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pLVX-Tight-Puro慢病毒载体使用说明

pLVX-Tight-Puro慢病毒载体使用说明
pLVX-Tight-Puro慢病毒载体使用说明

pLVX-Tight-Puro

pLVX-Tight-Puro 载体基本信息:

载体名称:

pLVX-Tight-Puro 质粒类型: 慢病毒载体;四环素诱导载体;Tet-On 载体

高拷贝/低拷贝:

-- 启动子:

pTight 克隆方法: 多克隆位点,限制性内切酶

载体大小:

7790bp 5'

测序引物及序列:

-- 3' 测序引物及序列:

-- 载体标签:

-- 载体抗性:

Ampicillian 筛选标记:

Puromycin 克隆菌株:

Stbl3, E.coli 备注: pLVX-Tight-Puro 载体是Tet-On 系统的应答载体,与之对应的调控载体是pLVX-Tet-On-Advanced

稳定性: 稳表达

组成型: 诱导型

病毒/非病毒: 慢病毒

pLVX-Tight-Puro 载体质粒图谱和多克隆位点信息:

pLVX-Tight-Puro载体序列:

ORIGIN

1 TGGAAGGGCT AATTCACTCC CAAAGAAGAC AAGATATCCT TGATCTGTGG ATCTACCACA

61 CACAAGGCTA CTTCCCTGAT TAGCAGAACT ACACACCAGG GCCAGGGGTC AGATATCCAC 121 TGACCTTTGG ATGGTGCTAC AAGCTAGTAC CAGTTGAGCC AGATAAGGTA GAAGAGGCCA 181 ATAAAGGAGA GAACACCAGC TTGTTACACC CTGTGAGCCT GCATGGGATG GATGACCCGG 241 AGAGAGAAGT GTTAGAGTGG AGGTTTGACA GCCGCCTAGC ATTTCATCAC GTGGCCCGAG 301 AGCTGCATCC GGAGTACTTC AAGAACTGCT GATATCGAGC TTGCTACAAG GGACTTTCCG 361 CTGGGGACTT TCCAGGGAGG CGTGGCCTGG GCGGGACTGG GGAGTGGCGA GCCCTCAGAT 421 CCTGCATATA AGCAGCTGCT TTTTGCCTGT ACTGGGTCTC TCTGGTTAGA CCAGATCTGA 481 GCCTGGGAGC TCTCTGGCTA ACTAGGGAAC CCACTGCTTA AGCCTCAATA AAGCTTGCCT 541 TGAGTGCTTC AAGTAGTGTG TGCCCGTCTG TTGTGTGACT CTGGTAACTA GAGATCCCTC 601 AGACCCTTTT AGTCAGTGTG GAAAATCTCT AGCAGTGGCG CCCGAACAGG GACTTGAAAG 661 CGAAAGGGAA ACCAGAGGAG CTCTCTCGAC GCAGGACTCG GCTTGCTGAA GCGCGCACGG

721 CAAGAGGCGA GGGGCGGCGA CTGGTGAGTA CGCCAAAAAT TTTGACTAGC GGAGGCTAGA 781 AGGAGAGAGA TGGGTGCGAG AGCGTCAGTA TTAAGCGGGG GAGAATTAGA TCGCGATGGG 841 AAAAAATTCG GTTAAGGCCA GGGGGAAAGA AAAAATATAA ATTAAAACAT ATAGTATGGG 901 CAAGCAGGGA GCTAGAACGA TTCGCAGTTA ATCCTGGCCT GTTAGAAACA TCAGAAGGCT 961 GTAGACAAAT ACTGGGACAG CTACAACCAT CCCTTCAGAC AGGATCAGAA GAACTTAGAT 1021 CATTATATAA TACAGTAGCA ACCCTCTATT GTGTGCATCA AAGGATAGAG ATAAAAGACA 1081 CCAAGGAAGC TTTAGACAAG ATAGAGGAAG AGCAAAACAA AAGTAAGACC ACCGCACAGC 1141 AAGCGGCCGG CCGCTGATCT TCAGACCTGG AGGAGGAGAT ATGAGGGACA ATTGGAGAAG 1201 TGAATTATAT AAATATAAAG TAGTAAAAAT TGAACCATTA GGAGTAGCAC CCACCAAGGC 1261 AAAGAGAAGA GTGGTGCAGA GAGAAAAAAG AGCAGTGGGA ATAGGAGCTT TGTTCCTTGG 1321 GTTCTTGGGA GCAGCAGGAA GCACTATGGG CGCAGCGTCA ATGACGCTGA CGGTACAGGC 1381 CAGACAATTA TTGTCTGGTA TAGTGCAGCA GCAGAACAAT TTGCTGAGGG CTATTGAGGC 1441 GCAACAGCAT CTGTTGCAAC TCACAGTCTG GGGCATCAAG CAGCTCCAGG CAAGAATCCT 1501 GGCTGTGGAA AGATACCTAA AGGATCAACA GCTCCTGGGG ATTTGGGGTT GCTCTGGAAA 1561 ACTCATTTGC ACCACTGCTG TGCCTTGGAA TGCTAGTTGG AGTAATAAAT CTCTGGAACA 1621 GATTTGGAAT CACACGACCT GGATGGAGTG GGACAGAGAA ATTAACAATT ACACAAGCTT 1681 AATACACTCC TTAATTGAAG AATCGCAAAA CCAGCAAGAA AAGAATGAAC AAGAATTATT 1741 GGAATTAGAT AAATGGGCAA GTTTGTGGAA TTGGTTTAAC ATAACAAATT GGCTGTGGTA 1801 TATAAAATTA TTCATAATGA TAGTAGGAGG CTTGGTAGGT TTAAGAATAG TTTTTGCTGT 1861 ACTTTCTATA GTGAATAGAG TTAGGCAGGG ATATTCACCA TTATCGTTTC AGACCCACCT 1921 CCCAACCCCG AGGGGACCCG ACAGGCCCGA AGGAATAGAA GAAGAAGGTG GAGAGAGAGA 1981 CAGAGACAGA TCCATTCGAT TAGTGAACGG ATCTCGACGG TATCGCCTTT AAAAGAAAAG 2041 GGGGGATTGG GGGGTACAGT GCAGGGGAAA GAATAGTAGA CATAATAGCA ACAGACATAC 2101 AAACTAAAGA ATTACAAAAA CAAATTACAA AAATTCAAAA TTTTCGGGTT TATTACAGGG 2161 ACAGCAGAGA TCCAGTTTAT CGATGAGGCC CTTTCGTCTT CACTCGAGTT TACTCCCTAT 2221 CAGTGATAGA GAACGTATGT CGAGTTTACT CCCTATCAGT GATAGAGAAC GATGTCGAGT 2281 TTACTCCCTA TCAGTGATAG AGAACGTATG TCGAGTTTAC TCCCTATCAG TGATAGAGAA 2341 CGTATGTCGA GTTTACTCCC TATCAGTGAT AGAGAACGTA TGTCGAGTTT ATCCCTATCA 2401 GTGATAGAGA ACGTATGTCG AGTTTACTCC CTATCAGTGA TAGAGAACGT ATGTCGAGGT 2461 AGGCGTGTAC GGTGGGAGGC CTATATAAGC AGAGCTCGTT TAGTGAACCG TCAGATCGCC 2521 TGGAGAAGGA TCCGCGGCCG CGCCGGCTCT AGATCGCGAA CGCGTGAATT CTACCGGGTA 2581 GGGGAGGCGC TTTTCCCAAG GCAGTCTGGA GCATGCGCTT TAGCAGCCCC GCTGGGCACT 2641 TGGCGCTACA CAAGTGGCCT CTGGCCTCGC ACACATTCCA CATCCACCGG TAGGCGCCAA 2701 CCGGCTCCGT TCTTTGGTGG CCCCTTCGCG CCACCTTCTA CTCCTCCCCT AGTCAGGAAG 2761 TTCCCCCCCG CCCCGCAGCT CGCGTCGTGC AGGACGTGAC AAATGGAAGT AGCACGTCTC 2821 ACTAGTCTCG TGCAGATGGA CAGCACCGCT GAGCAATGGA AGCGGGTAGG CCTTTGGGGC 2881 AGCGGCCAAT AGCAGCTTTG CTCCTTCGCT TTCTGGGCTC AGAGGCTGGG AAGGGGTGGG 2941 TCCGGGGGCG GGCTCAGGGG CGGGCTCAGG GGCGGGGCGG GCGCCCGAAG GTCCTCCGGA 3001 GGCCCGGCAT TCTGCACGCT TCAAAAGCGC ACGTCTGCCG CGCTGTTCTC CTCTTCCTCA 3061 TCTCCGGGCC TTTCGACCTG CAGCCCAAGC TTACCATGAC CGAGTACAAG CCCACGGTGC 3121 GCCTCGCCAC CCGCGACGAC GTCCCCAGGG CCGTACGCAC CCTCGCCGCC GCGTTCGCCG 3181 ACTACCCCGC CACGCGCCAC ACCGTCGATC CGGACCGCCA CATCGAGCGG GTCACCGAGC 3241 TGCAAGAACT CTTCCTCACG CGCGTCGGGC TCGACATCGG CAAGGTGTGG GTCGCGGACG 3301 ACGGCGCCGC GGTGGCGGTC TGGACCACGC CGGAGAGCGT CGAAGCGGGG GCGGTGTTCG

