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Extraction optimization and in vivo antioxidant activities of exopolysaccharide by Morchella esculen

Extraction optimization and in vivo antioxidant activities of exopolysaccharide by Morchella esculen
Extraction optimization and in vivo antioxidant activities of exopolysaccharide by Morchella esculen

Extraction optimization and in vivo antioxidant activities of exopolysaccharide by Morchella esculenta SO-01

Fanyun Meng 1,Bo Zhou 1,Rongshan Lin 1,Le Jia *,Xiaonan Liu,Peng Deng,Keming Fan,Guoyi Wang,Li Wang,Jianjun Zhang

College of Life Science,Shandong Agricultural University,Taian,Shandong 271018,PR China

a r t i c l e i n f o Article history:

Received 16November 2009

Received in revised form 16January 2010Accepted 22January 2010

Available online 13February 2010Keywords:

Morchella esculenta SO-01Exopolysaccharide

Response surface methodology Antioxidant activity Mice

a b s t r a c t

Response surface methodology was used to optimize extraction parameters for Morchella esculenta SO-01exopolysaccharide (EPS)produced during submerged culture.The optimum conditions for EPS extraction were predicted to be,concentration at 84.07°C,precipitation for 22.19h and pH 8.44,and EPS production was estimated at 5.45g/L.The actual yield of EPS under these conditions was 5.32g/L.The antioxidant capacity of the EPS was measured in vivo after ?lling the stomach with different doses of EPS and results showed that the activities of superoxide dismutase (SOD)and glutathione peroxidase (GSH-Px)of blood,spleen,liver,heart,and kidney were increased by 125%,46.11%,23.33%,12.19%,41.29%,and 63.24%,63.12%,166.54%,98.01%,57.68%,respectively,and that malonaldehyde (MDA)of blood,spleen,liver,heart,and kidney were decreased by 21.80%,67.84%,28.48%,56.15%,41.62%.The results provide a refer-ence for large-scale extraction of EPS by M.esculenta SO-01in industrial fermentation.

ó2010Elsevier Ltd.All rights reserved.

1.Introduction

Interest in medicinal mushrooms has increased in recent years (Wang et al.,2009)and some compounds extracted from mush-rooms are potential immunomodulators (Lee et al.,2009)or bio-logical response modi?ers (BRM)(Zaidman et al.,2005).Polysaccharides from fruiting bodies,cultured mycelium or culture broths have potential antitumor and immunomodulating proper-ties (Masuda et al.,2009;Ooi and Liu,2000;Wasser,2002).

Morchella esculenta ,an edible and medicinal mushroom,con-tains many biological active materials,such as protein,fat,mineral contents,ash,?ber,and carbohydrates (Litchfteld et al.,2006;Nesim Dursun et al.,2006).Polysaccharides from M.esculenta fruit-ing bodies and cultured mycelia have antioxidation,antitumor,and antivirus properties and increase fatigue resistance (Elmastas et al.,2006;Nitha and Janardhanan,2008;Rotaoll et al.,2005;Xu et al.,2008).

Since extraction parameters for exopolysaccharide (EPS)from M.esculenta have apparently not been studied,statistical designs were applied to optimize extraction conditions.Factors affecting the extraction of EPS were analyzed by Plackett–Burman (PB)experiments,and three signi?cant variables (concentration tem-perature,precipitation time,and pH)were chosen to optimize the extraction conditions using response surface methodology

(RSM),a collection of statistical techniques for designing experi-ments,building models,evaluating the effects of factors,and searching optimum conditions of factors for desirable responses (Gouda et al.,2001).In addition,animal experiments were per-formed to explore the antioxidant activities of EPS in vivo .2.Methods

2.1.Microorganism and culture conditions

Morchella esculenta SO-01was obtained from the Shandong Agricultural Academy of Sciences,China and maintained on syn-thetic potato dextrose agar (PDA).The cultures were incubated for 14d at 25°C,stored at 4°C,and subcultured every 2months.Cultivation in liquid media was carried out in 250-mL Erlenmeyer ?asks containing 100mL of (g/L):bran,40;sucrose,40;yeast ex-tract,5;KH 2PO 4, 1.5;MgSO 4á7H 2O, 1.5,and NH 4NO 3,3with pH 5.5.Flasks were inoculated with a 0.5-cm 2mycelial block of M.esculenta SO-01from the solid media,incubated at 25°C for 24h without shaking,and then shaken on a rotary shaker (Anting,Shanghai,China)at 180rpm for 3d.2.2.Measurement and preparation of EPS

The M.esculenta SO-01culture was centrifuged at 3000g for 15min,the supernatant liquid was mixed with 3volumes of 95%ethanol (v/v),stirred vigorously,and kept at 4°C for 18h.After

0960-8524/$-see front matter ó2010Elsevier Ltd.All rights reserved.doi:10.1016/j.biortech.2010.01.113

*Corresponding author.Tel.:+865388249958;fax:+865388248696.E-mail address:jiale9015@https://www.sodocs.net/doc/f43597765.html, (L.Jia).1

Equal contributors.Bioresource Technology 101(2010)

4564–4569

Contents lists available at ScienceDirect

Bioresource Technology

journal homepage:www.elsevier.c o m /l o c a t e /b i o r t ec

h

centrifugation(3000g,15min),the precipitated EPS was dissolved in distilled water(60°C),and the EPS content was determined by the phenol–sulfuric acid method,using glucose as the standard (Chaplin and Kennedy,1994).EPS powder was obtained by quick prefreezing at–35°C for1h and then by vacuum freeze drying (Labconco,USA)for8h,and applied to detect the antioxidant activities in vivo.

2.3.Plackett–Burman(PB)design

Initial screening of the most signi?cant fermentation parame-ters affecting EPS production by M.esculenta SO-01was performed by PB design as reported by Plackett(Plackett and Burman,1946). Seven variables including precipitation temperature,concentrated multiple,pH,concentration temperature,ethanol multiple,ethanol concentration,and precipitation time were studied in this experi-ment.In addition,5center points were added for the variables that could be assigned numerical values.The experimental design with the name,symbol code,and actual level of the variables is shown in Tables1and2.The analysis of variance(ANOVA)for the data and the model coef?cients were computed with the SAS statistical package(version8.2,SAS Institute Inc.).

2.4.Response surface optimization for EPS extraction

Based on the results of the Plackett–Burman test,concentration temperature,precipitation time,and pH were chosen for optimiza-tion of EPS extraction by the Box-Behnken design.The experimen-tal design with name,symbol code,and actual level of the variables is shown in Tables4and5.The test factors were coded according to the following equation:

x i?eX iàX0T=D X i i?1;2;3;:::;ke1Twhere x i is the coded value of an independent variable,X i is the real value of an independent variable,X0is the real value of the indepen-dent variable at the center point,and D X i is the step change value.

To correlate the response variable to the independent variables, the following quadratic polynomial equation was applied to?t the response variable to a quadratic model:

Y?b0tX

b i x it

X

b ii x2

i

t

X

b ij x i x je2T

where Y is the predicted response value,b0is the intercept term,b i is the linear term,b ii is the squared term,b ij is the interaction term, x i and x j are the coded level of independent variables.

All of the experiments were carried out in triplicate.Data were processed and analyzed according to Eq.(2)using Design Expert Software(version7.1.3,Stat-Ease.Inc.,Minneapolis,USA)includ-ing ANOVA.The optimum levels of the selected variables were ob-tained by solving the regression equation and analyzing the response surface contour and surface plots.

Table1

Levels and codes of variables for Plackett–Burman design.

Variables Symbol code Coded levers

à101

Precipitation temperature(°C)A14812 Concentration multiple A2432 pH A3789 Concentration temperature(°C)A4708090 Ethanol multiple A5234 Ethanol concentration(%)A6758595 Precipitation time(h)A7121824Table2

Results of Plackett–Burman for EPS extraction by M.esculenta SO-01.

