将被破坏，DAPI和Hoechest 33342等核酸标记探针就不再能识别DNA，因而也无法估计DNA总量。Molecular Probes公司的Click-iT EdU检测试剂盒可以解决这个问题。这种方法不需要变性步骤，因为荧光探针标记的叠氮化物小分子，而不是庞大的抗体分子，可以很轻易的识别并结合未变性DNA双链中的EdU分子。 采用BrdU方法时，你必须非常小心的去对DNA进行变性，才能一方面使BrdU抗体进入细胞，另一方面又保留足够的双链DNA分子来进行细胞周期的分析。有了EdU后则不同，由于你不再需要变性，这一切都很简单了；另外，常常用于DNA变性的HCl，可能破细胞内坏蛋白的抗原识别位点，因而限制了BrdU检测法中同时检测其他蛋白的应用，但这种情况在EdU法中不存在。

MTT分解比色法测定细胞生存和增殖

MTT reduction - a tetrazolium-based colorimetric assay for cell survival and proliferation Contributed by Joan M. Chapdelaine Pharmakon Research International, Inc.Waverly, PA, 18471 INTRODUCTION In 1983, a quantitative colorimetric assay for mammalian cell survival and cell prolifera-tion was proposed by Mosmann.1 The assay is dependent on the reduction of the tetrazo-lium salt MTT (3-(4,5-dimethylthazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) by the mitochondrial dehydrogenase of viable cells to form a blue formazan product. The assay measures cell respiration and the amount of formazan produced is proportional to the number of living cells present in culture. The assay has been shown to be a simple, rapid alternative to counting cells by dye inclusion/exclusion, monitoring the release of 51Cr from lysed cells, or the incorporation of [3H]-thymidine into cellular DNA. The MTT assay has been used with a growing number of cell types including primary cultured cells as well as established cell lines. This colorimetric microplate assay is cost effective because of the number of tests which can be performed at one time without the problem of radio-isotope and contaminated materials disposal. Applications of the MTT assay The use of the colorimetric assay for cell growth and cell survival offers major advantages in speed, simplicity, cost, and safety over conventional cell counting assays. Figure 1 shows in a block diagram form how the MTT assay can be substituted for the thymidine uptake assay. The MTT assay has fewer steps, uses fewer materials, and does not carry the added burden of radioactive waste disposal. Application Note 5

细胞凋亡的几种检测方法

细胞凋亡的几种检测方法 1、形态学观察方法 （1）HE（苏木精—伊红染色法）染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。 （2）丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 （3）台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。 （4）透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 2、DNA凝胶电泳 细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发

生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带 3、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定 凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。 检测步骤 1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体； 2、在微定量板上吸附组蛋白体’ 3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘ 4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’ 4、加酶的底物，测光吸收制。 用途 该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，

细胞增殖实验(MTT法)的步骤及方法

细胞增殖实验（MTT法）的步骤及方法 一、技术简介 细胞增殖是生物体的重要生命特征，细胞以分裂的方式进行增殖。单细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的个体。多细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的细胞，用来补充体内衰老和死亡的细胞；同时，多细胞生物可以由一个受精卵，经过细胞的分裂和分化，最终发育成一个新的多细胞个体。必须强调指出，通过细胞分裂，可以将复制的遗传物质，平均地分配到两个子细胞中去。可见，细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础。真核细胞的分裂方式有三种，即有丝分裂、无丝分裂和减数分裂。 MTT是3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide的简称。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。然后采用二甲基亚砜（DMSO）溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在570 nm波长处测定其光吸收值，反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。 二、实验流程（以贴壁细胞为例） 1. 收集对数期细胞，调整浓度。 2. 将细胞种植于96孔板中，待细胞贴壁后（约4-12 h）加药。 3. 5% CO2，37 o C孵育一定时间。 4. 每孔中加入200 μL MTT溶液（配制成5 mg/ml），培养4 h。 5. 吸去孔内的培养液，加入150 μL DMSO，可继续孵育4 h，使结晶物充分溶 解。 6. 取出96孔板，将其置于酶联免疫检测仪上，震荡15 s，然后在570 nm下 测量吸光值。 7. 结果统计分析。

