油菜种子萌发过程中DNA甲基化的MSAP分析
第50卷第24期 2005年12月论文
油菜种子萌发过程中DNA甲基化的MSAP分析
陆光远伍晓明*陈碧云高桂珍许鲲李响枝
(农业部油料作物遗传改良重点开放实验室, 中国农业科学院油料作物研究所, 武汉 430062. *联系人, E-mail: wuxm@https://www.sodocs.net/doc/d48771556.html,)
摘要 DNA甲基化对于植物的生长发育和组织分化具有十分重要的调控作用. 用MSAP (methylation- sensitive amplified polymorphism)和HPLC两种方法分析了油菜种子萌发过程中DNA甲基化的动态变化
过程, 并且比较了不同器官组织的甲基化水平差异. MSAP的分析结果表明, 油菜种子基因组中大约有15.7%的CCGG位点发生了胞嘧啶甲基化, 发生甲基化的方式以C5m CGG双链甲基化为主; 种子萌发过
程中同时发生甲基化和去甲基化事件, 其中去甲基化占据主导地位; 不同器官组织的甲基化水平存在
一定差异, 胚根的甲基化水平最低, 下胚轴次之, 子叶最高, HPLC分析结果与此一致. 最后, 对11个甲
基化多态性片段进行了序列分析, 发现基因编码区和非编码区发生DNA甲基化的频率基本相等. 由此
可见, 种子萌发过程中DNA的甲基化变化是一个十分复杂的过程, 油菜可能通过甲基化和去甲基化的
方式调控基因的表达, 并最终决定植株的生长发育和器官分化.
关键词 DNA甲基化MSAP种子萌发甘蓝型油菜
在真核生物中, DNA甲基化是一种常见而又十分重要的DNA修饰方式. DNA甲基化特别是胞嘧啶的甲基化(5m C)具有表观遗传效应(epigenetic effect)和突变效应(mutagenic effect), 导致基因特异表达、细胞分化和染色质失活(chromatin inactivation)[1]等. 甲基化并不改变DNA的碱基排列顺序, 但是阻断了遗传信息的传递, 从而引起形态性状的变化[2]. DNA甲基化对于植物的发育具有十分重要的调控作用. 在植物基因的启动子区和特定的编码区, 具有表达活性基因的甲基化程度通常要低于沉默的基因[3]. 在拟南芥的转基因植株中, DNA的去甲基化引起了表型性状的巨大变异[4], 而且同源异型基因SUPERMAN和AGAMOUS的甲基化将使其不能正常转录, 从而引起花器官的同源异型转换[5]. DNA甲基化与植物的春化作用也有关系. 在小麦中, 冬性近等基因系的甲基化程度大大高于春性近等基因系, 而且春化处理可以降低DNA的甲基化程度, 从而诱导或促进开花[6]. 在拟南芥中, 春化作用与FLC基因的表达密切相关, 组蛋白的甲基化可抑制FLC基因的表达[7]. 另外, 在番茄[8]、玉米[9]、水稻[10]等植物中, 不同组织间的甲基化水平存在显著差异, 暗示甲基化在细胞分化和器官发育过程中可能起到重要作用.
油菜是世界上最主要的油料作物之一, 已经在遗传多样性、分子标记、物理图谱构建和基因分离等方面做了大量的研究工作. 另外, 在DNA的甲基化方面也有少量报道, 如检测油菜在重铬酸钾毒害下DNA的甲基化变化情况[11], 研究植物逆转录转座子S1Bn SINE的甲基化特点及其与转座活性的关系[12]等. 但有关油菜生长发育与DNA甲基化相互关系方面的研究至今未见报道. 本研究利用MSAP和HPLC 方法分析油菜种子萌发过程中DNA甲基化状态的动态变化过程, 以期为了解DNA甲基化在油菜生长发育和器官分化中的作用提供理论依据.
1材料与方法
(ⅰ) 油菜材料. 甘蓝型油菜品种为Westar, 由国家油料作物种质中期库(中国农业科学院油料作物研究所, 武汉)提供. 供试材料为当年收获的新种子.
(ⅱ) 发芽实验. 在直径为15 cm的培养皿中, 加2层滤纸, 用蒸馏水充分湿透, 每皿均匀播种100粒油菜种子, 设4个重复, 在20℃的恒温箱中进行发芽. 每天检查发芽情况, 种子幼根的长度大于种子直径时为正常发芽种子. 发芽后7 d统计发芽率. 供试油菜种子的平均发芽率为98.6%, 在萌发过程中幼苗整齐一致, 长势良好, 说明新种子具有很强的生活力.
