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RASSF1A基因多态性与非小细胞肺癌相关性的研究

硕士专业学位论文

论文题目RASSF1A 基因多态性与非小细胞肺癌

相关性的研究

研究生姓名王安

指导教师姓名陈晓峰

专业名称外科学(胸外科)

学号20135238006

论文提交日期2016.5

RASSF1A基因多态性与非小细胞肺癌相关性的研究

中文摘要

目的:RASSF1是在多种肿瘤中广泛存在抑癌基因。本文目的是研究RASSF1A 基因第133 个密码子Ala/Ser多态性与肺癌遗传易感性及相关临床指标尤其是EGFR 突变之间的关系。

方法:我们收集从2011.1-2012.12上海市肺科医院225例经病理学确诊的肺癌患者和225例健康成人。采用病例-对照研究方法,使用PCR-RFLP(polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism)技术分析RASSF1A基因,肺癌病人的EGFR突变用ADx-ARMS方法来检测。

结果:RASSF1的基因分布符合Hardy–Weinberg平衡。肺癌病人的RASSF1Ala/Ala,Ala/Ser,Ser/Ser 基因型频率分别为82.2%, 16%, 1.8%,对照组的RASSF1Ala/Ala,Ala/Ser,Ser/Ser 基因型频率分别为90.7%, 8.9%, 0.4%。RASSF1Ala/Ser 杂合变异基因型的人群患肺癌的风险大大增加P=0.028。调整年龄、性别、吸烟等变量后P=0.013。

结论:RASSF1 Ala133Ser 多态性是肺癌的遗传易感因素,Ala/Ser 基因型增加了肺癌的发病风险。

关键词:NSCLC,RASSF1 SNP,预后,遗传易感性,EGFR突变

作者:王安

指导老师:陈晓峰

The correlation between RASSF1A 133 single nucleotide polymorphism and non-small cell lung cancer

Abstract

Objective: The Ras-Association domain Family1 (RASSF1)is a tumor suppressor gene (TSG). The aim of current study is to investigate the relationship between a single nucleotide polymorphism (SNP) at codon 133 of the RASSF1A gene and non-small cell lung cancer (NSCLC) susceptibility ,clinical parameters and survival.

Material and methods:225 pathologically diagnosed NSCLC patients and 225 healthy controls from Shanghai Pulmonary Hospital were enrolled. Clinicopathological features were collected and follow-up. The method of polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) was used to explore the polymorphism at codon 133 in the RASSF1 genes. EGFR mutation status of NSCLC patients was detected by ADx Amplification Refractory Mutation System (ADx-ARMS).

Results:Compared to healthy controls, the risk of Ala/Ser and Ala/Ser + Ser/Ser genotype were increased in NSCLC patients (Adjusted P =0.028, Adjusted P =0.013). The Ala/Ser genotype was associated with male (adjusted OR=3.84, 95% CI: 1.407-10.482) and smoking status (adjusted OR=11.967, 95% CI: 2.195-17.475), otherwise no significant difference with EGFR mutation. The RASSF1A SNP indicated a poor prognosis.

Conclusions: RASSF1A Ala133Ser SNP contributes to non-small cell lung cancer susceptibility and poor prognosis. The relevance between RASSF1A Ala133Ser SNP and male, smoking status is also close. No significant difference between RASSF1 SNP and EGFR mutation.

Keywords: NSCLC; RASSF1A SNP; cancer susceptibility; EGFR mutation; prognosis

Written by An Wang

Supervised by Xiaofeng Chen

目录

前言 (1)

实验材料 (3)

1.主要仪器设备 (3)

2.主要试剂 (3)

实验对象与方法 (5)

1.NSCLC数据库建立 (5)

2.实验方法 (5)

实验结果 (11)

1.基因组DNA提取结果分析 (11)

2.PCR扩增产物结果分析 (11)

3.限制性内酶酶切后结果分析 (12)

4.肺癌患者与对照组基因型分布 (13)

5.分析肺癌患者的临床资料与RASSF1A Ala/Ser SNP 之间的关系 (15)

