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6-Re-sequencing(华大基因高通量测序内部培训资料)

高通量测序基础知识

高通量测序基础知识简介 陆桂 什么是高通量测序? 高通量测序技术(High-throughput sequencing,HTS)是对传统Sanger测序(称为一代测序技术)革命性的改变,一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing,NGS )足见其划时代的改变, 同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing)。 什么是Sanger法测序(一代测序) Sanger法测序利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成,每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP),并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团,使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整,使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点,但终止在不同的的核苷酸上,可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段,凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。 什么是基因组重测序(Genome Re-sequencing) 全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序,并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。随着基因组测序成本的不断降低,人类疾病的致病突变研究由外显子区域扩大到全基因组范围。通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、双末端测序相结合的策略进行高通量测序,实现在全基因组水平上检测疾病关联的常见、低频、甚至是罕见的突变位点,以及结构变异等,具有重大的科研和产业价值。 什么是de novo测序 de novo测序也称为从头测序:其不需要任何现有的序列资料就可以对某个物种进行测序,利用生物信息学分析手段对序列进行拼接,组装,从而获得该物种的基因组图谱。获得一个物种的全基因组序列是加快对此物种了解的重要捷径。随着新一代测序技术的飞速发展,基因组测序所需的成本和时间较传统技术都大大降低,大规模基因组测序渐入佳境,基因组学研究也迎来新的发展契机和革命性突破。利用新一代高通量、高效率测序技术以及强大的生物信息分析能力,可以高效、低成本地测定并分析所有生物的基因组序列。 什么是外显子测序(whole exon sequencing) 外显子组测序是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。外显子测序相对于基因组重测序成本较低,对研究已知基因的SNP、Indel等具有较大的优势,但无法研究基因组结构变异如染色体断裂重组等。

DNA测序技术的发展和其最新进展

DNA测序技术的发展及其最新进展 摘要:自从诺贝尔奖得主桑格于1977年发明了第一代DN测序技术以来,DNA测序技术已经作为重要的实验技术广泛的应用于现代生物学研究当中。经过了几十年的发展,DNA测序技术日臻成熟,并且以单分子测序为特点的第三代测序技术也已经诞生。本文主要就每一代测序技术原理和特点及其最新进展做简要介绍。 关键词:DNA测序技术;第三代DNA测序技术;最新进展 The Development and New Progress of DNA Sequencing Technology Abstract: Since Nobel Prize Winner Sanger have founded the first generation of DNA Sequence technology in 1977, DNA sequencing technology has been widely used in modern biological researches as an important experimental. Over decades of year’s development, DNA sequence technology mature gradually and the third generation sequencing technologies characterized by single-molecule sequencing have also emerged. The mechanisms and features of each generation of sequencing technology and their latest progress will be discussed here. Key Words: DNA Sequence technology ; third generation DNA sequencing ;latest development 1.引言 DNA测序技术是分子生物学研究中最常用的技术,它的出现极大地推动了生物学的发展。自从1953年Watson和Crick发现DNA双螺旋结构后[1],人类就开始了对DNA序列的探索,在世界各地掀起了DNA测序技术的热潮。1977年Maxam和Gilbert报道了通过化学降解测定DNA序列的方法[2]。同一时期,Sanger发明了双脱氧链终止法[3]。20世纪90年代初出现的荧光自动测序技术将DNA测序带入自动化测序的时代。这些技术统称为第一代DNA测序技术。最近几年发展起来的第二代DNA测序技术则使得DNA测序进入了高通量、低成本的时代。目前,基于单分子读取技术的第三代测序技术已经出现,该技术测定DNA序列更快,并有望进一步降低测序成本,推进相关领域生物学研究。本文主要介绍DNA测序技术的发展历史及不同发展阶段各种主要测序技术的特点,并针对目前新一代DNA测序技术及目前国际DNA测序最新进展做简要综述。