(ⅲ) DNA提取. DNA提取按改进的SDS法[13]进行. 在油菜种子萌发过程的0, 1, 2, 4和8 d, 分别选取整齐一致的幼苗(或种子)提取其总DNA. 另外, 提取发芽8 d幼苗的子叶、下胚轴和胚根3个不同组织的总DNA.
论文第50卷第24期 2005年12月
(ⅳ) DNA甲基化的HPLC分析. HPLC分析按照Chakrabarty等人[14]报道的方法进行. 在200 μL的酶切反应体系中, 包含20 μg 总DNA, 5 U核酸酶P1 (Sigma), 10 U 碱性磷酸酶(TaKaRa), 10 μL 10×碱性磷酸酶缓冲液, 最后用酶切缓冲液(30 mmol/L NaCH3, 0.1 mmol/L ZnCl2, pH 5.3)补足200 μL. 水解反应在37℃进行3 h, 完毕后加入500 μL无水乙醇终止反应, 在10000 × g条件下离心15 min. 上清液转移到新的离心管, 真空干燥, 所得的核苷(nucleosides)样品用1 mL ddH2O溶解, 并用0.2 μm微孔滤膜过滤. HPLC分析在C18色谱柱(Waters, MA, USA)上进行; 缓冲液为50 mmol/L KH2PO4, 8%甲醇, pH 3.5; 流速为0.8 mL/min; 时间为20 min; 检测波长为285 nm. 5 mdC的含量用以下公式计算:
5 mdC(%)＝100×[5mdC]/([5mdC] + [dC]).
式中的[dC]和[5mdC]分别是两种形式dC的浓度, 其数值由标准曲线计算得出.
(ⅴ) DNA甲基化的MSAP分析. MSAP的程序主要参照Portis等人[15]报道的方法进行并稍作修改. DNA样品分别使用Eco RⅠ/HpaⅡ和Eco RⅠ/MspⅠ
两组限制性内切酶消化. 为了减少实验误差, 酶切和连接同时进行. 酶切-连接反应体系(50 μL)为: 500 ng 模板DNA, 5 U Eco RⅠ, 10 U HpaⅡ(或MspⅠ), 2 U T4 DNA连接酶, 5pmol Eco RⅠ接头, 50pmol HpaⅡ/ MspⅠ接头, 1×反应缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 10 mmol/L MgAc, 50 mmol/L KAc, 10 mmol/L DTT, 0.2 mmol/L ATP). 反应混合液在37℃保温过夜, 然后65℃灭活10 min, 并用ddH2O稀释10倍作为PCR扩增的底物.
取5 μL酶切-连接产物进行预扩增反应. 所得的PCR产物稀释50~100倍后再次用于选择性扩增反应, 并进行变性凝胶电泳分离和硝酸银染色检测, 具体方法见文献[13].
(ⅵ) 差异片段的回收、克隆和测序. 在PAGE 胶板尚未干燥之前用刀片将差异片段挖下, 捣碎, 加入20 μL ddH2O, 然后95℃保温5 min, 自然冷却. 从中取2 μL上清液为模板, 用原来的引物组合和反应条件重新做PCR. 取10 μL扩增产物在琼脂糖凝胶上检测, 确信扩增成功后将剩余产物与pGEM-T载体(Promega)连接, 转化大肠杆菌感受态细胞, 挑选阳性单克隆. 序列测定委托北京华大中生科技发展有限公司进行. 序列比对和分析在网上公共数据库NCBI (https://www.sodocs.net/doc/d48771556.html,) 进行.
为了进一步验证甲基化所产生多态性的真实性, 我们用已经克隆的片段为探针进行Southern杂交分析. 取不同来源的总DNA各20 μg, 分别用Eco RⅠ/ HpaⅡ和Eco RⅠ/MspⅠ两组内切酶将其完全消化, 然后在0.8%琼脂糖凝胶上电泳分离. 预杂交、杂交和洗膜的程序按Sharpe等人[16]报道的方法进行. 探针制备和检测使用地高辛标记试剂盒进行(Roche Diagnostics, Swiss).