6. RASSF1A Ala/Ser SNP与EGFR突变的关系 (17)

7.RASSF1A Ala/Ser和Ser/Ser基因型与预后的关系 (17)

讨论 (19)

结论 (23)

参考文献 (24)

中英文对照表 (27)

附录:硕士期间发表论文 (29)

致谢 (50)

前言

随着经济社会的发展,环境污染越来越严重,癌症成为人类面临的重大健康问题。世界卫生组织国际癌症研究署(IARC)2010年发布的癌症报告显示:2008 年全球肺癌新发病例预测约161万例,死亡约138 万例,分别占恶性肿瘤新发病例及死亡病例的13%及18%,居恶性肿瘤第一位。男性肺癌新发病例及死亡率居所有恶性肿瘤之首,女性肺癌新发病例及死亡率均明显低于男性,新发病例居第四位(低于乳腺癌、结直肠癌及宫颈癌),死亡率居第二位(仅次于乳腺癌)[1]。在我国,随着工业化速度加快、环境污染加重、人口老龄化加剧,吸烟率的上升,肺癌的癌症负担日益加重,在我国的肺癌致死率从1990的第十三位上升到第五位[2]。近年来,随着分子生物学和临床医学的发展及多排螺旋CT应用的普及,对肺癌的诊断及治疗有了较大的提高,但是对肺癌的发生发展及治疗仍未达到令人满意的程度。大约85%的肺癌为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC),约56%NSCLC病人确诊时已经是中晚期并且合并有远处转移[3]。肺癌的发生是一个复杂的多阶段的过程,由多基因交互影响、多种环境因素协同作用引起的复杂性疾病。目前已知与肿瘤的发生发展相关的环境因素有吸烟、饮酒、环境致癌物等[4]。环境致癌物对癌症形成的作用取决于致癌物作用的时间、剂量及持久性。然而,癌症的形成是一个多基因、多阶段的复杂过程,除了环境的作用,机体自身的免疫在癌症形成的过程中也有重要的作用。机体依靠自身的代偿、抑癌基因对肿瘤的抑制及损伤的修复与肿瘤相抗衡。不同遗传背景的个体即使暴露在相似的环境因素中,其患肿瘤的风险也不尽相同,这取决于个体遗传易感性。由此可见,肿瘤发生的使动因素为环境,而遗传因素则决定了个体对肿瘤发生的易感因素,研究肿瘤易感性对了解肿瘤发生发展甚至诊断治疗都有十分重要的意义。

遗传易感性是个体基因组的单个核苷酸序列决定,与疾病相关的遗传背景。人类在漫长的进化过程中,个体基因在与外界环境的相互作用中不断变化,具体表现表现为遗传多态性。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP) 正在人类基因组中广泛存在,每1000个碱基对中就有一个存在,主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性,它是人类可遗传的变异中最常见的一种,这种变异可由单个碱基的转换或颠换引起[5]。关于单核苷酸多态性的研究可以对复杂的多基因疾病如肿瘤有更深入的了解。首先,通过分析可以发现和确定疾病相关基

因的突变位点。其次,可以通过与疾病易感性有关的单核苷酸多态性对疾病进行早期分子水平诊断。除此之外,还可以发现对疾病具有调控作用的基因,通过新的分子治疗途径来对抗疾病,靶向治疗,而且还可根据个体的不同情况达到个体化用药。随着分子生物学发展,新的基因及有关因素不断被发现,对肿瘤的发病机制的认识提高到细胞分子水平,建立分子水平检测筛查肿瘤、早期发现肿瘤、探索肿瘤的发病机制。遗传易感性在肿瘤的早期诊断、早期治疗和预后的评价中的意义起着举足轻重的作用[6]。