转录组高通量测序

转录组高通量测序 2010-11-22 09:48 (第二代高通量测序技术-454) 转录组即特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和,是研究细胞表型和功能的一个重要手段。与基因组不同的是,转录组的定义中包含了时间和空间的限定。同一细胞在不同的生长时期及生长环境下,其基因表达情况是不完全相同的。罗氏GS-FLX-Titanium第二代高通量测序仪平均读长超过 400bp,在测序读长上遥遥领先于其它第二代高通量测序仪,使其成为转录组学研究的首选测序平台,已被广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。 一、罗氏454测序技术在环境微生物生态多样性研究中的突出优势体现在:(1)测序序列长,便于聚类拼接,可以对转录本进行从头组装(de novo assembly)。 (2)测序通量高,可以检测到低丰度转录本信息。 (3)可以对无基因组参考序列的新物种进行转录组测序,发现新的转录本和亚型。 (4)实验操作简单、结果稳定,可重复性强。无需进行克隆的文库构建,双链cDNA连接454接头后可以直接进行测序,实验周期短。 (5)测序数据便于进行生物信息分析,可以进行基因差异表达分析、鉴定基因的可变剪切以及预测新基因。 二、美吉公司在环境微生物生态多样性研究中的突出优势体现在: (1)拥有自主实验室和高通量测序平台,可以根据客户要求灵活安排实验,实验周期短,取样方便,质量可靠。 (2)技术人员经验丰富,可以稳定地进行总RNA的提取和双链cDNA的合成,可以根据顾客要求第一时间提供实验方案。 (3)有专业的生物信息团队和大型计算机,可以为客户提供个性化的生物信息分析服务。 (4)开放式实验室,参与式服务。客户不但可以参与整个实验过程,而且可以参与生物信息分析,提供最为增值的售后服务。 三、服务流程 (1)客户提供样本背景信息、实验目的和实验预期。 (2)美吉公司设计实验方案,提供测序深度建议和生物信息分析建议。 (3)客户认可实验方案,双方签订项目合作协议。 (4)项目开始运作,美吉公司指定专人和客户保持无障碍沟通。 (5)项目结束,美吉公司提供标准结题报告。 (6)客户可以和美吉公司签订长期合作协议,享受折扣和VIP服务。 四、送样要求 (1)动物、植物、微生物组织: > 请提供足量的新鲜样品,样品量≥5g;植物材料应避免过老的组织,尽量用柔嫩部位。 > 新鲜程度要求:采样后将样品立即液氮速冻-80℃保存(保存期不超过1个月),干冰运输,运输时间不超过72h。 > 样本保存期间切忌反复冻融。

Roche_454(GS_FLX_Titanium_System)超高通量测序技术原理

Roche 454(GS FLX Titanium System)超高通量测序技术原理 2005年底,454公司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System,被《Nature》杂志以里程碑事件报道,开创了边合成边测序(sequencing-by-synthesis)的先河。之后,454公司被罗氏诊断公司以1.55亿美元收购。2007年,他们又推出了性能更优的第二代基因组测序系统—— Genome Sequencer FLX System (GS FLX)。2008年10月,454推出了全新的GS FLX Titanium系列试剂和软件,让GS FLX的通量一下子提高了5倍,准确性和读长也进一步提升。 想当年,GS 20的出现,揭开了测序历史上崭新的一页。Jonathan Rothberg博士就是大规模并行测序的发明者,同时也是454的创始人。上世纪90年代,很多学者也都想到了大规模并行测序,他们试图将Sanger测序移到芯片上,但都以失败告终,因为这项技术没有可扩展性。1999年,Rothberg的儿子出世,他放了两个星期的陪产假。小家伙出生后被送入婴儿特护病房,Rothberg非常担心,甚至想获取儿子的基因组信息。这段担惊受怕的经历给了他灵感,他突然意识到焦磷酸测序(pyrosequencing)不仅简单,而且具有可扩展性。两个星期之后,Rothberg就开始设计芯片和流动室,让测序在更小的反应室中进行,并同时进行几百万个反应。 硬件的设计和制造也只是成功的一半,在样品制备上还有同样漫长的路要走。Rothberg摒弃了传统的细菌克隆与挑选,将DNA打断成随机片段,并寻找一种方法来克隆每个片段。受到其他学者乳液实验的启发,他也想将DNA放入油包水的乳液中,这样就省去了反应管。一个好汉三个帮。在Joel Bader等人的帮助下,Rothberg验证了这些想法的可行性,并利用了炸药中的表面活性剂来维持乳液的热稳定性。就这样,乳液PCR终于诞生了。 对细菌的16S rDNA的V6/V3可变区进行测序分析,不需进行克隆筛选,测序的通量高,获得的数据量大,周期短,能更加全面的反映微生物群体的物种组成,真实的物种分布及丰度信息。 GS FLX 测序原理 GS FLX系统的测序原理和GS 20一样,也是一种依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术;在DNA聚合酶,ATP硫酸化酶,荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下,将引物上每一个dNTP 的聚合与一次荧光信号释放偶联起来(图 1)。通过检测荧光信号释放的有无和强度,就可以达到实时测定DNA序列的目的。此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针,也不需要进行电泳;具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点。 Roche GS FLX System是一种基于焦磷酸测序原理而建立起来的高通量基因组测序系统。在测序时,使用了一种叫做“Pico TiterPlate”(PTP)的平板,它含有160多万个由光纤组成的孔,孔中载有化学发光反应所需的各种酶和底物。测序开始时,放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基,依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板,每次只进入一个碱基。如果发生碱基配对,就会释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在各种酶的作用下,经过一个合成反应和一个化学发光反应,最终将荧光素氧化成氧化荧光素,同时释放出光信号。此反应释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。有一个碱基和测序模板进行配对,就会捕获到一分子的光信号;由此一一对应,就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。