2结果与分析
2.1 MSAP分析
MSAP技术对模板DNA的质量有严格的要求. 油菜种子的含油量很高, 对DNA的提取有较大影响. 为此, 首先采用改进的SDS法提取干种子的DNA做预备实验, 以便获得信号强、稳定性好的MSAP谱带. 采用标准的MSAP程序, 经过必要的调整和优化, 在种子DNA为模板的扩增反应中获得了清晰可读、条带丰富的MSAP谱带, 其质量与幼苗DNA的扩增结果相当. 我们对扩增反应进行了多次重复, 发现MSAP带型具有很好的稳定性, 说明MSAP技术可以有效地应用于油菜基因组的甲基化检测. 经过引物筛选, 确定了12对扩增效果较好的Eco RⅠ/HpaⅡ-MspⅠ引物组合用于下一步分析(表1). 12对引物在种子DNA中总共扩增出484条清晰的带纹, 其中76条片段在Eco RⅠ/HpaⅡ和Eco RⅠ/MspⅠ两个组合的酶切、扩增产物之间表现出多态性. 由此推算, 在油菜基因组中CCGG位点发生胞嘧啶甲基化的比例大约是15.7%(76/484).
由于HpaⅡ对外部胞嘧啶的甲基化(m5CCGG)和内部胞嘧啶的甲基化(C m5CGG)都敏感, 而MspⅠ仅对外部胞嘧啶的甲基化敏感, 因此内部胞嘧啶的甲基化将导致测序胶中Eco RⅠ/HpaⅡ的酶切、扩增产物无带而Eco RⅠ/MspⅠ的酶切、扩增产物有带. 实际上, 在以干种子DNA为模板检测到的76个多态性片段中, 确实有大量的片段(54个)仅出现在Eco RⅠ/ MspⅠ而不出现在Eco RⅠ/HpaⅡ的酶切、扩增产物中. 不过, 也检测到少量片段(22个)仅出现在Eco RⅠ/ HpaⅡ而不出现在Eco RⅠ/MspⅠ的酶切、扩增产物中(表1). McClelland等人[17]认为这是由于外部胞嘧啶发生单链甲基化的结果. 由此可见, 油菜基因组CCGG位点发生甲基化的方式主要是以内部胞嘧啶(C m5CGG)双链甲基化为主.
第50卷 第24期 2005年12月
论 文
表1 油菜种子及幼苗的MSAP 扩增结果
引物组合a)
条带数
单态性 位点数 多态性 位点数 双链甲基 化位点数b)单链甲基化位点数b)
HM+TAA/E+AAC 71 5 3 5 0 HM+TAA/E+ACG 49 3 5 5 3 HM+TAA/E+ACT 62 5 7 5 1 HM+TAA/E+AGT 87 7 8 5 3 HM+TCC/E+AAC 52 7 12
5 2 HM+TCC/E+ACG 28 1 2 1 0 HM+TCC/E+ACT 1
6 9 3 2
7 HM+TCC/E+AGT 19 5 1 5 0 HM+TTC/E+AAC 40 7 6 5 3 HM+TTC/E+ACG 37 5 1 4 1 HM+TTC/E+ACT 26 7
3
6 1 HM+TCT/E+ACT 45 6 10
6
1
总计
532 67 61 54
c) 22 c)
a) 引物的核心序列HM 为5′-ATCATGAGTCCTGCTCGG-3′, E 为5′-GACTGCGTACCAATTC-3′, 后面附加的3个碱基为选择性碱基; b) 双链甲基化指C 5m CGG 发生双链甲基化, 单链甲基化指
5m
CCGG
发生单链甲基化, 这是根据在Eco R /ⅠHpa Ⅱ和Eco R /ⅠMsp Ⅰ两组酶切、扩增产物之间的多态性推测而来的; c) 仅在干种子DNA 中的分析结果
油菜种子发芽5个不同时期(0 , 1 , 2 , 4和8 d)的DNA 样品分别用限制性内切酶组合Eco R Ⅰ/Hpa Ⅱ
(H)和Eco R Ⅰ/Msp Ⅰ(M)消化, 共产生10个泳道. 12
对引物组合在10个泳道中总共检测到532条清晰的
片段, 每条片段代表了一个或两个同裂酶切割的位
点. 各引物组合检测到的片段数目从16条到87条不
等, 平均每对引物为44.3条(表1). 通过比较10个泳道MSAP 带纹的差异, 发现带型变化主要有两种类
型: (ⅰ) 单态性, 即带纹仅出现在H 泳道而不出现在
M 泳道中, 或反之亦然(图1(a)和(b)); 这种类型的带纹有67条(表1), 表明种子萌发过程中CCGG 位点的甲基化状态保持不变; (ⅱ) 多态性, 即种子萌发过程
中MSAP 带型发生了改变; 某些片段出现在干种子中, 但萌发后却消失了(图1(c)), 而另一些片段仅在萌发后的特定时期才能检测到(图1(d) ~ (f)), 这样的
片段有61条(表1), 表明CCGG 位点的甲基化状态在种子萌发过程中发生了改变.
