质粒提取试剂盒说明书

质粒提取试剂盒说明书

而载体构建的方法有多种：

常规克隆（分子克隆你不知道的那些事）

TA克隆（这么简单的TA克隆来领走吧）

同源重组（秒杀分子克隆！同源重组快人一步）

而经转化（DH5α感受态制备及转化）、菌落PCR（菌落PCR）验证得到阳性克隆后，就需要提取质粒了。构载体是分子生物学中最基本的实验了，而提质粒可以说是最简单的实验了，完全不经过大脑，照着说明书就是“机械”操作，因为这个有现成的试剂盒嘛。

嗯，虽然简单，但是也不能不想啊，要不然提质粒是按什么原理来的你都不知道，这不，当你还在傻傻用试剂盒提质粒的时候，我已经开始自己配buffer了。

加灭菌水补足到1 L。

这个溶液的主要作用是细胞裂解，氢氧化钠会破坏细胞膜的结构，同时会使基因组变性成单链，而对质粒无影响。在这一步，试剂盒的说明书上会说时间不能过长，因为时间长了对质粒也是有影响的。而SDS可以和蛋白结合，使变性蛋白质将溶解在溶液中，从而多肽链更好地与基因组DNA缠绕。这个溶液一看就是酸，用来中和碱的，同时还能清除掉蛋白质等细胞内的杂质，此时基因组也会复性沉淀下来。另外醋酸钾会与Solution Ⅱ中的SDS发生作用，反应生成的十二烷基硫酸钾，而十二烷基硫酸钾不溶于水，会迅速发生沉淀，也就是我们提质粒时经常看到的沉淀。

好了，到这一步后，试剂盒法一般是要先离心，取上清去过柱，有的剂盒有一个柱的平衡液：

高纯度质粒小量快速提取试剂盒操作方法及步骤说明书

杭州昊鑫生物科技股份有限公司 htpp://https://www.sodocs.net/doc/0815214189.html, HighPure Plasmid Mini Kit 高纯质粒小量快速提取试剂盒 目录号：PL03 试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成保存 50次 （PL0301） 100次 （PL0302） 200次 （PL0303） 平衡液室温5ml 10ml 20ml RNaseA（10mg/ml）-20℃150μl 250μl 500μl 溶液P1 4℃15 ml 25 ml 50 ml 溶液P2 室温15 ml 25 ml 50 ml 溶液P3 室温20 ml 35 ml 70 ml 去蛋白液PE 室温16ml 31.5 ml 63 ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 漂洗液WB 室温15 ml 25ml 50ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 洗脱缓冲液EB 室温10ml 15ml 20ml 吸附柱AC 室温50个100个200个 收集管（2ml）室温50个100个200个 本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。 储存事项: 1.第一次使用时，将试剂盒所带的全部RNase A加入溶液P1后（终浓度100ug/ml） 置于2-8℃保存。如果溶液P1中RNase A失活，提取的质粒可能会有微量RNA 残留，在溶液P1中补加RNase A即可。 2.环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分 钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。 3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时 盖紧盖子。 产品介绍：

本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。 产品特点： 1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附 量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。 2.独有的去蛋白液配方，可以高效去除残留的核酸酶，即使是核酸酶含量丰富的菌 株如JM系列、HB101也可以轻松去除。有效防止了质粒被核酸酶降解。 3.快速、方便，不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。获得的 质粒产量高、纯度好，可以直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。 注意事项 1. 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机， 如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。 2. 提取质粒的量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。一般高拷贝质粒，建议 接种单菌落于1.5-4.5 ml加合适抗生素的LB培养基，过夜培养14-16个小时，可提取出多达20μg的纯净质粒。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应适当加大菌体使用量，使用5-10 ml过夜培养物，同时按比例增加P1、P2、P3的用量，其它步骤相同。 3. 得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260 值为1相当于大约50μg/ml DNA。电泳可能为单一条带，也可能为2条或者多条DNA条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过90%。 4. 质粒DNA确切分子大小，必须酶切线性化后，对比DNA分子量Marker才可以知 道。处于环状或者超螺旋状态的的质粒，泳动位置不确定，无法通过电泳知道其确切大小。 5. 洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗 脱，但应该确保pH大于7.5，pH过低影响洗脱效率。用水洗脱质粒应该保存在－

质粒提取有关问题及注意点

质粒提取常见问题解析 涂布棒在酒精蘸一下，然后烧一下，能不能保证把所用的菌烧死？ 参考见解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即时杀菌。蘸了酒精后再烧一小会，烧的是酒精而不是涂布棒。建议涂布棒还是干烧较长时间后，冷却了再涂。同时作多个转化时，应用几个涂布棒免得交叉污染。 原先测序鉴定没有问题的细菌，37℃摇菌后发现质粒大小或序列出现异常? 参考见解：这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。解决办法： 1、降低培养温度，在20～25℃下培养，或室温培养可明显减少发生概率。 2、使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如rec类等，使得质粒复制更加稳定。 3、质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH浓度过高造成的，请大家注意一下！ 【有两种方法可以在提质粒前判断菌生长是否正常： 1、利用你的嗅觉。只要平时做实验仔细点就能闻出大肠杆菌的气味，新鲜的大肠杆菌是略带一点刺鼻的气味，但不至于反感。而在泥水状的菌液中你只要一凑过去就感觉到其臭无比或者没有气味，可以和正常菌液对照。 2、肉眼观察活化菌株。对于生长不正常的菌液进行划板验证或者稀释到浓度足够低涂板，第二天观察单克隆生长情况，LB平板生长的DH5A正常形态在37℃16h后直径在1mm左右，颜色偏白，半透明状，湿润的圆形菌斑，如果观察到生长过快，颜色又是泛黄的话基本上不正常了。】 未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？ 参考见解： 1、大肠杆菌老化：涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。 2、质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。 3、菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。 4、碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液的用量。对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液，可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。 5、溶液使用不当：溶液2和3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。 6、吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基，例如TB或2×YT，菌液体积必须减少；若质粒是非常高的拷贝数或宿主菌具有很高的生长率，则需减少LB培养液体积。 7、质粒未全部溶解(尤其质粒较大时) ：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。 8、乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。 9、洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。 10、洗脱液不合适：DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脱效率还取决于pH值，最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用，有利于提高洗脱效率。

