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高渗处理对根癌农杆菌介导转化平菇菌丝体的影响

高渗处理对根癌农杆菌介导转化平菇菌丝体的影响
高渗处理对根癌农杆菌介导转化平菇菌丝体的影响

食用菌学报2010.17(1):6~9

收稿日期:2010202205原稿;2010202228修改稿

基金项目:山东省科技发展计划项目(编号:2008G G1*******)、国家高技术研究发展计划(863计划)(编号:

2006AA10A211)的部分研究内容

作者简介:任 艳(1973-),女,1999年毕业于山东大学临床医疗专业,学士学位,助理研究员,主要从事微生物遗

传改造及应用研究,发表主笔论文5篇。

3

本文通讯作者 E 2m ail :ya nght @https://www.sodocs.net/doc/e5333000.html,

文章编号:100529873(2010)0120006204

高渗处理对根癌农杆菌介导转化平菇菌丝体的影响

任 艳,黄玉杰,张新建,杨合同3

(山东省科学院生物研究所,山东省应用微生物重点实验室,山东济南 250014)

摘 要:采用根癌农杆菌(Agrobacteri um t umef aciens ,EHA105菌株)介导法,对平菇(Pleurot us ostreat us )菌丝体遗传转化的最佳试验条件进行研究,结果表明:当平菇菌丝体与甘露醇和山梨醇的混合液预处理20min ,且与农杆菌共培养60min 时,转化效率高且用时较少。经PC R 和Sout her n Blotting 检测表明,转移DNA

(t ra nsf erred DNA ,T 2DNA )中的潮霉素抗性基因hp h 已整合到转化子基因组中。

关键词:平菇;根癌农杆菌;hp h 基因;高渗;共培养

平菇(Pleurot us ost reat us )作为一种食用真菌,在我国得到广泛栽培,但是由于平菇品种长

期无性繁殖致使菌种退化、产量降低,而传统的育种技术存在着周期长、见效慢、不稳定等问题,因此迫切需要探索更高效、稳定的育种方法。基因工程技术的发展为菌种选育开辟了一条新途径,1998年,DE GROO T 等首先把农杆菌介导法应用于真菌的遗传转化,以真菌的分生孢子和菌丝为受体,成功地将T 2DNA 转入泡盛曲霉(A s pergill us aw amori )、哈茨木霉(T richoderm a harz i am um )、粗糙脉胞菌(N euros pora crassa )和双孢菇(A g aricus

bis porus )中[1]

;CH EN 等利用改进的农杆菌介导法对双孢菇子实体进行转化并获得成功[2];2001年,T HOMAS 等同样用农杆菌转化了双孢菇的菌丝体和担孢子萌发菌丝,获得了稳定的转化子[3];但上述方法中转化效率相对较低,获得的转化子大部分不稳定。在传统的基因枪遗传转化方法中,许多植物及外植体在轰击转化前经渗透处理都有助于提高转化效率[427],因此,山东省应用微生物重点实验室通过对平菇菌丝体进行高渗处理以及与农杆菌共培养时间等条件的探索,筛选出平菇菌丝体转化的最佳条件。

1 材料和方法

1.1供试菌株与质粒 平菇(Pleurot us ost reat us )菌株L Z -2由山

东省农业科学院万鲁长老师赠送;根癌农杆菌(A g robacteri um t umef aciens )EHA105菌株由中国农业大学张力群老师惠赠;含有潮霉素抗性基因h p h 的质粒pCAMB IA1302由山东省应用微生物重点实验室保存。1.2培养基

PDA 培养基(/L ):马铃薯200g ,葡萄糖15g ,琼脂15g 。

PDA 选择培养基(/L ):PDA 培养基中加入不同浓度的潮霉素(Sigma 公司)。

LB 液体培养基(/L ):胰蛋白胨10g ,NaCl 10g ,酵母提取物5g ,p H 7.0~7.5。

LB 固体培养基(/L ):LB 液体培养基中加入15g 琼脂。

LB 诱导培养基(/L ):LB 液体培养基中加入

乙酰丁香酮(AS ,溶于二甲基亚砜中,工作浓度为200μmol/L )。

共培养诱导培养基(/L ):葡萄糖5g ;K 2

H PO 40.5g ;MgSO 4?7H 2O 0.2g ;Ca Cl 20.2g ;

谷氨酸0.05g ;Na Cl 0.02g ;ED TA 铁钠盐

第1期任 艳,等:高渗处理对根癌农杆菌介导转化平菇菌丝体的影响

0.066g;Na2M oO4 0.002g;琼脂20g;p H7.2~7.4。使用前加入溶于二甲基亚砜的AS,工作浓度为200μmol/L。

1.3潮霉素适宜筛选浓度的确定

将平菇菌株在PDA平板上25℃培养5d进行活化,然后分别接种于含有50、60、70、80、90、100、200μg/mL潮霉素的PDA平板,以不含潮霉素的PDA平板为对照,置于28℃恒温培养箱培养,每天观察菌丝生长情况,以筛选PDA中添加潮霉素的适宜浓度。

1.4根癌农杆菌介导的遗传转化

1.4.1农杆菌的活化与诱导

通过冻融法将质粒pCAMBIA1302转化到农杆菌EHA105中[8],将菌液涂于LB平板上(含有100μg/mL卡那霉素),28℃倒置培养, 2d后挑取农杆菌单菌落,接种于5mL LB液体培养基中,200r/min、28℃过夜培养。次日,按1%的接种量将过夜培养的菌液接种到新鲜的LB诱导培养基中,28℃培养5~6h至OD600达到0.5~0.6。

1.4.2高渗处理菌丝材料

按常规方法将平菇接种于PD A平板,25℃培养5d,选择菌落边缘生长均匀的菌丝,用打孔器选取直径约0.5cm的菌块,为改变细胞内外渗透压,每150片菌块浸泡于300mL的0.1mol/L甘露醇和0.2mol/L山梨醇等体积混合液中。将与混合液的作用时间设20、40、60min3个处理。处理完毕后将菌丝体表面的水分用无菌滤纸充分吸干。

1.4.3与农杆菌共培养时间筛选

取1.4.1处理后的含有p CA MB IA1302质粒的E HA105菌液10mL,分别与1.4.2中不同时间处理的菌块充分混合,28℃、150r/mi n进行共培养,时间设20、40、60mi n3个处理,每处理设3次重复。

1.4.4转化子的筛选

将经过共培养的菌块接种于共培养诱导培养基上,28℃培养2d,然后向其中倒入一层约15mL的PD A选择培养基,28℃继续培养,每天观察菌丝生长情况,及时挑取新生菌丝(为避免重复,每个平菇菌块挑取一次),并再次转接到PD A选择培养基平板上,连续培养7d,正常生长的平菇菌丝体为转化子,统计各处理组转化子数量。用S PSS统计软件进行数据分析。1.4.5转化子的稳定性检测

转化子在普通PD A平板上连续转接15代后再接入到PD A选择培养基平板上,观察菌丝生长状况,与普通PD A平板上菌丝生长一致的是可稳定遗传的转化子。

1.4.6转化子的分子检测

1.4.6.1PC R鉴定

按文献[9,10]的方法提取3个抗性稳定的转化子总D N A,以其为模板,以H P H2F:5’CC G G T T TCCA C TA TC G GC GA3’H P H2R:5’CAA A GCC T GA A C TCA CC GC3’为引物(由上海生工生物工程有限公司合成)扩增T2D N A 中潮霉素抗性基因hp h,以非转化子为阴性对照,以质粒p CA MB IA1302为阳性对照。PC R 反应体系为:25μL反应体系中加1.0μL

D NA,2.5μL10×PC R缓冲液,2.0μL

2.5m mol/L dN TP,0.2μL0.5m mol/L Ta q

D NA聚合酶,10μmol/L引物各1.5μL,

16.3μL dd H2O。

PC R反应条件为:94℃预变性4mi n;94℃变性1mi n,58℃复性1mi n,72℃延伸2min, 35个循环;72℃延伸10mi n。PC R产物采用0.8%琼脂糖进行凝胶电泳检测,凝胶成像系统照相。

1.4.6.2Sout her n blotti ng分子杂交

选择3个平菇转化子进行Sout her n blotting 分子杂交检测。

潮霉素抗性基因hp h的制备:以p CA MB IA1302质粒为模板,H P H2F和H P H2R 作为引物,扩增潮霉素抗性基因hp h,然后回收纯化PC R产物用以制备探针。

突变体基因组D NA酶切电泳:以限制性内切酶Eco R I酶解质粒p CA MB IA1302为阳性对照,以原始菌株为阴性对照,利用Eco R I酶切平菇转化子和非转化子的总基因组D NA,酶解产物用0.8%琼脂糖在20V电压下电泳过夜。

D NA从凝胶中转移至尼龙膜的步骤根据文献

[11]的方法进行。hp h基因片段探针标记,膜的预杂交、杂交、洗膜、显色等步骤均按Bioti n DecaL a bel D N A L a beling Kit(Fe r me ntas公司)说明书进行。

