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293、293T细胞培养及转染一点经验

293、293T细胞培养及转染一点经验

qq :439572370HEK-293是用DMEM 培养基培养吗?

HEK-293细胞是我在锐赛生物实验室做项目时常培养的细胞,DMEM+10%血清+双抗+谷氨酰胺,这类的细胞贴壁性不是太强,所以不要消化过久,容易损伤细胞。

状态较好的293细胞

细胞生长较快,一般1:3~1:5传代,30%~50%融合度2-3

天即可长满。

细胞状态不好后会变瘦、产生大量黑点(细胞碎片)。

网友咨询:我们这里的293转染质粒效率一直不高,

各种方法均试过了,很少能达到50%,老板说他在

国外做293转染很容易达到80%以上。我想问一下哪里有好的293细胞卖?非常感谢。答:293系列的细胞都是非常好转染的:注意点:

1.转染前细胞的铺板密度、细胞状态

2.转染的时间

3.转染试剂与质粒的比值

干扰载体转染293T 细胞48h 的图片,供参考。

293T 细胞生长速度更快,形态较293A 细胞小,贴壁性比293

细胞弱很多,消化时间更要注意,没培养过的刚接手细胞要在注意留种的同时多试验消化几次,掌握经验值。

293

细胞常用于腺病毒包装、293T

细胞常用于慢病毒包装。

FuGENE 转染流程

FuGENE HD真核细胞转染流程 FuGENE HD Transfection Reagent Quick Protocol.pdf FuGENE HD Transfection Reagent.pdf 1.细胞和质粒的准备 ①将约5-10×105A549细胞接种于6孔细胞板中,用含10%小牛血清的F-12k 培养过夜,约60%~80%铺满时用于转染。 注:一般荧光试验细胞稀一点为宜;WB试验细胞密一点为宜 ②转染时所用质粒均用转染专用质粒抽提试剂盒无菌提取,抽提后测定其浓度 和纯度,浓度在0.1μg/μL以上且纯度在1.8±0.5 (OD260/OD280)的质粒用于转染,质粒提取的具体步骤按说明书提供的方法进行。(注:质粒浓度测定未必可行,需同时进行酶切和PCR鉴定方可。) ③按照转染剂量,计算质粒使用浓度 2.转染流程 注:由于不同转染试剂对质粒大小、性质、转染量、细胞的种类有很强的特异性,必须谨慎选择转染试剂。以多次转染成功使用的转染试剂为佳。 ①将培养板中的上清弃去,用细胞用无抗无血清F12K洗涤三次后,每孔加入 800ul 无抗无血清F12K。 ②取出FuGENE HD转染试剂,使其温度上升到室温。 ③计算好质粒、转染试剂、以及无抗无血清F12K的量,最终液体总量为100 ul。 准备好无菌指形管,按计算结果加入90-98ul的无抗无血清F12K,加入2ug 质粒,振荡器混匀;随后加入6ul FuGENE HD转染试剂,立即震荡混匀(转染试剂加入时不能沾到管壁上!) ④室温静置7-12分钟后,将质粒:转染试剂混合液均匀滴加在细胞平板孔中, 吹打混匀或者震荡混匀。放入37℃培养箱孵育。

转染步骤及经验(精华)

转染步骤及经验(精华) 一、基础理论 转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类:物理介导方法:电穿孔法、显微注射和基因枪;化学介导方法:如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术;生物介导方法:有较为原始的原生质体转染,和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法,应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术,是目前转染效率最高的方法,同时具有细胞毒性很低的优势。但是,病毒转染方法的准备程序复杂,常常对细胞类型有很强的选择性,在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法,则各有其特点。需要指出的一点,无论采用哪种转染技术,要获得最优的转染结果,可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多,从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节(见后文)。 二、转染操作流程(以常用的6孔板为例) (1) 细胞培养: 取6孔培养板,以3x104/cm2密度铺板,37℃5%CO2培养箱中培养至70%~90%汇合。(不同细胞略有不同,根据实验室优化的条件进行,汇合过分,转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备: 在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量) A液:用不含血清培养基稀释1-10μg DNA,终量100μL, B液:用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂,终量100μL; 轻轻混合A、B液(1:1混匀),室温中置15分钟,稍后会出现微浊现象,但并不妨碍转染。 (3) 转染准备:用2mL不含血清培养液漂洗两次,再加入2mL不含血清及PS的培养液。 (4) 转染:把A/B复合物缓缓加入培养液中(缓慢滴加),轻轻摇匀,37℃温箱置6~8小时,吸除无血清转染液,换入正常培养液继续培养。 三、转染注意事项 1. 血清 A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清,因为血清会影响复合物的形成。 B.一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题,转染用的培养液可以含血清也可以不加,但血清一度曾被认为会降低转染效率,转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。 C. 对于对血清缺乏比较敏感的细胞,可以使用一种营养丰富的无血清培养基OPTI-MEMⅠ培养基, 或者在转染培养基中使用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞,建议使用LIPOFECTAMINE 2000。无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用,有条件的话,就用它代替PBS洗细胞两遍,注意洗的时候要轻,靠边缘缓缓加入液体,然后不要吹吸细胞,而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害,细胞又损失一部分,加了脂质体后,细胞受影响就更大了,死亡细胞会增多。 2.抗生素(PS) 抗生素,比如青霉素和链霉素,是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒,但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性,使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性,导致转染效率低。所以,在转染培养基中不能使用抗生素,甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样,在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染,不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素,因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外,为了保证无血