61条多态性片段可以分为4组(表2, A, B, C 和D), 其中出现频率最高的是A 和B 组. A 组有25条
片段, 其特点是在种子萌发前的H 和M 泳道都无带, 或者仅在其中一个泳道有带, 但在种子萌发后的H
和M 泳道中同时有带, 暗示在CCGG 位点发生了完
全的去甲基化. B 组有28个片段, 这些片段在干种子
图1 油菜种子和幼苗的MSAP 扩增例子
H, Eco R Ⅰ/Hpa Ⅱ的酶切、扩增产物; M, Eco R Ⅰ/Msp Ⅰ的酶切、扩增产物. (a)和(b), 萌发过程中甲基化状态保持不变; (c), 在干种子的H
和M 泳道有带但在萌发后消失了(表2, 带型C1); (d), 萌发后甲基化
状态发生了2次变化, 即带型出现了但随后又消失了; (e)和(f), 萌发 前无带但萌发后在H 和M 泳道都有带(表2, 带型A1) 表2 油菜种子萌发过程中甲基化状态的变化
干种子a)萌发种子甲基化变化情况b)
H M H M 带型 萌发前 萌发后
数目? ?++ A1 CCGG
GGCC
CCGG GGCC 22 ?+++
A2
CCGG
GGCC CCGG GGCC 1 +?++ A3 CCGG GGCC CCGG GGCC
2 ???+ B1 CCGG
GGCC CCGG GGCC 10 ??+? B2 CCGG
GGCC CCGG GGCC 18 ++?? C1 CCGG GGCC
CCGG
GGCC 1 +++? C2 CCGG GGCC
CCGG
GGCC 1 ++?+ C3 CCGG GGCC CCGG GGCC
1 ?+?? D1 CCGG
GGCC CCGG GGCC 2 +??? D2 CCGG GGCC CCGG GGCC
3 a) H, Eco R Ⅰ/Hpa Ⅱ的酶切、扩增产物; M, Eco R Ⅰ/Msp Ⅰ的酶
切、扩增产物; +, 有扩增产物; ?, 无扩增产物; b) 胞嘧啶带下划线表
示发生了甲基化. 下同
论 文
第50卷 第24期 2005年12月
中由于CCGG 位点胞嘧啶的完全甲基化而检测不到, 但在萌发种子中由于甲基化程度的降低而出现在H 或M 泳道中. 与此相反, C 组的3个片段和D 组的5个片段反映的是种子萌发后甲基化程度升高的情形(表2).
图2 种子萌发过程中甲基化和去甲基化的变化趋势
2.2 油菜种子萌发过程中DNA 甲基化状态的变化 在种子萌发过程中检测到多态性的61个CCGG
位点中, 在种子萌发前未甲基化而萌发后却发生了甲基化的位点有3个(表2, C1~C3), 在萌发前处于甲基化状态而萌发后却发生了完全去甲基化的位点有25个(表2, A1~A3), 是甲基化位点数目的8倍. 由此可见, 油菜种子在萌发过程中同时存在DNA 的甲基化和去甲基化现象, 但以去甲基化为主. 种子萌发过程中DNA 的甲基化和去甲基化变化趋势见图2. 可以看出, 在萌发过程中发生DNA 甲基化的数目变化不大, 而发生去甲基化的数目却持续上升, 最终导致基因组净的去甲基化位点数目不断增加. 2.3 组织特异性的DNA 甲基化
同时使用MSAP 和HPLC 两种方法分析了油菜
不同器官组织的DNA 甲基化水平. 12对MSAP 引物
组合在胚根、下胚轴和子叶中检测到的片段数目分别
是513, 503和494条. 通过比较Eco R Ⅰ/Hpa Ⅱ和
Eco R Ⅰ/Msp Ⅰ酶切、扩增产物的多态性, 发现不同组
织间的甲基化水平存在一定差异, 其中胚根组织的
甲基化水平最低(16.8%), 下胚轴次之, 而子叶的甲
基化程度最高(20.2%, 表3). 在HPLC 的分析结果中,
表3 MSAP 法和HPLC 法检测不同器官组织的甲基化水平
组织
MSAP HPLC 胚根
16.8% 20.6% 下胚轴
19.7% 28.3% 子叶
20.2% 31.7%
甲基化程度最高的也是子叶(31.7%), 其次是下胚轴, 胚根最低(20.6%), 与MSAP 分析结果相同(表3).