Runs A1A2A3A4A5A6A7EPS content(g/L)

111à1111à1 3.18

2à111à1111 4.92

31à111à111 3.67

4à11à111à11 5.03

5à1à11à111à1 2.03

6à1à1à11à111 4.08

71à1à1à11à11 3.92

811à1à1à11à1 4.81

9111à1à1à11 3.97

10à1111à1à1à1 4.05

111à1111à1à1 3.96

12à1à1à1à1à1à1à1 4.93

130000000 4.36

140000000 4.51

150000000 4.69

160000000 4.65

170000000 4.07

Table4

Levels and codes of variables for Box-Behnken design.

Variables Symbol Coded Levels

Uncoded Codedà101

Concentration temperature(°C)X1x1708090 Precipitation time(h)X2x2121824 pH X3x3789

Table5

Experimental and predicted values of EPS based on Box-Behnken design.

Runs x1x2x3EPS content(g/L)

Experimental Predicted

1à1à10 3.75 3.76

21à10 4.51 4.56

3à110 4.85 4.78

4110 5.36 5.34

5à10à1 3.97 3.93

610à1 4.59 4.49

7à101 4.27 4.35

8101 5.12 5.15

90à1à1 3.81 3.83

1001à1 4.34 4.43

110à11 4.17 4.07

12011 5.31 5.27

13000 4.98 5.07

14000 5.02 5.07

15000 5.12 5.07

16000 5.10 5.07

17000 5.15 5.07 Table3

ANOVA for the evaluation of the regression model in Plackett–Burman design.

Parameter Coef?cients F-value P

Intercept 4.18––

Precipitation temperature(°C)0.27 6.220.0592 Concentration multiple0.030.060.8228 pHà1.0256.650.0017** Concentration temperature(°C)à0.7329.170.0019** Ethanol multipleà0.239.390.0375* Ethanol concentration(%)à0.4710.310.0326* Precipitation time(h)à0.7526.740.0066** *Signi?cant at5%level.

**Signi?cant at1%level.

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2.5.Animal experiments

Sixty male mice(KunMing strain),weighing20±2g,were ob-tained from Missile Co.,Ltd.(Taian,China)and housed in stainless steel cages under controlled conditions(temperature22±1°C, humidity60–65%,lights on12h every day).After a3-d acclimati-zation period,all animals were randomly divided into six groups (10in each group).The?ve experiment groups received doses of 25,50,100,200,400mg EPS/kg body weight of mice by?lling the stomach(0.01mL/g body weight)with a syringe.The control group received the same volume of saline.The mice were allowed to have free access to water and food for28d.The experiments were performed under guidance of the Shandong Agricultural Uni-versity Committee.At the end of the experiment,all animals were sacri?ced under ether anesthesia,and blood samples were taken from the retrobulbar vein with a vacutainer and anticoagulated by heparin(stored at–80°C).The livers,hearts,spleens,and kidneys were rapidly removed,weighed,and homogenized(1:9, w/v)immediately in0.2M phosphate buffer(4°C,pH7.4).The homogenates were centrifuged(6000g)at4°C for20min and the supernatants were stored at–20°C.

2.6.Measurement of biochemical parameters in liver,heart,spleen, kidney,and blood

The SOD activities of liver,heart,spleen,kidney,and blood were measured according to the method of Bayer and Fridovich(1987). Fifty microliters of the organ extracts was mixed with1mL of physiological saline,centrifuged for3min at2500g,and the pellet was used for the enzyme reaction.Ice-cold water(0.2mL),0.2mL 95%ethanol,0.1mL trichloromethane were added to the pellet and mixed thoroughly with a homogenizer(Bagmixer400,France).The mixture presented three layers after centrifugation(3500g,5min): SOD extract(top layer),haemoglobin precipitation(middle layer) and trichloromethane(bottom layer).The top layer was removed by micropipettor carefully and the mixture,including0.05mL of SOD extract,50mmol potassium phosphate buffer(pH7.0), 13mmol methionine,0.075mmol nitroblue tetrazolium(NBT), 0.01mmol EDTA and0.002mmol ribo?avin,was reacted for 20min.The enzyme activity was expressed in relative units per milligram protein or micromoles per minute per liter of blood. The unit of SOD activity was expressed as U(50%inhibition of pho-tochemical reduction of NBT as1U).

The activity of GSH-Px was measured as described by Flohéand G}u nzler(1984).The reaction mixture consisted of50mmol potassium phosphate buffer(pH7.0),0.5mmol EDTA,1mmol NaN3,0.15mmol NADPH,1mmol GSH,and2.4U/mL of glutathi-one reductase(GR).The reaction was initiated by adding 0.15mmol H2O2.The rate of NADPH consumption was recorded at340nm.The activity of GSH-Px was expressed as mmol of NADPH oxidized per minute per milligram of tissue or micromoles per minute per liter of blood.

The content of malondialdehyde(MDA)was measured by the method of Zhao et al.(2002)with slight modi?cation.The mixture, including0.2mL sample and2mL of0.6%thiobarbituric acid(TBA, w/v),was heated in a boiling water for15min.After cooling rap-idly,the mixture was centrifuged at3000g for10min,and the supernatant was used for the determination of MDA level.

2.7.Statistical analysis

All experiments were carried out in triplicates.Data were pro-cessed and analyzed using Design Expert Software(version7.1.3, Stat-Ease.Inc.,Minneapolis,USA)including ANOVA.

3.Results and discussion

3.1.Determination of parameters of EPS extraction

According to Table2,the maximum EPS yield was5.03g/L,and the optimal extraction parameters were:precipitation tempera-ture,4°C;concentration multiple,2;pH,7;concentration temper-ature,90°C;ethanol multiple,4;ethanol concentration,75%;and precipitation time,24h.ANOVA results showed that precipitation time,pH,and concentration temperature had a highly signi?cant in?uence on EPS extraction at the1%level.The in?uence of other parameters was at the5%level or not signi?cant(Table3).There-fore,these three important factors were chosen to optimize the process of EPS extraction using RSM.

3.2.Response surface optimization of EPS extraction

To optimize the extraction conditions of EPS from M.esculenta SO-01,the experiments were planned to obtain a quadratic model consisting of12runs and5center points.The range and levels of three independent variables are shown in Table4,and the Box-Behnken design matrix together with the experimental and pre-dicted EPS data is shown in Table5.The EPS yield varied depending on the different extraction conditions(Table5).By using multiple regression analysis,the polynomial model for an empirical

Table6

ANOVA for the evaluation of the quadratic model.

Source Coef?cients S.E.Sum of squares Mean square F-value P

Modelàà 4.5200.50052.94<0.0001** Intercept 5.070.044ààààx1(temperature)0.340.0340.9400.94098.98<0.0001** x2(time)0.450.034 1.640 1.640172.76<0.0001** x3(pH)0.270.0340.5800.58061.510.0001** x1x2à0.060.0490.0160.016 1.650.2401 x1x30.060.0490.0130.013 1.390.2762 x2x30.150.0490.0930.0939.810.0166* x2

1

à0.190.0470.1500.15015.740.0054**

x2

2

à0.270.0470.3000.30031.960.0008**

x2

3

à0.400.0470.6700.67070.43<0.0001** Lack-of-?t0.0460.015 3.020.1566 R2=0.9855.

adj-R2=0.9669.

R=0.9927.

*Signi?cant at5%level.

**Signi?cant at1%level.

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relationship between EPS yield and test variables in coded units was expressed by Eq.(3).

Y EPS ?5:07t0:34x 1t0:45x 2t0:27x 3à0:062x 1x 2

t0:058x 1x 3t0:15x 2x 3à0:19x 21à0:27x 22à0:40x 2

3

e3T

where Y EPS is the predicted response for the yield of EPS (g/L),and

x 1,x 2and x 3are the coded test variables for concentration temper-ature (°C),precipitation time (h)and pH,respectively.

