天然抗菌肽的结构改造研究进展_刘倍均

天然抗菌肽的结构改造研究进展

刘倍均，姚佳2，倪京满

1*

1.兰州大学药学院，甘肃兰州730000；

2.兰州大学第一医院，

甘肃兰州730000摘要：抗菌肽是一类小分子多肽类物质，由10 50个氨基酸组成，具有广谱的抗菌特性，由于其机制与一般抗生素不同，故不易使病原菌产生耐药性，因此抗菌肽有望被开发成为新一代肽类抗生素。但抗菌肽的稳定性差、溶血毒副作用强、治疗指数低等缺点限制了其进一步发展，所以，近年来对抗菌肽的结构改造已成为研究热点。该文主要从抗菌肽的二级结构、结构改造及抗菌肽机制研究三方面进行了综述，并对抗菌肽在结构改造中存在的问题加以分析，为更好地把握和设计新型抗菌肽奠定基础。关键词：抗菌肽，结构改造，二级结构，作用机制，耐药性中图分类号：Q518.1

文献标识码：A

DOI ：10．16519/j．cnki．1004－311x．2015．01．020

Structure reformation strategy of natural antimicrobial peptides

Beijun Liu 1，Jia Yao 2，Jingman Ni 1*

1.School of Pharmacy ，Lanzhou University ，Lanzhou 730000，China ；

2.The First Hospital of Lanzhou University ，Lanzhou 730000，China

Abstract ：Antimicrobial peptides were a class of small molecule peptide substance ，which had 10－50amino acids.It had a broad spec-trum of antimicrobial properties.The mechanism of antimicrobial peptides was different from normal antibiotics ，so they did not induce drug resistance.Antimicrobial peptides were expected to be developed into a new generation of peptide antibiotics.However ，antimicrobial pep-tides had some drawbacks which could hamper its development in future ，such as low stability ，strong hemolytic activity.In recent years ，the structural reformation of antimicrobial peptides was a hot topic.Thus ，we reviewed three points about its secondary structure ，structure reformation ，mechanism and some questions in structure reform were analyzed ，which laid the foundation for a better grasp of the research and designing of antimicrobial peptides.

Key words ：antimicrobial peptides ，structure transformation ，mechanism ，resistance

基金项目：国家自然科学基金项目

（“稳定性酸敏感穿膜肽的设计与应用”，No．81273440）；甘肃省科技支撑计划项目（“创新中药甘草降糖分散片新药研发”

，No．1204FKCA147）资助作者简介：刘倍均（1990－），女，硕士生在读，研究方向：药物新剂型与新制剂，Email ：liubeijunld@163．com 。*通讯作者：倪京满（1965－），女，教

授，博士生导师，研究方向：药物新剂型与新制剂，

Tel ：0931－8915683，Email ：nijm@lzu．edu．cn 。收稿日期：2014－09－10；修回日期：2014－12－29

抗菌肽是指一类由10 50个氨基酸组成的小分子多肽类物质，其来源丰富，广泛存在于原核和大部分真核生物体内，参与宿主免疫系统的构建。它们有很宽的抗菌谱，可以作用于标准菌株，有的还选择作用于寄生虫、肿瘤细胞或病毒，并表现出很好的生物学活性。由于抗菌肽与常规抗生素的抗菌作用机制不同，因此它们不易诱导药物耐药性的产生，基于此，抗菌肽已成为生物医药学科的研究热点，但抗菌肽存在稳定性差、溶血毒副作用强等弊端，影响抗菌肽的应用。对抗菌肽进行结构改造可以在一定程度上弥补天然抗菌肽存在的缺陷，提高其使用价值。现从抗菌肽的二级结构、结构改造及作用机制三方面加以综述，并对改造中存在的问题加以分析，为今后设计优化新型抗菌肽奠定基础。

1抗菌肽的二级结构分类

天然抗菌肽一般是阳离子型，带有净正电荷的小分子多肽，在菌膜模拟环境条件下，抗菌肽会表现出不同的二级结构，二级结构的产生为抗菌肽发挥抗菌作用提供基础。1.1

α螺旋型抗菌肽

α螺旋是一个近乎完美的水脂两亲性结构

［1］

，即

带正电荷的亲水性氨基酸分布在螺旋轴的一边，其对

立面是疏水性氨基酸组成的疏水区，

螺旋度的变化会影响其抗菌活性。α螺旋抗菌肽主要包括天蚕素、爪

蟾抗菌肽Magainin 、

Cathelindia 等［2］。使用圆二色谱，可以对抗菌肽的二级结构作出分析，圆二色谱显

示α螺旋抗菌肽在192nm 附近有1个正峰，在208nm 、222nm 处呈现2个负峰。1.2β折叠型抗菌肽

β折叠型抗菌肽在氨基酸组成上多含有Cys ，β折叠型抗菌肽可以形成分子内二硫键。在抗菌肽家族中防御素及许多富含脯氨酸的抗菌肽都具有β折叠的二级结构。圆二色谱图中，β折叠在216 218nm 有1个负峰，在185 200nm 有1个强的正峰。鲎素是一个经典的折叠型抗菌肽，来源于鲎的红细胞中，它是由18个氨基酸组成的肽，在序列3 8和16 11之间构成反平行折叠结构，残基3和16以及7