lipo2000转染操作步骤

Stealth? RNAi or siRNA Transfection 以24孔板为例,其余规格的转染见表1 1 中板,细胞密度为30-50%适宜。 注意:根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度,如果转染后需要长时间后检测,则细胞中板密度适当降低,已避免细胞过度生长导致存活降低。 2 第二天(24-36小时后)每个孔转染方式如下: A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中,混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合,放置20min。 3 转染期间,将24孔板培养基换成无血清培养基,每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中,4-6小时候换成有血清培养基。 Plasmid DNA Transfection DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高,转染效率,表达效率也越高,并且可以降低细胞毒性。 1 中板。 贴壁细胞:0.5-2X105 cells/well,第二天待细胞密度达到90%以上时转染 悬浮细胞:4-8X105 cells/well,中板后随即转染。 2 转染。 A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中,混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合,放置20min。 转染期间,将24孔板培养基换成无血清培养基,每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中,4-6小时候换成有血清培养基。

Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection *:中板密度根据不同细胞不同实验有所不同,这里仅提的数据仅供参考 **:6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。 ***:6cm dish细胞质粒转染量4-6ug足以。

细胞转染操作方法及各方法比较

细胞转染操作方法 转染,是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入,转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例;化学介导方法很多,如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术;生物介导方法,有较为原始的原生质体转染,和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。 理想细胞转染方法,应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术,是目前转染效率最高的方法,同时具有细胞毒性很低的优势。但是,病毒转染方法的准备程序复杂,常常对细胞类型有很强的选择性,在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法,则各有其特点。 需要指出的一点,无论采用哪种转染技术,要获得最优的转染结果,可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多,从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态,到转染方法的操作细节,都需要考虑。 一、细胞传代 1. 试验准备:200ul/1mlTip头各一盒(以上物品均需高压灭菌),酒精棉球,废液缸,试管架,微量移液器,记号笔,培养皿,离心管。 2. 弃掉培养皿中的培养基,用1ml的PBS溶液洗涤两次。 3. 用Tip头加入1ml Trypsin液,消化1分钟(37℃,5%CO2 )。用手轻拍培养瓶壁,观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。 4. 加入1ml的含血清培养基终止反应。 5. 用Tip头多次吹吸,使细胞完全分散开。

6. 将培养液装入离心管中,1000rpm离心5min。 7. 用培养液重悬细胞,细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。 8. 将合适体积完全培养液加入离心管中,混匀细胞后轻轻加入培养皿中,使其均匀分布。 9. 将培养皿转入CO2培养箱中培养,第二天转染。 二、细胞转染 1. 转染试剂的准备 ①将400ul去核酸酶水加入管中,震荡10秒钟,溶解脂状物。 ②震荡后将试剂放在-20摄氏度保存,使用前还需震荡。 2. 选择合适的混合比例(1:1-1:2/脂质体体积:DNA质量)来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA,震荡后在加入合适体积的转染试剂,再次震荡。 3. 将混合液在室温放置10―15分钟。 4. 吸去培养板中的培养基,用PBS或者无血清培养基清洗一次。 5. 加入混合液,将细胞放回培养箱中培养一个小时。 6. 到时后,根据细胞种类决定是否移除混合液,之后加入完全培养基继续培养24-48小时。 三、第二次细胞传代 1. 在转染后24小时,观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。 2. 再次进行细胞传代,按照免疫染色合适的密度0.8X105个细胞/35mm培养皿将细胞重新转入培养皿中。 3. 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。

siRNA细胞转染实验操作指南

siRNA细胞转染实验操作指南 siRNA产品的最佳工作浓度、转染后检测时间因不同的细胞类型和研究目的而异。一般推荐的siRNA工作浓度为50nM,检测时间为转染后24~72h。可以通过设置时间梯度和浓度梯度进行组合实验来选择最优的siRNA工作浓度和检测时间。由于siRNA过量会对细胞产生毒性,实验建议的siRNA 工作浓度优化的范围为5~100nM。 下面以Lipofectamine 2000转染24孔板的293T细胞为例,选取50nM的siRNA工作浓度,介绍siRNA转染细胞的操作步骤。若使用其他的转染试剂,请参照对应的产品说明书进行操作。 1.在转染前一天,按1×105~5×105个/孔的量将细胞接种于不含抗生素的完全培养基中,使次日转染时细胞融合度30-50%为宜。接种时尽量 保证每孔细胞的接种数量一致,使细胞均匀地平铺在生长表面。 注意:降低转染时的细胞密度可延长转染和收样的时间间隔,避免细胞过度生长对实验结果造成影响。可根据细胞特性和实验目的等,调整接种时的细胞密度。 2.每个待转染的细胞样品(每个培养孔),按以下体系配置转染所需的siRNA-Lipofectamine 2000复合物: (1)配制稀释液A:取25pmol siRNA于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释,轻轻混匀。(*siRNA的用量计算参照表1) (2)配制稀释液B:使用前先将Lipofectamine 2000轻轻混匀,取出1ul于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释,轻轻混匀,室温下孵育5分钟。注意孵育时间不能超过25min。 (3)孵育完成后,将稀释液A与B轻轻混匀得到siRNA-Lipofectamine 2000复合物,在室温下孵育20分钟。此时溶液可能会浑浊,属于正常现象。 表1 不同细胞培养板siRNA 转染用量参考表 3.将孵育好的siRNA-Lipofectamine 2000复合物分别加到对应的细胞孔中,轻轻混匀。 注意:转染前无需更换新鲜培养基,直接将复合物加到原细胞培养基中即可。如有需要,也可根据情况更换培养基优化该步骤。 4.如果需要进行其他特殊处理,如加药等,可在此时进行。 5.将细胞培养板置于37℃的CO2培养箱中培养24-72h。具体培养时间根据细胞生长特性、实验目的进行调整。 注意:加入siRNA-Lipofectamine 2000复合物后一般无需更换培养基,但若脂质体类转染试剂对细胞毒性较大,可根据细胞的状态,在转染4-6小时后更换培养基。 6.进行后续总RNA提取、蛋白提取、细胞活性分析等实验。