2 结果与分析

2.1潮霉素适宜筛选浓度的确定

7

食 用 菌 学 报第17卷

检测结果表明,潮霉素对平菇菌丝体的生长速度有较大影响,当浓度为30μg/mL时,菌丝生长缓慢;当浓度为50、70μg/mL时,菌丝生长受到抑制;当浓度为100、200μg/mL时,菌丝停止生长。为了降低转化子的假阳性率,在平菇转化实验中,选取200μg/mL潮霉素作为PD A选择培养基的筛选浓度。

2.2高渗处理和共培养时间对转化子数目的影响

高渗处理平菇菌丝体时间和菌丝体与农杆菌共培养时间对转化子数量有不同程度的影响,结果见表1。

9个处理中,1、2菌丝体与农杆菌的共培养时间少于60min,农杆菌未能与菌丝体进行充分有效的结合,转化子数量较少;4、5中,由于菌丝体预处理时间较长,虽然与农杆菌作用时间不足60min,但在渗透压作用下转化子数量较多;7、8、9由于菌丝体处理时间过长,导致细胞发生不可恢复性死亡,转化子数量最少。3与6得到的转化子数量最多,两者之间无差异,但是3的总用时80min比试验6的100min短,所以3为最佳转化条件。

表1 高渗处理和共培养时间对转化子数目的影响

T able1 E ffect of different hyper2osmosis and co2cultivation treatments on transform ant production

编号Sa mple 高渗处理菌丝体时间

Hyp er2osmosis t reat me nt

period(min)

与农杆菌共培养时间

Co2cultivation p eriod wit h

A.t umef aciens(min)

转化子数

N o.of t ra nsf or mants

12020 3.33±0.33bc AB

22040 3.33±0.88bc AB

320607.00±0.58d C

44020 4.33±0.88c B

54040 4.33±0.33c B

640607.67±0.33d C

76020 1.33±0.33a A

86040 1.67±0.33ab A

96060 2.00±0.58ab AB

数据为3次实验平均值±SD;大小写英文字母表示P<0.01或P<0.05的差异显著性

Values shown rep resent t he mea ns of t hree replicates±SD;Diff erent lower and higher case letters rep resent significant diff erences at P0.05a nd P0.01,respectively.

2.3转化子的稳定性

随机选取的10个转化子经15次传代后其菌丝生长状况与在PDA平板上菌丝生长一致,因此这些转化子都是可稳定遗传的。

2.4对转化子的分子学鉴定

2.4.1PCR鉴定结果

平菇转化子基因组DNA中潮霉素抗性基因h p h的PCR检测结果见图1,从10个稳定遗传的转化子中选取的3个转化子,均可以扩增出大小约为1.2kb的片段(第2~4泳道),而以未转化的原始菌株DNA为模板扩增,没有条带出现(第1泳道),初步证明h p h基因插入到转化子染色体基因组内。

2.4.2Sout hern blotting分子杂交检测

平菇转化子的Sout hern杂交结果见图2,3个转化子样品中均产生了杂交带(第3~5泳道),而阴性对照(非转化子)未产生任何杂交信号(第1泳道),阳性对照质粒产生了与h p h探针杂交信号带(第2泳道),这证明了h p h基因已整合到转化子基因组中

泳道M:分子量标记;泳道1:阴性对照(非转化子);泳道2~4:平菇转化子;泳道5:阳性对照(质粒)

Lane M:markers;lane1:negative cont rol(non2transformant); lane2~4:P.ost reat us transformant s;5:positive control (plasmid)

图1 平菇转化子基因组DNA中潮霉素抗性

基因PCR检测结果

Fig.1 PCR detection of a hygromycin2resistance gene in

P.ost reatus transform ants

8

第1期任 艳,等:

高渗处理对根癌农杆菌介导转化平菇菌丝体的影响

图2 平菇转化子的Southern 杂交

Fig.2 Southern blotting of P.ost reatus transform ant

3 结论与讨论

本试验研究结果表明,当平菇菌丝体高渗处理20min 、与农杆菌共培养60min 时,转化效率高且用时较少,为根癌农杆菌介导转化平菇菌丝体的最佳转化条件。本研究中平菇菌丝体的高渗处理和与农杆菌共培养是关键步骤,这可能是由于高渗处理后细胞内外形成压力差,细胞发生质壁分离,液泡变小,此时再与充分诱导的农杆菌混合,能有效的促使农杆菌吸附在细胞表面,并借助此压差更易转入到平菇菌丝细胞内,从而提高转化效率。

以后工作中我们将对不同渗透剂进行浓度梯度处理,改变溶液渗透压,研究压差与转化结果的关系。

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[本文编辑] 王瑞霞

9

A C TA ED UL IS FU N

GI 2010.17(1):10~13

R eceived :Feb.5,2010; Accepted :Feb.28,2010

Sp onsored by t he Foundation of Sha ndong Province Technology Develop me nt Project (N o.2008GG10002025)a nd t he Foundation of National High T echnology Research and Develop me nt Program (863Progra m )(N o.2006AA10A211)

3

Corresponding author.T el :+862531282605386 E 2m ail :ya nght @https://www.sodocs.net/doc/e5333000.html,

Ef f ect of Hyp e r 2os m osis a nd Co 2cultivation Treat me nts on Agrobacterium t umefaciens 2Mediated Transf ormation

of Pleurot us ost reat us

R EN Ya n ,HU AN G Yujie ,Z HA N G Xi njia n ,YA N G Het ong

3

(Shandong Key L aborat ory of Applied Microbiology ;Institute of Biology ,Sha ndong Academy

of Scie nces ,J ina n ,Sha ndong 250014,China )

Abstract :Agrobacteri um t umefaciens 2mediated t ra nsf or mation of Pleurot us ostreat us was op timal w he n f ungal mycelia were exp osed t o hyper 2osmosis t reat me nt in a mannit ol 2sorbit ol solution a nd co 2cultivation wit h A.t umef aciens f or 20min and 60min ,resp ectively.PC R and Sout her n blotting confir med t hat t he hygromycin resista nce gene (hp h )had bee n integrated int o t he ge nomes of P.ostreat us t ra nsf or mants.

K ey w ords :Pleurot us ostreat us ;Agrobacteri um t umefaciens ;hp h ge ne ;hyp er 2osmosis ;co 2cultivation

Pleurot us ost reat us is a cultivated edible

mus hroom t hat

is

p op ula r

i n

Chi na

a nd

elsew here.

However ,

long 2ter m

asexual rep roduction results in st rai n degra dation a nd subseque nt low mus hroom yields.

The re a re

nume rous draw backs associated wit h t he use of t ra ditional breedi ng tech niques t o develop new st rai ns ,i ncludi ng t he time required t o comp lete t he p rocedures a nd t he lac k of st rai n sta bilit y.Met hodology based

on

ge netic

e ngi neeri ng

off e rs a n alter native app roac h a nd ,i n 1998,

Agrobacteri u m

t u mef aciens 2mediated

t ra ns 2

f or mation (A TM T )was applie d t o f ungi.D E G ROO T et al rep orted t he successf ul t ra nsf e r of

T 2D N A

f rom

A.

t u mef aciens

i nt o

Aspergill us awa mori ,Trichoder ma harzia n u m ,Neurosp ora crassa a nd

Agaricus bisp or us

[1]

.

The t ra nsf er of T 2D NA int o A.bisp or us f ruit bodies usi ng imp roved A TM T met hodology was later rep orted by C H EN et al [2]

a nd ,in 2001,T HO MAS

et

al

[3]

obtai ned A.

bisp or us

t ra nsf or ma nts f ollowi ng T 2D NA t ra nsf er i nt o f ungal mycelium a nd hyp hae of ger mi nated

basidiosp ores.However ,t he t ra nsf or mation

rate was low a nd most of t he t ra nsf or ma nts were unsta ble.Since os motic t reat me nt has bee n

rep orted

t o e n ha nce

p a rticle

bomba rdme nt 2mediate d t ra nsf or mation of maize a nd

rice

pla nts

[4~7]

,we

have

now

i nvestigated t he eff ects of diff ere nt hyp er 2

os mosis t reat me nts a nd co 2cult ure conditions on A.t u mef aciens 2me diate d t ra nsf or mation of P.ost reat us.

1 Materials a nd Met hods

1.1Microbial strains and plasmid

P.ost reat us ,st rain L Z 22,was provided by Mr Wan L uchang ,Shando ng Academy of Agricult ural Sciences. A.t umef aciens ,strain EHA105,was provided by Mr Wan Zhang Liqun ,Agricult ural

University of

China.

Plasmid

pCAMB IA1302,

carrying t he hygromycin 2resistance gene

(h p h ),

was

obtained from t he Shandong Key Laboratory of

Applied Microbiology.1.2Culture medium

N o.1R EN Ya n,HU AN G Yujie,Z HAN G Xinjia n,et al

PDA medium co nsisted of(/L):200g potato,15g gluco se and20g agar,and was made selective by supplementatio n wit h different co ncent ratio ns of hygro mycin (Sigma).

LB brot h(/L):10g t ryp to ne,10g N aCl,5g yeast ext ract,p H7.0~7.5.