Table 6shows the coef?cient estimates of Eq.(3)and the ANO-VA for the response surface quadratic polynomial model.The F -va-lue and P -value were used to examine the coef?cient signi?cance and the interaction strength between independent variables.The corresponding coef?cient will be more signi?cant if the absolute F -value becomes larger and the P -value becomes smaller (Elibol,2004).It can be seen from the Table 6that the linear term regres-sion coef?cients (x 1,x 2,x 3)and the quadratic coef?cients (x 21;x 22;x 2

3)were signi?cant at the 1%level,and the cross product coef?cient (x 2x 3)was signi?cant at the 5%level.The results indicated that the concentration temperature (°C),precipitation time (h)and pH are all signi?cantly correlated with the EPS extraction yield.

The ANOVA for response surface quadratic regression model (Table 6)showed that the model was highly signi?cant (P <0.0001)with a very high F -value (52.94).The ?tness of the model can be checked by the value of determination coef?cient (R 2),which was calculated to be 0.9855,indicating that 98.55%var-iability of the response could be predicted by the model.The value of adj-R 2(0.9669)suggested that the total variation of 97%for the amount of EPS extraction was attributable to the independent vari-ables and only about 3%of the total variation could not be ex-plained by the model.The F -value (3.02)and P -value (0.1566)of lack-of-?t implied that it was not signi?cant relative to the pure er-ror,which indicated that the model equation was appropriate to predict the yield of EPS extraction under any combination of values.

To determine optimal levels of the test variables for the amount of EPS extraction,the 3D response surface described by

the regression model is presented in Fig.1.By solving the inverse matrix (from Eq.(3)),the optimal values of the variables affecting the amount of EPS extraction given by the software were concen-tration temperature 84.07°C,precipitation time 22.19h and pH 8.44.Under these optimal conditions,the model gave the maximum predicted values of EPS extraction (5.45g/L),slightly higher than that obtained from the plot analysis (5.25g/L).In view of the operating convenience,the optimal extraction param-eters were determined to be concentration temperature 84°C,precipitation time 22h and pH 8.4,while the predicted value of EPS extraction was 5.36g/L,slightly lower than that of the max-imum predicted value (5.45g/L).

Triplicate experiments were performed under the determined conditions and EPS yields (5.32g/L)in agreement with the pre-dicted value (5.36g/L)were obtained,indicating that the model was adequate for EPS extraction

process.

Fig.1.Response surface plot for the yield of EPS extraction by M.esculenta SO-01in submerged culture in terms of the effects of (A)time and temperature,(B)pH and temperature,and (C)pH and time.Factors that were not included in the axes were ?xed at their respective optimum levels.

F.Meng et al./Bioresource Technology 101(2010)4564–45694567

3.3.Evaluation of antioxidant activity of EPS

As main index of antioxidant activities in vivo,the values of SOD,GSH-Px and MDA can effectively re?ect the degree of cell in-jury and lipid hydroperoxide in organisms(Fang and Zheng,2002). The antioxidant results of EPS are described in Fig.2–4.

SOD can eliminate the superoxide anion radical(?O2à)to protect cells from damage.Experiments in animals demonstrate a correla-tion between SOD and tolerance to oxygen toxicity(Zhang et al., 2009).It can be seen from Fig.2that the SOD activities of 400mg/kg group in mice blood,spleen,liver,heart,and kidney reached443.97±52.15U/mL,130.27±15.13U/mg protein, 180.49±25.44U/mg protein,73.83±6.96U/mg protein and 143.28±16.07U/mg protein,respectively,which were125%, 46.11%,23.33%,12.19%,and41.29%higher than that of the control group,respectively.The ANOVA showed that the activity of SOD in 400mg/kg group was signi?cant compared to that of the control group(P<0.01).The EPS of M.esculenta SO-01can effectively scav-enge the superoxide anion radical by increasing SOD activity in mice blood.

GSH-Px catalyzes the reduction of hydrogen peroxide that de-rived from oxidative metabolism as well as peroxides from oxida-tion of lipids and is considered the most effective enzyme against lipid peroxidation(Zhang et al.,2009).GSH-Px activities in each dose group are presented in Fig.3.The GSH-Px activities of 400mg/kg group in mice blood,spleen,liver,heart,and kidney tis-sue were613.48±89.35U/mL,19.15±5.74U/mg protein, 145.61±19.37U/mg protein,85.64±7.98U/mg protein and 54.81±8.59U/mg protein,respectively,which were63.24%, 63.12%,166.54%,98.01%,and57.68%higher than that of control group,respectively.The maximum GSH-Px activity appeared in li-ver tissue,which may be related to that the liver is the major organ to remove lipid hydroperoxide.The ANOVA showed that GSH-Px activities of blood,liver,heart,spleen,and kidney of mice treated with EPS were signi?cantly higher(P<0.01).These results indi-cated that the EPS tested has a noticeable effect on improving GSH-Px activity.

MDA is considered as a secondary indicator formed by lipid per-oxidation,re?ecting the content of free radicals produced by lipid peroxidation(Niki et al.,2005;Husain et al.,2003).As shown in Fig.4,the levels of MDA decreased with increasing EPS concentra-tions.The MDA content in blood,spleen,liver,heart,and kidney of mice that had received400mg/kg EPS reached9.47±0.62nmol/ mL, 2.65±0.95nmol/mg protein,10.07±0.58nmol/mg protein, 2.89±0.32nmol/mg protein,and 6.86±0.91nmol/mg protein, respectively,which was21.80%,67.84%,28.48%,56.15%,and 41.62%lower than that of the control group.

These data showed that the EPS of M.esculenta SO-01can in-crease antioxidant abilities by improving SOD and GSH-Px activi-ties,and reducing the MDA content in blood,liver,heart,spleen, and kidney of mice.The mechanism by which the activity of these enzyme is increased and by which MDA production is inhibited could be direct activation of the enzymes or binding of metal ions which are necessary for organisms to produce free radical(Volpi and Tarugi,1999).

4.Conclusions

Response surface methodology using second-order regression for a three-factor-three-level Box-Behnken design was a successful tool for optimization of extraction of EPS produced by M.esculenta SO-01in submerged culture.The EPS showed antioxidative activi-ties in vivo.The results provide a reference for large-scale extrac-tion of EPS by M.esculenta SO-01in industrial fermentation. Acknowledgements

The authors gratefully acknowledge the?nancial supports by Natural Science Fund Program of Shandong(Y2006D08)and Doc-toral Fund Program of Shandong(2007BS02021).

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研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结-实验步骤

研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结-实验步骤 蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分,蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。把原来spaces空间上的一篇蛋白质与蛋白质间相互作用研究方法转来,算是实验技巧分类目录的首篇。(另补充2:检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较) 一、酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后,诱饵蛋白结合于报道基因的启动子,启动报道基因在酵母细胞内的表达,如果检测到报道基因的表达产物,则说明两者之间有相互作用,反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中,人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能,丰富了酵母双杂交系统的功能。此外,酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。 二、噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列,当噬菌体生长时,表面就表达出相应的单抗,再将噬菌体过柱,柱上若含目的蛋白,就会与相应抗体特异性结合,这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用,不仅有高通量及简便的特点,还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前,用优化的噬菌体展示技术,已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库,并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。 三、等离子共振技术 表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance,SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”,当待测蛋白与诱饵蛋白结合后,薄膜的共振性质会发生改变,通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料,反应过程可实时监控。测定快速且安全,还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。

(完整版)WesternBlot(免疫印迹法)实验方法步骤

Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤 发布日期:2008-8-25 热门指数:4360 Western Blot(免疫印迹法) 主要包括以下4个基本步骤: n 样品制备 n 电泳分离 n 蛋白的膜转移 n 免疫杂交与显色――蛋白检测 溶液和试剂 n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS) n Modified RIPA buffer Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;P MSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mM n 1X SDS 样品缓冲液 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝 n 转移缓冲液 25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3) n 10X Tris缓冲盐(TBS) 准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6 n 脱脂奶粉或BSA n 甲醇 n TBS/T缓冲液 1X TBS, 0.1% Tween-20 n 封闭缓冲液(TBS/T)