和12之间形成2个二硫键［3］

。1.3环形结构抗菌肽

环形结构抗菌肽中的环形结构由序列中的一个

单键维持，环形结构的抗菌肽在抗菌肽家族中不太多见，它可能具有α螺旋结构、β折叠结构。该类抗菌肽抗菌谱广，能对抗细菌和真菌，通过NMＲ（质子核磁共振）技术测定结构，发现具有反平行β片层的结构，序列11位和18位间形成二硫键，通过二硫键稳定整个结构［4］。

2抗菌肽的结构改造

2.1氨基酸残基替换法

氨基酸残基替换法属于抗菌肽线性改造的方法，该方法简便易得，应用广泛，它是将原序列中的氨基酸用设计的其他氨基酸替换，观察替换后的效果。Maria Lnisa Mangoni等［5］研究抗菌肽TemporinL（Phe －Val－Gln－Trp－Phe－Ser－Lys－Phe－Leu－Gly －Arg－Ile－Leu），该抗菌肽具有很强的抗菌活性，但缺点是对人血红细胞也会产生很强的溶血作用，毒性较大，安全指数低。该课题组通过氨基酸残基替换法对Temporin L进行线性改造，研究发现将原序列中3位的Gln替换为Pro后，可以降低Temporin L对人血细胞的破坏作用，与母肽相比会同时提高Temporin L对革兰氏阳性菌及真菌的作用。引入某些氨基酸如Pro提高治疗指数，可能与Pro破坏抗菌肽二级结构有关［6］。若用L－Pro分别替换抗菌肽Polybia－MPI（IDWKKLLDAAKQIL－NH

2

）Leu7和Ala8或Asp9时，结果发现这替换后类似物丧失了抗菌活性，CD结果显示，Pro替换Leu7、Asp9会明显降低α螺旋的含量，Ala8被替换后会彻底丧失α螺旋的结构［7］，说明α螺旋二级结构对维持抗菌肽的生物活性有重要的作用。

2.2缩短氨基酸序列长度

将抗菌肽氨基酸序列长度变短是一种简单有效的改造方法，通过切除部分氨基酸残基得到活性较好的短肽。Cathelicidin家族的抗菌肽PMAP－36，它由36个氨基酸组成，将其C末端附近的12个氨基酸残基片段切去，由N末端剩下的24个氨基酸组成GI24的类似物，GI24与PMAP－36活性一致，可见N末端24个氨基酸是PMAP－36的活性区域［8］。人源性抗菌肽LL－37是由37个氨基酸组成，Yong hai Nan 等［9］截取LL－37中部的19个氨基酸得到类似物IG －19，发现IG－19仍具有很强的抗菌活性，同时对IG19进行了氨基酸替换研究，发现提高疏水性会增强对脂多糖LPS的中和能力。缩短序列长度既节约合成成本，也缩短了合成的时间。

2.3引入疏水性基团

疏水性是影响抗菌肽抗菌活性的一个重要因素，由于抗菌肽含有接近50%疏水性的氨基酸残基，疏水性基团的引入可以增加抗菌肽的疏水性，由于疏水性基团的存在，肽链在菌膜环境中容易形成多聚体，增强了对细胞膜的作用力，使抗菌肽活性增强。Jack C.Slootweg等［10］将2－氨基十一烷酸作为一种亲脂性的氨基酸，将其插入到抗菌肽Anoplin原序列的许多固定位点上，得到一系列亲脂性类似物，结果显示类似物抗菌活性显著提高，同时可以维持对菌膜的选择性。有研究还发现在一组非膜活性肽PA家族的N 末端引入棕榈酸，得到相应的脂肽类似物，发现引入棕榈酸后，抗菌谱变宽，对细菌和真菌都有效［11］。2.4片段组合

