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二次回归正交旋转组合设计优化单细胞蛋白饲料的研究

二次回归正交旋转组合设计

优化单细胞蛋白饲料的研究

张秋华

张亚丽

优化酵母菌发酵杂粕培养基的3个因素配比。应用DPS 统计分析软件中的三元二次正

交旋转组合设计方案进行试验设计,并分析各因素对Y 值的效应关系。对二次多项回归方程寻优,在30℃,接种量8.64%,发酵时间31.1h 时.发酵效价最高。二次正交旋转组合设计可用于发酵培养基组分的优化和分析。

关键词

酵母菌;单细胞蛋白;二次正交旋转组合设计

中图分类号

S816.32

Optimization of single cell protein by quadratic orthogonal rotation combination design Zhang Qiuhua,Zhang Min,Zhang Yali

Abstract Objective the formula of there ingredients of fermentation medium for yeast from swine ori -gin.Methods design the test by using the quadratic orthogonal rotation combination design in DPS soft -ware.Analyze the effect of various factors on response value.Results the optimization of quadratic re -gression equation was in 30℃,inoculum was 8.64%and the fermentation time was 31.1h.Conclusion quadratic orthogonal rotation combination design was suitable for the optimization of ingredients of fer -mentation medium.

Key words yeast ;single cell protein ;quadratic orthogonal rotation combination design

张秋华,延边大学农学院动物科学系,133400,吉林延边。张敏(通讯作者)、张亚丽,单位及通讯地址同第一作者。收稿日期:2009-06-01

随着动物营养研究的日益发展,人类对蛋白质尤其是营养价值高的可饲用蛋白源的需求愈来愈多。单细胞蛋白(SCP)是利用生物技术通过微生物培养而获得的菌体蛋白,是一类理想的蛋白质饲料,它主要包括一些微生物和藻类,蛋白质含量相当高[1]。单细胞蛋白饲料中含有动物生长发育所需要的部分营养物质,能够促进动物的新陈代谢,促进家畜对饲料营养成分的消化吸收。酵母菌是当前生产单细胞蛋白的微生物类群中,最受关注最为广泛应用的一类。酵母菌蛋白含量高达60%,几乎含所有的必需氨基酸,而且维生素含量也比较丰富。

单细胞蛋白饲料营养物质丰富,菌体中蛋白质含量高达40%~80%,其中氨基酸组分齐全,赖氨酸等必需氨基酸含量较高,同时富含维生素,可作为维生素的替代品,同时生产原料广泛,各种农作物的秸秆、秕壳、糠麸,农副产品加工的下脚料,某些植物树叶,以及石油泥炭等矿物质,都可用于生产单细胞蛋白饲

料,其生产具有不受气候条件的限制,可连续进行的特点,适合于大规模产业化生产[2]。目前利用非食用资源和废弃资源开发和推广微生物生产单细胞蛋白饲料已成为补充饲料蛋白来源不足的重要途径。

1试验材料与方法1.1

杂粕发酵料的制备

杂粕(豆粕、玉米脐子粕、菜籽粕、棉籽粕):市售

按玉米面5%、豆粕20%、玉米脐子皮15%、菜粕10%、棉粕40%的比例均匀混合高压灭菌后备用。

1.2酵母菌种的制备

取一定量的安琪高活性干酵母粉制成悬液,稀释

后涂单菌落平板,并将其单菌落挑至斜面上培养,保存在PDA 培养基上。

1.3液体菌种酵母液的制备

无菌条件下,将PDA 斜面培养基上挑取一环酵

母菌体,接入装有YPD 液体培养基的锥形瓶中,在恒温摇床30℃振荡培养24h 左右,转速130r/min ,制得酵母悬液含孢量为2.4×108~2.6×108个/ml 。

1.4

培养方法

以杂粕为主要发酵基质,将高压灭菌后的发酵料

添加适量的氮源和水,接种酵母菌于一定温度发酵培养,发酵一定时间后干燥、粉碎、保存待测。

1.5分析方法

单细胞蛋白(真蛋白)的测定[3]:称取发酵后干物质

1g 左右(精确至0.0001g),置于250ml 烧杯中,加蒸

馏水50ml 煮沸,依次加入10%CuSO 4水溶液20ml 和25%NaOH 溶液20ml ,搅拌后静置过夜,沉淀物以中速定量滤纸倾斜过滤,用70℃以上热水反复洗涤,直至滤液无沉淀(取10g/l BaCl 2试液5滴和2mol/l