LB agar(/L):LB brot h supplemented wit h15g agar.

LB inductio n medium(/L):LB brot h co ntaining aceto syringo ne(A S),dissolved in DM SO,to a final co ncent ratio n of200μm ol/L.

C o2cultiva tio n i n ductio n m e diu m(/L): 5g gluc ose,;0.5g K2H PO4;0.2g M gSO4?7H2O;0.2g Ca Cl2;0.05g glut a m ic acid;

0.02g N a Cl;0.066g ED TA2Fe2N a;0. 002g N a2M oO4;20g a ga r;p H7.2~7.4. AS,diss olve d i n D M SO,w as a d de d t o a f i nal

c o nce nt ra tio n of200μm ol/L p rio r t o use.

1.3Optimization of hygromycin concentration for selection of transform ants

P.ost reat us was grown on PDA at25℃for5d and mycelium was t hen t ransferred to PDA plates containing different concent rations (50,60,70,80,90,100,200μg/mL)of hygromyci n a nd i ncubated at28℃.PD A plates wit hout hygromyci n se rved as cont rols. Mycelial growt h was deter mined at24h intervals.

1.4Agrobacterium2mediated transformation

1.4.1Activation and induction of

A.t umef aciens

Plasmid p CAMBIA1302was transferred to A.t umef aciens EHA105using t he f reeze2t haw met hod[8].

Aliquot s of bacterial suspensio n co ntaining t he plasmid were sp read o n to LB agar plates co ntaining100μg/mL k a na m yci n a n d i ncu ba te d a t28℃f o r2 d.I n dividual c olo nies of A.t u m ef acie ns w e re t he n t ra nsf e r re d t o5m L L B b r ot h a n d i ncuba te d ove r nigh t a t28℃w it h s h a kin g(200r/ m i n).A liquots(1%)of t h e result a n t bacte rial susp e nsio n w e re t ra nsf e r re d t o L B i n ductio n m e diu m a n d i ncuba te d a t28℃f o r 5~6h u ntil t he O D600reac he d0.5~0.6.

1.4.2Hyper2osmosis treatment of f ungal mycelium Aga r discs(150×0.5c m dia.)contai ning P.ost reat us mycelium grow n on PD A plates at 25℃f or5d were i m mersed i n300mL of a solution contai ni ng equal volumes of0.1mol/L ma nnit ol a nd0.2mol/L sor bit ol f or20,40a nd 60min.Eac h t reat me nt was ca r ried out i n t riplicate(see Ta ble1i n t he Chinese version). Af te r i m mersion,t he discs we re re moved a nd excess liquid re moved by blotting wit h ste rile

f ilter p ap er.

1.4.3Op ti mization of co2cultivation p e riod wit h A.t u mef aciens

Susp e nsions of A.t u mef aciens E HA105 (10mL)containi ng t he p CA MB IA1302plas mid were co2cult ured wit h mycelium t reated as describe d i n section1.4.2by i ncubati ng at 28℃wit h s ha ki ng(150r/mi n)f or20、40a nd 60min.Eac h t reat me nt was ca r ried out i n t riplicate(see Ta ble1i n t he Chinese version).

1.4.4Scree ni ng of t ra nsf or ma nts

P.ost reat us mycelium co2cultivated wit h A.t u mef aciens was grow n on co2cultivation i nduction medium a nd i ncubate d at28℃f or 2d.Plates were t he n covered wit h a laye r of PD A selective medium(15mL)a nd,f ollowing i ncubation at28℃,new f ungal colonies we re pic ke d off,t ra nsf er red t o PD A selective me dium a nd i ncubate d f or a f urt her7 d.The numbe r of t ra nsf or ma nts was recor ded f or eac h t reat me nt group.

Data were a nalyse d usi ng S PSS sof twa re.

1.4.5Dete r mi nation of t ra nsf or ma nt sta bilit y Tra nsf or ma nts were i noculated on t o PD A selective medium af te r15successive subcult ures on PD A,a nd sta ble t ra nsf or mation was conside red t o have ta ke n place w he n t he mycelial growt h vigor was si mila r on bot h selective a nd non2selective me dia.

1.4.6Molecular confirmation of transf ormation. 1.4.6.1PC R ide ntif ication

11

A C TA ED UL IS FU N GI V ol.17

Total D N A was ext racted f rom t h ree sta ble t ra nsf or ma nts as p reviously described[9,10]. The hygromycin resista nce ge ne(hp h)was a mp lif ie d usi ng p ri mers H P H2F(5’2 CC G G T T TCCA C TA TC G GC GA23’)a nd H P H2 R(5’2CAA A GCC T GAA C TCA CC GC23’) synt hesized by t he Sha nghai Bioe ngi neeri ng Tech nology a nd Service Comp a ny.Plas mid p CA MB IA1302a nd a non2t ra nsf or ma nt se rved as p ositive a nd negative cont rols,resp ectively. PC R a mplif ication was ca r rie d out i n25μL reaction mixt ures contai ni ng:1.0μL D NA, 2.5μL10×PC R buff er,2.0μL2.5m mol/L dN TP,0.2μL0.5m mol/L Taq D N A p olymerase,1.5μL p ri me rs H P H2F a nd H P H2 R(10μmol/L)a nd16.3μL dd H2O.

A mplif ication conditions we re:94℃f or1mi n, 35cycles of94℃f or1mi n,58℃f or1mi n a nd72℃f or2mi n;t he n a f i nal exte nsion at 72℃f or10mi n.A mplif ication p roducts were f ractionated by elect rop horesis on0.8%(w/v) aga rose gels,a nd t he a mp lif ication p atte r ns were dete r mi ned usi ng a n aut omatic gel imagi ng a nalyze r.

1.4.6.2Sout he r n blotti ng

Three t ra nsf or ma nts was selecte d f or Sout her n blotti ng.The hygromycin resista nce ge ne was a mplif ied wit h t he p CA MB IA1302 plas mid as t he te mp late,a nd H P H2F a nd H P H2 R as p ri me rs.PC R p roducts we re recovered a nd p urif ie d t o p rep a re t he p robe.

Ge nomic D N A digestion a nd elect rop horesis:ge nomic D NA of t ra nsf or ma nts a nd a non2t ra nsf or ma nt was digeste d using Eco R I a nd t he p roducts were subjected t o elect rop horesis(20V)ove r night.

D N A was t ra nsf e rred f rom t he gel t o a nylon me m bra ne as p reviously describe d[11].L a beli ng of t he hp h p robe,me m bra ne p re2 hybridization,hybridization,me mbra ne was hing a nd color disp lay were ca rrie d out wit h t he Bioti n DecaL a bel D N A L a beli ng Kit (Fer me ntas)accor di ng t o t he ma nuf acturer’s inst ructions.Plas mid p CA MB IA1302a nd a non2t ra nsf or ma nt served as p ositive a nd negative cont rols,resp ectively.

2 Results a nd a nalysis

2.1Optimization of hygromycin concentration for selection of transformants

Mycelial growt h of P.ost reat us was slow on PDA containing30μg/mL hygromycin. Mycelial growt h was f urt her i nhibited at conce nt ration of50a nd70μg/mL,a nd no growt h was recor de d at100μg/mL conce nt rations a nd a bove.I n or der t o reduce t he number of f alse p ositives,200μg/mL hygromyci n was routinely a dded t he PD A selective medium.

2.2E ffect of hyper2osmosis and co2cultivation treatments on transformant production

The effect of different hyper2o smo sis and co2cultivation t reat ment s on t ransformant p roduction is shown in Table1(see t he Chinese version).Relatively few t ransformant s were p roduced when f ungal mycelia were co2cultivated wit h A.t umef aciens for less t han60min and t he hyper2o smosis exposure time was only20 min(Samples1and2,Table1).(see t he Chinese version).However,when t he hyper2 osmo sis exposure time was increased to40min, a larger number of t ransformant s was obtained even when t he co2cultivation time was less t han 60mins(cf.samples1and2wit h samples4and 5as shown in Table1).(see t he Chinese version).Longer exposure to hyper2osmotic conditions resulted in cell deat h and t he least number of t ransformant s(Samples7~9,Table 1).(see t he Chinese version)The highest number of t ransformant s was recorded under conditions used for samples3and6alt hough t he time for t he combined t reat ment s was20min less in t he former case.

2.3Stability of transformants

Ten randomly selected t ransformant s exhibited similar mycelial growt h vigor on bot h PDA and PDA selective medium after15 successive subcult ures on PDA,indicating t hat

21

N o.1R EN Ya n,HU AN G Yujie,Z HAN G Xinjia n,et al

t hese t ransformant s were stable.

2.4Molecular conf irm ation of transformants

2.4.1PCR data

PCR amplification of DNA ext racted f rom t hree of t he ten stable t ransformant s generated a fragment~1.2kb in size(lanes2~4,Fig.1) (see t he Chinese version)t hat was not detected in a non2t ransformant cont rol(lane1Fig.1) (see t he Chinese version).