细胞转染技术原理及应用

细胞转染技术原理及应用 常规转染技术可分为两大类,一类是瞬时转染,一类是稳定转染(永久转染)。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中,因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数,产生高水平的表达,但通常只持续几天,多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说,超螺旋质粒DNA转染效率较高,在转染后24-72小时内(依赖于各种不同的构建)分析结果,常常用到一些报告系统如荧光蛋白,β半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染,外源DNA 既可以整合到宿主染色体中,也可能作为一种游离体(episome)存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小,大约1/104转染细胞能整合,通常需要通过一些选择性标记,如来氨丙基转移酶(APH;新霉素抗性基因),潮霉素B磷酸转移酶(HPH),胸苷激酶(TK)等反复筛选,得到稳定转染的同源细胞系。 转染技术的选择对转染结果影响也很大,许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例,细胞数量,培养及检测时间等。一些传统的转染技术,如DEAE右旋糖苷法,磷酸钙法,电穿 孔法,脂质体法各有利弊 近年来国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术,以其适用宿主范围广,操作简便,对细胞毒性小,转染效率高受到研究者们的青睐。其中树枝状聚合物(Dendrimers)和聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)的转染性能最佳,但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性,且其合成工艺复杂。聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子,每相隔二个碳个原子,即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子,使得聚合物网络在任何pH 下都能充当有效的“质子海绵”(proton sponge)体。这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞,其效果好于脂质聚酰胺,经进一步的改性后,其转染性能好于树枝状聚合物,而且它的细胞毒性低。大量实验证明,PEI是非常有希望的基因治疗载体。目前在设计更复杂 的基因载体时,PEI经常做为核心组成成分。 线型PEI(Line PEI,LPEI)与其衍生物用作基因转染载体的研究比分枝状PEI(Branched PEI,BPEI)要早一些,过去的研究认为在不考虑具体条件,LPEI/DNA转染复合物的细胞毒性较低,有利于细胞定位,因此与BPEI相比应该转染效率高一些。但最近研究表明BPEI 的分枝度高有利于形成小的转染复合物,从而提高转染效率,但同时细胞毒性也增大。超高分枝的、较柔性的PEI衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基,在染实验中发现这种PEI的毒性 低,但转染效率却较高。 GenEscort是采用各种分枝状和超高分枝状的小分子PEI与各种含有生理条件下可降解键的交联剂交联,合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝结构使得其具有较高的正电性,因此易于高效地包裹各种DNA、RNA分子及质粒形成小的纳米颗粒,从而提高转染效率,当所形成复合物进入细胞以后,其中所含的生理条件下可降解的化学键在细胞内水解,使交联聚合物分解为无细胞毒性的小分子PEI,这样结构的转染试剂在体外应用可以获得高的转染效率和低的细胞毒性,其可降解性对体内应用也具有重要的意义。