转录组测序技术的应用及发展综述

转录组测序技术的应用及发展综述 摘要:转录组测序(RNA-Seq)作为一种新的高效、快捷的转录组研究手段正在改变着人们对转录组的认识。RNA-Seq利用高通量测序技术对组织或细胞中所有RNA 反转录而成cDNA文库进行测序,通过统计相关读段(reads)数计算出不同RNA的表达量,发现新的转录本;如果有基因组参考序列,可以把转录本映射回基因组,确定转录本位置、剪切情况等更为全面的遗传信息,已广泛应用于生物学研究、医学研究、临床研究和药物研发等。文章主要比较近年来转录组研究的几种方法和几种RNA-Seq的研究平台,着重介绍RNA-Seq的原理、用途、步骤和生物信息学分析,并就RNA-Seq技术面临的挑战和未来发展前景进行了讨论及在相关领域的应用等内容,为今后该技术的研究与应用提供参考。 关键词: RNA-Seq;原理应用;方法;挑战;发展前景 Abstract:Transcriptome sequencing (RNA-Seq) is a kind of high efficiency, quick transcriptome research methods are changing our understanding of transcriptome. RNA-Seq to use high-throughput sequencing of tissues or cells of all RNA reverse transcription into cDNA library were sequenced, through statistical correlation read paragraph (reads) numbers were calculated from the expression of different RNA transcripts, find new; if the genome reference sequence, the transcripts mapped to genomic, determine the position of the transcription shear condition, more genetic information, has been widely used in biological research, medical research, clinical research and drug development. This paper compared several methods of platform transcriptome studies and several kinds of RNA-Seq in recent years, RNA-Seq focuses on the principle, purpose, steps and bioinformatics analysis, and discusses the RNA-Seq technology challenges and future development prospect and the application in related field and other content, provide the reference for the research and application of the technology future. Key word:RNA-Seq ;application; principle; method; challenge; development prospects

高通量测序生物信息学分析(内部极品资料,初学者必看)

基因组测序基础知识 ㈠De Novo测序也叫从头测序,是首次对一个物种的基因组进行测序,用生物信息学的分析方法对测序所得序列进行组装,从而获得该物种的基因组序列图谱。 目前国际上通用的基因组De Novo测序方法有三种: 1. 用Illumina Solexa GA IIx 测序仪直接测序; 2. 用Roche GS FLX Titanium直接完成全基因组测序; 3. 用ABI 3730 或Roche GS FLX Titanium测序,搭建骨架,再用Illumina Solexa GA IIx 进行深度测序,完成基因组拼接。 采用De Novo测序有助于研究者了解未知物种的个体全基因组序列、鉴定新基因组中全部的结构和功能元件,并且将这些信息在基因组水平上进行集成和展示、可以预测新的功能基因及进行比较基因组学研究,为后续的相关研究奠定基础。 实验流程: 公司服务内容 1.基本服务:DNA样品检测;测序文库构建;高通量测序;数据基本分析(Base calling,去接头, 去污染);序列组装达到精细图标准 2.定制服务:基因组注释及功能注释;比较基因组及分子进化分析,数据库搭建;基因组信息展 示平台搭建 1.基因组De Novo测序对DNA样品有什么要求?

(1) 对于细菌真菌,样品来源一定要单一菌落无污染,否则会严重影响测序结果的质量。基因组完整无降解(23 kb以上), OD值在1.8~2.0 之间;样品浓度大于30 ng/μl;每次样品制备需要10 μg样品,如果需要多次制备样品,则需要样品总量=制备样品次数*10 μg。 (2) 对于植物,样品来源要求是黑暗无菌条件下培养的黄化苗或组培样品,最好为纯合或单倍体。基因组完整无降解(23 kb以上),OD值在1.8~2.0 之间;样品浓度大于30 ng/μl;样品总量不小于500 μg,详细要求参见项目合同附件。 (3) 对于动物,样品来源应选用肌肉,血等脂肪含量少的部位,同一个体取样,最好为纯合。基因组完整无降解(23 kb以上),OD值在1.8~2.0 之间;样品浓度大于30 ng/μl;样品总量不小于500 μg,详细要求参见项目合同附件。 (4) 基因组De Novo组装完毕后需要构建BAC或Fosmid文库进行测序验证,用于BAC 或Fosmid文库构建的样品需要保证跟De Novo测序样本同一来源。 2. De Novo有几种测序方式 目前3种测序技术 Roche 454,Solexa和ABI SOLID均有单端测序和双端测序两种方式。在基因组De Novo测序过程中,Roche 454的单端测序读长可以达到400 bp,经常用于基因组骨架的组装,而Solexa和ABI SOLID双端测序可以用于组装scaffolds和填补gap。下面以solexa 为例,对单端测序(Single-read)和双端测序(Paired-end和Mate-pair)进行介绍。Single-read、Paired-end和Mate-pair主要区别在测序文库的构建方法上。 单端测序(Single-read)首先将DNA样本进行片段化处理形成200-500bp的片段,引物序列连接到DNA片段的一端,然后末端加上接头,将片段固定在flow cell上生成DNA簇,上机测序单端读取序列(图1)。 Paired-end方法是指在构建待测DNA文库时在两端的接头上都加上测序引物结合位点,在第一轮测序完成后,去除第一轮测序的模板链,用对读测序模块(Paired-End Module)引导互补链在原位置再生和扩增,以达到第二轮测序所用的模板量,进行第二轮互补链的合成测序(图2)。 图1 Single-read文库构建方法图2 Paired-end文库构建方法