质粒提取试剂盒-说明书-翻译

精品文档 。 1欢迎下载 E.Z.N.A.? 质粒小提试剂盒操作规程（英文版译文） （适用于No. D6942, D6943 & D6944） 1. 自新鲜划痕选择培养板中分离单菌落，接种含适当选择性抗生素的1-5ml 的LB 培 养基进行培养。37℃强力摇动（~300rpm ）孵育12-16h 。使用10-20ml 培养管或容量至少4倍于培养容积的培养瓶。强烈推荐使用endA 阴性大肠杆菌菌株进行常规质粒分离。此类菌株包括DH5α和JM109。 2. 将1.5-5.0ml 细菌室温10,000 x g 离心1min 。轻轻倒出或吸走培养基并丢弃。 3. 加入250μl 的溶液I/Rnase A 重悬沉淀，涡旋或用移液器反复吹打。充分重悬沉 淀对于获得高质量的DNA 非常重要。 4. 加入250μl 溶液II ，倒置、转动试管数次使之轻轻混匀，得到透明的裂解产物。 可能需要孵育2min 。不要用力混合，以免使染色体DNA 断裂，减低质粒的纯度。该步反应不要超过5min 。溶液II 不用时要拧紧瓶盖，以免试剂被空气中的CO2酸化。 5. 加入350μl 溶液III ，立即倒置试管数次混匀，直至白色絮状沉淀物形成。为避免 形成局部沉淀，加入溶液III 后应立即、充分混匀溶液。 6. 室温≥10,000 x g 离心10分钟。白色沉淀物形成，立即进行下一步操作。 7. 小心翼翼．．．． 的吸取上清液，加入装配在2ml 收集管中的小量纯化柱I 中。确保离心沉淀未受扰动，确保没有细胞碎片加入到柱子中。室温下10,000 x g 离心1分钟，使裂解液完全通过柱子。 8. 丢弃滤过液，重新使用2ml 收集管；加入500μl HB 缓冲液清洗柱子，室温10,000 x g 离心1分钟，使溶液完成通过柱子。该步操作需确保残余的蛋白质污染被去除，以保证获得高品质的DNA 以适合于下游的应用。 9. 丢弃滤过液，重新使用2ml 收集管；加入700μl 用无水乙醇稀释的DNA 清洗液清 洗柱子，室温10,000 x g 离心1分钟，使溶液完全通过柱子，丢弃滤过液。 注意：DNA 清洗液的浓缩液使用前必须用无水乙醇稀释（5倍稀释），如果DNA 清洗液稀 释液经过冷藏，则使用之前必须置于室温。 10. 可选步骤：重复清洗，加入另外的700μl 用无水乙醇稀释的DNA 清洗液。 11. 将空柱子≥13,000 x g 离心2min ，使柱子的基质干燥。此步骤为关键操作，不可 遗漏。 12. 将柱子放入干净的1.5ml 微量离心管中。将30-50μl （取决于终产物的期望浓度） 洗脱液或无菌去离子水直接加入柱子基质上，使之于室温下静置1-2min 。≥13,000 x g 离心1min 洗脱DNA 。可以进行二次洗脱，以收集残存的DNA 。 13. DNA 的产量和质量：分别在波长260nm 和280nm 处测定样品适当稀释液的吸光度。DNA 的浓度计算如下： DNA 浓度=A 260×50×（稀释倍数）μg/ml A 260/A 280的比率可以反映核酸的纯度。比值大于1.8表明核算的纯度在90%以上。或者，DNA 的产量（及质量）有时可以通过琼脂糖胶/溴乙锭电泳与已知浓度的DNA 样品相比较更好的予以确定。通常情况下洗脱的大部分DNA 是超螺旋单体形式，但也可能存在串联体形式。 张小强 翻译