细胞转染的操作步骤

细胞转染的操作步骤 转染,是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入,转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例;化学介导方法很多,如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术;生物介导方法,有较为原始的原生质体转染,和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。红外碳硫仪理想细胞转染方法,应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术,是目前转染效率最高的方法,同时具有细胞毒性很低的优势。但是,病毒转染方法的准备程序复杂,常常对细胞类型有很强的选择性,在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法,则各有其特点。 >需要指出的一点,无论采用哪种转染技术,要获得最优的转染结果,可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多,从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态,到转染方法的操作细节,都需要考虑。 一、细胞传代 1. 试验准备:200ul/1mlTip头各一盒(以上物品均需高压灭菌),酒精棉球,废液缸,试管架,微量移液器,记号笔,培养皿,离心管。 2. 弃掉培养皿中的培养基,用1ml的PBS溶液洗涤两次。 3. 用Tip头加入1ml Trypsin液,消化1分钟。用手轻拍培养瓶壁,观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。 4. 加入1ml的含血清培养基终止反应。 5. 用Tip头多次吹吸,使细胞完全分散开。 6. 将培养液装入离心管中,1000rpm离心5min。 7. 用培养液重悬细胞,细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。8. 将合适体积完全培养液加入离心管中,混匀细胞后轻轻加入培养皿中,使其均匀分布。 9. 将培养皿转入培养箱中培养,第二天转染。 二、细胞转染 1. 转染试剂的准备 ①将400ul去核酸酶水加入管中,震荡10秒钟,溶解脂状物。 ②震荡后将试剂放在-20摄氏度保存,使用前还需震荡。 2. 选择合适的混合比例(1:1-1:2/脂质体体积:DNA质量)来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA,震荡后在加入合适体积的转染试剂,再次震荡。 3. 将混合液在室温放置10―15分钟。 4. 吸去培养板中的培养基,用PBS或者无血清培养基清洗一次。 5. 加入混合液,将细胞放回培养箱中培养一个小时。 6. 到时后,红外碳硫仪根据细胞种类决定是否移除混合液,之后加入完全培养基继续培养24-48小时。三、第二次细胞传代1. 在转染后24小时,观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。 2. 再次进行细胞传代,按照免疫染色合适的密度0.8X10 个细胞/35mm培养皿将细胞重新转入培养皿中。 3. 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。

细胞转染操作步骤

RNAi or siRNA Transfection 以24孔板为例,其余规格的转染见表1 1 中板,细胞密度为30-50%适宜。 注意:根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度,如果转染后需要长时间后检测,则细胞中板密度适当降低,已避免细胞过度生长导致存活降低。 2 第二天(24-36小时后)每个孔转染方式如下: A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中,混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合,放置20min。 3 转染期间,将24孔板培养基换成无血清培养基,每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中,4-6小时候换成有血清培养基。 Plasmid DNA Transfection DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高,转染效率,表达效率也越高,并且可以降低细胞毒性。 1 中板。 贴壁细胞:0.5-2X105 cells/well,第二天待细胞密度达到90%以上时转染 悬浮细胞:4-8X105 cells/well,中板后随即转染。 2 转染。 A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中,混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合,放置20min。 转染期间,将24孔板培养基换成无血清培养基,每孔400ul。将C管mix

加入24孔板对应孔中,4-6小时候换成有血清培养基。 Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection 中板密度*Culture vessel Surf. area per well Vol. of plating medium Vol. of dilution medium DNA Lipofectamine ?2000 cell/well 96-well0.3cm2100ul2X25ul0.2ug0.5ul 0.5-2X105 cell/well 24-well2cm2500ul2X50ul0.8ug 2.0ul 1-3X105 cell/well 12-well4cm21ml2X100ul 1.6ug 4.0ul 2-3X105 cell/well 6-well (35mm) 10cm22ml2X250ul 4.0ug**10ul 8-10X105 cell/dish 60mm20cm24ml2X0.5ml8.0ug***20ul 2-3X106 cell/dish 10cm60cm215ml2X1.5ml24ug60ul *:中板密度根据不同细胞不同实验有所不同,这里仅提的数据仅供参

细胞转染的详细过程

细胞转染的详细过程 1、准备工作如下: 1)从pFastBacTM construct中纯化重组的bacmind DNA(500ng/μl溶于TE中) 从相应的pFastBacTM construct对照中纯化bacmind DNA(500ng/μl溶于TE中)。 细胞培养在适合的培养基中。 细胞转染剂Cellfectin(4℃储存)无任何添加物(例如:FBS,抗生素等)的细胞培养基。用于细胞培养的完全生长培养基(例如:Sf-900ⅡSFM TNMFH 或其他适合的培养基)。2)在6孔板或是35毫米dish上,每孔培养9*105Sf9细胞,细胞培养于2ml含抗生素的生长培养基中。 3)细胞在27℃孵育至少一小时。 4)对于每一个转染的样品,准备bacmid DNA:与细胞转染剂在12*75mm消毒管中进行如下混合: 用100μl无血清培养基稀释1μl纯化的bacmid DNA。 用100μl无血清培养基稀释6μl 细胞转染剂。 将bacmind DNA与细胞转染剂进行混合,动作要轻柔,混合物在室温下孵育45分钟。 5)当DNA与脂质体进行孵育时,移去细胞原有的培养基并用2ml无血清培养基洗一次,移去用来清洗的无血清培养基。 6)在每一个含有DNA与脂质体混合物的管子中加入0.8ml无血清培养基,轻柔混合,分别把DNA与脂质体混合物加入含有细胞的孔中。 7)细胞在27℃孵育5小时。 8)从细胞中移去DNA与脂质体混合物加入2ml完全生长培养基。 9)将细胞在27℃进行孵育,实验人员必须每日观察,记录转染细胞的生长状态,细胞在转染后48小时长势应该比较良好,但72小时后直至可以看到明显的病毒感染的细胞病变。 2、第一代代病毒的收集与保存 1)当转染的细胞呈现出感染后期的形态时,收集每孔含有病毒的上清,转移到灭菌的15ml 压盖管中。 2)以500*g离心5分钟,从而移去上清中所含有的细胞及大的碎片。 3)将离心后的上清移到新的15ml压盖管中,用来保存第一代病毒,存放于4℃避光保存。 3、病毒的保存 1)病毒存放于4℃避光保存。 2)如果用的是无血清培养基,则加入终浓度为2%的FBS 。血清蛋白可以作为蛋白酶的底物。 3)长期保存时将一部分病毒储存在-80℃用于病毒的重新扩增。 4)病毒的常规储存不要低于4 ℃.病毒经过反复冻融会使其滴度下降10 到100倍。 4、杆状病毒的扩增 1)准备sf9细胞,2*106/孔,在室温孵育1小时。 2)在孵育1小时以后,用倒置显微镜观察昆虫细胞的贴壁情况。 3)在每孔中加入适量的P1代病毒。 4)在27℃进行孵育48小时。 5)在感染后48小时,收集每孔含有病毒的上清,转移到灭菌的15ml压盖管中。以1000*g 离心5分钟,从而移去上清中所含有的细胞及大的碎片。 5、病毒空斑分析 1)准备工作如下: 澄清的杆状病毒保存于4℃ 培养在适当培养基中的sf9细胞(30ml 5*105/ml对数生长期的细胞用于每一个滴度的杆状