3361 CCGAGATCGG CCCGCGCATG GCCGAGTTGA GCGGTTCCCG GCTGGCCGCG CAGCAACAGA 3421 TGGAAGGCCT CCTGGCGCCG CACCGGCCCA AGGAGCCCGC GTGGTTCCTG GCCACCGTCG 3481 GCGTCTCGCC CGACCACCAG GGCAAGGGTC TGGGCAGCGC CGTCGTGCTC CCCGGAGTGG 3541 AGGCGGCCGA GCGCGCCGGG GTGCCCGCCT TCCTGGAGAC CTCCGCGCCC CGCAACCTCC 3601 CCTTCTACGA GCGGCTCGGC TTCACCGTCA CCGCCGACGT CGAGGTGCCC GAAGGACCGC 3661 GCACCTGGTG CATGACCCGC AAGCCCGGTG CCTGACGGGC GCGTCTGGAA CAATCAACCT 3721 CTGGATTACA AAATTTGTGA AAGATTGACT GGTATTCTTA ACTATGTTGC TCCTTTTACG 3781 CTATGTGGAT ACGCTGCTTT AATGCCTTTG TATCATGCTA TTGCTTCCCG TATGGCTTTC 3841 ATTTTCTCCT CCTTGTATAA ATCCTGGTTG CTGTCTCTTT ATGAGGAGTT GTGGCCCGTT 3901 GTCAGGCAAC GTGGCGTGGT GTGCACTGTG TTTGCTGACG CAACCCCCAC TGGTTGGGGC 3961 ATTGCCACCA CCTGTCAGCT CCTTTCCGGG ACTTTCGCTT TCCCCCTCCC TATTGCCACG 4021 GCGGAACTCA TCGCCGCCTG CCTTGCCCGC TGCTGGACAG GGGCTCGGCT GTTGGGCACT 4081 GACAATTCCG TGGTGTTGTC GGGGAAGCTG ACGTCCTTTC CATGGCTGCT CGCCTGTGTT 4141 GCCACCTGGA TTCTGCGCGG GACGTCCTTC TGCTACGTCC CTTCGGCCCT CAATCCAGCG 4201 GACCTTCCTT CCCGCGGCCT GCTGCCGGCT CTGCGGCCTC TTCCGCGTCT TCGCCTTCGC 4261 CCTCAGACGA GTCGGATCTC CCTTTGGGCC GCCTCCCCGC CTGGAATTAA TTCTGCAGTC 4321 GAGACCTAGA AAAACATGGA GCAATCACAA GTAGCAATAC AGCAGCTACC AATGCTGATT 4381 GTGCCTGGCT AGAAGCACAA GAGGAGGAGG AGGTGGGTTT TCCAGTCACA CCTCAGGTAC 4441 CTTTAAGACC AATGACTTAC AAGGCAGCTG TAGATCTTAG CCACTTTTTA AAAGAAAAGA 4501 GGGGACTGGA AGGGCTAATT CACTCCCAAC GAAGACAAGA TATCCTTGAT CTGTGGATCT 4561 ACCACACACA AGGCTACTTC CCTGATTAGC AGAACTACAC ACCAGGGCCA GGGGTCAGAT 4621 ATCCACTGAC CTTTGGATGG TGCTACAAGC TAGTACCAGT TGAGCCAGAT AAGGTAGAAG 4681 AGGCCAATAA AGGAGAGAAC ACCAGCTTGT TACACCCTGT GAGCCTGCAT GGGATGGATG 4741 ACCCGGAGAG AGAAGTGTTA GAGTGGAGGT TTGACAGCCG CCTAGCATTT CATCACGTGG 4801 CCCGAGAGCT GCATCCGGAG TACTTCAAGA ACTGCTGATA TCGAGCTTGC TACAAGGGAC 4861 TTTCCGCTGG GGACTTTCCA GGGAGGCGTG GCCTGGGCGG GACTGGGGAG TGGCGAGCCC 4921 TCAGATCCTG CATATAAGCA GCTGCTTTTT GCCTGTACTG GGTCTCTCTG GTTAGACCAG 4981 ATCTGAGCCT GGGAGCTCTC TGGCTAACTA GGGAACCCAC TGCTTAAGCC TCAATAAAGC 5041 TTGCCTTGAG TGCTTCAAGT AGTGTGTGCC CGTCTGTTGT GTGACTCTGG TAACTAGAGA 5101 TCCCTCAGAC CCTTTTAGTC AGTGTGGAAA ATCTCTAGCA GTAGTAGTTC ATGTCATCTT 5161 ATTATTCAGT ATTTATAACT TGCAAAGAAA TGAATATCAG AGAGTGAGAG GCCTTGACAT 5221 TGCTAGCGTT TACCGTCGAC CTCTAGCTAG AGCTTGGCGT AATCATGGTC ATAGCTGTTT 5281 CCTGTGTGAA ATTGTTATCC GCTCACAATT CCACACAACA TACGAGCCGG AAGCATAAAG 5341 TGTAAAGCCT GGGGTGCCTA ATGAGTGAGC TAACTCACAT TAATTGCGTT GCGCTCACTG 5401 CCCGCTTTCC AGTCGGGAAA CCTGTCGTGC CAGCTGCATT AATGAATCGG CCAACGCGCG 5461 GGGAGAGGCG GTTTGCGTAT TGGGCGCTCT TCCGCTTCCT CGCTCACTGA CTCGCTGCGC 5521 TCGGTCGTTC GGCTGCGGCG AGCGGTATCA GCTCACTCAA AGGCGGTAAT ACGGTTATCC 5581 ACAGAATCAG GGGATAACGC AGGAAAGAAC ATGTGAGCAA AAGGCCAGCA AAAGGCCAGG 5641 AACCGTAAAA AGGCCGCGTT GCTGGCGTTT TTCCATAGGC TCCGCCCCCC TGACGAGCAT 5701 CACAAAAATC GACGCTCAAG TCAGAGGTGG CGAAACCCGA CAGGACTATA AAGATACCAG 5761 GCGTTTCCCC CTGGAAGCTC CCTCGTGCGC TCTCCTGTTC CGACCCTGCC GCTTACCGGA 5821 TACCTGTCCG CCTTTCTCCC TTCGGGAAGC GTGGCGCTTT CTCATAGCTC ACGCTGTAGG 5881 TATCTCAGTT CGGTGTAGGT CGTTCGCTCC AAGCTGGGCT GTGTGCACGA ACCCCCCGTT 5941 CAGCCCGACC GCTGCGCCTT ATCCGGTAAC TATCGTCTTG AGTCCAACCC GGTAAGACAC