质粒提取

1.菌液接种到500ml培养基中，加抗生素至工作浓度，37℃，300rpm过夜 2.4000rpm，15min离心菌液收集菌体。 3.用20ml solutionⅠ溶解菌团，充分打散混合均匀。 4.称取0.1g溶菌酶加入菌液，室温放置5min。 5.加入40ml solution Ⅱ，轻轻混合至澄清,冰上放置5min。 6.加30ml solution Ⅲ，轻轻混匀，冰浴10min。 7.4000rpm，20min，离心后将上清液倒到200ml量筒里面。 8.加入0.6倍体积的异丙醇混匀并室温放置10min。10000rpm离心15min。 9.用6.5ml的TE重悬沉淀，转移到4个EP管中，13000rpm 离心5min。 10.上清转移到15ml的离心管中，加7.2gCsCl和 200ul的10mg/ml的EB，混匀。 11.在超速离心管中加样并封口。60000rpm 10℃离心16h。 12.用一个注射器在超速离心管中上面戳一个孔，留下针头，并用另外一个注射 器从红色质粒带旁边管壁戳进去，吸取1-1.5ml，装入新的离心管中。 13.加5ml TE饱和丁醇，混匀后静置各相分离后去掉上层桃红色丁醇，重复这一 步，直到下层水相中没有桃红色。转移下层水相到EP管中。 14.加入1/10体积5M的Nacl和2倍体积的无水乙醇。在-20℃下放置20min。 15.13000rpm，10min离心后去上清，重悬沉淀于1ml的TE然后转移至EP管。 16.用1倍体积的25/24/1的酚/氯仿/异戊醇抽提两次。 17.每管加1/10体积的2.5M的乙酸钠和2倍体积的乙醇， -20℃下放置20min。 13000rpm离心10min，然后用70%的乙醇轻轻润洗并晾干EP管。 18.重悬于1ml TE中，并在OD260下测量浓度。

omga质粒提取试剂盒_说明书_翻译

omgaE.Z.N.A.质粒试剂盒操作规程说明书（译版） 1. 自新鲜划痕选择培养板中分离单菌落，接种含适当选择性抗生素的2-5ml的LB或YT培养基进行培养。37℃强力摇动（~300rpm）孵育20-24h。使用10-20ml培养管或容量至少4倍于培养容积的培养瓶。强烈推荐使用endA阴性大肠杆菌菌株进行常规质粒分离。此类菌株包括DH5α和JM109。 2. 将1.5-5.0ml细菌菌液室温13,000 g离心3min。轻轻倒出或吸走培养基并丢弃。 3. 加入200μl 的溶液Buffer T 1/Rnase A重悬沉淀，涡旋或用移液器反复吹打。充分重悬沉淀对于获得高质量的DNA非常重要。 4. 加入200μl溶液Buffer T 2，倒置、转动试管5-10次使之轻轻混匀，得到透明的裂解产物。室温孵育5min。不要用力混合，以免使染色体DNA断裂，减低质粒的纯度。该步反应不要超过5min。溶液II不用时要拧紧瓶盖，以免试剂被空气中的CO2酸化。 5. 加入200μl溶液Buffer T 3，立即倒置试管15-20次混匀，直至白色絮状沉淀物形成。冰上孵育5min。为避免形成局部沉淀，加入溶液III后应立即、充分混匀溶液。 6. 4℃13,000 g离心10分钟。白色沉淀物形成，立即进行下一步操作。 7. 小心翼翼的吸取上清液，加入到新的1.5ml离心管（不是试剂盒提供的）中。加入200ul 用异丙醇稀释的BAC 结合液（缓冲液），颠倒3-5次充分混匀。BAC 结合液使用前必须用96%-100%的异丙醇稀释，详细的说明见瓶壁或第三页说明书 8.加入样本DNA（HiBind DNA MicroElute）到提供的2ml收集管中。 9. 室温8000g离心30s，丢弃收集管，将离心柱放入新的收集管中。 10. 将收集柱放回收集管并加入750ul SPM buffer（用乙醇稀释），室温8000g离心30s，丢弃收集管，将离心柱放入新的收集管中。 11. 将空柱子以最大速度离心2min，使柱子的基质干燥。此步骤为关键操作，不可遗漏。 12. 将柱子放入干净的1.5ml微量离心管中。将20-50μl（取决于终产物的期望浓度）洗脱液（Elution Buffer）或无菌去离子水直接加入柱子基质上，使之于室温下静置5min。 13.最大速度离心2min洗脱DNA。可以进行二次洗脱，以收集残存的DNA。 14. -20℃保存洗脱的DNA。 15. DNA的产量和质量：分别在波长260nm和280nm处测定样品适当稀释液的吸光度。DNA的浓度计算如下： DNA浓度=A260×50×（稀释倍数）μg/ml A260/A280的比率可以反映核酸的纯度。比值大于1.8表明核算的纯度在90%以上。或者，DNA的产量（及质量）有时可以通过琼脂糖胶/溴乙锭电泳与已知浓度的DNA样品相比较更好的予以确定。通常情况下洗脱的大部分DNA是超螺旋单体形式，但也可能存在串联体形式。 适用于BACs，PACs，P1s和质粒分离步骤（标准）（D2156-00，D2156-01，D2156-02）彭伟翻译

质粒提取原理及步骤

For personal use only in study and research; not for commercial use 质粒提取原理及步骤 一、导论 已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA，这些方法都含有以下3个步骤：1. 细菌培养物的生长。 2. 细菌的收获和裂解 3. 质粒DNA的纯化。 （一）细菌培养物的生长 从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。现在使用的许多质粒载体（如pUC系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。此时，不必造反性地扩增质粒DNA。然而，较长一代的载体(如pBR3 22)由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。这样，像pBR３２２－类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不

同，前者大为增高。多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml)已成为标准的操作、用该方法提取的质粒

DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。 （二）细菌的收获和裂解 细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。选择哪一种方法取决于３个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。 1)大质粒(大于15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。 2)可用更剧烈的方法来分离小质粒。在加入EDTA后，有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理可破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。 3)一些大肠杆菌菌株(如HB101的一些变种衍生株) 用去污剂或加热裂解时可释放相对大量的糖类，当随后用氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时它们会惹出麻烦。糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的区带。因此很难避免质粒DNA内污染有糖类，而糖类可抑制多种限制酶的活性。故从诸如HB101和TG1等大肠杆菌蓖株中大量制备质粒时，不宜使用煮沸法。 4)当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌菌株(endA+株，如HB101) 中小量制备质粒时，建议不使用煮沸法。因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶A，以后在温育(如用限制酶消化)时，质粒DNA会被降解。但如果通过一个附加步骤(用酚：氯仿进行抽提)可以避免此问题。 ５)目前这一代质粒的拷贝数都非常高，以致于不需要用氯霉素进行选择性扩增就可获得高产。然而，某些工作者沿用氯霉素并不是要增加质粒DNA的产量，而是要降低细菌细胞在用于大量制备的溶液中所占体积。大量高度粘稠的浓缩细菌裂解物，处理起来煞为费事，而在对数中期在增减物中加入氯霉素可以避免这种现象。有氯霉素存在时从较少量细胞获得的质粒DNA的量以与不加氯霉素时从较大量细胞所得到的质粒DNA的量大致相等。 (三)质粒DNA的纯化

大量全血基因组DNA提取试剂盒操作方法及步骤说明书

大量全血基因组DNA提取试剂盒 目录号：DN04 DN0401 16次×10ml DN0402 32次×10ml DN0403 96次×10ml 适用范围： 适用于快速提取各种动物全血基因组DNA 试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成保存16次×10ml 32次×10ml 96次×10ml 10x红细胞裂解液室温50 ml 100 ml 300 ml 细胞核裂解液室温180 ml 180×2 ml 250 m l×4 蛋白沉淀液室温55 ml 110 ml 330 ml DNA溶解液室温15 ml 30 ml 90 ml 本试剂盒在室温储存18个月不影响使用效果。 储存事项: 1.环境温度低时细胞核裂解液中某些去污剂成份会析出出现浑浊或者沉淀，可在 37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。 2.蛋白沉淀液可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，如果不 能完全溶解，也不影响使用效果，直接取用上层溶液即可。

3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时 盖紧盖子。 产品介绍： 本试剂盒根据全血特点采用几个快速步骤提取基因组DNA。首先红细胞裂解液裂解去除不含DNA的红细胞，细胞核裂解液裂解白细胞释放出基因组DNA，然后蛋白沉淀液选择性沉淀去除蛋白，最后纯净的基因组DNA通过异丙醇沉淀并重溶解于DNA 溶解液。 产品特点： 1.从十几个配方中优选出的红细胞裂解液配方，裂解快速完全。 2.不需要使用有毒的苯酚等试剂。 3.快速，简捷，单个样品操作一般可在1小时内完成。 4.结果稳定，产量高（典型的产量10ml全血可提取出150-500μg），OD260/OD280 典型的比值达 1.7～1.9，长度可达50kb-150kb，可直接用于构建文库、PCR、Southern-blot和各种酶切反应。 注意事项 1.所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到2,500 x g，并配备容纳50ml心 管转头的传统台式离心机。 2.用户需自备异丙醇和70％乙醇。 3.典型的产量10ml全血可提取出150-500μg基因组DNA（不同样品尤其疾病样品中 中白细胞数量差异可能非常大，因此产量的个体差异也可能非常大）。 4.本试剂盒为溶液型，可以很容易的按照比例扩大或者缩小每次处理的全血量 （20μl-10ml），请联系我们索取其它处理量的操作手册。

高纯度质粒小提试剂盒使用说明书

高纯度质粒小提试剂盒 Pure Mini Plasmid Kit (目录号：HS0103) 产品包装 试剂盒成分 50 preps Buffer P1 15 ml Buffer P2 15 ml Buffer P3 20 ml Buffer PD 30 ml RNase A(10 mg/ml) 150 ul Buffer PW 60 ml Buffer EB 10 ml Spin Columns PA 50个 Collection Tubes (2 ml) 50个 （注意：使用前将全部RNase A 溶液加到Buffer P1中混合均匀，2 ~ 8℃保存） 保存条件 本试剂盒在室温(15 ~ 25℃)干燥条件下，可保存12个月；更长时间的保存可置于2 ~ 8℃。若溶液产生沉淀，应在使用前置于37℃下溶解沉淀。单独包装的RNase A 在室温可稳定保存12个月。加入RNase A 后的Buffer P1应置于2 ~ 8℃保存，可稳定保存6个月。 产品简介 本试剂盒用于高纯度质粒DNA 的小量制备与纯化。菌体经碱裂解、高盐、低pH 处理，质粒可从菌体中释放出来，并特异、高效地被离心柱硅胶膜（Spin Columns PA ）吸附。通过去蛋白液（Buffer PD ）和漂洗液（Buffer PW ）的清洗可去除蛋白及其他杂质，在低盐、高pH 条件下洗脱，最后得到高纯度的质粒DNA 。 北京厚生博泰科技有限公司 Beijing Hooseen Biotech Co., Ltd.