三代测序原理技术比较

导读从1977年第一代DNA测序技术(Sanger法)1,发展至今三十多年时间,测序技术已取得了相当大的发展,从第一代到第三代乃至第四代,测序读长从长到短,再从短到长。 摘要:从1977年第一代DNA测序技术(Sanger法)1,发展至今三十多年时间,测序 技术已取得了相当大的发展,从第一代到第三代乃至第四代,测序读长从长到短,再从短到长。虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置,但第三和第四代测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。测序技术的每一次变革,也都对基因组研究,疾病医疗研究,药物研发,育种等领域产生巨大的推动作用。在这里我主要对当前的测序技术以及它们的测序原理做一个简单的小结。 图1:测序技术的发展历程 生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。以上(图1)所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来,整个测序技术的发展历程。 第一代测序技术 第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格(Sanger)和考尔森(Coulson)开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆(Maxam)和吉尔伯特(Gilbert)发明的化学法(链降解). 并在1977年,桑格测定了第一个基因组序列,是噬菌体X174的,全长5375个碱基1。自此,人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力,并以此为开端步入基因组学时代。研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。在2001年,完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础,Sanger法核心原理是:由于ddNTP的2’和3’都不含羟基,其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键,因此可以用来中断DNA 合成反应,在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP(分为:ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP),通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列(图2)。这个网址为 sanger测序法制作了一个小短片,形象而生动。 值得注意的是,就在测序技术起步发展的这一时期中,除了Sanger法之外还出现了一些其他的测序技术,如焦磷酸测序法、链接酶法等。其中,焦磷酸测序法是后来Roche公司454技术所使用的测序方法2–4,而连接酶测序法是后来ABI公司SOLID技术使用的测序方法2,4,但他们的共同核心手段都是利用了Sanger1中的可中断DNA合成反应的dNTP。

基因测序技术的优缺点及应用

基因测序技术的优缺点及应用 随着人类基因组计划的完成,人类对自身遗传信息的了解和掌握有了前所未有的进步。与此同时,分子水平的基因检测技术平台不断发展和完善,使得基因检测技术得到了迅猛发展,基因检测效率不断提高。从最初第一代以 Sanger 测序为代表的直接检测技术和以连锁分析为代表的间接测序技术,到 2005 年,以Illumina 公司的 Solexa技术和 ABI 公司的 SOLiD 技术为标志的新一代测序 (next-generation sequencing,NGS) 的相继出现,测序效率明显提升,时间明显缩短,费用明显降低,基因检测手段有了革命性的变化。其技术正向着大规模、工业化的方向发展,极大地提高了基因检测的检出率,并扩展了疾病在基因水平的研究范围。2009 年 3 月,约翰霍普金斯大学的研究人员在《Science》杂志上发表了通过 NGS外显子测序技术,发现了一个新的遗传性胰腺癌的致病基因PALB2,标志着 NGS 测序技术成功应用于致病基因的鉴定研究。同年,《Nature》发表了采用 NGS 技术发现罕见弗里曼谢尔登综合征MYH3 致病基因突变和《Nat Genet》发表了遗传疾病米勒综合征致病基因。此后,通过 NGS 技术,与遗传相关的致病基因不断被发现,NGS 技术已成为里程碑式的进步。2010 年,《Science》杂志将这一技术评选为当年“十大科学进展”。 近两年,基因检测成为临床诊断和科学研究的热点,得到了突飞猛进和日新月异的发展,越来越多的临床和科研成果不断涌现出来。同时,基因检测已经从单一的遗传疾病专业范畴扩展到复杂疾病和个体化应用更加广阔的领域,其临床检测范围包括高危疾病的新生儿筛查、遗传疾病的诊断和基因携带的检测以及基因药物检测用于指导个体化用药剂量、选择和药物反应等诸多方面的研究。目前,基因检测在临床诊断和医学研究的应用正越来越受到医生的普遍重视和引起研究人员的极大的兴趣。 本文介绍了几种 DNA 水平基因检测常见的方法,比较其优缺点和在临床诊断和科学研究中的应用,对指导研究生和临床医生课外学习,推进临床科研工作和提升科研教学水平有着指导意义。 1、第一代测序 1.1 Sanger 测序采用的是直接测序法。1977年,Frederick Sanger 等发明了双脱氧链末端终止法,这一技术随后成为最为常用的基因测序技术。2001 年,Allan Maxam 和 Walter Gibert 发明了 Sanger 测序法,并在此后的 10 年里成为基因检测的金标准。其基本原理即双脱氧核苷三磷酸(dideoxyribonucleoside triphosphate,ddNTP) 缺乏PCR 延伸所需的 3'-OH,因此每当 DNA 链加入分子 ddNTP,延伸便终止。每一次 DNA 测序是由 4个独立的反应组成,将模板、引物和 4 种含有不同的放射性同位素标记的核苷酸的ddNTP 分别与DNA 聚合酶混合形成长短不一的片段,大量起始点相同、终止点不同的 DNA 片段存在于反应体系中,具有单个碱基差别的 DNA 序列可以被聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离出来,得到放射性同位素自显影条带。依据电泳条带读取DNA 双链的碱基序列。 人类基因组的测序正是基于该技术完成的。Sanger 测序这种直接测序方法具有高度的准确性和简单、快捷等特点。目前,依然对于一些临床上小样本遗传疾病基因的鉴定具有很高的实用价值。例如,临床上采用 Sanger 直接测序 FGFR 2 基因证实单基因 Apert 综合征和直接测序 TCOF1 基因可以检出多达 90% 的