1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSA n 一抗的稀释 1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗) Note:一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体,脱脂奶粉用于单克隆抗体,这样可得到较高的信噪比。抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。 n 预染的蛋白质Marker,可用于监测转膜的效率 样品制备 原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白,以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法,其余的样品制备方法参阅相关文献。 1.培养细胞或药物处理。 2.弃培养基,用1X PBS漂洗细胞2次,去尽残留培养基。 3.加入1X SDS样品缓冲液(6-well plate, 100 μl /w或75 cm2plate, 500-1000 μl/瓶),刮落细胞,转移到Ep管。注意:冰上操作。 4.超声10~15秒剪切DNA以减低样品粘性。 5.煮沸样品5 minutes。 6.离心12000g, 5 min,取上清。 7.电泳分离:上样15μl~20 μl 至SDS-PAGE 胶(10 cm x 10 cm)电泳。 如要定量检测某蛋白的表达水平,应用RIPA裂解液(1 ml per 107cells/100 mm dish/150 cm2flask)裂解细胞,收集裂解液至离心管中,在振荡器上混匀4~15min,14000g离心15min(4℃),弃沉淀,用B radford法或其它蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度以调整上样体积和上样量,进行Western杂交时还需设置内或外参照,通常用beta-actin。 注意:一般上样20~30 μg已足够,如待检蛋白为低丰度蛋白,可加大上样量至100μg,但电泳条带易拖尾,可制备亚细胞组份或采用更敏感的检测方法。 电泳分离(参照SDS-PAGE电泳方法) 转膜 杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素,选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于Western blot的膜主要有两种:硝酸纤维素膜(NC) 和PVDF膜。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物,在低离子转移缓冲液的环境下,大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起,但在非离子型的去污剂作用下,结合的蛋白还可以被

蛋白质的盐析与透析

蛋白质的盐析与透析 一、实验目的 1.了解蛋白质的分离纯化方法 2.掌握蛋白质的盐析及透析方法 二、实验原理 在蛋白质溶液中加入一定浓度的中性盐,蛋白质即从溶液中沉淀析出,这种作用称为盐析。盐析法常用的盐类有硫酸铵、硫酸钠等。 蛋白质用盐析法沉淀分离后,需脱盐才能获得纯品,脱盐最常用的方法为透析法。蛋白质在溶液中因其胶体质点直径较大,不能透过半透膜,而无机盐及其它低分子物质可以透过,故利用透析法可以把经盐析法所得的蛋白质提纯,即把蛋白质溶液装入透析袋内,将袋口用线扎紧,然后把它放进蒸馏水或缓冲液中,蛋白质分子量大,不能透过透析袋而被保留在袋内,通过不断更换袋外蒸馏水或缓冲液,直至袋内盐分透析完为止。透析常需较长时间,宜在低温下进行。 三、实验材料和试剂 10%鸡蛋白溶液,含鸡蛋清的氯化钠蛋白溶液,饱和硫酸铵溶液,硫酸铵晶体,1%硝酸银溶液。 四、实验步骤 (一)蛋白质盐析 取10%鸡蛋白溶液5ml于试管中,加入等量饱和硫酸铵溶液,微微摇动试管,使溶液混合后静置数分钟,蛋白即析出,如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵溶液,观察蛋白质的析出; 取少量沉淀混合物,加水稀释,观察沉淀是否会再溶解。 (二)蛋白质的透析 注入含鸡蛋清的氯化钠蛋白溶液5ml于透析袋中,将袋的开口端用线扎紧,然后悬挂在盛有蒸馏水的烧杯中,使其开口端位于水面之上。 经过10分钟后,自烧杯中取出1ml溶液于试管中,加1%硝酸银溶液一滴,如有白色氯化银沉淀生成,即证明蒸馏水中有Cl-存在。 再自烧杯中取出1ml溶液于另一试管中,加入1ml 10%的氢氧化钠溶液,然后滴加1-2滴1%的硫酸铜溶液,观察有无蓝紫色出现。 每隔20分钟更换蒸馏水一次,经过数小时,则可观察到透析袋内出现轻微混浊,此即为蛋白质沉淀。继续透析至蒸馏水中不再生成氯化银沉淀为止。 实验报告记录透析完毕所需的时间。 附:胶棉半透膜的制备 市售5%的胶棉液,加入干燥的150mL锥形瓶中,将锥形瓶横斜不断转动,使瓶的内壁和瓶口都均匀沾有胶棉液。倒出多余的胶棉液,然后倒置约1min使乙醚、乙醇不断蒸发,直到干燥。逐步剥离瓶口的薄膜,沿瓶壁薄膜夹缝注入蒸馏水,使薄膜逐步跟瓶壁胶离,轻轻取出,浸入蒸馏水中备用。 如有侵权请联系告知删除,感谢你们的配合!

食品中蛋白质的测定实验报告

1.目的 掌握凯氏定氮法测蛋白质的原理、操作、条件、注意事项。 2.原理 蛋白质是含氮有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白质分解。分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后在以硫酸或盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量计算含氮量再乘以换算系数,即为蛋白质含量。 3.试剂 3.1浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾,所有试剂均用不含氮的蒸馏水配制 3.2混合指示液 1份(1g/L)甲基红乙醇溶液与5份1g/L溴甲酚氯乙醇溶液临用时混合。 也可用2份甲基红乙醇溶液与1份1g/L次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。 3.3氢氧化钠溶液(400g/L) 3.4标准滴定溶液 硫酸标准溶液[c(1/2H2SO4)=0.0500mol/L]或盐酸标准溶液[c(HCl) 0.0500mol/L] 3.5硼酸溶液(20g/L) 4.仪器 定氮蒸馏装置 5.样品 全蛋(2.47g) 6.操作 6.1样品处理 准确称取2—5g半固体样品,小心移入干燥洁净的500mL凯氏烧瓶中,然后加入研细的硫酸铜0.5g,硫酸钾10g和浓硫酸20mL,轻轻摇匀后于瓶口放一小漏斗,将瓶以45°角斜放于加有石棉网的电炉上,小火加热,待内容物全部炭化后,泡沫完全消失后,加强火力,并保持瓶内液体微沸,至液体呈蓝绿色呈请透明后,再继续加热0.5h,取下放冷,慢慢加入20mL水。 放冷后,移入100mL容量瓶中,并用少量水洗定氮瓶,洗液并入容量瓶中,再加水至刻度,混匀备用。取与处理样品相同的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白试验。 6.2连接装置 装好定氮装置,于水蒸气发生器内装水至2/3处,加甲基红指示剂数滴及少量硫酸,以保持水呈酸性,加入数滴玻璃珠以防暴沸,用调压器控制,

检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术

一、检测蛋白质与蛋白质相互作用 ①FRET技术(in vivo) FRET,Fluorescence resonanceenergy transfer,即荧光共振能量转移技术。该技术得原理就是用一种波长得光激发某种荧光蛋白后,它释放得荧光刚好又能激发另一种荧光蛋白,使其释放另一波长得荧光,如下图所示: 以下图为例,若要利用FRET检测两种蛋白就是否有相互作用,需将两种蛋白得基因分别与这两种荧光蛋白得基因融合,并在细胞内表达出两种融合蛋白。然后只需用紫外光对CFP进行激发,并检测GFP就是否放出绿色荧光.如果能检测到绿色荧光,那么可以说明这两种蛋白可能有相互作用;反之,则就是这两种蛋白没有相互作用。 ②酵母双、三杂交技术(in vivo) 酵母双杂交系统主要用于考察两种蛋白就是否有相互作用,其原理就是典型得真核生长转录因子,如GAL4、GCN4等都含有二个不同得结构域,即AD与BD.这些转录因子只有同时具有这两个结构域时才能起始转录.由此,设计不同得两个载体,一个含有AD基因(假设为A载体),另一个含有BD基因(假设为B载体)。 一般将一个已知蛋白得基因连在B载体上,作为诱饵(Bait),将未知蛋白得基因连在A载体上,将这两个载体都转到特定得酵母细胞内,瞧未知蛋白与已知蛋白就是否有相互作用.如果两者有相互作用,那么就可以启动报告基因得转录,从而使这个酵母细胞能在选择培养基上显现出来或者生存下来;如果两者无相互作用,那么报告基因就无法表达,那么这个酵母细胞就无法在择培养基上显现出来或者生存下来,如下图所示:

由于酵母双杂交系统不能鉴定膜蛋白间得相互作用,因此又发展出了分离泛素酵母双杂交系统。该系统得原理如下图所示: 如图所示,将泛素蛋白拆分为两个片段,即C端段(Cub)与N端段(NubG),并在C端段得N端接上一个LexA—VP16转录因子,此时它并不能激活基因转录(因为它被限制在了C端段上,不能进入细胞核发挥作用)。 将该C端段连到一个膜蛋白上,将N端段连接到另一个膜蛋白上。若两个膜蛋白有相互作用,那么两个膜蛋白在相互靠近时会使泛素蛋白得N端段与C端段靠近结合,形成一个完整得泛素蛋白。此时泛素蛋白酶体会将这一段被泛素标记得片段降解,那么连接C端段得LexA-VP16转录因子掉落,即可进入细胞核启动标记基因得表达。 酵母三杂交得原理与双杂交一样,只就是它研究得就是两个蛋白与第三个成分间得相互作用,通过第三个成分使两个蛋白相互靠近。第三个成分可以就是:蛋白、RNA或小分子,如下图所示: 如上图所示,在加入第三种成分前,蛋白X与蛋白Y之间并无直接相互作用,因此无法使BD与AD靠近,报告基因不能表达;当加入第三种成分后,蛋白X与蛋白Y得距离被拉近,BD与AD靠近,报告基因表达,从而可以被检测到。 ③ Pulldown技术(invitro) Pulldown,即蛋白沉降技术,它就是建立在蛋白质亲与层析得基础上得一种检测蛋白质间相互作用得分析方法.亲与层析得原理如下图所示,不同蛋白对配体得亲与程度不同,因此可以先将非特异结合得蛋白用低浓度缓冲液给清洗出去,只剩目得蛋白与层析柱结合,然后再用洗脱液将目得蛋白洗脱下来,达到纯化目得蛋白得作用。

蛋白质免疫印迹技术的实验研究

万方数据

万方数据

万方数据

蛋白质免疫印迹技术的实验研究 作者:张燕婉, 叶珏, 时那, 孟宪敏, 王来元, ZHANG Yan-wan, YE Jue, SHI Na, MENG Xian-min, WANG Lai-yuan 作者单位:中国医学科学院,阜外心血管病医院中心实验室,北京,100037 刊名: 实验技术与管理 英文刊名:EXPERIMENTAL TECHNOLOGY AND MANAGEMENT 年,卷(期):2008,25(10) 被引用次数:21次 参考文献(9条) 1.郭尧君蛋白质电泳实验技术 2006 2.Nieman T Detection based on solution-phase chemiluminescence systems 1989 3.李晓军,秦浚川,武建国蛋白印迹技术研究进展[期刊论文]-临床检验杂志 2004(3) 4.Towbin H;Staehelin T;Gordon Electrophoretic franker of proreins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets.Procedure and some appHcations 1979(76) 5.Hauri H P;Bucher K Immunoblotting with monodonal antibodities:Importance of the blocking solution 1986(159) 6.高红,王贵新,王维林,张可仞用蛋白印迹技术初步评价肝母细胞瘤血管内皮生长因子表达的意义[期刊论文]-中华小儿外科杂志 2006(2) 7.Towbin H;Gordon J Immunoblotting and dot immunobinding:current status and outlook 1984(72) 8.Tovey ER;Baldo BA Characterisation of allergens by protein blotting 1987(08) 9.沈关心;龚非力抗体技术实验指南 2006 本文读者也读过(1条) 1.段勇.黄韬.袁育林.刘华.李娅.金克炜.DUAN Yong.HUANG Tao.YUAN Yulin.LIU Hua.LI Ya.JIN Kewei蛋白质免疫印迹技术检测肺癌组织上皮钙粘蛋白的表达[期刊论文]-检验医学2009,24(1) 引证文献(7条) 1.秦双立,徐玥蛋白质印迹法在氟中毒研究中的应用[期刊论文]-山东化工 2015(13) 2.马瑛,马明,沈辉,骆新荣,高庆华不孕奶牛宫颈黏液相关ASA免疫印迹分析[期刊论文]-中国奶牛 2013(06) 3.程娜娜,韩榕He-Ne激光和增强UV-B辐射对拟南芥叶片微管蛋白的影响[期刊论文]-激光生物学报 2013(04) 4.刘娇,华碧春,黄智锋蛋白表达检测技术在中药肝损伤机制研究中的应用进展[期刊论文]-浙江中医药大学学报2013(04) 5.韩继美胶体金免疫层析法对AFP、CEA和FN的快速检测[学位论文]硕士 2009 6.黄斌芳c-Jun基因启动子区的遗传变异与肺癌易感性的研究[学位论文]硕士 2012 7.程娜娜He-Ne激光和增强UV-B辐射对拟南芥叶片微管结合蛋白MAP65-1的影响[学位论文]硕士 2014 引用本文格式:张燕婉.叶珏.时那.孟宪敏.王来元.ZHANG Yan-wan.YE Jue.SHI Na.MENG Xian-min.WANG Lai-yuan 蛋白质免疫印迹技术的实验研究[期刊论文]-实验技术与管理 2008(10)

蛋白质测定实验报告

蛋白质测定实验报告标准化管理部编码-[99968T-6889628-J68568-1689N]

蛋白质测定方法——化学报告

蛋白质的检测 酚试剂法灵敏度较高 20~250mg 费时蛋白质在碱性溶 液中其肽键与 Cu2+螯合,形成 蛋白质一铜复合 物,此复合物使 酚试剂的磷钼酸 还原,产生蓝色 化合物 酚类、柠檬 酸、硫酸铵、 tris缓冲液、 甘氨酸、糖 类、甘油等均 有干扰作用 由上表可大致了解五种检测蛋白质的方法,下面以实验的形式进行详细阐述: 1 材料与方法 仪器材料 (1)仪器:凯氏定氮仪、紫外分光光度计、可见光分光光度计、工作离心机、布氏漏斗、抽滤泵。 (2)试剂及原材料:牛奶、酸奶、豆浆、LpH=4. 7醋酸- 醋酸钠缓冲液、乙醇-乙醚等体积混合液、浓H2SO4 、40%氢氧化钠、30%过氧化氢、2%硼酸溶液、0. 050molPL标准盐酸溶液、硫酸钾- 硫酸铜接触剂、混合指示剂、标准蛋白溶液、双缩脲试剂、考马斯亮蓝G- 250试剂。 实验方法 (1)凯氏定氮法测定蛋白质含量 将待测样品与浓硫酸共热,含氮有机物即分解产生氨(消化) ,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。为了加速消化,可以加入CuSO4 作催化剂和加入K2SO4 以提高溶液的沸点,而加入30%过氧化氢有利于消化溶液的澄清。消化好的样品在凯氏定氮仪内经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至定量硼酸溶液中,然后用标准盐酸溶液进行滴定,记录,计算出样品含氮量。每个样品做三次重复测定,取平均值。 (2)紫外吸收法测定蛋白质含量 蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收峰在280nm处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。 紫外吸收法简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。低浓度的盐,例如,