片段组合是指通过拼接的方法将不同序列的抗菌肽进行自由组合，筛选出活性强，安全性高的抗菌肽。Xiaoxia Xu等［12］通过组合抗菌肽cecropinA（1－8）－magainin2（1－12）发现抗菌肽A－MA保留了抗菌特性，同时没有溶血活性，提高了抗菌肽的安全性。片段组合使活性区域叠加后可以增强生物学活性，如组合2个牛乳铁蛋白抗菌肽的活性区即lacto-ferrampin（LFam－pin265 284）和部分lactofemicin （LFcin17－30），与其单独母肽相比，组合肽抗菌活性显著增强［13］。多肽组合还可以通过化学键来完成，Song Jingjing等［14］将肽Mitp和MitpE通过形成分子间二硫键链接起来形成AMitp，MitpE含His，Mitp 含Lys，链接肽在酸性条件下，His质子化，使AMitp 带更多的正电荷，具有酸激活的特性，同时链接肽酶解稳定性提高。

2.5环化

2.5.1骨架环化反应

骨架环化反应（如：共价键链接N末端－NH2基和C末端－COOH基或N末端Cys和C末端－SH 基）作为一种有效的手段被用于稳固蛋白质结构和功能。与二硫键相比，酰胺键共价链接能产生一个更稳定的拓扑限制［15］，因此，骨架环化的方法可以提高酶解稳定性（特别是可以耐受外切蛋白酶）。Leonard T.Nguyen［16］等应用骨架环化方法改造富含Trp和Arg短肽，该组分别使用二硫键和酰胺键对肽进行环化改造，结果发现二种环化方法对抗菌肽有不同的影响，二硫键环化类似物抗菌活性显著增强，而酰胺键环化类似物酶解稳定性会显著提高。

2.5.2分子内侧链环化

环化是改善抗菌肽的稳定性的一种很好的方法［17－20］，可以利用官能团进行分子内侧链环化，常见的如侧链由酰胺键或二硫键连接，形成分子内环化。

近年来，随着化学与生物的结合，烯烃环闭合复分解反应和点击化学反应被不同程度的成功应用到抗菌肽侧链环化改造中。烯烃环闭合复分解反应简称ＲCM反应，是一种常用的环化反应，由Fu和Grubbs 在1992年首次提出，是一种在金属催化剂下的碳－碳双键打开并重新链接成单键的过程，该过程伴随2个碳原子的消失［21－22］。Hubert Chapuis等［23］利用ＲCM反应环化α螺旋抗菌肽lasioglossinⅢ，环化包括单烃基键合和双烃基键合2种类似物，结果发现，单烃基键合肽可以提高抗菌肽的酶解稳定性，而双烃基键合肽会使溶血活性提高，但抗菌活性降低。圆二色谱结果表明，在水溶液，与母肽相比单一烃基键合肽类似物有轻微的优势来形成α螺旋的二级结构，但双烃基键合抗菌肽类似物，α螺旋率显著提高。虽然，双烃基键合α螺旋率提高，但抗菌活性降低的原因可能是分子侧链双烃基键合降低了抗菌肽的活动自由度，削弱了与菌膜的作用，而溶血活性提高与双烃基键合后疏水性的增加密切相关。可见，这种ＲCM反应产生的C－C键合对α螺旋有稳定作用［24］，可以被用来修饰α螺旋抗菌肽。“click chem-istry”（点击化学）是美国诺贝尔化学奖得主K．B．Sharpless提出的，最大的特点是能快速合成大量化合物［25］。点击化学的代表是Cu（Ⅰ）催化叠氮基和炔基的环加成，它会区域选择性地合成1，4－二取代－1，2，3－三唑结构的产物，多用水为溶剂，产率高，绿色环保，反应时间短等优点［26］。分子三维分析技术证明1，4－二取代－1，2，3三唑结构与酰胺键有着相似的空间距离和平面排布［27］，它有极大潜力运用于抗菌肽结构改造。研究发现，Cu（Ⅰ）催化产生的1，4－二取代－1，2，3－三唑结构可以替换分子内二硫键［28］，消除二硫键自身不稳定的因素。Kai Holland N［29］等探讨了三唑结构与二硫键，TP－1是一个17序列的双环肽，分子序列中包含2个二硫键，空间结构是β折叠的彩带样结构。用三唑结构替换分子内二硫键后，发现仍可以维持生物活性，Kawamoto Ste-ven A［30］等应用点击化学对BCL9多肽进行双环化，形成具有稳定结构的环肽，发现双环化类似物保留了原有的生物活性。因此，Cu离子催化的点击化学反应产生的1，4－二取代－1，2，3－三唑结构被认为是一种新型的药效团，有极大的潜力可以将其运用到抗癌、抗菌、HIV酶抑制剂等研究中［31］。