真核细胞转染操作方法

一些真核蛋白在原核宿主细胞中的表达不但行之有效而且成本低廉,然而许多在细菌中合成的真核蛋白或因折叠方式不正确,或因折叠效率低下,结果使得蛋白活性低或无活性。不仅如此,真核生物蛋白的活性往往需要翻译后加工,例如二硫键的精确形成、糖基化、磷酸化、寡聚体的形成或者由特异性蛋白酶进行的裂解等等,而这些加工原核细胞则无能为力。 一些真核蛋白在原核宿主细胞中的表达不但行之有效而且成本低廉,然而许多在细菌中合成的真核蛋白或因折叠方式不正确,或因折叠效率低下,结果使得蛋白活性低或无活性。不仅如此,真核生物蛋白的活性往往需要翻译后加工,例如二硫键的精确形成、糖基化、磷酸化、寡聚体的形成或者由特异性蛋白酶进行的裂解等等,而这些加工原核细胞则无能为力。需要表达具有生物学功能的膜蛋白或分泌性蛋白,例如位于细胞膜表面的受体或细胞外的激素和酶,则更需要使用真核转染技术。由于DNA导入哺乳动物细胞有关技术方法的发展,使真核表达成为可能。 利用克隆化的真核基因在哺乳动物细胞中表达蛋白质,具有以下多种不同用途: (1) 通过对所编码的蛋白质进行免疫学检测或生物活性测定,确证所克隆的基因。 (2) 对所编码的蛋白质须进行糖基化或蛋白酶水解等翻译后加工的基因进行表达。 (3) 大量生产从自然界中一般只能小量提取到的某些生物活性蛋白。

(4) 研究在各种不同类型细胞中表达的蛋白质的生物合成以及在细胞内转运的 情况。 (5) 通过分析正常蛋白质及其突变体的特性,阐明蛋白质结构与功能的关系。 (6) 使带有内含子而不能在原核生物如酵母中正确转录为 mRNA的基因组序列 得到表达。 (7) 揭示某些与基因表达调控有关的DNA序列元件。 DNA转染技术现已变成研究基因功能和组分的重要工具,已发展了很多转染方法,并成功应用于转染各种细胞。目前广泛应用方法有磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、病毒载体,以及阳离子脂质体介导转染法。 进行真核转染的一般程序: 克隆目的基因(经测序验证)-准备真核表达载体-将目的基因插入表达载体中-转染-筛选-鉴定 下面以pcDNA3为载体,p16为目的基因,介绍真核转染的实验操作。 一、试剂准备 1、HBS(Hepes-buffered saline):876mg NaCl溶于90ml ddH2O,加入1M Hepes,调pH到7.4,补ddH2O至100ml, pH7.4,滤过除菌。 2、核酸贮存液,过滤除菌。 3、培养基:含血清或不含血清的,用于转染细胞的正常培养。 二、操作步骤 (一)克隆目的基因 1、根据GenBank检索的目的基因序列,设计扩增引物,并在上、下游引物的5’-端分别引入酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ,行RT-PCR。 2、回收特异性扩增片段,连入T载体。 3、转化DH5α,质粒制备。 4、酶切初步鉴定,测序证实。 (二) 真核重组表达载体的构建:

sirna转染常见问题解答

siRNA转染常见问题解答 SiRNA导入细胞有以下几种方法:化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。选择时应该依据实验条件考虑以下因素:细胞对转入方式的承受能力、细胞对病毒侵染的易感性、细胞的生长特性等。其中,化学转染技术是目前最为常用的方法,由于电转的方法对细胞损伤比较大,一般不建议选择电转。 针对最常见的化学转染技术,有几种常见的问题以及解决方法。 一、哪种转染试剂效果好? 在选择转染试剂时,一般要考虑的是结合特定的细胞株,而不是被导入细胞中的物质。选择细胞毒性小,转染效率高的转染试剂。脂质体试剂的毒性较大,建议选择非脂质体的转染试剂,如BIODAI的RFect系列纳米材料转染试剂。 二、转染后出现细胞死亡是什么原因?如何优化转染条件? 转染后细胞死亡,原因也是多样的,如脂质体毒性,转染浓度过高,转染前的细胞状态不佳等都可能导致转染后细胞死亡的情况发生,这种情况下就需要适当优化转染条件;在优化转染条件时需要考虑以下因素:转染试剂和细胞特有的自身条件。例如:siRNA与转染试剂的比例、转染时间、细胞传代数和细胞密度等。一般说,转染试剂毒性小,转染时所需的细胞密度就小,如RFect系列siRNA转染试剂一般要求30-50%细胞密度,而lipo2000转染时所需的细胞密度一般在70%左右。如果经优化后细胞死亡仍很多,应及时考虑更换转染试剂。 三、如何优化siRNA与转染试剂的比例? SiRNA的量与转染试剂的比例需要进行优化,一般选择24孔板进行优化,比较节省各 种试剂。可以在10-100nM之间设定几个siRNA的浓度水平,如30nM,50nM,80nM,100nM。 转染试剂根据说明书推荐的剂量上下浮动各3个浓度。之后siRNA的量与转染试剂的量进行 两两组合,从中选择转染效率最高的组合用于接下来的实验。如果通过荧光显微镜观察荧光 判断转染效率的话,siRNA的最低终浓度不要低于10nM,一般推荐的siRNA终浓度多在 50-100nM。这里需要说明的是,以荧光信号的强弱判断siRNA转染效果并不准确,最好采 用荧光定量PCR来判断转染效果。因为siRNA转染成功最客观的标志就是基因表达量的减 少,另外,细胞本身会吸附荧光染料,会出现非特异性吸附。

细胞转染的步骤

【试剂与仪器】 1 .小牛血清。 2 .双抗溶液(链霉素100μg+ 青霉素100 单位)。 3 .DMEM 培养基。 4 .转染试剂(LIPOFECTAMINE 2000 )。 5 .细胞培养基(DMEM+10%NCS )。 6 .PBS 。 7 .无血清培养基。 8 .胰酶(Trypsin )。 9 .培养皿,移液管,量筒,恒温水浴箱,离心机,15ml 离心管,微量移液器,荧光显微镜和CCD 。 【操作步骤】 1 .转染前一天,胰酶消化细胞并计数,细胞铺板,使其在转染日密度为90% 。细胞铺板在0.5ml 含血清,不含抗生素的正常生长的培养基中。 2. 对于每孔细胞,使用50μl 无血清DMEM 培养基稀释0.8μg-1.0μg DNA 。多孔操作可以批量制备。 3. 对于每孔细胞,使用50μl DMEM 培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000 试剂。LIPOFECTAMINE 2000 稀释后,在5 分钟内同稀释的DNA 混合。保温时间过长会降低活性。 4. 混合稀释的DNA (由第2 步)和稀释的LIPOFECTAMINE 2000 (由第3 步)。在室温保温20 分钟。注意:溶液可能会混浊,但不会影响转染。复合物可以在室温保持6 小时稳定。 5. 直接将复合物加入到每孔中,摇动培养板,轻轻混匀。注意:如果在无血清条件下转染,使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基,替换为0.5ml 无血清培养基。 6. 在37℃,5 %的CO 2 中保温24-48 小时,无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5 小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。 7. 在细胞中加入复合物24-72 小时后,分析细胞抽提物或进行原位细胞染色,检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达,在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中,两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。

lipo转染操作步骤

L i p o2000瞬时转染细胞步骤 Stealth?RNAiorsiRNATransfection 以24孔板为例,其余规格的转染见表1 1中板,细胞密度为30-50%适宜。 注意:根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度,如果转染后需要长时间后检测,则细胞中板密度适当降低,已避免细胞过度生长导致存活降低。 2第二天(24-36小时后)每个孔转染方式如下: A将20pmolsiRNA溶于50ulOpti-mem无血清培养基中。 B将1ullipo2000溶于50ulOpti-mem无血清培养基中,混匀室温放置5min。 C将AB两管混合,放置20min。 3转染期间,将24孔板培养基换成无血清培养基,每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中,4-6小时候换成有血清培养基。PlasmidDNATransfection DNA(ug):lipo2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高,转染效率,表达效率也越高,并且可以降低细胞毒性。1中板。 贴壁细胞:0.5-2X105cells/well,第二天待细胞密度达到70-80%时转染 悬浮细胞:4-8X105cells/well,中板后随即转染。 2转染。 A将0.8ugDNA溶于50ulOpti-mem无血清培养基中。 B将2ullipo2000溶于50ulOpti-mem无血清培养基中,混匀室温放置5min。 C将AB两管混合,放置20min。 转染期间,将24孔板培养基换成无血清培养基,每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中,4-6小时候换成有血清培养基。 Table1.CultureSharedreagentsDNAtransfectionRNAitransfection