2.4.2Sout hern blotting

Sout hern blotting of P.ost reat us t ransformant s is shown in Fig.2(see t he Chinese versio n).No hybridization signals were obtained wit h t he h p h probe in t he case of wild2 type P.ost reat us(Lane1).However, hybridization signals were observed wit h t he t hree randomly selected t ransformant s(lanes3 to5)and t he p CAMB IA1302plasmid(po sitive cont rol)(Lane2)confirming t hat t he h p h gene had been integrated into t he genomes of t he t ransformant s.

3 Conclusion and discussion

Our data show t hat A g robacteri um2 mediated t ransformatio n of P.ost reat us was optimal when f ungal mycelia were expo sed to hyper2osmosis and co2cultivation times of20min and60min,respectively.Pressure differences between t he inside and out side of t he P. ost reat us hyp hae resulting from t he hyper2 o smo sis t reat ment may accelerate cell plasmolysis,increase adsorption of A. t umef aciens cells on to t he hyp hal surface,and facilitate t he t ransfer of genetic material to t he f ungus.Furt her st udies are required to determine t he relationship between t he strengt h of t he hyper2o smotic fluid and t ransformation efficiency.

R eferences

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31

根癌农杆菌介导的真菌转化

根癌农杆菌介导的真菌转化 以下是为大家整理的根癌农杆菌介导的真菌转化的相关范文,本文关键词为根癌,杆菌,介导,真菌,转化,根癌,杆菌,介导,真菌,转化,,您可以从右上方搜索框检索更多相关文章,如果您觉得有用,请继续关注我们并推荐给您的好友,您可以在综合文库中查看更多范文。 根癌农杆菌介导的真菌转化 (一)农杆菌电击感受态制备及电击转化A感受态的制备 1)将农杆菌菌液划线于Yeb平板(50μg/mlkana),28℃,36-48h。

2)挑单菌落至3mlYeb试管(50μg/mlkana)中,28℃,200rpm培养过夜。3)转1ml至50mlYeb中,28℃,200rpm培养至oD600=0.8。 4)于4℃,5000rpm,10min收集菌体。 5)用50mL10%的甘油(去离子水配置,湿热灭菌)洗沉淀3次(4℃,5000rpm,10min),洗涤时一定要把菌体悬浮均匀。 6)重悬于1ml10%甘油中(约1011个细胞/ml),可立即使用,或分装为每管50μl,液氮速冻后,-80℃保存备用。b电击转化 1)将1μl质粒加入到农杆菌感受态细胞中,混匀,转至无菌预冷的电击杯中。2)将电击杯放入电转化仪的电极之间,16kv/cm,5ms。 3)取出电击杯,迅速加入200-300μlYeb(不加抗生素),并将混合液转入ep管中。4)于28℃,220rpm,2-3h。 5)将50-100μl菌液涂布于Yeb平板(50μg/mlcar和50μg/mlkana)上,于28℃培养2-3天后,挑斑鉴定。 (二)农杆菌化学感受态制备及化学法转化https://www.sodocs.net/doc/e5333000.html,petentcells 1)Inoculateasinglecolonyto5mlLb2)growat28℃tologphage,shakingat250rp m 3)Inoculate2mlofthecultureto50mlLbmediumandgrowtooD600=0.5ca.8h ours4)chillonicefor10minutes 5)spindownthecellsbycentrifugationat3000g(8000rpm)for10minutesat4℃

农杆菌介导的遗传转化在水稻基因工程中的应用

中国稻米 专论与综述 2007年第3期 农杆菌介导的遗传转化在水稻基因工程中的应用 摘要:农杆菌作为一种天然的遗传转化系统,在水稻基因工程中倍受重视。本文概述了农杆菌介导转化水稻的原理、影响因素、遗传改良上的应用及存在的问题。 关键词:农杆菌转化系统;原理;影响因素;遗传改良 (1湖南农业大学生物安全科技学院,湖南长沙410128;2湖南农业大学水稻基因组学实验室,湖南长沙410128; 3 美国俄亥俄州立大学植物生理实验室,美国俄亥俄州43210) 潘素君 1,2 戴良英 1,2 刘雄伦 2 王国梁 2,3 收稿日期:2007-01-18 水稻是全世界最重要的粮食作物之一,其栽培面积和总产量仅次于小麦。水稻不仅作为食品支持26亿人的生命,还是禾谷类作物中开展分子生物学研究的“模式植物”。随着分子生物学和分子遗传理论的迅速发展,利用遗传工程手段,有目的地将外源基因或DNA 构建导入水稻基因组,通过外源基因的直接表达,或通过内源基因表达的调控,获得抗病、抗虫、抗逆、高产优质的优良品种已成为水稻育种的重要手段。农杆菌介导法因其简单易行、转化率高、可导入较为完整的基因、整合位点稳定、拷贝数低、外源基因表达比较稳定而在水稻的遗传转化中得到广泛应用。 1农杆菌介导的遗传转化原理 农杆菌转化系统是一种天然的基因转化系统,转化植物细胞的农杆菌有两类,即根癌农杆菌和发根农杆菌。根癌农杆菌所含质粒是T i 质粒,发根农杆菌所含质粒是Ri 质粒。在水稻转化中,常用的是T i 质粒。 T i 质粒上含有可转移DNA (T-DNA )区、结合区(C on )、 复制起始区(Ori )和毒性区(V ir )。其中与冠瘿瘤生成有关的是V ir 区和T-DNA 区。T-DNA 区左右边界各有 25b p 的重复序列,左边界缺失仍可致瘤,而右边界缺 失则不能致瘤。两个边界之间是生长素和细胞分裂素合成基因以及冠瘿碱合成基因。V ir 区为30b p ,V irA 、 V irB 、V irC 、V irD 、V irE 、V irG 、V irH 等七个操纵子24个基 因起共调控作用。当植物受到伤害时,将分泌一些酚类化合物,这些酚类化合物一方面通过染色体基因的介导促使农杆菌向植物受伤的部位移动并附着于植物细胞表面。另一方面V irA 作为受体蛋白接受酚类诱导物,自身磷酸化并激活V irG 蛋白,V irG 蛋白是一种 DNA 转录活化因子,被激活后可以特异性结合到其它V ir 基因启动子区上游的V ir 盒(V ir box )的序列,启动 这些基因的转录。 V irD1和V irD2共同作用,由T-DNA 右边界开始 向左边界切割产生一条T-DNA 链(T-链),T-链5′末端与V irD2结合,其余部分与V irE2结合,组成T-复合体。T-复合体被转移到农杆菌外,通过植物细胞壁上由V irB 蛋白组成的通道进入到植物细胞内。V irD2和V irE2上的核定位信号(N LS )被转运蛋白识别,经过主动运输过程通过核孔进入细胞核内,转入细胞核的 T-DNA 以单拷贝或多拷贝的形式整合到植物染色体 上。 2农杆菌介导转化水稻的影响因素 2.1 菌株和载体 选取合适的农杆菌菌株和高效的载体系统对转化 至关重要。目前,用于水稻转化的农杆菌菌株较为普遍的有A281、A656、LBA4404、EHA101、EHA105、AG L1。 H iei [1] 等用菌株LBA4404、EHA101与载体p IG 121Hm 、 p T OK 233做试验,发现在T sukinohikari 培养基中 LBA4404(p T OK 233)比LBA4404(p IG 121Hm )和EHA101(p IG 121Hm )介导转化效果要好,在K oshihikari 培养基 中LBA4404(p l G 121Hm )最有效,EHA101(p T OK 233)对水稻的转化频率最低。LBA4404(p T OK 233)对爪哇稻转化频率较高。比较LBA4404、EHA105、AG L1这三种农杆菌菌株对水稻愈伤组织的转化能力,EHA105的转化效果最好,LBA4404次之,AG L -1最差[2,3] 。李双成 [4] 将 EHA105和AG L1的菌液按体积2∶1混合用于共转化, 表明两者对转化具有协同作用。 2.2 转化受体 在外植体的选择上,Sm ith 和H ood [5]认为,用农杆 菌转化单子叶植物,应选择处于适宜生理状态的那些组织,其特点是:能够产生vir 基因活化分子;内源激素 ?10?