使用本试剂盒可从1 ~ 5 ml过夜培养的菌液中纯化得到高达20 ug的高纯度质粒DNA，可在30 min之内完成提取任务。所得质粒可直接用于酶切、转化、PCR、测序、低敏感细胞株的转染等各种常规分子生物学操作。 产品特点 1. 快速：步骤少，操作简便，节约时间。 2. 简便：离心吸附柱不需要预平衡，漂洗液Buffer PW 和去蛋白液Buffer PD不需要另加乙醇，即开即用。 3. 纯度高：所得质粒可直接用于酶切、转化、PCR、测序、低敏感细胞株的转染等各种常规分子生物学操作。 操作步骤 1. 取1 ~ 5 ml过夜培养的菌液，室温12,000 rpm离心1 min，尽量将上清去除干净。 （注意：根据菌液的浓度决定取液量，浓度高时取1 ml菌液离心即可，浓度低时可多收集一次） 2. 加入250 ul Buffer P1，用枪头充分吹打使菌体重悬均匀。 （注意：是否将RNase A溶液加到Buffer P1中并混合均匀；菌体沉淀是否悬浮充分，如有未彻底悬浮的菌块会影响裂解，导致提取的质粒浓度及纯度降低） 3. 加入250 ul Buffer P2，温和颠倒混匀6 ~ 8次，直到溶液变得清亮粘稠。 （注意：不可剧烈震荡，以免造成基因组DNA片段的污染，所用时间不要超过5 min，以免质粒受到破坏，如未完全变得清亮，可能是菌体太多，可增加Buffer P2的用量，在后续的操作中Buffer P3的用量也要相应增加） 4. 加入350 ul Buffer P3，立即温和颠倒混匀6 ~ 8次，可见白色沉淀物产生，室温静置2 min，然后12,000 rpm离心3 ~ 5 min。 （注意：Buffer P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀，如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清） 5. 小心将上清液转移到离心吸附柱Spin Columns PA中，静置2 min，让质粒DNA与吸附柱中的硅胶膜充分结合。12,000 rpm离心0.5 ~ 1 min，弃收集管中的废液。 6. 向吸附柱中加入500 ul去蛋白液，12,000 rpm离心1 min，弃收集管中废液。 （注意：如果宿主菌是endA-，如DH5α若TOP10，此步骤可省略。如果宿主菌是endA+，如TG1、BL21、HB101、JM101等，此步骤不可省略，因这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒。如果提取低拷贝质粒

质粒提取操作步骤

操作步骤： 本实验方法适用于从1-10ml过夜培养的大肠杆菌菌液中提取质粒。提取量受菌株、质粒拷贝数、菌液体积和培养时间、培养基类型等因素的综合影响。 1.收菌：将过夜培养（37℃，12-16小时）的菌液于室温≧10,000g 离心1-2分钟，彻底弃除上清。 注意：高拷贝质粒建议使用≦5ml菌液；菌液用量过大不仅不能增加质粒产量，反而会因裂解不完全或杂质封闭硅胶膜而降低产量；培养时间不宜过长，否则会增加开环结构质粒的比例。。 2.重悬：加入250μl含RNase A的细胞悬浮液（S1），充分混悬震荡 或用枪头反复抽打使细菌彻底分散悬浮。 3.裂解：加入250μl细胞裂解液（S2），轻轻上下颠倒混合5次，室 温静置1-5分钟，待细菌充分裂解，溶液变半透明。 注意：避免剧烈震荡导致基因组DNA裂解，裂解时间不能超过5分钟。 4.中和：加入350μl中和缓冲液（S3），轻轻上下颠倒混合5次，充 分混匀，避免剧烈震荡。室温下≧12,000g离心10分钟。 5.DNA结合：小心吸取上清，转移到插入收集管的离心吸附柱内，室 温下≧12,000g离心1分钟，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新插回收集管中。 6.清洗：加入500μl漂洗液（WB,请确认已加入乙醇！）于离心吸附 柱中，室温下≧12,000g离心30秒，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新插回收集管中。 7.再次清洗：加入500μl漂洗液（WB）于离心吸附柱中，室温下≧ 12,000g离心30秒，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新插

回收集管中。将离心吸附柱开盖再次离心2分钟，彻底除去残余漂洗液。 8.洗脱：小心取出离心吸附柱，将其套入一个新的1.5ml灭菌离心 管中。向硅胶吸附膜的中央加入100μl洗脱缓冲液（EB），室温放置1分钟后，≧12,000g离心1分钟收集质粒DNA。 注意：为提高质粒浓度，最低可使用30μl的EB溶液，离心收集后壳将洗脱的质粒溶液再次加入离心吸附柱中重复洗脱；使用100μlEB溶液则无需二次洗脱；对6kb以上的质粒，可使用预先加热至55℃的EB溶液洗脱以提高产量；EB溶液不含EDTA，故不会影响荧光测序等后续反应；如必须使用无菌去离子水洗脱，需注意其pH值是否接近中性，否则应使用NaOH溶液将pH值调节至7.0-8.5之间。 9.储存：弃除离心吸附柱，纯化的质粒可直接用于后续反应或于 -20℃长期保存。 注意：经检测，本试剂盒从endAˉ菌株（如DH5α，TOP10，XL1-blue等）中提取的质粒反复冻融20次无降解；如需在4℃长期保存或者保存从endA+菌株（如JM109，HB101，BL21等）中提取的质粒，可向每100μl质粒溶液中加入11μl的10×TE溶液，但含EDTA的质粒溶液不可用作荧光测序模板。

OMEGA小提试剂盒提取质粒步骤(无内毒)