在胚根、下胚轴和子叶3个不同组织间检测到多态性的片段有39条, 这些组织特异性甲基化的片段可以分为15种类型(T01~T15, 表4), 其中T07类的片段数目最多, 共12条. 这些片段仅出现在胚根的H 和M 泳道中, 而在下胚轴和子叶中都无带, 表明下胚轴和子叶组织中的CCGG 位点发生了完全甲基化(5m C 5m CGG 或5m CCGG), 而胚根则未发生甲基化.
表4 油菜幼苗组织特异性的甲基化类型
胚根
下胚轴
子叶
带型
H M H M H M
数目
T01 + + + + +
? 2 T02 + + + + ? ? 4 T03 + + + ? ? ? 2 T04 + + + ? + ? 2 T05 + + ? + ? + 2 T06 + + ? + ? ? 3 T07 + + ? ? ? ? 12 T08 + ? + ? ? ? 1 T09 + ? ? ? + ? 1 T10 ? + ? ? + ?
1
T11 ? + ? ? ? + 1 T12 ? ? ? ? + + 2
T13 ? ? + ? + ?
3
T14 ?
?
?
+
?
+ 2 T15
? ? ? ? ? + 1
2.4 甲基化多态性片段的验证和序列分析
对部分甲基化多态性片段进行回收、克隆、Southern 杂交验证和测序, 以便了解甲基化片段在基
因组上的分布规律. 这些片段包括干种子特异性甲
基化片段(M1, M2, M3和M4)、萌发种子特异性甲基
化片段(M5, M6, M7和M8)、胚根特异性甲基化片段
(M9)、下胚轴特异性甲基化片段(M10)及子叶特异性
甲基化片段(M11). 选取有代表性的发育时期特异性
甲基化片段M5和组织特异性甲基化片段M10为探
针, 与不同发育时期或不同组织的总DNA 进行
Southern 杂交, 以验证甲基化多态性的真实性. 结果表明, M5探针在干种子的H 泳道中检测到的带纹较小, 而在其他3个泳道中检测到的片段较大(图3(a)), 与MSAP 的带型变化(表2, D2类)相吻合. 在探针M10的杂交结果中, 子叶、下胚轴和胚根3个组织的H 泳道中都检测到分子量较大的差异片段, 而M 泳
第
50卷 第24期 2005年12月
论 文
图3 Southern blot 验证DNA 甲基化的带型
(a) 探针M5的杂交结果, 箭头所指为差异片段; (b) 探针M10的杂交结果, 箭头所指为特征片段. H, Eco R Ⅰ/Hpa Ⅱ酶切产物; M, Eco R Ⅰ/Msp Ⅰ酶切产物; L, 标准分子量λ/Eco R Ⅰ+Hin d Ⅲ; 1, 干种子; 2, 幼
苗; 3, 子叶; 4, 下胚轴; 5, 胚根
道中仅在子叶和胚根中检测到小分子量的差异片段, 同样印证了MSAP 的检测结果(表4, T11类), 即下胚轴的CCGG 位点中两个胞嘧啶发生了完全甲基化, Msp Ⅰ没有活性, 不能产生小分子量的特征片段(图3(b)).
对克隆的11个片段进行了序列测定和同源性搜
索, 结果发现这些片段的分子量都较小(26~174 bp), 而且其中仅有一个片段(M8)的内部包含有同裂酶Hpa Ⅱ/Msp Ⅰ的识别位点(CCGG), 说明所检测到的差异片段主要是由于胞嘧啶缺乏甲基化, 同裂酶依然能够切割所产生的. 在11个测序片段中, 与基因编码区高度同源的有6个, 与假基因同源的有1个, 与非编码区同源的有4个, 表明基因编码区和非编码区中CCGG 位点发生甲基化的概率基本相等(表5).