农杆菌的活化培养及介导的遗传转化

农杆菌的活化培养及介导的遗传转化 一、目的要求 通过实验掌握农杆菌的活化与培养技术与农杆菌介导获得目的基因的转化植株。 二、基本原理 农杆菌共培养法最早是由Marton 等(1979 年)以原生质体为受体建立起来的,经过一系列改进后,目前已经成为最常用的转化方法。共培养法是利用Ti 质粒系统,将农杆菌与植物原生质体、悬浮培养细胞、叶盘、睫段等共同培养的一种转化方法。 三、材料及方法 1.含目的基因共整合载体或双元载体的根癌农杆菌。 2.植物幼苗。 (一)细菌培养液直接浸染法 操作︰ (1)无菌受体材料的准备︰叶片、睫段、胚轴、子叶等均可做受体材料,有两种来源。取自无菌试管苗。 取自田间或温室栽培植株︰叶片、睫尖、睫段用蒸馏水冲冼1 遍后,70%乙醇洗45 秒,0.1%升汞消毒6~8 分钟,无菌水冲洗三遍,无菌滤纸吸干水分。 (2)受体材料预培养︰将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm 的小块或用6mm 打孔器凿成圆盘,无菌胚轴、睫切成约0.8~1cm 长的切段,接种在愈伤组织诱导或分化培养基上进行预培养,注意叶片近轴面向下︰预培养2~3 天,材料切口处刚刚开始膨大时即可进行侵染。 (3)农杆菌培养︰从平板上挑取单菌落,接种到20mL 附加相应抗生素的细菌培养液体培养基(pH7.0)中,在恒温摇床上,于27℃, 180r/ min 培养至OD600 为0.6~0.8。 取OD600 为0.6~0.8 的菌液,按1%~2%的比例,转入新配制的无抗生素的细菌培养液体培养基中,可在与上相同的条件下培养6 小时左右,OD600 为0.2~0.5 时即可用于转化;或同时加入100~500μmol/的AS; (4)侵染︰于超净工作台上,将菌液倒入无菌小培养皿中(可根据材料对菌液的敏感情况进行不同倍数的稀释)。从培养瓶中取出预培养过的外植体,放入菌液中,浸泡适当时间(一般1~5 分钟,不同材料处理时间不同)。取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。 (5)共培养︰将侵染过的外植体接种在愈伤组织诱导或分化培养基上(烟草为MS 十 IAA0.5mg/L + BA2.0mg/L) ,在28℃暗培养条件下共培养2~4 天(光对某些植物的转化有抑制作用,故需暗培养,共培养时间因不同植物而异)。

农杆菌介导转化法的概述

农杆菌介导转化法的概述 自从1983年转基因植物诞生以来,植物基因工程成为发展最快、应用潜力最大的生物技术领域之一。植物转基因技术是指把从动物、植物或微生物中分离到的目的基因,通过各种方法转移到植物的基因组中,使之稳定遗传并赋予植物新的农艺性状,如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等。[1] 目前,应用于植物转基因较多的方法有基因枪轰击法和农杆菌介导法。由于基因枪轰击的随机性,容易出现突变、丢失和引起基因沉默等不利于外源基因在宿主植物的稳定表达的缺点,而农杆菌介导法是一种天然的植物遗传转化系统,外源基因在转基因植物中的拷贝数低、遗传稳定,是最常用的转基因技术[2]。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中,近年来,农杆菌介导转化法在一些单子叶植物(尤其是水稻)中也得到了广泛应用。本文对农杆菌介导转化法进行综述。 1 关于农杆菌 农杆菌[3-5]是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌,它能在自然条件下趋化性的感染大多数双子叶植物的受伤部位,并诱导产生冠瘿瘤或发状根。与植物基因转化有关的有根瘤农杆菌和发根农杆菌这两种类型。 1.1根癌农杆菌 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)含有Ti质粒,能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤,即诱发冠瘿瘤;Ti质粒是农杆菌染色体外的遗传物质,为双链共价闭合环状DNA分子,大小约200-250kb。 依据Ti质粒诱导的植物细胞产生的冠瘿碱的种类不同,根癌农杆菌可分为4种类型:章鱼碱型(Octopine)、胭脂碱型(Nopaline)、农杆碱型(Agropine)和琥珀碱型(Succinamopine)。 原始的Ti质粒根据其功能的不同可分为4个区: 1.1.1T-DNA区(Transfer—DNA region):不同来源的菌株,T-DNA的长度在12~24 kb,它是在农杆菌侵染细胞时,从Ti质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA,其携带的基因与肿瘤的形成有关,但与T-DNA本身的转移与整合无关.T-DNA上最重要的是T-DNA区两端的边界各为25 bp的重复序列.其中14 bp 是完全保守的,分10 bp(CAGGAATATAT)和4 bp(GTAA)不连续的2组.左右2个

根癌农杆菌转基因的分子机制

吉林农业科学2007,32(1):19-25JournalofJilinAgriculturalSciences 文章编号:1003-8701(2007)01-0019-07 根癌农杆菌转基因的分子机制 周晓航,刘洪章* (吉林农业大学园艺学院,长春130118) 摘要:根癌农杆菌将T-DNA转移并插入寄主细胞的基因组,需要趋化与附着、vir区活化、T-DNA切割及转运、T-DNA整合及表达等步骤。本文对这些步骤分子机制的研究进展进行了综述。 关键词:根癌农杆菌;T-DNA转移 中图分类号:Q812文献标识码:A 野生型根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)是一种土壤病原细菌,它通过根部伤口侵入植物体,刺激寄主在侵染部位形成冠瘿瘤,引发根癌病(crowngall)。该病害在世界范围内普遍发生,患病植株株体衰弱,严重时可以整株死亡,因此,在生产上造成极大危害。冠瘿瘤的生成,是由于根癌农杆菌染色体外遗传物质—— —Ti质粒上的一段DNA(T-DNA)转移到植物细胞,整合进染色体组并进行表达的结果。这种具有天然转基因功能的质粒,经过改造,在基因工程中可以用作基因转移的载体[1]。农杆菌介导的转化方法(Agrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformation,ATMT)是研究植物和真菌反向遗传学的常用技术。基于上述原因,近几年来,T-DNA的转运,以及随后在植物(或者真菌)细胞中的整合,表达乃至遗传等问题,一直受到植物病理学家和遗传工程学家的广泛关注,参与这些步骤的相关基因表达调控及其编码产物的功能研究方面多有报道,现就T-DNA外运的分子机理作如下概述。1T-DNA转移概述 T-DNA的转运及整合存在如下模式: A.根癌农杆菌由于趋化性而游向并附着到植物细胞表面。 B.农杆菌Ti质粒上的vir区基因活化表达,其中VirD2将T-DNA切割下来,并生成VirD2-T链结合物(VirD2-Tstrandcomplex);而VirB各蛋白参与转运通道装配。 C.VirD2-T链结合物穿越VirB通道,进入植物细胞;VirE2与VirE1形成复合体,自同一通道穿过。 D.在植物细胞质,VirE2与VirE1解离,前者结合到T链(结合有VirD2)上形成T复合体。 E.T复合体与植物细胞因子结合:VirD2与AtKAPα、亲环蛋白相结合;VirE2与VIP1和(或者)VIP2相结合;VirD2核定位序列区磷酸化;AtKAPα可能与推测的AtKAPβ相互作用。 F.T复合体经核孔进入细胞核。在VIP1和(或者)VIP2的作用下,T复合体靶向染色体。然后整合进植物基因组[2]。 2趋化及附着 与活植物组织临近或接触,菌体形态受诱导向线形转变[3],然后一端附着到植物体上。根癌农杆菌具有两个系统,控制对植物细胞的附着:一个依赖于AttR,为所有供试植物的发病以及侵染非豆科植物根系所必需。另一系统调控根癌农杆菌结合到豆科植物根系上[4]。以胡萝卜、拟南芥细胞为试材收稿日期:2006-05-12 作者简介:周晓航(1975-),硕士,研究方向:果树生物技术。 通讯作者:刘洪章,博士生导师

农杆菌介导水稻快速转化-Bio-protocol

农杆菌介导水稻快速转化 Agrobacterium-mediated Rapid Transformation of Rice 崔莹,蔡朝霞,林拥军,陈浩* 作物遗传改良国家重点实验室,华中农业大学,武汉 *通讯作者邮箱:hchen@https://www.sodocs.net/doc/e5333000.html, 引用格式:崔莹,蔡朝霞,林拥军,陈浩. (2018). 农杆菌介导水稻快速转化. Bio-101 e1010176. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010176. How to cite: Cui, Y., Cai, C. X., Lin, Y. J. and Chen, H. (2018). Agrobacterium-mediated rapid transformation of rice. Bio-101 e1010176. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010176. (in Chinese) 实验原理:Toki等(2006)发现,水稻成熟胚在诱导愈伤1 d后可以被农杆菌侵染,诱导愈伤5 d后可以被高效转化。Toki (1997)研究表明在32 °C、光照条件下,水稻愈伤组织可以快速分裂。在该条件下进行筛选培养,14 d可以得到明显的抗性愈伤组织。本实验的目的是在实验室已有的遗传转化方法基础上,参考Toki等(1997,2006)发表的部分实验参数,建立快速的水稻转化方法,以缩短遗传转化周期。本实验在32 °C、光照条件下诱导愈伤,对诱导5 d的水稻愈伤组织进行侵染,随后在32 °C、光照条件下以潮霉素作为筛选剂进行筛选培养,14 d后获得了抗性愈伤组织,对抗性愈伤组织进行分化培养,获得稳定的转化植株。从愈伤组织诱导到转化再生植株生根,整个实验周期约为50 d。 关键词:水稻成熟胚,农杆菌介导,快速转化 材料与试剂 1. 滤纸 2. 水稻种子 3. 75%酒精 4. 吐温20 5. 农杆菌菌株EHA105 (携带含目的基因载体) 6. 6-Benzylaminopurine (6-BA) (Sigma, catalog number: B-3408) 7. Kinetin (KT) (Sigma, catalog number: K-0753)