高通量测序 名词解释

高通量测序基础知识汇总 一代测序技术:即传统的Sanger测序法,Sanger法是根据核苷酸在待定序列模板上的引物点开始,随机在某一个特定的碱基处终止,并且在每个碱基后面进行荧光标记,产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸,每一次序列测定由一套四个单独的反应构成,每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP),并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH 基团,使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止,使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点,但终止在不同的的核苷酸上,可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段,通过检测得到DNA碱基序列。 二代测序技术:next generation sequencing(NGS)又称为高通量测序技术,与传统测序相比,二代测序技术可以一次对几十万到几百万条核酸分子同时进行序列测定,从而使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能,所以又被称为深度测序(Deep sequencing)。NGS主要的平台有Roche(454 & 454+),Illumina(HiSeq 2000/2500、GA IIx、MiSeq),ABI SOLiD等。 基因:Gene,是遗传的物质基础,是DNA或RNA分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列。基因通过复制把遗传信息传递给下一代,使后代出现与亲代相似的性状。 DNA:Deoxyribonucleic acid,脱氧核糖核酸,一个脱氧核苷酸分子由三部分组成:含氮碱基、脱氧核糖、磷酸。脱氧核糖核酸通过3',5'-磷酸二酯键按一定的顺序彼此相连构成长链,即DNA链,DNA链上特定的核苷酸序列包含有生物的遗传信息,是绝大部分生物遗传信息的载体。

测序 基础知识

转录组高通量测序中,reads、contigs、scaffold、unigene、singleton 高通量测序时,在芯片上的每个反应,会读出一条序列,是比较短的,叫read,它们是原始数据; 有很多reads通过片段重叠,能够组装成一个更大的片段,称为contig(克隆群); 多个contigs通过片段重叠,组成一个更长的scaffold; 一个contig被组成出来之后,鉴定发现它是编码蛋白质的基因,就叫singleton; 多个contigs组装成scaffold之后,鉴定发现它编码蛋白质的基因,叫unigene。 基因组测序方法: 链中止法测序:通过合成与单链DNA互补的多核甘酸链,由于合成的互补链可在不同位置随机终止反应,产生只差一个核苷酸的DNA分子,从而来读取待测DNA分子的顺序。 化学降解法测序:在待定的核苷酸碱基中引入化学集团,再用化合物处理,使DNA分子在被修饰的位置降解。 自动化测序:与链终止测序原理相同,这姿势用不同的荧光色彩标记ddNTP,如ddA TP 标记红色荧光,ddCTP标记蓝色荧光,ddGTP标记黄色荧光,ddTTP标记绿色荧光。由于每种ddNTP带有各自待定的荧光颜色,二简化为由1个泳道同时判读4种碱基。 非常规DNA测序毛细管电泳、光点测序、DNA芯片测序、随机的组装(鸟枪法)鸟枪法:就有可能出现错装。 鸟枪法策略指导测序策略 不需要背景信息构建克隆群 时间短需要几年时间 需要大型计算机 得到的是草图(Draft)得到的是精细图谱 EST (Expressed sequence tag)测序 EST是一种重要的基因组图分子标记,以EST为探针很容易从cDNA文库中筛选全基因,又可从BAC克隆中找到其基因组的基因序列。 优点:mRNA可直接反转录成cDNA,而且cDNA文库也可比较容易构建。 对cDNA文库大量测序,即可获得大量的EST序列 EST为基因的编码区,不包括内含子和基因间区域,一次测序的结果足以鉴定所代表的基因。 人类基因组计划于1990年启动,我国于1999年加入,承担1%任务,即人类3号染色体短臂上约30MB的测序任务。 2000年6月26完成草图。测序错误率低于1%%。