RASSF(Ras association domain family 1, Ras相关区域家族)共有10个成员,在调控凋亡、细胞周期、微管稳定性等方面具有重要作用[7]。RASSF1位于3p21.3,它的不稳定性可以导致肺癌的发生。在2000年Dammann等利用酵母双杂交筛选方法首次成功地克隆了RASSF1基因[8]。自此,众多学者对它在多种肿瘤中的表达情况、失活原因、抑癌机制及其临床应用等进行了大量而系统的研究,已发现该基因在多种肿瘤的发生、发展过程中起着举足轻重的作用。RASSF1共有8个转录体(A-H)[9]。RASSF1A是研究最多的一个转录体,在羧基端有一个RAS相关区域,氨基端有一个甘油二酯(diacylglycerol,DAG)相关区域[10]。RASSF1A在133密码子可发生碱基的替换,导致丙氨酸(alanine,Ala)被丝氨酸(serine,Ser)所替代[11]。已有研究证明RASSF1A Ala/Ser的多态性突变可以增加乳腺癌、肝癌等癌症的易感性[12, 13]。RASSF1A在所有的小细胞肺癌中缺失,在部分原发性肺癌中发生错义突变[8]。大量研究表明RASSF1A是一个抑癌基因。在过去的数十年里,针对EGFR(epidermal growth factor receptor)突变肺癌患者的靶向治疗已经变成标准疗法[14]。并且,有报道显示RASSF3的高表达与EGFR突变有明显的相关性[15]。虽然,此前有报道显示了RASSF1的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)可导致肺癌的易感性[16]。但是,其样本量偏小,没有探究RASSF1A多态性与EGFR突变之间的关系,并且缺失对相关肺癌患者预后的探讨。

实验材料

1.主要仪器设备

(1)CO2 恒温培养箱(美国Thermo Scientific 公司)

(2)制冰机(三洋电机国际贸易有限公司SIM-F140)(3)电蒸馏水器(上海沪博迅实业医疗设备厂YN-ZD-Z)(4)电子天平(德国Sartorius BS124S)

(5)高压灭菌锅(英国Astell 公司AMA440N)

(6)凝胶图像分析系统(美国Bio-Rad公司GelDocXR)(7)电泳仪(德国Biometra)

(8)温度梯度循环仪(德国TGRADIENT96)

(9)格兰仕微波炉(中国微波炉公司 G80F20CN2L-B8)(10)电热鼓风干燥箱(上海智城ZDP-2160)

(11)双人单面超净工作台(上海上净净化设备厂)

(12)涡旋振荡器(上海泸西仪器厂)

(13)医用超低温冰箱(美国Thremo Electrom FORMA 702)(14)双门电冰箱伊来克斯(中国电器有限公司BCD-233)(15)台式冷冻离心机(德国Eppendorf 公司5804R)(16)蛋白核酸分析仪(德国Eppendorf 公司61310)(17)PCR仪(德国Eppendorf Mastercycler nexus)

(18)电子天平(上海精密科学仪器有限公司JA1003N)(19)枪头、PCR管(无锡NEST 生物技术公司)

(20)水浴锅(Leica公司产品HI1210)

2.主要试剂

(1)Tris 缓冲盐溶液

(2)TE 缓冲液(PH 8.0)

(3)细胞裂解液

(4)TE 缓冲液饱和酚

(5)无水乙醇

(6)乙二胺四乙酸(EDTA)

(7)3dH2O

(8)50bp Marker

(9)全血DNA提取试剂盒(国产天根)

(10)石蜡包埋组织DNA提取试剂盒(国产天根)(11)Premix Taq PCR试剂盒(日本TaKaRa 公司) (12)限制性核酸内切酶AluI(日本TaKaRa 公司) (13)琼脂糖粉(南京森贝伽生物科技有限公司)(14)EB染料

RASSF1A基因多态性与非小细胞肺癌相关性的研究实验对象与方法

实验对象与方法

1.NSCLC数据库建立

1.1 研究对象选择

本研究为病例-对照研究,病例组主要为来自于同济大学附属上海市肺科医院2011年1月至2012年12月经病理切片确诊为NSCLC患者的石蜡标本225例。对照组选取同济大学附属上海市肺科医院体检中心的健康体检者血液标本225例,年龄和性别与病例组相匹配。病人组随访至2015年6月。