6001 GACTTATCGC CACTGGCAGC AGCCACTGGT AACAGGATTA GCAGAGCGAG GTATGTAGGC

6061 GGTGCTACAG AGTTCTTGAA GTGGTGGCCT AACTACGGCT ACACTAGAAG AACAGTATTT

6121 GGTATCTGCG CTCTGCTGAA GCCAGTTACC TTCGGAAAAA GAGTTGGTAG CTCTTGATCC

6181 GGCAAACAAA CCACCGCTGG TAGCGGTGGT TTTTTTGTTT GCAAGCAGCA GATTACGCGC

6241 AGAAAAAAAG GATCTCAAGA AGATCCTTTG ATCTTTTCTA CGGGGTCTGA CGCTCAGTGG

6301 AACGAAAACT CACGTTAAGG GATTTTGGTC ATGAGATTAT CAAAAAGGAT CTTCACCTAG

6361 ATCCTTTTAA ATTAAAAATG AAGTTTTAAA TCAATCTAAA GTATATATGA GTAAACTTGG

6421 TCTGACAGTT ACCAATGCTT AATCAGTGAG GCACCTATCT CAGCGATCTG TCTATTTCGT

6481 TCATCCATAG TTGCCTGACT CCCCGTCGTG TAGATAACTA CGATACGGGA GGGCTTACCA

6541 TCTGGCCCCA GTGCTGCAAT GATACCGCGA GACCCACGCT CACCGGCTCC AGATTTATCA

6601 GCAATAAACC AGCCAGCCGG AAGGGCCGAG CGCAGAAGTG GTCCTGCAAC TTTATCCGCC

6661 TCCATCCAGT CTATTAATTG TTGCCGGGAA GCTAGAGTAA GTAGTTCGCC AGTTAATAGT

6721 TTGCGCAACG TTGTTGCCAT TGCTACAGGC ATCGTGGTGT CACGCTCGTC GTTTGGTATG

6781 GCTTCATTCA GCTCCGGTTC CCAACGATCA AGGCGAGTTA CATGATCCCC CATGTTGTGC

6841 AAAAAAGCGG TTAGCTCCTT CGGTCCTCCG ATCGTTGTCA GAAGTAAGTT GGCCGCAGTG

6901 TTATCACTCA TGGTTATGGC AGCACTGCAT AATTCTCTTA CTGTCATGCC ATCCGTAAGA

6961 TGCTTTTCTG TGACTGGTGA GTACTCAACC AAGTCATTCT GAGAATAGTG TATGCGGCGA

7021 CCGAGTTGCT CTTGCCCGGC GTCAATACGG GATAATACCG CGCCACATAG CAGAACTTTA

7081 AAAGTGCTCA TCATTGGAAA ACGTTCTTCG GGGCGAAAAC TCTCAAGGAT CTTACCGCTG

7141 TTGAGATCCA GTTCGATGTA ACCCACTCGT GCACCCAACT GATCTTCAGC ATCTTTTACT

7201 TTCACCAGCG TTTCTGGGTG AGCAAAAACA GGAAGGCAAA ATGCCGCAAA AAAGGGAATA

7261 AGGGCGACAC GGAAATGTTG AATACTCATA CTCTTCCTTT TTCAATATTA TTGAAGCATT

7321 TATCAGGGTT ATTGTCTCAT GAGCGGATAC ATATTTGAAT GTATTTAGAA AAATAAACAA

7381 ATAGGGGTTC CGCGCACATT TCCCCGAAAA GTGCCACCTG ACGTCGACGG ATCGGGAGAT

7441 CAACTTGTTT ATTGCAGCTT ATAATGGTTA CAAATAAAGC AATAGCATCA CAAATTTCAC

7501 AAATAAAGCA TTTTTTTCAC TGCATTCTAG TTGTGGTTTG TCCAAACTCA TCAATGTATC

7561 TTATCATGTC TGGATCAACT GGATAACTCA AGCTAACCAA AATCATCCCA AACTTCCCAC

7621 CCCATACCCT ATTACCACTG CCAATTACCT GTGGTTTCAT TTACTCTAAA CCTGTGATTC

7681 CTCTGAATTA TTTTCATTTT AAAGAAATTG TATTTGTTAA ATATGTACTA CAAACTTAGT

7741 AGTTTTTAAA GAAATTGTAT TTGTTAAATA TGTACTACAA ACTTAGTAGT

//

pLVX-Tight-Puro其他相关慢病毒载体:

Tet-pLKO-neo Tet-pLKO-puro pPACKH1-GAG

pMD2.G pCMV-dR8.2-dvpr pLKO.1-GFP-shRNA pLKO.1-TRC control pLKO.1-hygro pLKO.1-TRC

pCDH-MSCV-MCS-EF1-copGFP pCDH-MSCV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro FUW-tetO-hOKMS FUW-tetO-hOCT4 FUW-tetO-hSOX2 FUW-tetO-hKLF4

FUW pLVX-AcGFP1-N1 pLVX-AcGFP1-C1

pLVX-AmCyan1-N1 pLVX-DsRed-Express2-C1 pLVX-DsRed-Express2-N1 pLVX-DsRed-Monomer-N1 pLVX-PAmCherry-C1 pLVX-PAmCherry-N1 pLVX-ZsGreen1-N1 pLVX-IRES-ZsGreen1 pLVX-IRES-mCherry pLVX-mCherry-C1 pLVX-mCherry-N1 pLVX-tdTomato-C1 pLKO.1-puro pLentilox 3.7 pLVX-Tet-On-Advanced

pLVX-IRES-Puro pLVX-IRES-Neo pLVX-IRES-Hyg

pLVX-EF1α-DsRed-Monomer-C1 pLVX-EF1α-AcGFP1-N1 pLVX-EF1α-AcGFP1-C1 pLVX-EF1α-mCherry-C1 pLVX-EF1α-IRES-mCherry pLVX-EF1α-IRES-ZsGreen1 pLVX-MetLuc Control pLVX-MetLuc pLVX-Hom-Mem1

pLVX-Het-2 pLVX-DD-AcGFP1-Actin pPRIME-TET-GFP-FF3

pSIH1-H1-CopGFP pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro pCDF1-MCS2-EF1-copGFP pLOX-CWBmi1 pLOX-CW-CRE

pRSV-rev pMDLg-pRRE pLL3.7

pLVX-DD-AmCyan1 Control pLVX-DD-AmCyan1 Reporter pLVX-DD-tdTomato Reporter pLVX-DD-tdTomato Control pLVX-PTuner-Green pLVX-CherryPicker2

pLVX-TetOne-Puro-Luc pLVX-TetOne pLVX-TetOne-Puro

pLVX-TetOne-Luc pLVX-rHom-Nuc1 pLVX-rHom-Sec1

pLVX-rHom-1 pLVX-Hom-Nuc1 pLVX-Het-Nuc1

pLVX-PTuner pLVX-PTuner2 pLVX-DD-ZsGreen1 Reporter pLVX-Het-1 pLVX-CherryPicker Control pLVX-Tet3G

pCDH-CMV-MCS-EF1-RFP-T2A-Puro pCDH-CMV-MCS-EF1-Hygro pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo pCDH-MCS-T2A-Puro-MSCV pCDH1-MCS2-EF1-copGFP pCDF1-MCS2-EF1-Puro pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP pWPXL pLVX-TRE3G-ZsGreen1 pLVX-TRE3G-mCherry pLenti6.3-EmGFP-BveI miR pLenti6/V5-GW/lacZ

pLenti6.3/V5-GW/EmGFP pLenti6.3-MCS pLenti6.3-DsRed2-BveI miR pLenti6.3-MCS-IRES2-EGFP pLVX-shRNA2 psPAX2

VSV-G pSico PGK Puro pcDNA6.2-DsRed2-MCS1 miR pcDNA6.3-EmGFP-NC- II pcDNA6.2-EmGFP-NC- I pcDNA6.2-EmGFP-BsaI miR pLenti6.3-BveI miR pLenti6.3-MCS-IRES2-DsRed2 pLEX-MCS

pGIPZ pLP2 pLP1

FUGW pFUGW pLOX-Ttag-iresTK

pMDLg/pRRE pLentG-KOSM pCMV-dR8.91

pLVX-TRE3G-Luc Control pLVX-TRE3G-IRES pCgpv

pSico pSicoR pLVTHM

pGensil-1 pLVX-EF1α-IRES-Puro pCDF1-MCS2-EF1-copGFP pPACKH1-REV pLVX-Het-Mem1 pLVX-shRNA1

pLKO.1-puro-GFP-siRNA pPRIME-TREX-GFP-FF3 pcDNA6.2-DsRed2-BsmBI miR pCDH-MSCV-MCS-EF1-Puro pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP pLVX-TRE3G

FUW-tetO-hMYC pLOX-TERT-iresTK pLP/VSVG

FUW-M2rtTA pCDH-EF1-MCS-(PGK-Puro) pcDNA6.2-EmGFP-MCS1 miR pLVX-AmCyan1-C1 pLVX-Hom-1 pcDNA6.2-BsaI miR

pLVX-DsRed-Monomer-C1 pLVX-mCherry-Actin pTRIPZ

pLVX-ZsGreen1-C1 pLVX-CherryPicker1 LeGO-iC2

pLVX-IRES-tdTomato pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro pLKO.3G