免疫印迹实验报告——wester blot

Western blot实验报告 摘要:目的:学习并掌握western blot分离蛋白及观察方法 方法:western blot 结果:见后文 结论:western blot能很好地分离蛋白 关键词:western blot、分离、小鼠组织、蛋白 Western blot test report Abstract: objective: Learn and master the western blot protein isolated and observation method Methods: western blot:,sds-page and electric transfer Results: see below Key words: Western blot、separate、mouse tissues、protein 前言:免疫印迹又称Western印迹(Western blotting),与DNA的Southern印迹技术相对应,两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜),然后用探针检测特异性组分。不同的是,Western blotting所检测的是抗原类蛋白质成分,所用的探针是抗体,它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点,具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测,以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。目前,Western blotting广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。 免疫印迹可分成两个步骤:蛋白质由凝胶转移至固相基质;特异性抗体检测。 蛋白质转移通常由电泳实现,现常用的方法有二:1 半干法:将凝胶和固相基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间,通电10-30分钟可完成转移;2 湿法:将凝胶和固相基质夹在滤纸中间,浸在转移装置的缓冲液中,通电45分钟或过夜课完成转移。本试验采用湿法转移。免疫印迹用膜通常有硝酸纤维素膜和尼龙膜两种。大多数应用前者。本实验也用硝酸纤维素膜进行转移。 1 试剂与仪器 1.1 试剂(所有试剂均供两组用) 1.1.1 8%电泳分离胶的配制 H2O 6.9ml

蛋白质的盐析与透析

蛋白质的分离纯化 一、实验目的 1.了解蛋白质的分离纯化方法 2.掌握蛋白质的盐析及透析方法 二、实验原理 在蛋白质溶液中加入一定浓度的中性盐,蛋白质即从溶液中沉淀析出,这种作用称为盐析。盐析法常用的盐类有硫酸铵、硫酸钠等。 蛋白质用盐析法沉淀分离后,需脱盐才能获得纯品,脱盐最常用的方法为透析法。蛋白质在溶液中因其胶体质点直径较大,不能透过半透膜,而无机盐及其它低分子物质可以透过,故利用透析法可以把经盐析法所得的蛋白质提纯,即把蛋白质溶液装入透析袋内,将袋口用线扎紧,然后把它放进蒸馏水或缓冲液中,蛋白质分子量大,不能透过透析袋而被保留在袋内,通过不断更换袋外蒸馏水或缓冲液,直至袋内盐分透析完为止。透析常需较长时间,宜在低温下进行。 三、实验材料和试剂 10%鸡蛋白溶液,含鸡蛋清的氯化钠蛋白溶液,饱和硫酸铵溶液,硫酸铵晶体,1%硝酸银溶液,双缩脲试剂 四、实验步骤 (一)蛋白质盐析 取10%鸡蛋白溶液5ml于试管中,加入等量饱和硫酸铵溶液,微微摇动试管,使溶液混合后静置数分钟,蛋白即析出,如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵溶液,观察蛋白质的析出; 取少量沉淀混合物,加水稀释,观察沉淀是否会再溶解。 (二)蛋白质的透析 注入含鸡蛋清的氯化钠蛋白溶液5ml于透析袋中,将袋的开口端用线扎紧,然后悬挂在盛有蒸馏水的烧杯中,使其开口端位于水面之上。 经过10分钟后,自烧杯中取出1ml溶液于试管中,加1%硝酸银溶液一滴,如有白色氯化银沉淀生成,即证明蒸馏水中有Cl-存在。 再自烧杯中取出1ml溶液于另一试管中,加入1ml 10%的氢氧化钠溶液,然后滴加1-2滴1%的硫酸铜溶液,观察有无蓝紫色出现。 每隔20分钟更换蒸馏水一次,经过数小时,则可观察到透析袋内出现轻微混浊,此即为蛋白质沉淀。继续透析至蒸馏水中不再生成氯化银沉淀为止。 实验报告记录透析完毕所需的时间。

免疫印迹介绍及实验过程

免疫印迹 免疫印迹 免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blotting),是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性,现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白,并能对蛋白进行定性和半定量分析。结合化学发光检测,可以同时比较多个样品同种蛋白的表达量差异。 免疫印迹法的基本原理 将混合抗原样品在凝胶板上进行单向或双向电泳分离, 然后取固定化基质膜与凝胶相贴。在印迹纸的自然吸附力、电场力或其它外力作用下, 使凝胶中的单一抗原组份转移到印迹纸上, 并且固相化。最后应用免疫覆盖液技术如免疫同位素探针或免疫酶探针等, 对抗原固定化基质膜进行检测和分析。 免疫印迹法的基本步骤 免疫印迹法(以抗原分析为例)基本上可分为抗原分离、抗原印迹和抗原检定三个步骤。在每一步中因采用的具体实验方法不同, 可构成多种免疫印迹分析系统。 免疫印迹法的优点 免疫印迹法是一项分析抗原、抗体的技术。它具有下列优点: 1、湿的固定化基质膜柔韧, 易于操作; 2 、固定化的生物大分子可均一的与各种免疫探针接近, 不会象凝胶那样受孔径阻隔; 3、免疫印迹分析只需少量试剂; 4、孵育、洗涤的时间明显减短; 5、可同时制作多个拷贝, 用于多种分析和鉴定; 6、结果以图谱形式可长期保存; 7、免疫探针可通过降低PH值等方法, 象抹去录音磁带一样将探针抹掉, 再换用第二探针进行分析检测。免疫印迹法的应用范围及优点不仅局限于此, 它必将随着这一方法的深入研究而不断发展和完善。 免疫印迹 免疫印迹又常称Western blot,是一综合性的免疫学检测技术。它利用SDS-PAGE技术将生物样品中的蛋白质分子按分子量的大小在凝胶上分离开,然后用电转移的方法将蛋白转移到固相膜上(NC、尼龙或PVDF膜),最后进行免疫学检测。由于免疫学检测敏感性高,并且通过SDS-PAGE样品中的待检蛋白得到了浓缩,因此,Western blot的灵敏度特别高,可达到放射免疫的分析水平。而使用一般的免疫学检测技术(如ELISA、放射免疫沉淀)检测时,由于要求被检测蛋白可溶、要求抗体效价高、亲和力高和特异性强,往往并不容易达到目的。而Western blot却没有这些缺点。因此,Western blot广泛应用于生物样品中是否存在某一蛋白质(抗原)的检测。也可用于粗略测定抗原蛋白的相对含量和抗原多肽链的相对分子量。

蛋白质测定实验报告

蛋白质测定方法——化学报告

蛋白质的检测 酚试剂法灵敏度较高 20~250mg 费时蛋白质在碱性溶 液中其肽键与 Cu2+螯合,形成 蛋白质一铜复合 物,此复合物使 酚试剂的磷钼酸 还原,产生蓝色 化合物 酚类、柠檬 酸、硫酸铵、 tris缓冲液、 甘氨酸、糖 类、甘油等均 有干扰作用 由上表可大致了解五种检测蛋白质的方法,下面以实验的形式进行详细阐述:

1 材料与方法 1.1 仪器材料 (1)仪器:凯氏定氮仪、紫外分光光度计、可见光分光光度计、工作离心机、布氏漏斗、抽滤泵。 (2)试剂及原材料:牛奶、酸奶、豆浆、0.12mol/LpH=4. 7醋酸- 醋酸钠缓冲液、乙醇-乙醚等体积混合液、浓H2SO4 、40%氢氧化钠、30%过氧化氢、2%硼酸溶液、0. 050molPL标准盐酸溶液、硫酸钾- 硫酸铜接触剂、混合指示剂、标准蛋白溶液、双缩脲试剂、考马斯亮蓝G- 250试剂。 1.2 实验方法 (1)凯氏定氮法测定蛋白质含量 将待测样品与浓硫酸共热,含氮有机物即分解产生氨(消化) ,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。为了加速消化,可以加入CuSO4 作催化剂和加入K2SO4 以提高溶液的沸点,而加入30%过氧化氢有利于消化溶液的澄清。消化好的样品在凯氏定氮仪内经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至定量硼酸溶液中,然后用标准盐酸溶液进行滴定,记录,计算出样品含氮量。每个样品做三次重复测定,取平均值。 (2)紫外吸收法测定蛋白质含量 蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收峰在280nm处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。 紫外吸收法简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。低浓度的盐,例如, 生化制备中常用的(NH4)2SO4 等和大多数缓冲液不干扰测定,特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测,因为此时只需测定蛋白质浓度的变化,而不需知道其绝对值。 此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差,干扰物质较多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质有一定的误差,故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表,再进行计算的方法加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的,虽然经过校正,测定的结果还是存在一定的误差。 此外,进行紫外吸收法测定时,由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化,因此要注意溶液的pH值,测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。取待测样品制成蛋白浓度大约在0. 1~1. 0mgPmL的蛋白质溶液,用紫外分光光度计进行比色,对照标准曲线得出样品含氮量。每个样品做3次重复测定,取平均值。 (3)双缩脲法测定蛋白质含量