HCl 溶液1滴并在黑色背景下观察无白色沉淀为止)。

将滤纸及沉淀物在烘箱65~70℃下干燥2h 后全部移入凯氏烧瓶中,按微量凯氏定氮法[4]测定其蛋白含量。

2试验设计2.1

单因素试验

通过单因素试验分别对温度、时间、料水比、氮

源、接种量五因素进行固态发酵,以杂粕发酵后真蛋

白含量作为评价指标,结果如图1~图5。

真蛋白增长率(%)

时间24h ,料水比1:1.2,氮源2,接种量6%

6050

4030

2010

020

304050

温度(℃)

图1

温度对发酵效果的影响

温度30℃,料水比1:1.2,氮源2,接种量6%

真蛋白增长率(%)

4846

444240383612

24

48

60

时间(h )

图2

时间对发酵效果的影响

温度30℃,时间24h ,氮源2,接种量6%

真蛋白增长率(%)

6050

4030

201001:

1

1:1.21:1.41:1.6

图3

料水比对发酵效果的影响

温度30℃,时间24h ,料水比

1:1.2,接种量6%

真蛋白增长率(%)

60

5040302010

01

234

注:氮源比例[5]为1(尿素0.5%+硫酸铵1%);2(尿素1%+硫酸铵

1.5%);3(尿素1.5%+硫酸铵2%);4(尿素2%+硫酸铵

2.5%)。

图4

氮源对发酵效果的影响

温度30℃,时间24h ,料水比

1:1.2,氮源2

真蛋白增长率(%)

60

504030201004

6

8

10

接种量(%)

图5

接种量对发酵效果的影响

根据各因素对杂粕发酵后真蛋白含量的影响可知,选择交适宜的条件范围如下:温度20~40℃;发酵时间12~48h;料水比1:1.4;氮源添加量(尿素1.5%+硫酸铵2%);接种量5%~10%。并根据其他学者试验设计结果以及本试验所确定的各因素有效范围,对影响酵母菌增殖的主要因素(温度、接种量、发酵时间)进行优化。

2.2二次回归正交旋转组合试验

采用二次正交旋转组合设计[6],3个关键因素温度、接种量、发酵时间。首先,选择3因素的上下限值(Z 1j ,

Z 2j )。计算各影响因素的零水平(Z 0j )和变化间隔△j 并

根据公式:

Z 0j =(Z 1j +Z 2j )/2△j =(Z 1j -Z 2j )/γ

编制因素水平编码表,如表2所示。

表1

发酵条件优化各因素水平与变化间隔表

因子水平设计(r=1.682)

(-r)205.7612(-1)24.16.9116.87(0)308.6424(+1)35.910.3731.1(+r)4011.5236

温度(℃)(X 1)

接种量(%)(X 2)发酵时间(h)(X 3)

项目

5.951.27.13

间距

表2

三因素二次正交旋转组合设计试验方案及结果

试验号

1234567891011121314151617181920212223

X 11111-1-1-1-1-1.68181.68180000000000000

X 211-1-111-1-100-1.68181.681800000000000

Y(%)50.8345.2349.8342.1345.2338.5342.4325.8326.8346.6338.2348.8339.2355.3355.1352.5552.8353.5954.2353.4254.2554.4054.41

X 31-11-11-11-10000-1.68181.6818000000000

表3

二次多项模型及其各项的方差分析表

变异来源X 1X 2X 3X 1^2X 2^2X 3^2X 1X 2X 1X 3X 2X 3回归剩余失拟误差总和

平方和351.6491102.5698296.9017556.4948196.190276.070816.24512.5181617.65822.77317.2345.5391640.431

自由度

1111111119135822

p 值

0000000.00940.01920.006900.0091偏相关

0.96910.90460.9637-0.9801-0.9466-0.8773-0.6452-0.5953-0.6644均方

351.6491102.5698296.9017556.4948196.190276.070816.24512.518179.73981.75183.44680.6924F 值200.739458.5521169.4868317.6759111.995543.42519.27357.135610.2753F2=102.60474F1=4.978282.3模型的建立与检验利用DPS 数据处理系统对试验结果进行分析得到温度(X 1)、接种量(X 2)、发酵时间(X 3)与单细胞蛋白饲料产量(Y )的数学模型回归方程为:

Y =53.85312+5.07434X 1+2.74053X 2+4.66263X 3-5.91803X 12-3.51387X 22-2.18804X 32-1.425X 1X 2-1.25X 1X 3-1.5X 2X 3

在显著水平为0.1的条件下,通过方差分析求出单细胞蛋白饲料产量拟合的模型F 失拟=4.97828<F 0.01(5,8)=6.63,表明未知因素对试验结果影响很小,可以忽略;F 回归=102.60474>F 0.01(9,13)=4.19,达到极显著

水平,说明模型成立。预测值和实际吻合较好,故以此模型进行预报具有较高的可行性。

2.4优化分析

通过DPS 软件中的数据优化程序求得当Y 值为

Max 时,三个因素的水平取在端点(0、0、1),即温度30℃,

接种量8.64%,发酵时间31.1h 。此时,预测的单细胞蛋白含量最大Y Max 为56.33%。

2.5因子互作效应分析

产量(%)

图6X 1与X 2交互作用对杂粕真蛋白含量的影响

产量(%)

图7X 1与X 3交互作用对杂粕真白含量的影响

产量(%)

图8X 2与X 3交互作用对杂粕真蛋白含量的影响

由各因素间交互效应曲线可知,发酵后单细胞蛋白含量都随着各影响因素增加值的变化而变化[7],表现为温度和接种量、温度和发酵时间、接种量和发酵时间的交互作用曲面为“马鞍型[8]”,其三因素对杂粕真蛋白含量影响的交互作用是相似的。温度、接种量、发酵时间对菌体蛋白含量的影响效应均呈开口向下的抛物线,当各因素超过0水平时,各交互作用均转变为负值[9],温度、接种量、发酵时间3因素中,某一因素均以其它二因素代码值为0水平时,单细胞蛋白含量最高。由图6可知,当发酵温度一定时,随着接种量的增加,单细胞蛋白含量开始有小幅度的上升达到极值后又开始下降,这可能是由于酵母菌反应速率逐渐加快,蛋白质转化率明显上升,随着温度继续升高酶蛋白变性失活,导致蛋白转化率下降所致[10]。由图7可知,当温度处于较高水平时,随着发酵时间的递增,单细胞蛋白含量呈直线上升的趋势后又逐渐下降,其原因可能是酵母菌的呼吸作用消耗了部分有机物出现了蛋白的“浓缩效应”[11],使杂粕中的营养物质慢慢被耗竭。由图8可以看出,当发酵时间较长时,接种量较低时,单细胞蛋白含量较低。这可能是因为发酵周期过短,菌体不能充分增殖导致产物中真蛋白含量过低。而当反应时间过长时,曲线表现为开始平缓,过最大值后又小幅度下降,这可能是因为发酵前期酵母菌大量增殖致使发酵后期营养供应不足[12],酵母菌活动旺盛而使其逐渐产生自体溶解现象,使菌体蛋白含量下降。

2.6预测值检验

以优化得到的发酵条件进行3次重复发酵验证试验,测得Y Max分别为56.47%、56.58%和57.1%,平均值为56.72%,试验值与模型的理论值相差0.39%,与预测值(56.33%)基本符合。

3结论

二次正交旋转组合设计与传统的单因子试验和正交试验法相比,基本保留了回归正交设计试验次数少、计算简便以及部分消除回归系数之间的相关性等特点,能根据测值直接寻求最优区域,可以从多角度对模型进行模拟分析[13]。本试验以农产品加工的蛋白废料为基质,采用微生物对其进行固态发酵,将杂粕中的营养物质生物转化为微生物菌体蛋白[14],由于其成本低、对饲料中营养成分破坏影响程度小并能提高其真蛋白含量,在一定程度上改善杂粕的适口性和消化率,从而生产出能够被动物提吸收利用的单细胞蛋白饲料。通过二次正交旋转组合设计建立二次回归模型,对其发酵工艺条件进行优化与验证检验。可知,在30℃、接种量8.64%、发酵时间31.1h时,获得最高菌体蛋白含量为56.72%,较发酵前真蛋白含量提高了17.78%。可见该模型可较好地反映出发酵杂粕的条件,利用酵母菌发酵杂粕生产单细胞蛋白饲料不但提高了其蛋白营养品质而且也提高了饲料的利用价值,一经研制成功,将是一种无残留、无毒副作用、安全无污染、清洁环保的新型绿色生物单细胞蛋白饲料。

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(编辑:张学智,mengzai007@https://www.sodocs.net/doc/ee8565804.html,)

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