pLVX-tdTomato-N1 pLVX-PTuner2-C pLVX-Puro

pLVX-Tight-Puro pLVX-DD-ZsGreen1 Control pSicoR PGK Puro

pLVX-EF1α-DsRed-Monomer-N1 pCDH-UbC-MCS-EF1-Hygro pLVTH

pLVX-EF1α-mCherry-N1 pCDH-CMV-MCS-EF1-RFP

慢病毒载体使用手册

LentiCRISPRv2 and lentiGuide-Puro: lentiviral CRISPR/Cas9 and single guide RNA CRISPR (C lustered R egularly I nterspaced S hort P alindromic R epeats) is a microbial nuclease system involved in defense against invading phages and plasmids. CRISPR loci in microbial hosts contain a combination of CRISPR-associated (Cas) genes as well as non-coding RNA elements capable of programming the specificity of the CRISPR-mediated nucleic acid cleavage. Lentiviral CRISPR/Cas can infect a broad variety of mammalian cells by co-expressing a mammalian codon-optimized Cas9 nuclease along with a single guide RNA (sgRNA) to facilitate genome editing (Shalem*, Sanjana*, et al., Science 2014). Protocols for cloning into the lentiviral transfer plasmid and general considerations for producing lentivirus are described below. Separate protocols are available for amplifying the genome-scale CRISPR knock-out (GeCKO) libraries. This protocol is for creating individual lentiviral CRISPR plasmids targeting a single genomic locus. lentiCRISPRv2 (one vector system): This plasmid contains two expression cassettes, hSpCas9 and the chimeric guide RNA. The vector can be digested using BsmB I, and a pair of annealed oligos can be cloned into the single guide RNA scaffold. The oligos are designed based on the target site sequence (20bp) and needs to be flanked on the 3' end by a 3bp NGG PAM sequence, as shown on the next page. lentiGuide-Puro (two vector system): This plasmid expressed only the chimeric guide RNA. It does not contain Cas9. Please use lentiCas9-Blast (a separate lentiviral construct that delivers hSpCas9 and blasticidin resistance) to first integrate Cas9 into your cell line. The lentiGuide-Puro vector can be digested using BsmB I, and a pair of annealed oligos can be cloned into the single guide RNA scaffold. The oligos are designed based on the target site sequence (20bp) and needs to be flanked on the 3' end by a 3bp NGG PAM sequence, as shown on the next page. Which vector to use: lentiCRISPRv2 is identical to the original lentiCRISPRv1 but produces nearly 10X higher titer virus. lentiGuide-Puro produces >100X higher titer virus over lentiCRISPRv1 and should be used in cell lines where Cas9 has already been integrated in (e.g. using the separate lentiCas9-Blast lentivirus). For applications where Cas9 cannot first be introduced (e.g. primary cells), lentiCRISPRv2 is recommended. After transduction, use puromycin to select for cells with lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro. Lentiviral production: Before starting any lentiviral work, please ensure compliance with your Environmental Health and Safety office and government/organization/university. Briefly, to make lentivirus, a transfer plasmid (e.g. lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro) must be co-transfected into HEK293(F)T cells with the packaging plasmids pVSVg (AddGene 8454) and psPAX2 (AddGene 12260). As a positive control for viral production, we often use a CMV-EGFP lentiviral transfer plasmid (eg. AddGene 19319). Target design notes and online resources: For application of Cas9 for site-specific genome editing in eukaryotic cells and organisms, we have computationally identified suitable target sites for the S. pyogenes Cas9 and calculated most likely off-targets within the genome. Please visit https://www.sodocs.net/doc/c09492370.html, to access these Cas9 target design tools. Complete plasmid sequences, protocols, a discussion forum and additional information can be found at the Zhang Lab GeCKO website: https://www.sodocs.net/doc/c09492370.html,/gecko/ . Citation: Please reference the following publications for the use of this material. Improved lentiviral vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Sanjana NE*, Shalem O*, Zhang F. Nature Methods (2014). Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Shalem O*, Sanjana NE*, Hartenian E, Shi X, Scott DA, Mikkelsen T, Heckl D, Ebert BL, Root DE, Doench JG, Zhang F (2014). Science, 343, 83-7. DOI: 10.1126/science.1247005

过表达慢病毒载体构建和包装手册 version1

过表达慢病毒载体构建和包装手册 Version1.0 吉凯基因 二零一一年五月

目录 简介 (3) 第一部分过表达慢病毒载体的制备 实验流程 (4) 实验材料 (5) 过表达克隆制备 (6) 第二部分慢病毒包装与滴度检测 实验流程 (17) 实验材料 (18) L e n t i v i r u s病毒包装 (21) 病毒的收获及浓缩 (22) L e n t i v i r u s滴度测定 (24) 参考文献 (33)

简介 慢病毒(Lentivirus)载体是以人类免疫缺陷型病毒(HIV)为基础发展起来的基因治疗载体,它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力,并可以在体内较长期的表达且安全性高。吉凯基因提供的慢病毒为“自杀”性病毒,即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞,也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代,属于假型病毒。但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险,吉凯基因建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒,除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性,否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。 吉凯基因慢病毒载体系统由GV慢病毒载体系列、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体三质粒组成。GV慢载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件,例如WRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)。通常根据不同的实验目的针对GV载体改造以进行基因功能研究。pHelper 1.0载体中含有HIV病毒的gag基因,编码病毒主要的结构蛋白;pol基因,编码病毒特异性的酶;rev基因,编码调节gag和pol基因表达的调节因子。pHelper 2.0载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因,提供病毒包装所需要的包膜蛋白。 吉凯基因过表达慢病毒产品可通过对GV慢病毒载体的改造和病毒包装,获得带有特定基因序列的慢病毒颗粒,以满足不同的实验需求。 本手册为吉凯基因RNAi慢病毒载体的构建和病毒包装的通用操作流程,目的是为了方便大家交流使用,部分细节内容未能做到一一详述,敬请谅解。同时希望大家能够针对手册中的错误和问题,提出宝贵的意见。

慢病毒转染手册

慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体,它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。 基本概述 慢病毒载体的研究发展得很快,研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞,从而达到良好的的基因治疗效果,在美国已经开展了临床研究,效果非常理想,因此具有广阔的应用前景。 慢病毒的应用 目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差,转移到细胞内的siRNA半衰期短,体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的,因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略,不但使脂质体有效转染的细胞种类增加,而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA,在长期稳定表达载体的细胞中,甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中,是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的,这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列,而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时,它指导的转录就会停止,在转录产物3’端形成1~4个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子,其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游,适合于表达~21ntRNA和~50ntRNA茎环结构(stem loop)。在siRNA表达载体中,构成siRNA的正义与反义链,可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA;也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4~5T转录终止位点之间的茎环结构序列,转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构,在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA的方法,寻找高效的siRNA,然后从中挑选符合载体要求的序列,将其引入siRNA表达载体。 慢病毒载体 慢病毒载体(Lentiviral vector)较逆转录病毒载体有更广的宿主范围,慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒,在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA,实现在多种类型的细胞和转基因

病毒载体概述

病毒载体概述 引言 基因导入系统(gene delivery system)就是基因治疗的核心技术,可分为病毒载体系统与非病毒载体系统。本章主要论述用于人类基因治疗的病毒载体系统。 用于基因治疗的病毒载体应具备以下基本条件: 1、携带外源基因并能包装成病毒颗粒; 2、介导外源基因的转移与表达; 3、对机体不致病。 然而,大多数野生型病毒对机体都具有致病性。因此需要对其进行改造后才能用于人体。原则上,各种类型的病毒都能被改造成病毒载体。但就是由于病毒的多样性及与机体复杂的依存关系,人们至今对许多病毒的生活周期、分子生物学、与疾病发生及发展的关系等的认识还很不全面,从而限制了许多病毒发展成为具有实用性的载体。近20年来,只有少数几种病毒如反转录病毒(包括HIV病毒)、腺病毒、腺病毒伴随病毒、疱疹病毒(包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)、甲病毒等被成功地改造成为基因转移载体并开展了不同程度的应用。 第一节病毒载体产生的原理 病毒载体的产生建立在对病毒的生活周期与分子生物学认识的基础之上。研究病毒载体首先要对病毒的基因组结构与功能有充分的了解,最好能获得病毒基因组全序列信息。病毒基因组可分为编码区与非编码区。编码区基因产生病毒的结构蛋白与非结构蛋白;根据其对病毒感染性复制的影响,又可分为必需基因与非必需基因。非编码区中含有病毒进行复制与包装等功能所必需的顺式作用元件。 各种野生型病毒颗粒都具有一定的包装容量,即对所包装的病毒基因组的长度有一定的限制。一般来说,病毒包装容量不超过自身基因组大小的105~110%。