1.2 流行病学资料收集

采用临床病历为主问卷调查为辅的方法收集研究对象的临床资料包括性别、年龄、吸烟史、组织学类型、淋巴结转移、TNM分期、EGFR突变等。现吸烟或者曾经吸烟每天五支以上并持续两年或者两年以上定义为吸烟个体。TNM分期根据2009年颁布的第7版肺癌分期进行。EGFR突变由同济大学附属上海市肺科病理科提供。本次研究经统计大学附属上海市肺科医院伦理委员会同意,所有研究对象均签署了知情同意书,调查表的流行病学资料采用随机复查方式进行质量控制。

2.实验方法

2.1 血样收集及处理

抽取每位研究对象外周静脉血1ml,注入EDTA-K2 抗凝离心管,摇匀。新鲜样本4℃储存过夜后,转移至-80℃保存。使用前尽快将样本置于37℃水浴锅使其融化,然后将样本放于冰上。待收取一定量的样本后集中采用TianGen全血基因组提取试剂盒提取DNA,使用方法及步骤按说明书进行。

2.2 全血基因组DNA的提取

(1)取400μl 新鲜血液到高温灭菌EP管中,加入3倍体积红细胞裂解液,混匀,室温下放置5分钟,每隔1分钟混匀一次。然后10000rpm离心一分钟,吸去上清,留下白细胞沉淀,加200μl 缓冲液GA,振荡至彻底混匀。

(2)加入4μl100mg/mlRNaseA 溶液,振荡15 秒,室温放置5 分钟。

(3)加入20μl 蛋白酶K溶液把样品,充分混匀。

实验对象与方法RASSF1A基因多态性与非小细胞肺癌相关性的研究(4)加入200μl 缓冲液GB到样品中,充分混匀,在70℃水浴箱中放置10 分钟,溶液变清亮后,快速离心去除管盖内壁水珠。加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀,一般70℃放置时会消失,不会影响后续实验,如溶液未变清亮,说明细胞裂解不彻底,可能导致提取DNA 量少和提取出的DNA 不纯。

(5)加入200μl 无水乙醇,充分振荡混匀15 秒,此时可能会出现絮状沉淀,快速离心以去除管盖内壁的水珠。

(6)以上所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3放回收集管中,12000rpm 离心30 秒,弃除废液,将吸附柱CB3放回收集管中。

(7)向吸附柱CB3中加入500μl 缓冲液GD,使用前应先加入无水乙醇,12000rpm 离心30 秒倒掉废液,将吸附柱CB3 放回收集管中。

(8)将吸附柱CB3中加入700μl 漂洗液PW使用前应先加入无水乙醇,12000rpm 离心30 秒,倒掉废液,将吸附柱CB3 放回收集管中。

(9)将吸附柱CB3中加入500μl 漂洗液PW,12000rpm 离心30 秒,倒掉废液。

(10)将吸附柱CB3 放回收集管中,12000rpm 离心2分钟,倒掉废液。将吸附柱CB3开盖,室温静置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液,残余的漂洗液中乙醇会影响后续(PCR,酶切等)实验。

(11)将吸附柱CB3转入一个离心管中,向吸附膜的中间部位悬空加60ul洗脱液TE,室温放置5分钟,12000rpm离心2分钟,将DNA产物收集到离心管中,可将得到的产物再加入吸附柱CB3 中,这样可以增加基因组DNA的得率,室温放置2分钟,12000rpm离心2分钟,将产物收集到EP管中,-20℃冰箱保存。

2.3 石蜡包块DNA的提取

(1)样本处理:如果样本为石蜡切片,则需要5-8张;如果样本是为石蜡块,则手术刀刮取约30 mg的组织样本,所取组织应尽量去除多余的石蜡。如果样品表面暴露于空气中,最初刮取的2-3片弃掉不用。