OMEGA小提试剂盒提取质粒步骤(中文翻译版) 1、将携带目的质粒的大肠杆菌接种于含10~15ul基础培养基/氨苄西林培养介质的50ml培养瓶中。 2、室温下500×g离心10min。 3、弃去上清，剩余沉淀物中加入500ul的SolutionⅠ/RNase A，彻底混匀。 4、将混悬液移至新的2ml离心管中，加入500ul SolutionⅡ，轻柔彻底混匀，可得清亮的细菌裂解物，室温下孵育2min（混匀时用力过大，可破碎出染色体DNA，使目的质粒纯度下降）。 5、向4中液体加入250ul预冷的Buffer N3，轻柔、彻底混匀，直到出现白色絮状沉淀，4℃≥12000×g离心10min（可室温，最好4℃）（Buffer应彻底混匀，若混合物粘稠呈棕色或呈球状，应多混匀几次以中和溶液，溶液的彻底中和对于获得好的产出是必要的）。 6、小心吸取并将上清液转移进新的1.5ml离心管1：0.1的比例向上清液中加入ETR Solution 混匀溶液并于冰上孵育10min，孵育过程中颠倒几次以混匀（加入ETR Solution后，细菌裂解物将出现浑浊，但冰上孵育后将变澄清）（勿用2ml离心管收集上清，因为2ml离心管中有太多液体时，ETR Solution将悬浮于溶液中）。 7、将6中液体于42℃孵育5min，溶液将再次变浑。室温下12000×g离心3min，ETR Solution 将于离心管底部形成蓝色层。 8、将上层水相转移入新的2ml离心管中，按1：0.5的比例加入无水乙醇（室温，96~100％），轻柔混匀，室温下孵育1~2min。 9、将8中的溶液取700ul到柱子中，组装收集管，室温下1000×g离心1min，弃去收集管中通过柱子的液体，柱子和收集管重复利用。 10、重复9中步骤，直到收集的细菌裂解物全部用完。 11、将500ul Buffer HB加入柱子中，室温下1000×g离心1min，弃去收集管中废液（目的：将残存的蛋白污染物除去，是获得高质量DNA所必需的）。 12、向柱子中加入混有乙醇的700ulDNA Wash Buffer，室温下1000×g离心1min，弃去收集管中液体。 13、重复12中的步骤。 14、弃去收集管中液体，空管在最大转速（≥13000×g）离心3min以干燥柱子（对于移除柱子中残留的乙醇是必须的）。 15、将柱子放入新的 1.5ml离心管中，直接向柱子中的白色网状物上加入Endotoxin-Free Elution Buffer 80~100ul（依终产物浓度而定，可每次30ul×2次），室温下放置2min，≥13000×g离心1min，以洗提DNA（将提取约70~85％柱子中收集的DNA，可再重复一次以提取完全，但因再次加入洗提液，会使终产物浓度下降）。 声明：文档为自己翻译后逐字打出来的，有不妥之处望各位同行不吝赐教，以方便大家实验参考，谢谢。

质粒提取试剂盒说明书

质粒提取试剂盒说明书 质粒提取的质量和得率受多种因素影响，既和质粒本身的性质以及拷贝有关，也和菌液的状态及实验操作有关，因此在质粒提取中的一些实验要点显得就极为重要了。质粒提取这看似简单的实验，却暗藏杀机，下面我们来看一下在质粒提取过程中那些习以为常的实验操作中的“误会“。 通常我们会认为越多的菌液或是越浓的菌液提取的质粒会越多，但实际实验中结果并非如此。 良好菌液的标准： 按1：1000的比例将菌液接种至培养基中，摇菌时间在8-12个小时，不超过16个小时。 菌液均匀悬浮于培养基中，无凝块、无沉淀，菌液的OD600吸光值在0.8-1.0之间，不超过1.2。 在提取质粒后进行凝胶电泳，如果在在超螺旋质粒的下方出现弥散条带，则是由于忘记加入RNaseA或RNaseA消化不充分，不完全降解的RNA与质粒共同被提取出来。

加入RNaseA的两个阶段： 在使用试剂盒提取质粒时，菌液重悬时在P1溶液中加入RNaseA 提取质粒后，在质粒溶液中加入RNaseA（试剂盒或溶液法） RNaseA的使用方法： RNaseA在质粒中的使用终浓度为20μg/ml 经RNaseA孵育的质粒，需要进行纯化去除残留的RNaseA 如何判断我们所使用的菌体量是否合适呢？在裂解时经几次颠倒混匀后，裂解液仍然为浑浊状态，说明未被裂解的菌体仍然悬浮在裂解液中，而充分裂解的菌体，溶液于裂解液中，裂解液呈现为澄清，质粒充分释放。 质粒小提试剂盒适合1-5 ml菌体的提取 小提中量试剂盒适合5-15 ml菌液的提取