TUNEL法检测细胞凋亡

细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。基因组DNA 断裂时，暴露的3'-0H 可以在末端脱氧核苷酸转移酶（Terminal Deox yn ucleotidyl Tran sferase,TdT）的催化下加上荧光素（FITC）标记的dUTP（fluorescein-dUTP），从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL 法检测细胞凋亡的原理。 TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的DNA断裂，但不会检测出射线等诱导的DNA断裂（和细胞凋亡时的断裂方式不同）。这样一方面可以把凋亡和坏死区分开，另一方面也不会把 射线等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。 针对问题2（TUNEL法的实验原理是什么？）： 基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让rTDT和bio标记的dUTP进入细 胞内，在rTDT的辅助下dUTP与核断裂的DNA 3 -0H结合，再用HRP标记的链霉亲和素与dUTP 上的biot in 结合（每个链霉亲和素至少可以再结合3个biot in 分子），最后用DAB 过氧化氢与SP上的辣根过氧化物酶HRP发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情 况。■ 1. TUNEL工作原理：简单说就是一一TUNEL细胞凋亡检测试剂盒是用来检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况。 其原理是；生物素（biot in ）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT En zyme）的 作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3' - 0H末端，并可与连接了的辣根过氧化酶的 链霉亲和素（Streptavidin-HRP ）特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB的存在下，产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在普通 显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-0H形成，很少能够被染色。 针对问题3 （TUNEL实验中几个关键步骤是什么？）： 1. 充分脱蜡和水化。脱蜡可以先60度20min，再用二甲苯两次5~10min ;而水化用梯度乙 醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀； 2. 把握好细胞通透的时间。一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k的孵育时间，常用10~30min, 几um切片用短时间；几十um切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和 抗体进入胞内。 3. 适当延长TUNEL反应液的时间。一般是37度1h,你也可以根据你的凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长至2h,但要结合你最终的背景着色。 4. DAB显色条件的选择。一般DAB反应10分钟左右，结合镜下控制背景颜色，最长不超过 30min;我不喜欢用promega公司提供的DAB液（桃红色），不利于辨认棕褐色。 5. PBS的充分清洗。我个人认为，在TUNEL反应后和酶标反应后的清洗应十分严格，可增加 次数达5次，因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。 6. 此外，内源性POD的封闭也十分关键。对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，我的经 验是适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度，可以达到很好的封闭效果，且不影响最终的 特异性染色。 针对问题5.细胞通透的原理、通透剂的浓度、孵育时间及其配制方法？ 1. 蛋白酶K是消化膜蛋白，从而起打孔作用，增加

(完整)常见细胞凋亡检测的方法与注意事项

(完整)常见细胞凋亡检测的方法与注意事项 编辑整理： 尊敬的读者朋友们： 这里是精品文档编辑中心，本文档内容是由我和我的同事精心编辑整理后发布的，发布之前我们对文中内容进行仔细校对，但是难免会有疏漏的地方，但是任然希望（(完整)常见细胞凋亡检测的方法与注意事项）的内容能够给您的工作和学习带来便利。同时也真诚的希望收到您的建议和反馈，这将是我们进步的源泉，前进的动力。 本文可编辑可修改，如果觉得对您有帮助请收藏以便随时查阅，最后祝您生活愉快业绩进步，以下为(完整)常见细胞凋亡检测的方法与注意事项的全部内容。

常见细胞凋亡检测的方法与注意事项 大家常把细胞凋亡和细胞坏死混淆,其实两者是不同的细胞死亡形式，大家可以在死亡细胞的形态、生化和分子指标上将二者区分开来，细胞凋亡检测的方法不少，这里就总结下几种常用的检测方法. 细胞凋亡检测更多详情，点击查看不可不知的细胞检测方法——MTT 一、细胞凋亡的形态学检测 根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。 1 光学显微镜和倒置显微镜 （1) 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。 贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落. (2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等.凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割 成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的DNA特异性染料有:HO 33342 (Hoechst 33342），HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。 DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ～1mg/ml。 结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样(creased)，部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体(图1）。 3 透射电子显微镜观察 结果评判：凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro—apoptosis nuclei)的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations)的空泡结构(图2）；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。 图2