(2)将石蜡切片或石蜡块样本装于1.5 ml无菌离心管中,加入1ml二甲苯,剧烈涡旋10sec。

(3)将涡旋震荡好的石蜡样本12000rpm室温离心2 min,弃上清,留取沉淀。

(4)在上述管中加入1 ml无水乙醇,涡旋混匀10sec。

RASSF1A基因多态性与非小细胞肺癌相关性的研究实验对象与方法(5)将上述试管12,000rpm(~13,400×g )室温离心2 min,弃上清,留取沉淀。

(6)离心获得的沉淀室温放置5-10 min,充分挥发乙醇。

(7)在沉淀中加入200μl缓冲液GA和20μl Proteinase K,充分震荡混匀,56℃孵育1 h直至样本完全裂解。

(8)将上述样本置于90℃孵育1 h。

(9)在上述试管中加入220μl缓冲液GB涡旋混匀,再加入250μl无水乙醇,涡旋震荡充分混匀,短暂离心使管壁上的溶液收集到管底。

(10)将上一步骤所得的混合液加入一个吸附柱CR2中8000rpm室温离心2 min,倒掉废液,重新将吸附柱放回收集管中。注意:吸附柱最大容量为700μl,可将剩余液体重复上述步骤上柱。

(11)向吸附柱CR2中加入500μl缓冲液GD,8000rpm室温离心60sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中。

(12)向吸附柱CR2中加入600μl 漂洗液PW,8000rpm室温离心60sec,倒掉废液,将吸附柱放回收集管中。

(13)重复操作步骤12。

(14)将吸附柱CR2放回收集管中,12000rpm离心2 min,倒掉废液。将吸附柱开盖置于室温放置2-5min,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。注意:乙醇残留会抑制后续的酶反应,所以晾干时要确保乙醇挥发干净。但也不要干燥太长时间,以免难以洗脱DNA。

(15)将吸附柱CR2转入一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加65℃预热的30-100μl洗脱缓冲液TE或ddH2O洗脱,室温放置2-5 min,12000 rpm 离心2 min,将收集有DNA的离心管-20℃保存。

2.4 DNA浓度测定和DNA稀释

用紫外分光光度仪测所提取DNA浓度和纯度,取波长为260nm,280nm 两个波段,测得相应的DNA的OD260nm及OD280nm的数值,计算DNA含量,公式为:DNA含量=50mg/ml×OD260nm×稀释倍数;计算DNA的纯度,公式为:DNA纯度=OD260nm/OD280nm,并用三蒸水将基因组DNA稀释至终浓度为10-20ng/μl。

2.5.PCR引物设计

实验对象与方法RASSF1A基因多态性与非小细胞肺癌相关性的研究按照引物设计原则,应用Primer5.0引物设计软件设计引物。所设计的引物长度为21bp,由下列引物PCR所得DNA序列大小为226bp,引物设计的结果为:RASSF1上游引物:5'-CAA AGG CCT GCA GTG CGC GCA -3'RASSF1下游引物:5'-GAT CAA CAG CAA CCT CTT CAT -3'

引物由美国Invitrogen公司合成

2.6.PCR反应

PCR即聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR),是一种体外扩增特异DNA片段的技术,该反应可使DNA的数量在较短时间内增加到上百万倍,方便对目的DNA的研究与利用。其基本原理和DNA复制类似,但反应体系相对简单。在模板,引物和4 种dNTP 等原料在DNA聚合酶的催化下发生合成反应。用于扩增已知序列的DNA片段。PCR的特异性取决于引物和模板的特异性。反应分三步:(1)变性:通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂,双键解离形成单链DNA,使DNA变性;(2)退火:当温度降到引物Tm值附近时,引物与DNA模板互补区结合形成杂交链;(3)延伸:在DNA聚合酶和4种dNTP存在条件下,聚合酶催化以引物为起始点的DNA延伸反应。以上三步为一个循环,每个循环的产物为下个循环的模板,不断循环下去,循环30次后新生DNA片段理论上可达到230拷贝。PCR的整个过程主要通过控制温度来实现。高温变性,低温退火和中温延伸,模板上介于两个引物之间的片段不断得到扩增,每循环一次,目的DNA 的拷贝数增加一倍。

PCR的发应体系如下:

将上述试剂混合均匀后置于PCR 仪中,PCR 扩增条件为:

94℃预变性5min

94℃变性45s

RASSF1A基因多态性与非小细胞肺癌相关性的研究实验对象与方法55℃退火45s

72℃延伸1min

72℃终延伸7min

反应进行35个循环

2.7.PCR产物琼脂糖凝胶电泳电泳

(1)用三蒸水将电泳槽和梳子冲洗干净,晾干;