中量提取试剂盒适合50-100 ml菌液的提取 大量提取试剂盒适合100-200 ml菌液的提取 如果我们想要增加提取的菌体量，也要相应提高所加入的裂解液体积。

质粒提取试剂盒 说明书 翻译

E.Z.N.A.?质粒小提试剂盒操作规程（英文版译文） （适用于No. D6942, D6943 & D6944） 1. 自新鲜划痕选择培养板中分离单菌落，接种含适当选择性抗生素的1-5ml的LB培养基进行培养。37℃强力摇动（~300rpm）孵育12-16h。使用10-20ml培养管或容量至少4倍于培养容积的培养瓶。强烈推荐使用endA阴性大肠杆菌菌株进行常规质粒分离。此类菌株包括DH5α和JM109。 2. 将1.5-5.0ml细菌室温10,000 x g离心1min。轻轻倒出或吸走培养基并丢弃。 3. 加入250μl 的溶液I/Rnase A重悬沉淀，涡旋或用移液器反复吹打。充分重悬沉淀对于获得高质量的DNA非常重要。 4. 加入250μl溶液II，倒置、转动试管数次使之轻轻混匀，得到透明的裂解产物。可能需要孵育2min。不要用力混合，以免使染色体DNA断裂，减低质粒的纯度。该步反应不要超过5min。溶液II不用时要拧紧瓶盖，以免试剂被空气中的CO2酸化。 5. 加入350μl溶液III，立即倒置试管数次混匀，直至白色絮状沉淀物形成。为避免形成局部沉淀，加入溶液III后应立即、充分混匀溶液。 6. 室温≥10,000 x g离心10分钟。白色沉淀物形成，立即进行下一步操作。 7. 小心翼翼 ．．．．的吸取上清液，加入装配在2ml收集管中的小量纯化柱I中。确保离心沉淀未受扰动，确保没有细胞碎片加入到柱子中。室温下10,000 x g离心1分钟，使裂解液完全通过柱子。 8. 丢弃滤过液，重新使用2ml收集管；加入500μl HB缓冲液清洗柱子，室温10,000 x g离心1分钟，使溶液完成通过柱子。该步操作需确保残余的蛋白质污染被去除，以保证获得高品质的DNA以适合于下游的应用。 9. 丢弃滤过液，重新使用2ml收集管；加入700μl用无水乙醇稀释的DNA清洗液清洗柱子，室温10,000 x g离心1分钟，使溶液完全通过柱子，丢弃滤过液。 注意：DNA清洗液的浓缩液使用前必须用无水乙醇稀释（5倍稀释），如果DNA清洗液稀释液经过冷藏，则使用之前必须置于室温。 10. 可选步骤：重复清洗，加入另外的700μl用无水乙醇稀释的DNA清洗液。 11. 将空柱子≥13,000 x g离心2min，使柱子的基质干燥。此步骤为关键操作，不可遗漏。 12. 将柱子放入干净的1.5ml微量离心管中。将30-50μl（取决于终产物的期望浓度）洗脱液或无菌去离子水直接加入柱子基质上，使之于室温下静置1-2min。≥13,000 x g离心1min洗脱DNA。可以进行二次洗脱，以收集残存的DNA。 13. DNA的产量和质量：分别在波长260nm和280nm处测定样品适当稀释液的吸光度。DNA的浓度计算如下： DNA浓度=A260×50×（稀释倍数）μg/ml A260/A280的比率可以反映核酸的纯度。比值大于1.8表明核算的纯度在90%以上。或者，DNA的产量（及质量）有时可以通过琼脂糖胶/溴乙锭电泳与已知浓度的DNA样品相比较更好的予以确定。通常情况下洗脱的大部分DNA是超螺旋单体形式，但也可能存在串联体形式。 张小强翻译

OMEGA小提试剂盒提取质粒步骤(中文翻译版)

质粒提取（小提，mini kit） 1、将携带目的质粒的大肠杆菌接种于含10~15ul基础培养基/氨苄西林培养介质的50ml培养瓶中。 2、室温下5000×g离心10min。 3、弃去上清，剩余沉淀物中加入500ul的SolutionⅠ/RNase A，彻底混匀。 4、将混悬液移至新的2ml离心管中，加入500ul SolutionⅡ，轻柔彻底混匀，可得清亮的细菌裂解物，室温下孵育2min（混匀时用力过大，可破碎出染色体DNA，使目的质粒纯度下降）。 5、向4中液体加入250ul预冷的Buffer N3，轻柔、彻底混匀，直到出现白色絮状沉淀，4℃≥12000×g离心10min（可室温，最好4℃）（Buffer应彻底混匀，若混合物粘稠呈棕色或呈球状，应多混匀几次以中和溶液，溶液的彻底中和对于获得好的产出是必要的）。 6、小心吸取并将上清液转移进新的1.5ml离心管1：0.1的比例向上清液中加入ETR Solution 混匀溶液并于冰上孵育10min，孵育过程中颠倒几次以混匀（加入ETR Solution后，细菌裂解物将出现浑浊，但冰上孵育后将变澄清）（勿用2ml离心管收集上清，因为2ml离心管中有太多液体时，ETR Solution将悬浮于溶液中）。 7、将6中液体于42℃孵育5min，溶液将再次变浑。室温下12000×g离心3min，ETR Solution将于离心管底部形成蓝色层。 8、将上层水相转移入新的2ml离心管中，按1：0.5的比例加入无水

乙醇（室温，96~100％），轻柔混匀，室温下孵育1~2min。 9、将8中的溶液取700ul到柱子中，组装收集管，室温下1000×g 离心1min，弃去收集管中通过柱子的液体，柱子和收集管重复利用。 10、重复9中步骤，直到收集的细菌裂解物全部用完。 11、将500ul Buffer HB加入柱子中，室温下10000×g离心1min，弃去收集管中废液（目的：将残存的蛋白污染物除去，是获得高质量DNA所必需的）。 12、向柱子中加入混有乙醇的700ulDNA Wash Buffer，室温下10000×g离心1min，弃去收集管中液体。 13、重复12中的步骤。 14、弃去收集管中液体，空管在最大转速（≥13000×g）离心3min 以干燥柱子（对于移除柱子中残留的乙醇是必须的）。 15、将柱子放入新的1.5ml离心管中，直接向柱子中的白色网状物上加入Endotoxin-Free Elution Buffer 80~100ul（依终产物浓度而定，可每次30ul×2次），室温下放置2min，≥13000×g离心1min，以洗提DNA（将提取约70~85％柱子中收集的DNA，可再重复一次以提取完全，但因再次加入洗提液，会使终产物浓度下降）。 声明：文档为自己翻译后逐字打出来的，有不妥之处望各位同行不吝赐教，以方便大家实验参考，谢谢。