农杆菌转化法原理

农杆菌转化法原理: 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌,它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位(受伤处的细胞会分泌大量酚类化合物,从而使农杆菌移向这些细胞),并诱导产生冠瘿瘤或发状根。 根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒,其上有一段T-DNA,农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后,可将T-DNA插入到植物基因组中,并且可以通过减速分裂稳定的遗传给后代,这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。 人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区,借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合,然后通过细胞和组织培养技术,再生出转基因植株。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中,近年来,农杆菌介导转化在一些单子叶植物(尤其是水稻)中也得到了广泛应用。 农杆菌转化植物细胞涉及一系列复杂的反应,主要包括:①受伤的植物细胞为修复创伤部位,释放一些糖类、酚类等信号分子。②在信号分子的诱导下,农杆菌向受伤组织集中,并吸附在细胞表面。③转移DNA上的毒粒基因被激活并表达,同时形成转移DNA的中间体。④转移DNA进入植物细胞,并整合到植物细胞基因组中。 方法:(根据不同受体环境基因要求而不同) 1.农杆菌准备 2.外植体的准备(愈伤组织、悬浮细胞系、幼嫩茎段或叶片); 3.用MS-AS液体培养基稀释原菌液15倍(1.5ml / 20ml)或离心后稀释3倍; 4.外植体与菌液共培养20 分钟; 5.放置在带滤纸的培养皿上(注意充分吸干多余的菌液); 6.将外植体接种到MS-AS固体诱导培养基,培养2-3天; 7.移至含卡那霉素(Kan)300mg/L和羧苄青霉素(Cb 300mg/L)的固体筛选培养基上进行Kan抗性愈伤组织的筛选; 8.隔20天,进行第二次筛选; 9.抗性愈伤组织在固体筛选培养基上分化成苗; 10 在生根培养基上生根,获得完整的再分化植株。

农杆菌介导水稻遗传转化的相关讨论

农杆菌介导水稻遗传转化相关的讨论 羧苄青霉素的作用 羧苄青霉素在农杆菌介导法对水稻进行遗传转化的过程中起到抑制农杆菌生长的作用。根据前人的研究经验,浓度为250mg/L时候抑制效果最好且不会影响愈伤组织的再生。本实验过程中我们发现,经过经验用量的羧苄青霉素抑制处理,转移至筛选培养基后一周左右即可见到少量愈伤农杆菌复发,有的甚至在第二次筛选时仍然生长出农杆菌,并未达到很好的抑制农杆菌生长的目的。这有可能是在长期的实验过程和进化过程中,农杆菌对苏氨苄青霉素产生了耐受性。因此,在遵循不影响愈伤组织生长的原则下,可以适当增加羧苄青霉素的用量,或者与头孢霉素配合使用,可以达到很好的抑制效果。 潮霉素作为筛选剂的最适宜浓度 本实验采用潮霉素基因作为筛选标记,经过长期经验积累,发现潮霉素浓度梯度25mg/L,35mg/L和45mg/L进行多轮筛选,假阳性最低,筛选效果最好,为最适筛选浓度。 各个阶段不同添加物的作用 水稻遗传转化过程中的碳源有多种选择,主要有葡糖糖,麦芽糖和蔗糖,糖类除作能源外,还可以作为渗透调节剂对愈伤组织的的质量起重要作用。根据转化受体的不同,碳源的种类和浓度也有区别。本实验室研究中发现,粳稻作为转化受体时,蔗糖为最佳的碳源,而在籼稻的遗传转化中,麦芽糖和蔗糖配合使用,效果最好。 植物激素是愈伤组织诱导和绿苗分化的关键性因素。2 ,4-D 的质量浓度至关重要,对于愈伤组织诱导来说,低浓度及高浓度的 2 ,4-D 都不适宜水稻成熟胚愈伤组织的诱导。在籼稻的遗传转化中,2 ,4 -D与6 -BA 配合使用更有利于愈伤组织的诱导及分化。 潮霉素和除草剂均可以作为筛选剂。适宜的筛选浓度有利有抗性愈伤组织的生长,潮霉素浓度过高,阳性愈伤组织也有可能被筛死,浓度过低,又会有较高的假阳性出现。实验证明,只用潮霉素筛选所得的抗性愈伤和先用潮霉素筛选后用除草剂筛选所得的抗性愈伤,在分化再生过程中有显著差异。前者分化出芽所

农杆菌转化法原理

农杆菌转化法原理 This manuscript was revised on November 28, 2020

农杆菌转化法原理: 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌,它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位(受伤处的细胞会分泌大量酚类化合物,从而使农杆菌移向这些细胞),并诱导产生冠瘿瘤或发状根。 根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒,其上有一段T-DNA,农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后,可将T-DNA插入到植物基因组中,并且可以通过减速分裂稳定的遗传给后代,这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。 人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区,借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合,然后通过细胞和组织培养技术,再生出转基因植株。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中,近年来,农杆菌介导转化在一些单子叶植物(尤其是水稻)中也得到了广泛应用。 农杆菌转化植物细胞涉及一系列复杂的反应,主要包括:①受伤的植物细胞为修复创伤部位,释放一些糖类、酚类等信号分子。②在信号分子的诱导下,农杆菌向受伤组织集中,并吸附在细胞表面。③转移DNA上的毒粒基因被激活并表达,同时形成转移DNA的中间体。④转移DNA进入植物细胞,并整合到植物细胞基因组中。 方法:(根据不同受体环境基因要求而不同) 1.农杆菌准备 2.外植体的准备(愈伤组织、悬浮细胞系、幼嫩茎段或叶片); 3.用 MS-AS液体培养基稀释原菌液15倍(1.5ml / 20ml)或离心后稀释3倍; 4.外植体与菌液共培养20 分钟; 5.放置在带滤纸的培养皿上(注意充分吸干多余的菌液); 6.将外植体接种到MS-AS固体诱导培养基,培养2-3天 ; 7.移至含卡那霉素(Kan)300mg/L和羧苄青霉素(Cb 300mg/L)的固体筛选培养基上进行Kan抗性愈伤组织的筛选; 8.隔20天,进行第二次筛选; 9.抗性愈伤组织在固体筛选培养基上分化成苗; 10 在生根培养基上生根,获得完整的再分化植株。

农杆菌介导法

实验九植物遗传转化——农杆菌介导法 一、目的 了解农杆菌转化的机理;掌握农杆菌介导转化水稻的技术 二、原理 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)具有跨界转移DNA的能力。下列因子与转化过程有关: 1. Ti 质粒(tumor-inducing plasmid)上的T-DNA (transferred DNA) T-DNA是农杆菌Ti质粒上能够转移到植物基因组的一段DNA序列。T-DNA含有RB和LB两个边界,它们是25bp的正向重复序列,是T-DNA 转移的顺式作用元件。不同类型的农杆菌其边界序列有所不同,但划线部分为完全保守序列。置于该边界内的任何外源基因均可被转化。LB缺失突变后农杆菌仍能致瘤,但RB缺失会导致致瘤能力丧失,这时几乎完全没有T-DNA的转移。 LB(-链)5’GT TTACACCACAA TA TATCCTG CCA 3’ RB(+链)5’TGA CAGGA TA TA TTGGCGGGTAA AC 3’ 2. Ti质粒上的Vir区(virulence region)操纵子 转化所必需的基因有vir A、B、C、D、E、G。其中蛋白VirD1/D2识别T-DNA边界RB和LB;VirC识别T-DNA右边界的超驱增强子;VirD2在T-DNA底链起内切酶作用造成切刻,并与T-链5’ 共价结合,带有1个核定位信号NLS;VirB形成转移复合通道;VirE2为单链DNA 结合蛋白,有2个NLS。该操纵子的表达顺序如下: vir A和vir G组成型表达形成VirA和VirG蛋白→VirA被植物创伤信号分子激活→激活的VirA使VirG激活→激活的VirG 诱导vir C、D、E、B、F、H表达。 3. 农杆菌染色体基因组相关基因:chv A、chv B(农杆菌运动、附着)、chv D、chv E(编码单糖结合蛋白、趋化性)、psc A、att、cel(合成纤维素丝,附着)。它们与农杆菌的趋化性和识别附着植物细胞有关。 4. 寄主细胞表面受体 5.诱导条件: 小分子酚类化合物:如乙酰丁香酮(AS,acetosyringone)、羟基乙酰丁香酮(OH-AS,hydroxyacetosyringone);它们是植物细胞创伤反应的一部分,或创伤细胞合成木质素的一部分,是莽草酸合成途径的产物。植物细胞必须在创伤和活跃的代谢状态下才能产生AS及OH-AS。农杆菌对一系列植物酚类化合物具有趋化性,同时高浓度的AS又可使农杆菌的vir 基因活化表达。这些化合物是双子叶植物细胞壁合成的前体,通常不存在于单子叶植物中,这正说明了为什么根癌农杆菌不易感染单子叶植物。若要实现农杆菌对水稻的转化,必须添加这类诱导物。 糖类:如D-葡萄糖、D-木糖等。它们在Vir区基因诱导和农杆菌毒力上起一定作用。 高浓度的肌醇可促进vir基因的表达。 低pH:pH 5.1-5.8 时Vir区基因的诱导达到最高水平。