(2)配制5×TBE电泳缓冲液30mL于烧杯中,加入0.6g琼脂糖粉,放入微波炉加热沸腾至凝胶澄清透明,即为2%的琼脂糖凝胶;

(3)将加热熔化的胶,冷却至60℃左右,并加入4μl的EB,充分混匀至颜色澄清,倒入胶槽,插上相应孔径的梳子,静置冷却,待凝固后拔去梳子,置于电泳槽内;

(4)向电泳槽中倒入5×TBE电泳缓冲液,以没过胶面2mm为标准,去胶孔中的气泡;

(5)取4μlPCR产物和1μl的5×loading Buffer混匀,沿着胶孔边缘缓慢匀速加入,避免产生气泡;

(6)接通电源,黑色为负极,红色为正极,DNA 样品由负极向正极泳动,电压在100V左右,通过条带的位置,判断停止电泳的时间;

(7)电泳结束后,凝胶成像系统观察电泳带型及其位置,与MAKER比较判断扩增产物的大小,凝胶成像并保存图像。

2.8.PCR产物的酶切

限制性酶切片段多态性RFLP(restriction fragment length polymorphism)的原理:突变、重排及单个核苷酸的插入和缺失可使DNA序列发生改变,其中可能造成限制性酶切位点的增加、缺失或易位,致使DNA分子的限制酶切位点数目,位置发生改变。用限制酶切割不同个体DNA 时,所产生的限制性片段的数目和每个片段的长度不同。在琼脂糖凝胶电泳中可以显示不同的条带。

酶切的反应体系如下:

实验对象与方法RASSF1A基因多态性与非小细胞肺癌相关性的研究

反应条件:将上述酶切体系试剂混合均匀置于37℃CO2恒温培养箱过夜,使AluI 限制性内切酶对PCR产物进行充分酶切,最后加10×loading buffer终止酶切反应。用2%琼脂糖凝胶进行电泳分离,根据酶切结果判断基因型。为了对基因型检测的质量控制对样本随机抽取10%进行重复实验。

2.9.统计分析

用卡方检验对病例组和对照组基因型频率的实际值和预期值Hardy-Weinberg平衡分析,判断其是否符合Hardy-Weinberg平衡定律,以确定选择对象的随机性、可靠性。用非条件Logistic回归模型对肺癌患者的临床资料进行分析,并计算相对危险度的比值比(odds ratio,OR)及其95%置信区间(confidence interval,CI),用Kaplan-Meier 生存曲线和多因素Cox回归来进行患者的预后分析,并得出患者的风险比(hazard ratio,HR)及其95%CI。所有的统计检验均为双侧检验,以P<0.05作为具有统计学差异的标准。数据统计分析采用SPSS19.0进行。

实验结果

1.基因组DNA提取结果分析

提取获得的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳,出现图1结果,说明提取成功。

图1 全血基因组DNA的凝胶电泳

2.PCR扩增产物结果分析

PCR完成后,其产物在2%琼脂糖凝胶电泳可见一条带位于200-250bp之间,而目的基因大小为226bp,则说明该条带为需要扩增的含多态性位点的目的基因。如图2:

图2 PCR扩增产物的凝胶电泳

3.限制性内酶酶切后结果分析

扩增获得的目的RASSF1片段有226bp,经AluI(TaKaRa 公司)限制性内切酶消化后酶切片段分别为:60bp,166bp,226bp。有三种基因型存在:无突变完全切开的纯合基因型Ala/Ala,存在60bp,166bp两个条带;单链发生突变,未完全切开的杂合基因型Ala/Ser 存在60bp,166bp,226bp三个条带;完全突变,无法切开的纯合基因型Ser/Ser 存在226bp一个条带。见下图,图3.1为示意图,其余图3.2,3.3,3.4为具体事例。

图3.1 AluI限制性内切酶酶切后凝胶电泳的结果

图3.2

图3.3

图3.4 4.肺癌患者与对照组基因型分布

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