焦磷酸测序技术的原理

Pyrosequencing技术的原理 Pyrosequencing是一项全新的DNA测序技术,可以快速、准确地测定一段较短的目标片段。其基本原理如下: 第1步:1个特异性的测序引物和单链DNA模板结合,然后加入酶混合物(包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、Luciferase和Apyrase)和底物混合物(包括APS和Luciferin)。 第2步:向反应体系中加入1种dNTP,如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对,则会在DNA 聚合酶的作用下,添加到测序引物的3‘末端,同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。 第2步图示(图片来自互联网) 第3步:在ATP硫酸化酶的作用下,生成的PPi可以和APS结合形成ATP;在荧光素酶的催化下,生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素,同时产生可见光。通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰,峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。 第3步图示(图片来自互联网) 第4步:反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解。 第4步图示(图片来自互联网) 第5步:加入另一种dNTP,使第2-4步反应重复进行,根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。

第4步图示(图片来自互联网) Pyrosequecing技术操作简单,结果准确可靠,可应用于SNP位点检测、等位基因频率测定、细菌和病毒分型等领域。 →如果您认为本词条还有待完善,请编辑词条 上一篇SNP(单核苷酸多态性)下一篇阅读质粒图谱 具体事例 【摘要】建立了一种将序列标记反转录聚合酶链反应(PCR)与焦磷酸测序技术结合的相对基因表达量测定法(简称“SRPP”)。先用来源特异性引物对不同来源的同一基因通过反转录标记上特异性标签,PCR后用焦磷酸测序法对扩增产物进行序列解码,使得测序结果中的序列代表基因的来源,峰高代表基因在不同来源中的相对表达量。用实时荧光定量PCR法对本方法的准确性进行了验证,结果表明,SRPP可以同时准确测定同一基因在3个不同来源中的表达量,并实际测定了Egr1基因在糖尿病、肥胖和正常小鼠肝中的表达量差异。 【关键词】序列标记反转录, 聚合物链反应,焦磷酸测序,基因表达 1 引言 差异表达基因与疾病密切相关,深入研究可在基因水平揭示疾病的发病机制。目前,用于检测基因表达水平的技术主要有SAGE法[1]、实时荧光定量PCR法[2,3]和基因芯片法[4]等。但这些方法存在仪器设备昂贵、定量性能差以及同时测定基因表达量的来源数目受限等缺点。 焦磷酸测序技术是新近发展起来的一种基于酶催化化学反应的测序技术[5~8],不需要使用荧光标记,定量性能好。目前,焦磷酸测序技术多用于单核苷酸多态性(SNP)分析、微生物分型和基因甲基化分析等。本研究将焦磷酸测序技术用于基因表达量差异的比较分析,考察了其可行性和准确性,并将其应用于检测Egr1基因在糖尿病、肥胖症和正常小鼠中的差异表达。 2 实验部分 仪器、试剂与材料

高通量测序技术

高通量测序技术(High-throughput sequencing)又称“下一代”测序技术 ("Next-generation" sequencing technology),以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。 根据发展历史、影响力、测序原理和技术不同等,主要有以下几种:大规模平行签名测序(Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)、聚合酶克隆(Polony Sequencing)、454焦磷酸测序(454 pyrosequencing)、Illumina (Solexa) sequencing、ABI SOLiD sequencing、离子半导体测序(Ion semiconductor sequencing)、DNA 纳米球测序(DNA nanoball sequencing)等。 高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变,一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定,因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing)足见其划时代的改变,同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能,所以又被称为深度测序(deep sequencing)。 实验过程 1.样本准备(sample fragmentation) 2.文库构建(library preparation) 3.测序反应(sequencing reaction) 4.数据分析(data analysis) 测序平台 自从2005年454 Life Sciences公司(2007年该公司被Roche正式收购)推出了454 FLX焦磷酸测序平台(454 FLX pyrosequencing platform)以来,因为他们的拳头产品毛细管阵列电泳测序仪系列(series capillary array electrophoresis sequencing machines)遇到了两个强有力的竞争对手,曾推出过3730xl DNA测序仪(3730xl DNA Analyzer)的Applied BioSystem(ABI)这家一直占据着测序市场最大份额的公司的领先地位就开始动摇了,一个就是罗氏公司(Roche)的454 测序仪(Roch GS FLX sequencer),,另一个就是2006年美国Illumina公司推出的Solexa基因组分析平台(Genome Analyzer platform),为此,2007年ABI公司推出了自主研发的SOLiD 测序仪(ABI SOLiD sequencer)。这三个测序平台即为目前高通量测序平台的代表。(见表一) 公司名称技术原理技术开发者 Apply Biosystems(ABI) 基于磁珠的大规模并行克隆连接 DNA测序法 美国Agencourt私人基因组学公司(APG) Illumina 合成测序法英国Solexa公司首席科学家David Bentley Roche 大规模并行焦磷酸合成测序法 美国454 Life Sciences公司的创始人Jonathan Rothberg Helicos 大规模并行单分子合成测序法美国斯坦福大学生物工程学家Stephen Quake Complete Genomics DNA纳米阵列与组合探针锚定连接 测序法 美国Complete Genomics公司首席科学家radoje drmanac 表一:主流测序平台一览 Roche 454焦磷酸测序 (pyrophosphate sequencing) Illumina Solexa 合成测序 (sequence by synthesize) Illumina Genome AnalyzerIIx测序原理 Illumina公司的新一代测序仪Hiseq 2000和Hiseq 2500具有高准确性,高通量,高灵敏度,和低运行成本等突出优势,可以同时完成传统基因组学研究(测序和注释)以及功能基因组学(基因表达及调控,基因功能,蛋白/核酸相互作用)研究。Hiseq是一种基于单分子簇的边合成边测序技术,基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组DNA的随机片段附着到光学透明