【1】生物样本中蛋白质的提取及测定(分子医学实验)

《分子生物学实验》 实验报告 实验名称:生物样本中蛋白质的提取及测定 姓名:杰 学号:3140104666 组别: 同组同学:唐曦

带教教师:伟俞萍 实验日期:2015年9月15日 目录 1.原理: (3) 1.1生物样本中蛋白质的提取 (3) 1.2生物样本中蛋白质的测定 (3) 1.2.1 Lowry法 (3) 1.2.2 考马斯亮蓝法 (4) 1.2.3 紫外吸收法 (4) 2.操作步骤 (4) 2.1生物样本中蛋白质的提取 (4) 2.2生物样本中蛋白质的测定 (5) 2.2.1 Lowry法 (5) 2.2.2 考马斯亮蓝法 (5) 2.2.3紫外吸收法 (5) 3、实验结果 (6) 3.1 原始数据 (6) 3.1.1 Lowry法 (6) 3.1.2 考马斯亮蓝法 (7) 3.1.3 紫外吸收法 (7)

3.2 数据处理 (8) 3.2.1 Lowry法 (8) 3.2.2 考马斯亮蓝法 (9) 3.2.3 紫外吸收法 (10) 4.讨论: (11) 1.原理: 1.1生物样本中蛋白质的提取 离体不久的组织,在适宜的温度及pH等条件下,可以进行一定程度的物质代谢。因此,在生物化学实验中,常利用离体组织来研究各种物质代谢的途径与酶系作用,也可以从组织中提取各种代谢物质或酶进行研究。但生物组织离体过久,其所含物质的含量和生物活性都将发生变化。例如,组织中的某些酶在久置后会发生变性而失活;有些组织成分如糖原、ATP等,甚至在动物死亡数分钟至十几分钟,其含量即有明显的降低。因此,利用离体组织作代谢研究或作为提取材料时,都必须迅速将它取出,并尽快地进行提取或测定。一般采用断头法处死动物,放出血液,立即取出实验所需的脏器或组织,除去外层的脂肪及结缔组织后,用冰冷的生理盐水洗去血液(必要时可用冰冷的生理盐水灌注脏器以洗去血液),再用滤纸吸干,即可用于实验。取出的脏器或组织,可根据不同的方法制成不同的组织样品。包括组织糜、组织匀浆、组织浸出液。由于动物肝脏细胞比较脆弱,易于破碎,故本实验选用小鼠肝脏细胞作为实验材料,采用匀浆法法将其破碎,然后加入样品提取液使蛋白质溶解,用高速离心法弃去细胞碎片。收集上清液后可进行蛋白质定量分析。 1.2生物样本中蛋白质的测定 1.2.1 Lowry法 1921年,Folin发明了Folin-酚试剂法测定蛋白质的浓度,反应原理是利用蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸残基还原酚试剂(磷钨酸-磷泪酸)生成蓝色

(完整版)蛋白免疫印迹(westernblot)实验

蛋白免疫印迹(western blot)实验 实验步骤: 一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂:见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液:1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml;10%SDS 6.0 ml;β-巯基乙醇 0.2 ml;ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液:甘氨酸 2.9 g;Tris 5.8 g;SDS 0.37 g;甲醇200 ml;加ddH2O定容至1000 ml。 4. 0.01 M PBS(pH7.4):NaCl 8.0 g;KCl 0.2 g;Na2HPO4 1.44 g;KH2PO4 0.24 g;加ddH2O至1000 ml。 5. 膜染色液:考马斯亮兰 0.2 g;甲醇80 ml;乙酸2 ml;ddH2O118 ml。包被液(5%脱脂奶粉,现配):脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。 6. 显色液:DAB 6.0 mg;0.01 M PBS 10.0 ml;硫酸镍胺 0.1 ml;H202 1.0 μl。【晶莱生物】 二、蛋白样品制备 1.单层贴壁细胞总蛋白的提取 (1)倒掉培养液,并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液(或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走)。 (2)每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS(0.01M pH7.2~7.3)。平放轻轻摇动1 min洗涤细胞,然后弃去洗液。重复以上操作两次,共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。 (3)按1ml裂解液加10 μl PMSF(100 mM),摇匀置于冰上。(PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。) (4)每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液,于冰上裂解30 min,为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 (5)裂解完后,用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧(动作要快),然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。(整个操作尽量在冰上进行。) (6)于4℃下12000 rpm离心5 min。(提前开离心机预冷) (7)将离心后的上清分装转移倒0.5 ml的离心管中放于-20℃保存。

实验一蛋白质含量测定

实验一蛋白质含量的测定 姓名:mangogola 一.实验原理 生物化学实验中,经常需要测定蛋白质的含量,一般常用的蛋白质含量测定方法有紫外吸收法、福林酚试剂法以及一些改进的Lowry法可以应用。 紫外吸收法测定蛋白质含量的原理是由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸中的苯环含有共轭双键,因此蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收高峰在280nm处,且蛋白质溶液的光密度值与其含量呈正比关系。该方法具有简单、灵敏、快速和不消耗样品的优点,但易受核酸分子中嘌呤、嘧啶等的干扰,准确度较差。根据蛋白质和核酸的吸收峰不同,可通过计算适当校正核酸的干扰作用。 Lowry法的原理是:在碱性条件下,蛋白质与铜离子形成铜-蛋白质复合物,该复合物可还原磷钼酸-磷钨酸(Folin试剂)产生深蓝色的钼蓝和钨蓝混合物。该方法灵敏度较高,但较费时。 对膜蛋白或相当稀的(如<1ug/ml)蛋白溶液的含量测定,以及为减小去污剂、脂类、碳水化合物的干扰,可采用一些改进的Lowry法,如蛋白质-染料结合法。原理是:当染料考马斯亮蓝G250与蛋白质结合时,最大吸收峰从465nm移动到595nm,而且吸收值在一定蛋白浓度下线性相关,因此用标准浓度的蛋白测OD595作标准曲线,即可求得待测样品的蛋白浓度。此方法简单经济、快速、灵敏度也较高。需要注意的是,染料与蛋白质可在3min内完成结合,由于染料试剂中含有酒精成分,易挥发,所以结合生成的复合物在1h 内可比较稳定地存在于溶液中,制作的标准曲线后部会出现弯曲现象。 二.实验过程(Lowry法) 1.溶液配制 A液:2%Na2CO3,用0.1mol/LNaOH配制。(不能将NaOH和 Na2CO3干粉混合配制,这样会因释放CO2而不准确) B液:0.5%CuSO4.5H2O,用1%酒石酸钾或酒石酸钠配制。 C液:使用前将A、B液按50:1混合,当天使用。 D液:Folin试剂 标准蛋白溶液:200ug/mLBSA溶液 2.标准曲线测定 按照下表进行操作,用一系列标准浓度的BSA平行进行两组测定反应,记录A500。取两组测定的平均值,以蛋白浓度为横坐标,光密度值为纵坐标绘制标准曲线。 3.将待测样品稀释至标准曲线浓度范围内,同时按上述方法测A500,根据标准曲线读出蛋