质粒提取原理和方法

质粒DNA提取的原理及方法 碱裂解法质粒DNA提取原理 质粒DNA提取主要包括以下几个方面：如何将细胞裂解释放质粒DNA，如何将质粒DNA和基因组DNA分离开来，如何去除RNA污染，如何去除蛋白质和其它杂质。 质粒提取方法中，最常用的方法是碱裂解法，它具有得率高，适用面广，快速，纯度高等特点。其原理是： 强碱性条件下，质粒DNA和基因组DNA同时从细胞中释放出来，并发生变性。在pH中性，并有高盐浓度存在的条件下，质粒DNA会迅速发生复性，仍为可溶性状态，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，在去垢剂SDS作用下，染色体DNA与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，通过离心去除沉淀后，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA，用异丙醇或乙醇沉淀可将之纯化出来。 BIOMIGA公司质粒DNA纯化系列试剂盒，采用碱裂解法质粒提取原理，在高盐环境下，采用硅胶膜特异性的吸附质粒DNA，而蛋白质不被吸附，最后用低盐洗脱液将DNA从膜上洗脱下来，方法简单，快速，质量好，收获量高。 影响质粒提取的因素 影响质粒提取的因素有很多种，如质粒拷贝数，宿主菌株的种类，细菌的培养时间、培养基种类、培养条件等等。 质粒拷贝数 质粒DNA最终收获量取决于质粒的拷贝数和质粒的大小。BIOMIGA 公司质粒DNA提取系列试剂盒，操作步骤适用于高拷贝数质粒的纯化，对于低拷贝质粒纯化提取，应加大起始菌液量的体积，并且相应地增加各种缓冲液的用量。 下表给出一些常用质粒载体的拷贝数： 质粒种类 复制起点 拷贝数 1 mL菌液质粒DNA收获量(μg) pSC101 pSC101 5 pACYC P15A

10-12 pSuperCos pMB1 10-20 pBR322 pMB1 15-20 pGEMR Muted pMB1 300-400 6-7 pBluescriptR ColE1 300-500 6-8 pUC Muted pMB1 500-700 8-12 宿主菌株 宿主菌株的种类将会影响质粒的收获量。含内源核酸酶的宿主菌株，如JM101, JM110, HB101, TG1以及它们的衍生菌株，通常因为内源核酸酶的存在，或者在提取过程中释放出来的核酸酶的作用下，将会显著影响最终收获量，或者纯化到的质粒容易降解，推荐客户将质粒转化至不含内源核酸酶的宿主菌株中，如Top10, DH5a进行质粒纯化。 如果从含内源核酸酶的宿主菌株中纯化质粒DNA，请用试剂盒附送的核酸酶去除溶液，去除核酸酶的污染。或选用HP系列试剂盒进行质粒的纯化。 下表给出一些常用的宿主菌株种类：

微量临床样品基因组DNA快速提取试剂盒操作方法及步骤说明书

微量临床样品基因组DNA快速提取试剂盒 目录号：DN25 目录编号包装单位 DN2501 50次 适用范围： 适合于从微量血液、法医材料、干血点、药签等微量样品中分离纯化基因组DNA。 试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成保存50次 裂解液ML 室温11 ml 结合液CB 室温15 ml 抑制物去除液IR 室温25 ml 漂洗液WB 室温15ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 Poly Carrier -20℃200 μl 洗脱缓冲液EB 室温10 ml 蛋白酶K粉（可选） 20mg/ml -20℃20 mg 吸附柱AC和收集管室温50套本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果储存事项：

1.结合液CB或者抑制物去除液IR低温时可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分 钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。 2.为避免降低活性，方便运输，提供蛋白酶K为冻干粉状，收到后，可短暂离心后， 加入1毫升灭菌水溶解。因为反复冻融可能会降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量(20微升)分装冻存，－20℃保存。 3.避免试剂长时间暴露于空气中发生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖 紧盖子。仔细阅读注意事项4。 4. 产品介绍： 本试剂盒采用特制的进口DNA吸附柱和独特的缓冲液系统，特别适合于从微量血液、法医材料、干血点、药签、口香糖、尿液等微量样品中分离纯化基因组DNA。各种来源样品裂解消化处理后DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜（特别配备了Poly Carrier可以从体系中轻松捕获微量核酸），再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，将盐、细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净的基因组DNA 从硅基质膜上洗脱。纯化后的DNA无杂质和PCR抑制剂，可直接适用于PCR分析。 产品特点： 1.不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。 2.节省时间，简捷，单个样品操作一般可在20分钟内完成。 3.配备了Poly Carrier用于充分收集特别微量DNA。 4.多次柱漂洗确保高纯度，提取的DNA 纯度高，质量稳定可靠，可适用于各种常规 操作，包括PCR、酶切、测序、Southern 杂交等。