基因重组技术的发展使病毒载体的产生成为可能。最简单的做法就是,将适当长度的外源DNA插入病毒基因组的非必需区,包装成重组病毒颗粒。比如,本实验室曾将4、5kb的lacZ基因表达盒 (CMV-lacZ-polyA)插入HSV1病毒的UL44(糖蛋白C)基因的XbaI位点中,病毒基因组的其余部分不改变,构建成重组病毒HSV1-lacZ100(吴小兵等,1998)。由于UL44基因产物对于HSV病毒在培养细胞中产毒性感染就是非必需的,因此,该重组病毒可以在细胞中增殖传代。用这种重组病毒感染细胞,能将lacZ基因带入细胞并高效表达。用同样的方法,将AAV-2病毒的rep与cap基因片段(4、3kb)插入HSV1病毒的UL2(编码尿嘧啶DNA糖基化酶)或UL44(编码糖蛋白C)基因中,构建成具有提供重组AAV载体复制与包装所需的全部辅助功能的辅助病毒rHSV-rc(伍志坚等,1999)。 然而,这样的重组病毒作为基因转移载体有许多缺点。首先,许多野生型病毒通过在细胞中产毒性复制而导致细胞裂解死亡;或带有病毒癌基因而使细胞发生转化。因此必须经过改造使其成为复制缺陷性病毒并且删除致癌基因后才能用于基因治疗。其次,插入外源DNA的长度受到很大限制,尤其对于基因组本身较小的病毒如腺病毒伴随病毒(AAV,4、7kb)、反转录病毒(8~10kb)、腺病毒(36kb),如果不去除病毒基因,可供外源DNA插入的容量就十分小。因此,必须删除更多的病毒基因以腾出位置插入较大的外源DNA。为了增加病毒载体插入外源DNA的容量,除了可以删除病毒的非必需基因外,还可以进一步删去部分或全部必需基因,这些必需基因的功能由辅助病毒或包装细胞系反式提供。 病毒载体大体上可分为两种类型: 重组型病毒载体:这类载体就是以完整的病毒基因组为改造对象。一般的步骤就是选择性地删除病毒的某些必需基因尤其就是立早基因或早期基因,或控制其表达;缺失的必需基因的功能由互补细胞反式提供;用外源基因表达单位替代病毒非必需基因区;病毒复制与包装所需的顺式作用元件不变。这类载体一般通过同源重组方法将外源基因表达单位插入病毒基因组中。如在传统的重组腺病毒构建方法中,将外源基因表达盒(exogenous gene expression cassette)插入穿梭质粒(如pXCX2或pFGdX1)的腺病毒同源序列中,与辅助

慢病毒载体包装构建过程

慢病毒载体包装构建过程 原理:慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞,从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞,如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,使用慢病毒载体,能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率,且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加,能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。 概念:慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 来源的一种病毒载体,慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息,是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下,经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒,通过感染细胞或活体组织,实现外源基因在细胞或活体组织中表达。 辅助成分:慢病毒载体辅助成分包括:慢病毒包装质粒和可产生病毒颗粒的细胞系。 慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒,需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞,在细胞中进行病毒的包装,包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中,离心取得上清液后,可以直接用于宿主细胞的感染,目的基因进入到宿主细胞之后,经过反转录,整合到基因组,从而高水平的表达效应分子。 基本原理:慢病毒载体系统由两部分组成,即包装成分和载体成分。

包装成分:由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建,能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。包装成分通常被分开构建到两个质粒上,一个质粒表达Gag和Pol蛋白,另一个质粒表达Env蛋白,其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞),即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。 载体成分:与包装成分互补,即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列,同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。 为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能,需尽量减少二者的同源性,如将包装成分上5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、3′LTR换成SV40 polyA等。 一、实验流程(1和2为并列步骤) 1.慢病毒过表达质粒载体的构建 设计上下游特异性扩增引物,同时引入酶切位点,PCR(采用高保真KOD酶,3K内突变率为0%)从模板中(CDNA质粒或者文库)调取目的基因CDS区(coding sequence)连入T载体。将CDS区从T载体上切下,装入慢病毒过表达质粒载体。 2.慢病毒干扰质粒载体的构建 合成siRNA对应的DNA颈环结构,退火后连入慢病毒干扰质粒载体 3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒,三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提,共转染293T细胞,转染后6 h 更换为完全培养基,培养24和48h后,分别收集富含

表达载体的构建方法及步骤

表达载体的构建方法及步骤 一、载体的选择及如何阅读质粒图谱 目前,载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。一个合格质粒的组成要素: (1)复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而 真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。 (2)抗生素抗性基因可以便于加以检测,如Amp+ ,Kan+ (3)多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 (4)P/E 启动子/增强子 (5)Terms 终止信号 (6)加poly(A)信号可以起到稳定mRNA 作用 选择载体主要依据构建的目的,同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目 的是要表达一个特定的基因,则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点: 【1】构建DNA 重组体的目的,克隆扩增/基因表达,选择合适的克隆载体/表达载体。【2】.载体的类型: (1)克隆载体的克隆能力-据克隆片段大小(大选大,小选小)。如<10kb 选质粒。(2)表达载体据受体细胞类型-原核/真核/穿梭,E.coli/哺乳类细胞表达载体。

(3)对原核表达载体应该注意:选择合适的启动子及相应的受体菌,用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位;表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异,适应目的基因与载体易于链接,不能产生阅读框架错位。 综上所述,选用质粒(最常用)做载体的5点要求: (1)选分子量小的质粒,即小载体(1-1.5kb)→不易损坏,在细菌里面拷贝数也多(也有大载 体); (2)一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束,一般10个以上的拷贝,而严谨型质粒<10个。 (3)必需具备一个以上的酶切位点,有选择的余地; (4)必需有易检测的标记,多是抗生素的抗性基因,不特指多位Ampr(试一试)。(5)满足自己的实验需求,是否需要包装病毒,是否需要加入荧光标记,是否需要加入标签蛋白,是否需要真核抗性(如Puro、G418)等等。 无论选用哪种载体,首先都要获得载体分子,然后采用适当的限制酶将载体DNA 进行切割,获得线性载体分子,以便于与目的基因片段进行连接。 如何阅读质粒图谱 第一步:首先看Ori 的位置,了解质粒的类型(原核/真核/穿梭质粒) 第二步:再看筛选标记,如抗性,决定使用什么筛选标记。 (1)Ampr 水解β-内酰胺环,解除氨苄的毒性。 (2)tetr 可以阻止四环素进入细胞。 (3)camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物,使之失去毒性。 (4)neor(kanr)氨基糖苷磷酸转移酶使G418(长那霉素衍生物)失活