测序技术的发展历程

测序技术的发展历程 随着1953年沃森和克里克发现了DNA的双螺旋结构,到2001年,首个人类基因组图谱的绘制完成,人们越来越多的认识到测序在生物医学中的重要作用。 测序技术的发展历史 Sanger测序技术 1975年由桑格和考尔森开创的链终止法测序技术标志着人类第一代DNA测序技术的诞生。1977年,人类历史上第一个基因组序列噬菌体X174由桑格团队测序完成。自此,人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力,并以此为开端步入基因组学时代。 SangerJ.D. Waston、F.Crick

虽然第一代测序技术的测序读长可达1000bp,准确性高达99.999%,但其测序成本高,通量低等方面的缺点,严重影响了其真正大规模的应用。因而第一代测序技术并不是最理想的测序方法。从那时起人们开始了二代测序技术的探索。 第二代测序技术 第二代测序技术的核心思想是边合成边测序(Sequencing by Synthesis),在Sanger等测序方法的基础上,通过技术创新,用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP,当DNA聚合酶合成互补链时,每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光,根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理,从而获得待测DNA的序列信息。 现有的技术平台主要包括Roche/454 FLX(已宣布停产)、Illumina Hiseq Miseq等系列和Applied Biosystems SOLID system。 Roche/454 FLX Illumina Hiseq 2500 AB SOLID 第三代测序技术 第二代测序技术虽然较Sanger测序有了巨大的突破,但是其测序的理论基础仍然建立在PCR扩增的基础之上。为了有效的避免测序过程中由于PCR扩增带来的偏差,科学家们积极投身到第三代单分子测序仪研究当中。目前最具代表性的包括Heliscope单分子实时合成测序法,纳米孔测序技术等。

高通量测序入门

很高兴成为论坛特邀专家,鄙人会接下来的一段时间内写一些高通量测序数据方面的帖子,由浅入深,可能刚开始会比较简单一些,后面会有一些针对性的专题,也欢迎各位大侠或小菜提出建议或问题大家一起探讨。为了活跃论坛建议大家直接跟帖或发新帖,我会尽快回复大家。 本人方向也仅限在RNA-seq 领域,所以其他领域的问题可能不太了解,只能按照自己的背景知识和请教别人解答,请大家慢拍砖! 另外,由于实验室课题比较忙,所以可能不能及时发帖或回复大家,也请见谅。 既然是入门专题,那就先简单说一下,要分析高通量测序数据的配置要求吧: 声明:该配置不适用与从华大拿回分析结果直接写paper 的同学。我认识的一位同学一点生物信息背景也没有,直接用华大返回分析结果发了很好的文章,如果想这样的同学可直接跳过这篇,等待以后的专题。 言归正传: 1. 软配置: 生物理论知识:熟悉生命活动的基本过程,对复制、转录、翻译、转录后修饰有较清晰的认识,如果知道cis-element 和trans-factor 的区别就更好了。推荐朱玉贤的分子生物学,能够掌握60% 就差不多了(这是对想通过测序数据进行生物分析同学的要求,如果是做软件开发等就无所谓了,比如国内做的很好的一些实验室,都是数学或自动化专业的牛人,以下一些配置也不适用这些牛人) 实验理论知识:不一定要做过实验,但至少要知道实验的过程,比如测序前样本的处理过程,序列片段化、加接头、PCR 扩增等。也许没有用,但将来出了问题,你可以很容易知道问题出在哪里 编程知识:要求不用太高,学一些perl 就可以了,对于生物专业的同学(本人就是生物专业),强烈推荐perl 语言入门,好像现在已经出到第五版了。此书极为搞笑,本人当时看了一个星期,其中幽默的语言导致本人经常笑出声音引得实验室同学以为神经了。对于有C 语言基础的同学来说简直就是菜,两天就可以通了。另外,学有余力的同学可以学一些R 以及python 或java. 因为好多软件都是用R 或python 写的,如果要是比较懒或三国杀很忙抽不出空就算了,学学perl 就好了。切记一点:perl 的学习过程中除了基础知识,一定要看一下哈希和模块这两部分。当然如果你们导师允许你对数据去个冗余也要半个月的话,你只学到循环就可以了。 统计学知识:只要大学上过生物统计也就差不多了(遇到二百五的老师你就比较悲剧了),最基本的知道什么是标准化,正态分布,p value 以及卡方检验或Fisher 精确检验,多重检验,,FDR 这些概念和计算方法也就差不多了。推荐从以下统计软件中择一精通之: SAS(比较变态,硕士期间学了,后来就还给老师了) excel(入手比较容易,好好学学,功能比较全,我学的差) matlab(本人认为最牛的统计软件,有专门的论坛,有兴趣的同学可以google 一下) SPSS(上手比较容易,而且很多汉化的非常好,新手同学比较推荐,但是精通比较