3抗菌肽的作用机制研究

3.1抗菌肽作用于菌膜

破坏菌膜的方式大致有以下三种：①环式模型，带正电荷的抗菌肽在静电吸引作用下，聚集到带负电荷的菌膜表面，抗菌肽诱导并参与单层磷脂膜连续弯曲，通过小孔使抗菌肽插入由磷脂头部基团组成的水通道中［32］，在分子动力学模拟中，线性抗菌肽一般是产生无序的环形孔，则会引起更大的穿透力［33－34］。

②毯式模型，抗菌肽平铺到菌膜的表面直到域浓度时，才会在膜表面形成小孔，随之发生膜的破坏，导致菌体死亡［35］，人源性的抗菌肽LL－37就是采用这种方式来破坏菌膜［36］。③桶式模型，抗菌肽在质膜中是垂直于细胞膜排列的其疏水侧面在外部，极性面组成孔洞，细菌细胞质内容物从这些孔洞流失，导致细胞死亡，其中抗菌肽是以单体或者是多聚体的形式进行结合的，利用桶式模型的抗菌肽通常是α螺旋双亲结构或β折叠结构的抗菌肽［37－38］。上述三种方式是一般抗菌肽破膜的机制，但目前抗菌肽精确的抗菌机制仍然没有研究清楚，需要进一步探讨。探讨的方式可以采用模拟菌膜环境，Wang KＲ等［39］在研究抗菌肽MPI的作用机制时，利用了计算机辅助模拟菌膜的技术，观察抗菌肽与菌膜作用的动力学过程，直观地观察到抗菌肽与菌膜作用的变化，Dosler Si-bel［40］利用结晶紫染色分别评估铜绿假单胞菌菌膜破坏，发现单独抗生素孵育菌膜，在抗生素治疗浓度时，仍然不会破坏菌膜，而菌膜与抗菌肽LL－37孵育时，发现会破坏生物被膜的形成，使菌体死亡。

3.2抗菌肽抑制或破坏细胞内容物

抗菌肽的作用机制除了上述的与菌膜作用以外，还有研究显示抗菌肽可以与细胞内容物作用，与细胞内的DNA、ＲNA或蛋白质结合，抑制细菌细胞壁的合成。抗菌肽BuforinⅡ具有很低的螺旋度，当与模拟的菌膜接触时，BuforinⅡ可以紧密地结合双股DNA分子，最终形成肽－DNA复合物，诱发菌体死亡［41］。肽与双股DNA结合力与结构的改变紧密相连，可以设计出具有特定结构的抗菌肽来促进膜的穿透，DNA的结合和凝聚。反过来说明α螺旋的对膜的穿透是十分重要的，但对DNA的结合与凝聚影响不明显。

4问题与措施

4.1问题

在抗菌肽结构改造中，环化方法对抗菌肽结构产生的影响比一般的线性改造要大的多，在环化改造中特别要注意环化位点引起的生物活性的变化，对于烯烃环闭合复分解反应在应用上要注意产物有化学立体选择性，在合成时采用确保产物结构的准确性是后续研究的基础［42］。对于点击化学在抗菌肽结构改造

中的研究还不是很多，大都集中于它与二硫键之间的对比上，对于其他方面的如替换氨基酸位点间隔，构效关系等涉及很少，此外，点击化学的双环化应用是一个难点这些可能是今后可以深入探讨的方向。

4.2措施

在对某一种抗菌肽进行改造前，要对其进行深入的文献调查，找到序列中影响活性的关键氨基酸，再结合现有的构效关系理论，在维持或提高抗菌活性的前提下对其进行有目的改造，规避原有的弊端，提高改造的成功性，另外，在对抗菌肽机制的研究时，可以利用计算机辅助设计、蛋白质免疫印迹等手段进一步深入验证。

5展望

近年来，通过对新发现的抗菌肽的氨基酸序列进行结构修饰，来寻找影响抗菌肽活性的关键位点，从而进一步设计抗菌肽类似物，以期获得生物活性改善的抗菌肽。结构修饰的大部分抗菌肽有α螺旋两亲性的特点，结合抗菌肽的二级结构，疏水性氨基酸残基数量及位置等方面对抗菌肽进行有目的改造，由于抗菌肽酶解稳定性差是阻碍其应用的重要因素，因此在今后的研究中只有保证在维持抗菌活性基础上，提高其酶解稳定性，才能够有效将抗菌肽应用于食品、医药等领域。目前抗菌肽的作用机制研究还不是很清楚，须要进一步探索，近几年发展起来计算机辅助设计平台可以模拟抗菌肽与生物膜的作用，还可作为筛肽的一个有用的工具，通过计算机模拟，得到一些类似物参数，有助于抗菌肽的设计与开发。

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