细胞转染

细胞转染 转染技术是指将外源分子如DNA,RNA等导入真核细胞的技术。常规的转染技术可分为两大类,一类是瞬时转染,一类是稳定转染(永久转染)。前者外源DNA/RNA不整合到宿主的染色体中,因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数,产生高水平的表达,但通常只持续几天,多用于启动子和其他调控元件的分析。一般来说,超螺旋质粒DNA转染效率较高,在转染后24—72小时内(依赖于各种不同的构建)分析结果,常常用到一些报告系统如荧光蛋白,β半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染,外源DNA既可以整合到宿主染色体中,也可能作为一种游离体存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中的概率很小,大约1/104转染细胞能整合,通常需要通过一些选择性标记,如来氨丙基转移酶(APH:新霉素抗性基因),潮霉素B磷酸转移酶(HPH),胸苷激酶(TK)等反复筛选,得到稳定转染的同源细胞系。 转染技术的选择对转染结果影响也很大,许多转染方法需要优化DNA与转染试剂的比例、细胞数量、培基及检测时间等。 常用转染方法的主要原理及应用特点如下 转染方法原理应用特点 磷酸钙法磷酸钙DNA复合物 吸附细胞膜被细胞内 吞 稳定转染 瞬时性转染 不适用于原代细胞 操作简便但重复性差 有些细胞不适用 DEAE-右旋糖苷法带正电荷的DEAE- 右旋糖苷与核酸带负 电的磷酸骨架相互作 用形成的复合物被细 胞内吞瞬时性转染相对简便、结果可重复 但对细胞有一定的毒副作 用 转染时需要除血清 电穿孔法高脉冲电压破坏细胞 膜电位,DNA通过膜 上形成的小孔导入 稳定转染 瞬时性转染 所有细胞 适用性广但细胞致死率 高,DNA和细胞用量大, 需根据不同细胞类型优化 电穿孔实验条件 病毒介导法通过侵染宿主细胞将 外源基因整合到染色 体中稳定转染可用于难转染的细胞、原 代细胞,体内细胞等 但携带基因不能太大细胞 需处于分裂期 需考虑安全因素 逆转录病毒特定宿主细胞 腺病毒通过侵染宿主细胞将 外源基因整合到染色 体中 瞬时转染 特定宿主细胞 可用于难转染的细胞 需考虑安全因素 阳离子脂质体法带正点的脂质体与核 酸带负电荷的磷酸基 团形成复合物被细胞 内吞 稳定转染 瞬时性转染 所有细胞 适用性广,转染效率高, 重复性好,但转染时需要 除血清。转染效果随细胞 类型变化大 Biolistic颗粒传递法将DNA用显微重金 属颗粒沉淀,再将包 被好的颗粒用弹道装 置投射入细胞,DNA 瞬时性转染可用于:人的表皮细胞, 纤维原细胞,淋巴细胞系 以及原代细胞

两种转染试剂转染 C2C12 细胞效率比较分

两种转染试剂转染 C2C12 细胞效率比较分精品论文 两种转染试剂转染 C2C12 细胞效率比较分 析 韦伟,赵元元,张维娅,赵书红,李新云 5 ,农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室~华中农业大学~武汉 430070, 摘 要:C2C12 细胞是鼠的骨骼肌成肌细胞~常用于体外研究肌细胞成肌分化~研 究表明 C2C12 细 胞的转染效率较低~为了提高 C2C12 细胞的转染效率~建立理想的转染条件 ~本研究对 比分析了 FuGENE HD 和 Lipofectamine 2000 两种常用转染试剂的转染效 率。研究结果表明 10 FuGENE HD 转染寡核苷酸的效率比 Lipofectamine 2000 高~而转染 质粒的效率比 Lipofectamine 2000 低。另外我们还发现培养基中的血清会降低细胞的转染 效率。本研究结 果为提高 C2C12 细胞的转染效率提供了新的信息。 关键词:转染效率,寡核苷酸,质粒,C2C12 细胞 中图分类号:Q-33 15 Compare analysis of the transfection efficiency of two transfection regents in C2C12 Cells

Wei Wei, Zhao Yuanyuan, Zhang Weiya, Zhao Shuhong, Li Xinyun (Key Lab of Agricultural Animal Genetics, Breeding and Reproduction of Ministry of Education, 20 Huazhong Agricultural University, WuHan 430070) Abstract: C2C12 cells are the myoblast of mice, which are used as the model for investigating the differentiation of myoblast in vitro. The transfection efficiency of the C2C12 cells was not good in many studies. In order to improve the transfection efficiency of C2C12 cells and contribute an ideal condition of transfection. The transfection efficiency of two transfection reagents, FuGENE 25 HD and Lipofectamine 2000, was analyzed in this study. According the results, the transfection efficiency of FuGENE HD was higher than that of Lipofectamine 2000 when oligo nucleic acids was transfected, but it was lower than Lipofectamine 2000 when plasmid was transfected in the C2C12 cells. Also, we found that serum in cultured medium could inhibit the transfection efficiency. These results offered useful information for improving the transfection efficiency of 30 C2C12 cells. Key words: transfection efficiency; oligo nucleic acids; plasmid; C2C12 cells 0 引言 简转染是指将外源遗传物质转入到真核细胞内的过程。转染对现代分子生物学研究意义