高通量测序:第二代测序技术详细介绍

在过去几年里,新一代DNA 测序技术平台在那些大型测序实验室中迅猛发展,各种新技术犹如雨后春笋般涌现。之所以将它们称之为新一代测序技术(next-generation sequencing),是相对于传统Sanger 测序而言的。Sanger 测序法一直以来因可靠、准确,可以产生长的读长而被广泛应用,但是它的致命缺陷是相当慢。十三年,一个人类基因组,这显然不是理想的速度,我们需要更高通量的测序平台。此时,新一代测序技术应运而生,它们利用大量并行处理的能力读取多个短DNA 片段,然后拼接成一幅完整的图画。 Sanger 测序大家都比较了解,是先将基因组DNA 片断化,然后克隆到质粒载体上,再转化大肠杆菌。对于每个测序反应,挑出单克隆,并纯化质粒DNA。每个循环测序反应产生以ddNTP 终止的,荧光标记的产物梯度,在测序仪的96或384 毛细管中进行高分辨率的电泳分离。当不同分子量的荧光标记片断通过检测器时,四通道发射光谱就构成了测序轨迹。 在新一代测序技术中,片断化的基因组DNA 两侧连上接头,随后运用不同的步骤来产生几百万个空间固定的PCR 克隆阵列(polony)。每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成。之后进行引物杂交和酶延伸反应。由于所有的克隆都是系在同一平面上,这些反应就能够大规模平行进行。同样地,每个延伸所掺入的荧光标记的成像检测也能同时进行,来获取测序数据。酶拷问和成像的持续反复构成了相邻的测序阅读片段。

Solexa高通量测序原理

--采用大规模并行合成测序法(SBS,Sequencing-By-Synthesis)和可逆性末端终结技术(ReversibleTerminatorChemistry) --可减少因二级结构造成的一段区域的缺失。 --具有高精确度、高通量、高灵敏度和低成本等突出优势 --可以同时完成传统基因组学研究(测序和注释)以及功能基因组学(基因表达及调控,基因功能,蛋白/核酸相互作用)研究 ----将接头连接到片段上,经PCR扩增后制成Library。 ----随后在含有接头(单链引物)的芯片(flowcell)上将已加入接头的DNA片段变成单链后通过与单链引物互补配对绑定在芯片上,另一端和附近的另外一个引物互补也被固定,形成“桥” ----经30伦扩增反应,形成单克隆DNA簇 ----边合成边测序(Sequencing By Synthesis)的原理,加入改造过的DNA 聚合酶和带有4 种荧光标记的dNTP。这些dNTP是“可逆终止子”,其3’羟 基末端带有可化学切割的基团,使得每个循环只能掺入单个碱基。此时,用激光扫描反应板表面,读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类。之后,将这些基团化学切割,恢复3'端粘性,继续聚合第二个核苷酸。如此继续下去,直到每条模板序列都完全被聚合为双链。这样,统计每轮收集到的荧光信号结果,就可以得知每个模板DNA 片段的序列。目前的配对末端读长可达到2×50 bp,更长的读长也能实现,但错误率会增高。读长会受到多个引起信号衰减的因素所影响,如荧光标记的不完全切割。 Roche 454 测序技术 “一个片段= 一个磁珠= 一条读长(One fragment =One bead = One read)”1)样品输入并片段化:GS FLX 系统支持各种不同来源的样品,包括基因组DNA、PCR 产物、BAC、cDNA、小分子RNA 等等。大的样品例如基因组DNA 或者BAC 等被打断成300-800 bp 的片段;对于小分子的非编码RNA 或者PCR 扩增产物,这一步则不需要。短的PCR 产物则可以直接跳到步骤3)。 2)文库制备:借助一系列标准的分子生物学技术,将A 和B 接头(3’和5’端具有特异性)连接到DNA 片段上。接头也将用于后续的纯化,扩增和测序步

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