3 讨论
检测植物基因组中胞嘧啶甲基化主要有两类方法. 第一类是检测基因组中全部胞嘧啶的甲基化程度, 比如HPLC 法, 其原理是用核酸酶将总DNA 降解为单个核苷酸后再用HPLC 方法定量分析, 从而能够从总体上测定出基因组中胞嘧啶的甲基化程度[18]. 第二类是检测特定DNA 序列的甲基化程度, 比如 MSAP 法. MSAP 是由AFLP 改进而来的, 其原理是用甲基化敏感的同裂酶Hpa Ⅱ和Msp Ⅰ代替高频内切酶Mse Ⅰ, 每个DNA 样品分别用Eco R Ⅰ/Hpa Ⅱ和Eco R Ⅰ/Msp Ⅰ两组内切酶同时消化, 加上特定的接头, 经选择性PCR 扩增, 然后在PAGE 凝胶上加以电泳检测[19]. 由于Hpa Ⅱ和Msp Ⅰ的识别序列相同(5′-
表5 组织和发育时期特异性甲基化片段的序列分析
片段名称
片段大小/bp
谱带类型b)
序列同源性
M1 152 B1
c) d)Thiobacillus denitrificans ATCC 25259. 硫氧还蛋白家族 M2 44 B1
XM_505961 (3072-3095)
Yarrowia lipolytica CLIB99, YALI0F27753g mRNA
M3 80 B1
AF219992 (6124-6143)
Mus musculus aquaporin-4 (Aqp4) gene, 外含子A, B, 0, X, 1和2 及部分cds M4 106 A1
BX883044 (34213-34232)
Rattus norvegicus 第20号染色体, 主要组织相容性复合物 M5 115 D2
AP006444 (78681-78745)
Brassica napus 线粒体DNA. NADH 亚基1 M6 109 D2
CR734755 (381-403)
Tetraodon nigroviridis 全长cDNA M7 26 D2
AF428287 (395-415)
Arabidopsis AT3g30390/T6J22_16 mRNA, 全部cds. M8 a) 45 D1
AL162651 (58918-58948)
Arabidopsis DNA, 第3号染色体, BAC F26K9克隆. M9 174 T13
AJ430548 (197-310)
Brassica napus 转座子14G32-20, RT 反转录酶假基因 M10 144 T11
AY606857 (104-126)
Mus musculus M46, 动脉粥样硬化相关DNA 甲基化多态片段, 染色体组序列. M11 115 T08
AL049711 (59220-59275)
Arabidopsis DNA, 第3号染色体, BAC F4F15克隆 a) 该片段内部存在一个CCGG 识别位点; b) 谱带类型说明见表2和表4; c) 序列登陆号; d) 括号内数据为序列同源区
论文第50卷第24期 2005年12月
CCGG-3′), 但对甲基化的敏感程度不同, 即HpaⅡ不能切割双链甲基化的5m CCGG, C5m CGG和5m C5m CGG, 但能切割单链甲基化的序列, 而MspⅠ能切割C5m CGG但不能切割5m CCGG序列[17], 因此CCGG发生甲基化后将导致Eco RⅠ/HpaⅡ和Eco RⅠ/MspⅠ
的酶切、扩增产物产生多态性(表6). 反之, 通过比较电泳谱带的差异, 可以推测出CCGG的甲基化情况. 表6 同裂酶HpaⅡ和MspⅠ的甲基化敏感性及限制性谱带
内切酶的消化性限制性带型
甲基化状态
HpaⅡMspⅠ H M CCGG
GGCC 有活性有活性 + + C5m CGG
GG5m CC 无活性有活性? +
5m CCGG
GGCC 有活性无活性 + ?
5m C5m CGG
GG5m C5m C 无活性无活性??我们同时使用MSAP和HPLC两种方法分析了油菜基因组中胞嘧啶的甲基化情况. 在MSAP的检测结果中, 油菜幼苗3个器官组织的甲基化水平存在较大差异, 其中子叶的甲基化水平最高, 下胚轴次之, 胚根最低, 变化范围在16.8%~20.2%之间. HPLC的检测结果与MSAP一致, 3个组织器官的甲基化水平在20.6%~31.7%之间. 因此, MSAP的分析结果是可靠的, 但其检测结果比HPLC偏低. MSAP技术已经应用于真菌[19]、水稻[20]、拟南芥[21]和辣椒[15]等物种的基因组DNA甲基化研究中, 而且在水稻中DNA甲基化产生的多态性得到了Southern杂交的验证[20], 在拟南芥中通过序列测定和比较分析证明了MSAP 检测结果的有效性和可靠性[21]. MSAP的优点是技术简单, 无需大型仪器, 成本低, 效率高, 而且分析结果直接与基因序列联系起来, 为研究基因表达与DNA甲基化的相互关系提供了一个十分有效的方法. 不过, MSAP在应用中也有明显的局限性: (ⅰ) 由于使用了4%~6%的测序胶, 该方法只能有效检测分子量在50~1500 bp范围内的片段[22], 分子量过大或过小都无法显示; (ⅱ) 由于使用了同裂酶HpaⅡ和MspⅠ, 该方法只能检测基因组中CCGG序列的甲基化情况, 而CCGG序列仅仅是基因组中的很小一部分(1/256)[20]; (ⅲ) 由于所使用同裂酶的分辨能力有限, 只能检测CCGG位点中的部分甲基化情况, 对于某些甲基化情况是无法识别和检测的, 造成检测结果偏低[20].