农杆菌介导转基因的原理

农杆菌介导转基因的原理? 转基因技术的飞速发展为生物定向改良和分子育种提供了一种较佳的方法,并使其成为基因工程和育种的最有效途径,目前应用较广泛的转基因技术有农杆菌介导法、花粉通道法、显微注射法、基因枪法、离子束介导法等等,其中农杆菌介导法以其费用低、拷贝数低、重复性好、基因沉默现象少、转育周期短及能转化较大片段等独特优点而备受科学工作者的青睐。农杆菌介导法主要以植物的分生组织和生殖器官作为外源基因导入的受体,通过真空渗透法、浸蘸法及注射法等方法使农杆菌与受体材料接触,以完成可遗传细胞的转化,然后利用组织培养的方法培育出转基因植株,并通过抗生素筛选和分子检测鉴定转基因植株后代。 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌,它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位,并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒,其上有一段T-DNA,农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后,可将T-DNA插入到植物基因组中。因此,农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区,借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合,然后通过细胞和组织培养技术,再生出转基因植株。 农杆菌转化的详细机理已有大量综述, 并介绍新进展. 野生型根癌农杆菌能够将自身的一段DNA转入植物细胞. 因为转入的这一段DNA含有一些激素合成基因, 因而导致转化细胞自身激素的不平衡从而产生冠瘿瘤. 这些致瘤菌株都含有一个约200 kb的环状质粒, 被称为Ti(tumor inducing)质粒, 包括毒性区(Vir 区)、接合转移区(Con区)、复制起始区(Ori区)和T-DNA区4部分. 其中与冠瘿瘤生成有关的是Vir区和T-DNA区. 前者大小为30 kb, 分virA~J等至少10个操纵子, 决定了T-DNA的加工和转移过程. T-DNA可以将携带的任何基因整合到植物基因组中, 但这些基因本身与T-DNA的转移与整合无关, 仅左右两端各25 bp的同向重复序列为其加工所必需, 其中14 bp是完全保守的, 分10和4 bp不连续的两组. 两边界中以右边界更为重要. VirA作为受体蛋白接受损伤植物细胞分泌物的诱导, 自身磷酸化后进一步磷酸化激活VirG蛋白; 后者是一种DNA 转录活化因子, 被激活后可以特异性结合到其他vir基因启动子区上游的一个叫vir框(vir box)的序列, 启动这些基因的转录. 其中, virD基因产物对T-DNA进行剪切, 产生T-DNA单链. 然后以类似于细菌接合转移过程的方式将T-DNA与VirD2组成的复合物转入植物细胞], 在那里与许多VirE2蛋白分子(为DNA单链结合蛋白)相结合, 形成T链复合物(T-complex). 在此过程中VirE1作为VirE2的一个特殊的分子伴侣具有协助VirE2转运和阻止它与T-DNA链结合的功能. 实验表明, 转基因植物产生的VirE2蛋白分子也能在植物细胞内与VirD2-T-DNA形成T链复合物. 之后, 这一复合物在VirD2和VirE2核定位信号(NLS)引导下以VirD2为先导被转运进入细胞核. 转入细胞核的T-DNA以单或多拷贝的形式随机整合到植物染色体上. 研究表明T-DNA优先整合到转录活跃区, 而且在T-DNA的同源区与DNA的高度重复区T-DNA的整合频率也比较高. 整合进植物基因组的T-DNA也有一定程度的缺失、重复、填充和超界等现象发生, 例如在用真空渗透法转化的拟南芥中有66%出现超界现象, 甚至有整个Ti质粒整合进植物基因组的报道, T-DNA超界转移现象的机理尚不完全清楚, 可能与其左边界周边序列有关. 现在, 对农杆菌感染过程中其本身因子的转录与调控已研究得相当深入, 但

水稻遗传转化体系Protocol

水稻遗传转化体系Protocol Introduction 1.水稻的遗传转化研究历史与现状 20 世纪80年代末, 水稻的遗传转化首获成功。1988 年, 3 个不同的研究小组以水稻原生质体为受体,采用“电击法”或“PEG 介导法”等方法将外源 3]。1991 年, 基因枪转化的方法在水稻中基因导入到水稻中并获得再生植株[1 ~ 获得成功[4],随后成为水稻遗传转化的常用方法之一。1993 年,Chan 等人[5]首先采用农杆菌介导的方法获得了转基因水稻。Hiei 等人[6]以水稻成熟种子诱导的愈伤为受体, 建立了农杆菌介导的粳稻高效转化体系, 使得农杆菌介导法逐渐成为了水稻转化最常用的方法。此后, 粳稻的转化方法被进一步优化, 使粳稻的遗传转化周期大幅缩短[7]。虽然Hiei等[6]建立的农杆菌介导的转化体系使得粳稻的转化不再困难, 但是许多籼稻的转化依然存在障碍, 主要是转化效率低下。因此, 一些研究者对籼稻的转化体系进行了一些优化, 使得籼稻的转化效率得到了一定的提高[8,9]。最近, Hiei 和Komari[10]发表了一个粳稻和籼稻均适用的农杆菌高效转化的方法.根据他们的结果, 采用幼胚作为外植体, 籼 13 个稻的转化可以在两个半月内完成,且转化效率非常高(一个幼胚可以得到5 ~ 独立的转化植株)。 2. 转基因技术在水稻上的研究与应用[11] a. 转基因抗虫水稻 对于水稻最主要的害虫——螟虫(二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等)在水稻中尚未发现有效的抗性种质资源. 目前,最有希望和前途的方法就是利用转基因技术把外源抗虫基因引入水稻中创造出新的抗虫品种。虽然水稻中已经发现和鉴定了19 个抗褐飞虱的基因[12], 但是由于褐飞虱有多个生物型且易产生变异, 抗性品种往往推广数年后就会失去抗性。 b. 转基因抗病水稻 见抗水稻病毒研究 c. 转基因抗旱水稻 d. 转基因营养高效利用水稻

根癌农杆菌介导的植物遗传转化1

实验三根癌农杆菌介导的植物遗传转化 一实验目的 了解植物遗传转化的方法和理论 掌握根癌农杆菌介导的遗传转化技术 二原理 植物遗传转化技术是指通过物理的,化学的或生物学的方法,将外源的基因导入受体植物细胞中获得再生植株的转基因技术。自1983转基因植物问世以来,至今不到20年时间里,植物转基因技术发展迅速,除了占指导地位,运用最为广泛的农杆菌介导法,还发展了10多种转基因方法,如物理方面的基因枪法,电激法,显微注射法,超声波法,激光微束法,炭化硅纤维介导法,电泳法等;化学方面PEG介导转化,脂质体介导转化;生物学方面的种质系统法如花粉介导法,花粉管通道法等。 农杆菌介导法 土壤农杆菌(Agrobacterium)是一种革兰氏阳性菌,有两个种与植物转基因有关,即根癌农杆菌(Agrobacterium Tumefaciens)和发根农杆菌(Agrobacterium Rhizogenes).它们在自然状态下具有趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位,并诱导产生冠缨瘤或发状根,在离体条件下,可以在不加任何生长素的培养基中持续生长,研究表明根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti 和Ri质粒,上面有一段T-DNA区,可以通过一系列过程进入植物细胞并将这一段T-DN插入到植物基因组中,这是农杆菌侵染植物后产生冠缨瘤或发状根的根本原因,因此农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系,人们可将所构建的目的基因插入到去除了致瘤基因的Ti(Ri)质粒的T-DNA区,借助农杆菌侵染受体植物细胞后T-DNA向植物基因组的高频转移和整合特性,实现目的基因对受体植物细胞的转化,然后通过植物细胞合和组织培养技术,利用植物细胞的全能性获得转基因再生植株。农杆菌介导法转基因技术的关键是T-DNA整合受体植物基因组的过程,这一过程依赖与Ti质粒上的T-DNA区,和Vir区各种基因的表达以及一系列蛋白质和核酸的相互作用。简略地说。其过程是:植物细胞在受伤后细胞壁破裂,分泌高浓度的创伤诱导分子,它们是一些酚类化合物,如乙酰丁香酮(acetosyringone,AS)和羟基乙酰丁香酮(hydroxy- acetosyringone,OH-As)农杆菌对这类物质具有趋化性,首先在植物细胞表面发生贴壁,继而植物创伤分子诱导农杆菌Vir区各种基因的激活和表达。首先是VirA和virG基因的活化,磷酸化的virG蛋白激活一系列vir基因的表达,导致T-DNA被剪切,加工,形成T-链蛋白复合体(T-复合体),通过农杆菌和植物细胞的细胞膜,细胞壁进入植胞内,T-复合体上的核靶向序列可引导T-DNA整合到植物基因组。 三实验材料 烟草KRK26叶片,农杆菌菌株EHA105,质粒的T-DNA含目的基因GFP,卡那霉素抗性基因为选择标记基因,结构如下图所示: LB Bt nos3 MCS nos3 nptII nos5 RB