检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术

一、检测蛋白质与蛋白质相互作用 ① FRET技术(in vivo) FRET,Fluorescence resonance energy transfer,即荧光共振能量转移技术。该技术的原理是用一种波长的光激发某种荧光蛋白后,它释放的荧光刚好又能激发另一种荧光蛋白,使其释放另一波长的荧光,如下图所示: 以下图为例,若要利用FRET检测两种蛋白是否有相互作用,需将两种蛋白的基因分别与这两种荧光蛋白的基因融合,并在细胞内表达出两种融合蛋白。然后只需用紫外光对CFP进行激发,并检测GFP是否放出绿色荧光。如果能检测到绿色荧光,那么可以说明这两种蛋白可能有相互作用;反之,则是这两种蛋白没有相互作用。 ②酵母双、三杂交技术(in vivo) 酵母双杂交系统主要用于考察两种蛋白是否有相互作用,其原理是典型的真核生长转录因子,如GAL4、GCN4等都含有二个不同的结构域,即AD和BD。这些转录因子只有同时具有这两个结构域时才能起始转录。由此,设计不同的两个载体,一个含有AD基因(假设为A载体),另一个含有BD基因(假设为B载体)。 一般将一个已知蛋白的基因连在B载体上,作为诱饵(Bait),将未知蛋白的基因连在A载体上,将这两个载体都转到特定的酵母细胞内,看未知蛋白与已知蛋白是否有相互作用。如果两者有相互作用,那么就可以启动报告基因的转录,从而使这个酵母细胞能在选择培养基上显现出来或者生存下来;如果两者无相互作用,那么报告基因就无法表达,那么这个酵母细胞就无法在择培养基上显现出来或者生存下来,如下图所示:

由于酵母双杂交系统不能鉴定膜蛋白间的相互作用,因此又发展出了分离泛素酵母双杂交系统。该系统的原理如下图所示: 如图所示,将泛素蛋白拆分为两个片段,即C端段(Cub)和N端段(NubG),并在C端段的N端接上一个LexA-VP16转录因子,此时它并不能激活基因转录(因为它被限制在了C端段上,不能进入细胞核发挥作用)。 将该C端段连到一个膜蛋白上,将N端段连接到另一个膜蛋白上。若两个膜蛋白有相互作用,那么两个膜蛋白在相互靠近时会使泛素蛋白的N端段和C端段靠近结合,形成一个完整的泛素蛋白。此时泛素蛋白酶体会将这一段被泛素标记的片段降解,那么连接C端段的LexA-VP16转录因子掉落,即可进入细胞核启动标记基因的表达。 酵母三杂交的原理与双杂交一样,只是它研究的是两个蛋白和第三个成分间的相互作用,通过第三个成分使两个蛋白相互靠近。第三个成分可以是:蛋白、RNA或小分子,如下图所示: 如上图所示,在加入第三种成分前,蛋白X与蛋白Y之间并无直接相互作用,因此无法使BD和AD靠近,报告基因不能表达;当加入第三种成分后,蛋白X与蛋白Y的距离被拉近,BD和AD靠近,报告基因表达,从而可以被检测到。 ③ Pulldown技术(in vitro) Pulldown,即蛋白沉降技术,它是建立在蛋白质亲和层析的基础上的一种检测蛋白质间相互作用的分析方法。亲和层析的原理如下图所示,不同蛋白对配体的亲和程度不同,因此可以先将非特异结合的蛋白用低浓度缓冲液给清洗出去,只剩目的蛋白与层析柱结合,然后再用洗脱液将目的蛋白洗脱下来,达到纯化目的蛋白的作用。

蛋白印迹实验报告

蛋白印迹实验报告 篇一:实验十二Western印迹鉴定目标蛋白 实验十二Western印迹鉴定目标蛋白 实验目的 1.了解Western blot的原理及其意义,掌握Western blot的操作方法; 2.应用Western blot 技术分析鉴定经SDS-PAGE分离后转移到尼龙膜上的重组蛋白。 实验原理 Western印迹法简称蛋白质印迹法。蛋白质样品经SDS-PAGE电泳后,凝胶所含的样品蛋白质区带通过电泳方法转移、固定到载体(如尼龙膜、硝酸纤维素膜)上,固相载体以非共价键的形式与蛋白质结合,从而固定住蛋白质;以膜上的蛋白或多肽为抗原,与相应的第一抗体起免疫反应,再和酶标记或同位

素标记的第二抗体反应,用适当的溶液漂洗去未结合抗体后,置含底物的溶液中温育,或通过放射自显影显出谱带,即可检测出样品中的特异蛋白组分。 试剂与器材 试剂 1.转移缓冲液:甘氨酸(39 mmol/L),Tris 碱(48mmol/L),SDS (%),200ml 甲醇(20%),定容至1,000mL; 2.封闭液:5% 脱脂奶粉,% 叠氮钠,溶于PBST溶液中; 3.丽春红S(Ponceaus)染液:丽春红S溶于1mL 冰乙酸中,加水至100mL; 洗膜液:PBS 缓冲液含% Tween 20; 5.DAB浓缩显色液(50X):DAB (二氨基联苯胺)是根过氧化物酶的底物之一,临用前稀释。 6.5 x PBS:在1600mL蒸馏水中溶解Na 2HPO4 , Na H2PO4, 40g Na Cl,

用/L NaOH调pH至,加水定容至2升。高压灭菌20 分钟,室温保存。用前稀释至1x 。 7.SDS-PAGE电泳用溶液和试剂。 器材 电泳装置一套; 2.电转移膜装置 3.抗体-酶反应摇床 操作方法 〈一〉电转移 1.将蛋白质样品进行SDS-PAGE,待溴酚蓝跑出胶后停止电泳(1)。 2.载手套切6-8张定性滤纸和一张尼龙膜,它们的大小应与凝胶的大小相同。在尼龙膜的一(左)角作一记号(或剪角),与滤纸和海棉(纤维)垫浸泡于转移缓冲液中。 3.剥胶,并将凝胶裁成合适大小,切角以做记号(2)。 4.按下图示制备“夹心饼”,打开电极板,在一边放上一块纤维垫,再依次往上叠加3-4张滤纸,将凝胶轻放于滤

蛋白酶的盐析沉淀实验报告

蛋白酶的盐析沉淀实验报告 班级:生工1005 学号:020******* 姓名:朱同辉 实验目的: 1.掌握使蛋白质胶体溶液保持稳定的因素; 2.了解蛋白质沉淀的几种方法及其意义; 3.掌握测定蛋白酶活力的原理和方法; 4.学习酶活力的计算方法。 实验原理: 盐析法 在蛋白质溶液中加入少量中性盐,蛋白质溶解度增加,称为盐溶;而加入大量中性盐达一定浓度,蛋白质就会沉淀,称为盐析。 原理 : ①大量盐加入后,能与蛋白质争夺水分子,去除水膜; ②大量盐能中和蛋白质分子表面电荷,使分子间静电斥力减弱,疏水作用增强,使蛋白质沉淀。 盐析效果: 二价离子 > 一价离子 离子半径小 > 离子半径大 阳离子∶Mg2+>Ca2+>Ba2+>NH4+>Na+>K+>Pb+>Cs+ 阴离子∶PO43->SO42->Cl->Br->NO3->I->SCN- 蛋白质的溶解度与盐离子强度间的关系可以用Cohn 经验式来表示: 式中:S —蛋白质的溶解度 I —离子强度 β—常数,与温度和pH 有关 Ks —盐析常数,与蛋白质和盐的种类有关 其中I 根据下式计算: 式中:ci —i 离子的浓度(mol/L ) zi —i 离子所带的电荷 蛋白酶活力的测定 福林(Folin )试剂在碱性条件下可被酪氨酸还原成兰色化合物,蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸,将产物中未被水解的酪蛋白除去后与福林试剂作用,根据显兰色的深浅可以计算出酪氨酸的产生量,从而推断酶活力的大小。 蛋白酶液的稀释、酶活测定和计算 K —在酪氨酸标准曲线上O.D 值为l 时酪氨酸的微克数(μg ),K 值为 108.53 680 D .O N K 10 4 ???=酶活力I K S log s -β=2 i i z c 2 1I ∑=

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