pLVX-TetOne-Puro慢病毒载体使用说明

pLVX-TetOne-Puro pLVX-TetOne-Puro 载体基本信息: 载体名称: pLVX-TetOne-Puro 质粒类型: 慢病毒载体;四环素调控载体 高拷贝/低拷贝: 高拷贝 克隆方法: 限制性内切酶,多克隆位点 启动子: TRE3GS 载体大小: 9227 bp 5' 测序引物及序列: -- 3' 测序引物及序列: -- 载体标签: 无 载体抗性: 氨苄青霉素 筛选标记: 嘌呤霉素(Puromycin ) 克隆菌株: Stbl3 宿主细胞(系): 常规细胞系(293、CV-1、CHO 等) 备注: 慢病毒载体pLVX-TetOne-Puro 是集调控与应答功能于一体的四环素诱导载体。 稳定性: 稳表达 组成型/诱导型: 诱导型 病毒/非病毒: 慢病毒 pLVX-TetOne-Puro 载体质粒图谱和多克隆位点信息:

pLVX-TetOne-Puro载体序列: ORIGIN 1 TGGAAGGGCT AATTCACTCC CAAAGAAGAC AAGATATCCT TGATCTGTGG ATCTACCACA 61 CACAAGGCTA CTTCCCTGAT TAGCAGAACT ACACACCAGG GCCAGGGGTC AGATATCCAC 121 TGACCTTTGG ATGGTGCTAC AAGCTAGTAC CAGTTGAGCC AGATAAGGTA GAAGAGGCCA 181 ATAAAGGAGA GAACACCAGC TTGTTACACC CTGTGAGCCT GCATGGGATG GATGACCCGG 241 AGAGAGAAGT GTTAGAGTGG AGGTTTGACA GCCGCCTAGC ATTTCATCAC GTGGCCCGAG 301 AGCTGCATCC GGAGTACTTC AAGAACTGCT GATATCGAGC TTGCTACAAG GGACTTTCCG 361 CTGGGGACTT TCCAGGGAGG CGTGGCCTGG GCGGGACTGG GGAGTGGCGA GCCCTCAGAT 421 CCTGCATATA AGCAGCTGCT TTTTGCCTGT ACTGGGTCTC TCTGGTTAGA CCAGATCTGA 481 GCCTGGGAGC TCTCTGGCTA ACTAGGGAAC CCACTGCTTA AGCCTCAATA AAGCTTGCCT 541 TGAGTGCTTC AAGTAGTGTG TGCCCGTCTG TTGTGTGACT CTGGTAACTA GAGATCCCTC 601 AGACCCTTTT AGTCAGTGTG GAAAATCTCT AGCAGTGGCG CCCGAACAGG GACTTGAAAG 661 CGAAAGGGAA ACCAGAGGAG CTCTCTCGAC GCAGGACTCG GCTTGCTGAA GCGCGCACGG 721 CAAGAGGCGA GGGGCGGCGA CTGGTGAGTA CGCCAAAAAT TTTGACTAGC GGAGGCTAGA 781 AGGAGAGAGA TGGGTGCGAG AGCGTCAGTA TTAAGCGGGG GAGAATTAGA TCGCGATGGG 841 AAAAAATTCG GTTAAGGCCA GGGGGAAAGA AAAAATATAA ATTAAAACAT ATAGTATGGG 901 CAAGCAGGGA GCTAGAACGA TTCGCAGTTA ATCCTGGCCT GTTAGAAACA TCAGAAGGCT

慢病毒包装原理及应用

慢病毒包装系统简介及应用 一、慢病毒包装简介及其用途 慢病毒(Lentivirus )载体是以HIV-1 (人类免疫缺陷I 型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体,它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快,研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞,从而达到良好的的基因治疗效果,在美国已经开展了临床研究,效果非常理想,因此具有广阔的应用前景。 目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi 的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差,转移到细胞内的siRNA 半衰期短,体外合成siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的,因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA 的载体,然后转移到细胞内转录siRNA 的策略,不但使脂质体有效转染的细胞种类增加,而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA ,在长期稳定表达载体的细胞中,甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA 表达载体中,是由RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA 合成的,这是因为RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列,而且合成的RNA 不会带poly A 尾。当RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续4 个或5 个T 时,它指导的转录就会停止,在转录产物3' 端形成1~4 个U 。U6 和H1 RNA 启动子是两种RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子,其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游,适合于表达~21ntRNA 和~50ntRNA 茎环结构(stem loop )。在siRNA 表达载体中,构成siRNA 的正义与反义链,可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA ;也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA),载体包含位于RNA 聚合酶Ⅲ启动子和4 ~5 T转录终止位点之间的茎环结构序列,转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ' 突出端的茎环结构,在细胞内进一步加工成siRNA 。构建载体前通常要通过合成siRNA 的方法,寻找高效的siRNA ,然后从中挑选符合载体要求的序列,将其引入siRNA 表达载体。 慢病毒载体(Lentiviral vector )较逆转录病毒载体有更广的宿主范围,慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达shRNA 的高滴度的慢病毒,在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA ,实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默,为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能,以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒,需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞,在细胞中进行病毒的包装,包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中,离心取得上清液后,可以直接用于宿主细胞的感染,目的基因进入到宿主细胞之后,经过反转录,整合到基因组,从而高水平的表达效应分子。 二、这一系统的目的,主要是为了解决以下问题: 1. 对于一些较难转染的细胞,如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能大大提高目的基因转导效率,而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加,这就为RNAi,cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。 2. 进行稳转细胞株的筛选; 3. 为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液; 在细胞相关的实验操作中,对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞,通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率,以达到目的基因的高效瞬时表达。

慢病毒载体,稳定表达

慢病毒载体,稳定表达 一、慢病毒 逆转录病毒(Retrovirus):是一种RNA病毒,在复制时需在逆转录酶的作用下首先将RNA 转变为cDNA,再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增。主要包括RNA肿瘤病毒、慢病毒及泡沫病毒等三种亚科。 慢病毒(Lentivirus):属于逆转录病毒科,名称源自该种病毒长达数年的潜伏期。 最经典的慢病毒是由HIV病毒改造而来,而且HIV-1/HIV-2系统也得到了广泛的应用,除了HIV病毒系统以外,后续还有猿类免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus, SIV)载体系统、猫免疫缺陷病毒(felines immunodeficiency virus, FIV)载体系统、绵羊梅迪-维斯纳病毒(MMV)载体系统和马传染性贫血(EIA)载体系统等。 慢病毒结构: 2个调节基因: (1)tat基因:反式激活因子,对HIV基因起正调控作用。 (2)rev基因:病毒蛋白表达调节因子,增加gag和env基因对结构蛋白的表达。 4个辅助蛋白(附属)基因: (1)vif和vpu调节感染性病毒颗粒的产生; (2)vpr和nef参与疾病的表现。 慢病毒的优势: 1.慢病毒携带的基因组可整合到宿主基因组,使宿主细胞长时间稳定表达外源基因; 2.可感染分裂和非分裂细胞; 3.低免疫原性,直接注射活体组织不易造成免疫反应,适用于动物实验; 4.可以更换特异性启动子; 5.野生型的HIV大小约为9.8 kb,插入片段可长达5-6 kb;