本研究的目的之一是了解油菜种子在萌发过程中DNA甲基化的变化规律. MSAP研究发现, 在油菜种子的基因组中大约有15.7%的CCGG位点发生了胞嘧啶甲基化, 这一结果与水稻剑叶组织16.3%的甲基化水平十分接近[20], 但与拟南芥幼苗组织 35%~ 43%的甲基化水平差异较大[21]. 这种不同物种间DNA甲基化水平的差异, 一方面可能与检测方法(如引物数目、扩增条件、电泳时间和显带方法等)和实验材料(如种子, 幼苗和成熟叶片等)有关, 另一方面可能是遗传控制的结果. 在拟南芥中已有研究报道证实, 染色体NOR区的甲基化水平变异是受到普通遗传因子和表观遗传因子共同控制的[23].
一个十分有趣的现象是在油菜种子萌发过程中同时检测到甲基化和去甲基化事件, 而且去甲基化事件占据绝对主导地位. 前人的研究资料表明, 植物在发育过程中, 胞嘧啶的甲基化对基因具有重要的表达调控作用[24], 在基因的内部或邻近区域发生甲基化可以抑制这些基因的表达, 而去甲基化后又可以激活基因的表达[25]. 因此, 对于这些基因而言, 去甲基化似乎是基因表达的必须步骤. 油菜种子萌发过程中检测到大量的去甲基化事件, 是与种子萌发后启动了大量基因的表达相一致的. 在种子萌发过程中同时还观察到少量的甲基化事件, 暗示部分基因正在关闭. 这似乎表明, 植物通过DNA甲基化和去甲基化的方式实现基因的有序表达.
我们的另外一个目的是比较油菜不同器官组织DNA甲基化水平的差异. 研究发现在油菜萌发8 d的幼苗中, 胚根的甲基化水平最低, 下胚轴次之, 而子叶的甲基化水平最高. 在其他的物种中也报道过不同器官组织中甲基化水平存在巨大差异的现象. 在西红柿中, 种子的甲基化水平比成熟叶片高, 而成熟叶片比幼苗高[8]. 与此相似, 水稻中幼苗的甲基化程度比剑叶高[20]. 根据目前已知的知识, 这种不同组织间的甲基化水平差异是理所当然的, 因为甲基化是植物在发育和分化过程中控制基因表达的一种调控机制[3], 尽管还不清楚甲基化调控基因表达的具体过程.
我们还对不同组织和不同发育时期发生特异性甲基化的部分片段进行了序列分析. 同源性搜索结果表明, 11个甲基化多态性片段中大约一半的片段与基因编码区同源, 另一半与非编码区同源, 即基因编码区和非编码区的CCGG序列发生甲基化的频率
第50卷第24期 2005年12月论文
相等, 这一结果与Cervera等人在拟南芥中的研究结果相似[21]. 通过序列比对和数据检索, 我们初步获得了一些可能与油菜种子发育和器官分化有关的基因片段, 这些结果为进一步研究油菜生长发育与特异基因表达调控的关系奠定了基础.
致谢感谢张银波、李俊在片段克隆和Southern杂交方面所提供的帮助. 本工作为国家自然科学基金(批准号: 30170585)、湖北省自然科学基金(批准号: 2004ABA123)和农业部油料作物遗传改良重点实验室开放基金(批准号: 200402)的资助项目.