各种转染方法比较

各种转染方法比较 转染方法原理主要应 用 特点主要的厂家及产品 DEAE-葡聚糖法带正电的DEAE-葡聚糖与核酸 带负电的磷酸骨架相互作用形成 的复合物被细胞内吞 瞬时转 染 相对简便、重复比磷酸钙好,但对细 胞有一定的毒副作用,转染时需除血 清且一般只用于BSC-1,CV-1,COS 细胞系 Sigma-Aldrich(DEAE-Dextran Transfection Kit) DNA复合物吸附细胞膜稳定转 染,染瞬 转染 不适用于原代细胞(所需的DNA浓 度较高),操作简便但重复性差,有些 细胞不适用 细胞建议用CSCL梯度离心,转染 是拷贝数较多 GIBCO BRL,Promega 阳离子脂质体法带正电的脂质体与核酸带负电的 磷酸基团形成复合物,然后脂质 体上剩余的电核与细胞膜上的唾 液酸残基的负电核结合;另一种 解释是通过细胞是内吞作用而被 进入细胞。(若DNA浓度过高, 中和脂质体表面电核,而降低了 与细胞的结合能力) 稳定转 染,瞬时 转染,所 有细胞 使用方法简单,可携带大片段DNA, 通用于各种类型的裸露DNA或 RNA,能转染各种类型的细胞,没 有免疫原性。虽在体外基因转染中 有很高的效率,但在体内,能被血 清清除,并在肺组织内累积,诱发 强烈的抗炎反应,导致高水平的毒 性,这在很大程度上限制了其应用 Invitrogen(Lipofectamine 2000,Lipofectamine, Lipofectin,Lipofectamine Plus,Cellfectin) Roche(Dosper,DOTAP,FuGENE 6) CPG Biotech Co(GeneLimo Plus,GeneLimo Super) Promega(Transfast,Tfx, Transfectam)

293细胞培养心得

293细胞培养 293细胞是用5型腺病毒75株系转化,含有Ad5 E1区的人胚肾亚三倍体细胞系,是一种E1区缺陷互补细胞系。它是加拿大McMaster University的F.L.Graham与https://www.sodocs.net/doc/855850072.html,ey于1976年用DNA转染技术构建而成。293细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞,表现出典型的腺病毒转化细胞的表型,细胞允许Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。哺乳细胞的大规模培养方式有三种:贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。这三种方式均可用于293细胞的大规模培养。293细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长,也可生长在血清浓度降低的培养基中。单层培养细胞在5-10%FBS-DMEM中能生长很好。一般来讲,1:10传代后,一周可以长满。严禁过度生长,这点很重要。因为会导致细胞密度加大和堆积,影响病毒斑的形成和转染,传代时也不易打散。悬浮的293细胞很容易大规模培养,但不容易长期保持稳定。293细胞在传代120次以后,其表型可能改变,生长状况不再完全是单层的了,偶尔会形成局部的细胞成团聚集,应立即抛弃,重新引入新传代的细胞。 293细胞培养特性: 1、293细胞明显适应酸性环境,pH值在6.9~7.1时,可顺利贴壁生长, 换液时动作要轻。一般用高糖的DMEM培养基。 2、传代:倒去废液,PBS洗一次(轻),用0.02%EDTA与0.25%Trypsin消化,生长良好细胞,培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s,然后吸去,再让剩下的EDTA/Trypsin作用30s,镜下观察细胞变圆,就可加DMEM终止消化,反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。12小时-24小时90%以上细胞贴壁。293细胞传代时机为达80-90%汇合,传代比例为1:3。 3、293细胞在低代时容易贴壁,生长良好,在传到几十代以后,易聚集成团,且贴壁不牢,用PBS冲洗时即可能脱落,即使消化后也不容易吹打成单细胞悬液,最好购入时先大量冻存。 4、复苏293细胞的另一生长特性是贴壁所需时间长且贴壁不牢。细胞冷冻后复苏时,都有不同程度的肿胀,若以50ml培养瓶待细胞长满瓶底的70%~80%时消化冻存,复苏时将其全部接种至2个50ml瓶中时较为合适。刚复苏的293贴壁很慢,复苏接种后24小时内,应尽量减少观察细胞次数或不作观察,以免因晃动而影响细胞贴壁。复苏后48小时左右观察贴壁情况并进行首次更换培养基比较合适,如果用一次性塑料培养瓶可增加细胞贴壁牢度。换液前宜将培养基预热。 5、转染:体外应用293细胞进行细胞转染时,如果是采用磷酸钙转染,一定要注意293细胞不要全部长满细胞培养盘,长满细胞时加入磷酸钙就会使293细胞大片的脱落,最好是当293生长到1/2或2/3时进行磷酸钙转染,可以避免细胞的大量脱落。 其它的经验:1、用大瓶培养较小瓶要好,可能是更有利于293均匀的分布,利于营养的摄取 2、培养液要新鲜,每次只配1000ml,分为2-4瓶,不用的培养液,冻存在-20度, 3、要及时传代,最好是细胞基本铺满培养瓶底部,但是细胞之间还没有完全贴紧,总是多少有空隙的时候最好。 4、如果细胞贴壁不好,可能是消化过久,或是培养瓶不够干净,当然要除外细胞污染。 5、如果使用用玻璃培养瓶或皿,可以采用高压灭菌的0.2%明胶溶液预处理培养瓶/培养皿,方法是将明胶加入培养皿,使之浸泡到底面的各个部分,然后吸出,置超净台内晾干即可使用。这样处理后细胞贴壁效果好且镜下细胞立体感强。如果是新的塑料培养瓶就不用处理。

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