二、慢病毒载体 慢病毒载体(Lentivirus)是一类改造自人免疫缺陷病毒(HIV)的病毒载体,是逆转录病毒的一种,基因组是RNA,其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代,属于假型病毒。可利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定表达,具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。 慢病毒包装过程: 慢病毒基因组进入细胞后,在细胞浆中反转录为DNA,形成DNA整合前复合体,进入细胞核后,DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA,回到细胞浆中,表达目的蛋白;或产生小RNA。慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定,并随细胞基因组的分裂而分裂。 慢病毒包装和侵染细胞的过程(元和生物) 三、慢病毒的使用和优势 慢病毒的使用量的取决因素:滴度,感染体积,MOI ,细胞密度 滴度(Titer):单位体积液体中有感染能力的病毒或噬菌体数目。单位:TU/mL (活性滴度单位)、copies/mL (物理滴度单位) 检测方法:定量PCR检测干扰后细胞基因组中外源DNA拷贝数。 实验原理:慢病毒介导外源基因以逆转录方式整合进目的细胞基因组。 图3 MOI(multiplicity of infection):感染复数或者复感染指数。指感染时病毒和细胞数量的比值。在实验中也将某个细胞达到80%感染时所需的MOI 值定义为这个细胞的MOI值。加的病毒量(μl)=细胞数×MOI/滴度(…/ml) ×1000。 最后,818 一些有关慢病毒方面的产品: 1.关于慢病毒载体构建方面: ORF表达克隆产品【LPP-货号-载体-100,ORF/Promoter/lncRNA慢病毒】 shRNA克隆产品【LPP-货号-载体-050,shRNA慢病毒】 miRNA克隆产品【LPP-货号-载体-050,miRNA/inhibitor慢病毒】

慢病毒载体构建步骤研究

一、简介 慢病毒( Lentivirus )载体是以HIV-1 (人类免疫缺陷I 型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体,它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快,研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达。 目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi 的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差,转移到细胞内的siRNA 半衰期短,体外合成siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的,因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA 的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA 的策略,不但使脂质体有效转染的细胞种类增加,而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA ,在长期稳定表达载体的细胞中,甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。慢病毒载体能够产生表达shRNA 的高滴度的慢病毒,在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA ,实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默,为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能,以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。慢病毒作为siRNA 的携带者,不但具备特异性地使基因表达沉默的能力,而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势,为基因功能的研究提供了更强有力的工具。 在所构建的siRNA表达载体中,是由RNA聚合酶川启动子来指导RNA合成的,这是因为RNA聚合酶川有明确的起始和终止序列,而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA 聚合酶川遇到连续4个或5个T时,它指导的转录就会停止,在转录产物3'端形成1~4个U。 U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶川依赖的启动子,其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游,适合于表达?21ntRNA 和?50ntRNA 茎环结构(stem loop )。在 siRNA 表达载体中,构成siRNA 的正义与反义链,可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA ;也可由载体直接表达小发卡状RNA (small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶川启动子和4?5T转录终止位点之间的茎环结构序列,转录后即可 折叠成具有1~4个U 3 '突出端的茎环结构,在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前 通常要通过合成siRNA 的方法,寻找高效的siRNA ,然后从中挑选符合载体要求的序列,将其引入siRNA 表达载体(筛选)。 二、实验流程(大致的简单过程) 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的

pLVX-Puro慢病毒载体使用说明

pLVX-Puro pLVX-Puro载体基本信息: 载体名称: pLVX-Puro , pLVXpuro 质粒类型: 哺乳动物细胞慢病毒表达载体 高拷贝/低拷贝: 高拷贝 启动子: CMV 克隆方法: 多克隆位点,限制性内切酶 载体大小: 8102 bp 5' 测序引物及序列 : CMV-F:CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG 3' 测序引物及序列: -- 载体标签: -- 载体抗性: 氨苄 筛选标记: 嘌呤霉素 备注: 含有组成型CMV启动子的慢病毒载体稳定性: / 组成型: -- 病毒/非病毒: 慢病毒 pLVX-Puro载体质粒图谱和多克隆位点信息:

pLVX-Puro载体简介: Description pLVX-Puro is an HIV-1-based, lentiviral expression vector. Lentiviral particles derived from the vector allow you to express your gene of interest in virtually any cell type, even primary cells. Expression of your gene is driven by the constitutively active human cytomegalovirus immediate early promoter (PCMV IE), located just upstream of the multiple cloning site (MCS), allowing constitutive, high level expression of your protein of interest. pLVX-Puro contains all of the viral processing elements necessary for the production of replication-incompetent lentivirus, as well as elements to improve viral titer, transgene expression, and overall vector function. The woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element (WPRE) promotes RNA processing events and enhances nuclear export of viral and transgene RNA (1), leading to increased viral titers from packaging cells, and enhanced expression of your gene of interest in target cells. In addition, the vector includes a Rev-response element (RRE), which further increases viral titers by enhancing the transport of unspliced viral RNA out of the nucleus (2). Finally, pLVX-Puro also contains a central polypurine tract (cPPT) element that increases nuclear importation of the viral genome during target cell infection, resulting in improved vector integration and more effi cient transduction (3). In addition to lentiviral elements, pLVX-Puro contains a puromycin resistance gene (Puror) under the control of the murine phosphoglycerate kinase (PGK) promoter (PPGK) for the selection of stable transductants. The vector also contains a pUC origin of replication and an E. coli ampicillin resistance gene (Ampr) for propagation and selection in bacteria. Use pLVX-Puro constitutively expresses your gene of interest from PCMV IE when transduced into target cells. Before the vector can be transduced into cells, however, it must be transfected into 293T packaging cells with our Lenti-X? HT Packaging System (Cat. Nos. 632160 and 632161). This packaging system allows you to safely produce high titer, infectious, replication-incompetent, VSV-G pseudotyped lentiviral particles that can infect a wide range of cell types, including non-dividing and primary cells (4). pLVX-Puro载体序列: ORIGIN 1 TGGAAGGGCT AATTCACTCC CAAAGAAGAC AAGATATCCT TGATCTGTGG ATCTACCACA 61 CACAAGGCTA CTTCCCTGAT TAGCAGAACT ACACACCAGG GCCAGGGGTC AGATATCCAC 121 TGACCTTTGG ATGGTGCTAC AAGCTAGTAC CAGTTGAGCC AGATAAGGTA GAAGAGGCCA

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