参考文献
1 Gonzalgo M L, Jones P A. Mutagenic and epigenetic effects of
DNA methylation. Mutat Res, 1997, 386(2): 107~118
2 Holliday R. The inheritance of epigenetic defects. Science, 1987,
238(4824): 163~170
3 Finnegan E J, Brettell R I S, Dennis E S. The role of DNA methy-
laiton in the regulation of plant gene expression. In: Jost J P, Saluz
H P, eds. DNA Methylation: Molecular Biology and Biological
Significance. Basel: Birkhauser, 1993. 218~261
4 Ronemus M J, Galbiati M, Tchnor C, et al. Demethylation-induced
developmental pleiotropy in Arabidopsis. Science, 1996, 273(5275): 654~657
5 Jacobsen S E, Sakai H, Finnegan E J, et al. Ectopic hypermethyla-
tion of flower-specific genes in Arabidopsis. Curr Biol, 2000,
10(4): 179~186
6 Sherman J D, Talbert L E. Vernalization-induced changes of the
DNA methylation pattern in winter wheat. Genome, 2002, 45(2):
253~60
7 Bastow R, Mylne J S, Lister C, et al. Vernalization requires epi-
genetic silencing of FLC by histone methylation. Nature, 2004,
427(6970): 164~167
8 Messeguer R, Ganal M W, Steffens J C, et al. Characterization of
the level, target sites and inheritance of cytosine methylation in
tomato nuclear DNA. Plant Mol Boil, 1991, 16(5): 753~770
9 Lund G, Messing J, Viotti A. Endosperm specific demethylation
and activation of specific alleles of alpha-tubulin genes of Zea
may. Mol Gen Genet, 1995, 246(6): 716~722
10 Dhar M S, Pethe V V, Gupta V S, et al. Predominance and tissue
specificity of adenine methylation in rice. Theor Appl Genet, 1990,
80(3): 402~408
11 Labra M, Grassi F, Imazio S, et al. Genetic and DNA-methylaiton
changes induced by potassium dichromate in Brassica napus L.
Chemosphere, 2004, 54(8): 1049~1058
methylated at symmetrical and non-symmetrical positions in Bras-
sica napus: identification of a preferred target site for asymmetrical methylation. Plant Mol Biol, 1999, 39(2): 243~255
13 陆光远, 杨光圣, 傅廷栋. 一种简便的应用于油菜的AFLP银染
技术. 华中农业大学学报, 2001, 20(5): 413~415
14 Chakrabarty D, Yu K W, Paek K Y. Detection of DNA methylation
changes during somatic embryogenesis of Siberian ginseng (Eleu-
terococcus senticosus). Plant Sci, 2003, 165(1): 61~68
15 Portis E, Acquadro A, Comino C, et al. Analysis of DNA methyla-
tion during germination of peper (Capsicum annuum L) seeds us-
ing methylation-sensitive amplification polymorphism (MSAP).
Plant Sci, 2004, 166(1): 169~178
16 Sharpe A G, Parkin I A G, Keith D J, et al. Frequent nonreciprocal
translocations in the amphidiploid genome of oilseed rape (Bras-
sica napus). Genome, 1995, 38(6): 1112~1121
17 Mcclelland M, Nelson M, Raschke E. Effect of site-specific modi-
fication on restriction endonucleases and DNA modification me-
thyltransferases. Nucleic Acids Res, 1994, 22(17): 3640~3659
18 Palmgren G, Mattson O, Okkels F T. Employment of hydrolytic
enzymes in the study of the levels of DNA methylation. Biochem Biophys Acta, 1990, 1049(3): 293~297
19 Reyna-Lopez G E, Simpson J, Ruiz-Herrera J. Differences in DNA
methylation patterns are detectable during the dimorphic transition of fungi by amplification of restriction polymorphism. Mol Gene Genet, 1997, 253(6): 703~710
20 Xiong L Z, Xu C G, Saghai M A, et al. Patterns of cytosine me-
thylation in an elite rice hybrid and its parental lines detected by methylation sensitive amplification polymorphism technique. Mol Gen Genet, 1999, 261(3): 439~446
21 Cervara M T, Ruin-Garcia L, Martinez-Zapater J M. Analysis of
DNA methylation in Arabidopsis thaliana based on methyla-
tion-sensitive AFLP markers. Mol Genet Genomics, 2002, 268(4): 543~552
22 Xu M L, Li X Q, Korban S S. AFLP-based detection of DNA me-
thylation. Plant Mol Boil Rep, 2000, 18(4): 321~330
23 Riddle N C, Richards E J. The control of natural variation in cyto-
sine methylaiton in Arabidopsis. Genetics, 2002, 162(1): 355~363 24 Siroky J, Ruffini-Castiglione M, Vyskot B. DNA methylation pat-
tern of Melandrium album chromosomes. Chromosome Res, 1998, 6(6): 441~446
25 Grunau C, Renault E, Rosenthal A, et al. MethyDB-a public data-
base for DNA methylation data. Nucleic Acid Res, 2001, 29(1): 270~274
(2005-07-26收稿, 2005-10-31收修改稿)
12 Goubely C, Arnaud P, Tatout C, et al. S1 SINE retroposons are