农杆菌介导法

农杆菌介导的高效水稻遗传转化体系的研究A Highly Efficient Agrobacterium - mediated Rice Transformation Method 水稻是基因组研究的模式植物 ,近年来水稻基因组研究取得了很大进展 ,构建了遗传图谱和物理图 谱 ,完成了籼稻和粳稻的全基因组草图测2 - 3序 ,以及第 1 号和第 4 号染色体的精细测4 - 5序 ,并对第 10 号染色体的结构进行了详细分析。在此基础上 ,各实验室大规模地 ,系统地进行水稻功能基因研究 ,普遍采用的研究手段是基因标签技术。基因标签技术包括 T - DNA 和转座子标签 ,创建大量的基因标签体是功能基因研究的材料平台。而根癌农杆菌介导的水稻遗传转化是水稻基因标签技术中的重要步骤之一。本研究完善了根癌农杆菌介导的水稻转化方法 ,以期为水稻功能基因研究提供丰富材料 , 为水稻重要农艺性状的改良开辟途径。 1材料 以水稻品种日本晴(Oryza sativa L. ssp.japonica)为试验材料。菌株类型为 EHA105 超毒力菌株 ,载体为增强子捕获载体 pFX- E24. 2 - 15R(见图 1) ,载体上带有 GUS报告基因、35 S的 CaMV 启动子序列和潮霉素选择标记基因(HYG) 。农杆菌菌株为EHA105。 2方法 2.1水稻愈伤组织的诱导诱导方法参照 HIEI7等。将日本晴水稻种子去壳 ,用 75 %乙醇灭菌 5min ,再用2. 5 %的次氯酸钠灭菌处理不同时间(40min ,37 min ,30 min 和 25 min) ,以确定最佳灭菌时间 ,灭菌后用无菌水冲洗 6~8 次 ,于 MS 固体培养基上28 ℃避光培养 ,30 d 后 ,将愈伤组织进行继代培 养 ,得到胚性愈伤组织。 2.2农杆菌转化愈伤组织用 AB 固体培养基+氯霉素 25 mg/L + 利福平 20 mg/L + AS 20 mg/L培养农杆菌 ,在20 ℃下培养5~6 d。用无菌勺子轻轻刮下培养的农杆菌 ,放入 AAM液体培养基中(加有2 mg/L 2 ,4

农杆菌介导的水稻转化

农杆菌介导的水稻转化 实验目的 学习农杆菌介导的将目的基因导入水稻的方法。 实验原理 随着分子生物学的发展,越来越多的参与植物抗病有关的基因被分离出来,如防卫反应有关的基因、参与抗病信号传导的基因,参与对病原物识别的基因等,要鉴定这些基因在植物抗病性中的作用和地位,就要构建转化植物的双元载体如超量表达、反义和RNA干涉的双元载体转化植物,来明确该基因在植物抗病中的作用。 水稻上常用的遗传转化方法分为DNA直接导入法和农杆菌介导的转化法。DNA直接导入法主要包括PEG(polyethylene glycol)介导的转化法、电击转化法、基因枪转化法和花粉管通道转化法。其中PEG法、电穿孔法以原生质体为受体,由于对原生质体再生的依赖而在应用上受到很大限制。基因枪法优点是受体广泛,不受寄主范围的限制,转化率较高,但和其它DNA直接导入法一样存在共同的缺点:外源DNA的整合方式复杂,常常是多拷贝插入,较易出现转基因沉默现象,转化的外源基因片断不能太大(上限是16-20kb),转入基因的分离有时呈非孟德尔遗传等。同DNA直接导入法相比,农杆菌介导的转化法不需要原生质体的培养,简便易行,能有效地转入较大的外源DNA片断;转化效率高,转化的外源基因整合位点比较稳定(一般在T-DNA 25bp处与植物基因组整合),整合的外源基因基本上保持其结构的完整性;整合的外源基因多为单拷贝或低拷贝;整合的外源基因在转基因植株中的显性表达率较高,共抑制现象相对较少;转入的外源基因通常以孟德尔遗传规律遗传。所以已成为转化单子叶植物的首选方法。 一、目标基因对农杆菌的转化 1.1农杆菌感受态细胞的制备 1.取-70℃保存的农杆菌EHA105于含50μg/ml利福平YM平板划线,28℃黑暗培养。 2.挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中,220rpm 28℃振荡培养12-16小时。 3.取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中,28℃,220rpm振荡培养至OD600=0.5。 4.转入无菌离心管,5000rpm离心5分钟,去上清液。 5.加入10ml预冷的0.1M的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置20分钟后,4℃,5000rpm 离心5分钟,去上清。 6.加入4ml预冷的含10%甘油的0.1M的CaCl2溶液,轻轻悬浮。 7.农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中,每管200μl冻存于-70℃。 1.2. 双元载体转化农杆菌EHA105 取1μg左右的质粒DNA加入到200ml EHA105感受态细胞中,混匀后,冰浴30分钟,-70℃放置3分钟,42℃水浴1-2分钟,加入800mlYM液体培养基28℃,175rpm摇培2-3小时后涂在含50μg/ml Kanamycin的YM平板上,28℃培养。 1.3农杆菌转化子的PCR鉴定 将农杆菌转化子,用PCR方法鉴定是否正确转进EHA105中。挑取转化的农杆菌单菌落接种于含50μg/ml Kanamycin的YM液体培养基中,28℃,220rpm摇培16小时,直接用

农杆菌介导的植物遗传转化研究进展

生物技术进展 2011年第1卷第4期260 265 Current Biotechnology ISSN 2095-櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅殯 殯 殯 殯 2341 进展评述 Reviews 收稿日期:2011-08-30;接受日期:2011-10-11基金项目:国家自然科学基因项目(31070139)资助。 作者简介:姚冉,硕士研究生,研究方向为遗传学。*通讯作者:张志芳,研究员,博士,博士生导师,主要从事基因工程研究。E-mail :zhangzf@mail.caas.net.cn 农杆菌介导的植物遗传转化研究进展 姚 冉1,2,石美丽1,潘沈元1,沈桂芳2,张志芳 2*1.徐州师范大学生命科学学院,江苏徐州2211162.中国农业科学院生物技术研究所,北京100081摘 要:农杆菌介导的转基因方法是目前植物遗传转化的重要方法之一。本文从农杆菌转化原理、菌株比较及载体发 展入手, 系统讨论了植物转化受体对转化效率的影响,同时分别综述了农杆菌介导转化技术在双子叶和单子叶植物转化应用中的最新进展。 关键词:农杆菌;遗传转化;进展 DOI :10.3969/j.issn.2095-2341.2011.04.06 Progress on Agrobacterium tumefaciens -mediated Plant Transformation YAO Ran 1,2 ,SHI Mei-li 1,PAN Shen-yuan 1,SHEN Gui-fang 2,ZHANG Zhi-fang 2* 1.School of Life Science ,Xuzhou Normal University ,Jiangsu Xuzhou 221116,China 2.Biotechnology Research Institute ,Chinese Academy of Agricultural Sciences ,Beijing 100081,China Abstract :In current ,Agrobacterium -mediated gene transferring is one of major methods used in genetic transformation of plants.This paper systematically reviewed the effect on plant transformation efficiency based on the introduction of the principle of this transformation ,comparison among different kinds of Agrobacterium strains and the development to transformation vectors.In addition ,the newly progresses on the Agrobacterium -mediated transformation of dicotyledonous and monocotyledons species transformation were also discussed ,respectively. Key words :Agrobacterium tumefaciens ;genetic transformation ;progress 植物遗传转化(plant genetic transformation )技术也称植物转基因技术,是应用DNA 重组技术将外源基因通过生物、物理或化学等手段导入植物基因组,以获得外源基因稳定遗传和表达的植物遗传改良的一门技术 [1] 。目前最常用的转基 因方法是基因枪法和农杆菌法。基因枪法的基本 原理是利用表面附着有外源DNA 的金属微粒在高压装置中加速后高速运动到受体细胞中,从而达到转化DNA 的目的。但是基因枪法与农杆菌介导法相比,存在着转化率低、外源DNA 整合机 理不清楚、 得到的转化体往往是嵌合体、遗传稳定性较差、转入外源基因的沉默现象突出等缺点。农杆菌属于革兰氏阴性土壤杆菌,分根癌农 杆菌(Agrobacterium tumefaciens )和发根农杆菌 (Agrobacterium rhizogenes )。根癌农杆菌中含有Ti 质粒,能诱发冠瘿瘤。发根农杆菌中含有Ri 质粒,可以导致受伤部位产生毛发状根。Ti 质粒(包括Ri 质粒)上有一段转移DNA (transfer DNA ,又称T-DNA ),受伤的植物细胞中产生的化 学复合物可使农杆菌吸附于植物上,使T-DNA 转移到植物细胞内并整合到染色体上。 目前大量研究工作的目标是明确农杆菌将外 源DNA 导入受体细胞的分子机制,从而改进农杆菌菌株、 质粒和转化技术,以进一步提高转化效率。由于植物受体在转化过程中的作用尚不十分明确,所以农杆菌在转化过程中如何进入植物细

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