生物技术综合实验作业

西北农林科技大学 生物技术综合大实验论文

论文题目绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆表达和纯化作者姓名李欢乐

所在学院生命科学学院

专业班级生技113班

指导老师王媛媛

完成时间2014.06.14

目录

摘要 (3)

引言 (4)

材料与方法 (4)

1材料 (4)

1.1材料 (4)

1.2仪器 (4)

1.3试剂 (4)

2方法 (4)

2.1碱裂解法提取质粒 (5)

2.2感受态细胞的制备 (5)

2.3转化受体细胞并诱导表达 (5)

2.4.细胞破碎处理 (5)

2.5硫酸铵沉淀法处理 (5)

2.6疏水柱层析 (5)

2.7离子柱层析 (6)

2.8分子筛层析 (6)

2.9SDS-PAGE电泳检测 (6)

结果与分析 (6)

1.质粒的提取 (6)

2.感受态的制备 (6)

3.GFP的诱导表达 (6)

4.GFP的分离 (7)

5.疏水层析 (8)

6.离子层析 (8)

7.凝胶过滤层析 (8)

8.SDS-PAGE电泳 (9)

绿色荧光蛋白(GFP)的克隆表达和纯化

李欢乐

（西北农林科技大学生命科学学院生技113班学号：2011014026，陕西杨凌）摘要

目的：研究PGLO中绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在Top10中基因重组表达后蛋白质的纯化与分离。方法：从PGLO菌液中用碱裂解法提取含有GFP蛋白的质粒，然后用提取到的质粒转化感受态的Top10表达菌株，用LB培养基对转化后的Top10进行扩大培养，用阿拉伯糖诱导GFP基因表达可以看到绿色菌落，将收集到的细胞破碎，利用硫酸铵沉淀法沉淀GFP，然后经过疏水柱层析、离子交换柱层析、分子筛层析纯化表达的GFP，最后进行SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳，染色，脱色，检测纯化效果。结论：通过对GFP的表达纯化，重点学习并掌握了蛋白质的纯化流程，了解到不同理化因素对蛋白质纯化效果的影响以及纯化过程中的注意事项。

关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化层析纯化

Green Fluorescent Protein（GFP）Gene Cloning

Expression and purification

huan le lee

(class 3 grade 2011, college of life science ,Northwest A&F University, Yang Ling) : Abstract

Objective: searching for the expression of the gene of green fluorescent protein in Top 10, separation and purification..Method:extracting the GFP plasmid which then were used to transform the competent cell of Top 10 in PGLO by alkali splitting.expand culturing the transformed competent cell by LB culture medium. The Ara can guide the expression of GFP gene and we can see light green clonies .use the way of precipitation with ammonium sulfate to precipitate GFP from disruption cell collected by Selecta Sonopuls.Then purify the production by hydrophobic chromatography、ion chromatography and gel filtration chromatography one after another.finally observe the result of purify by SDS-PAGE. Conclusion:Through the expressed GFP purification,learn and grasp the process of purification of protine and the physicochemical property factor of influence of the process and what shuold be paid attention.

引言：2008年10 月 8日，瑞典皇家科学院把今年的诺贝尔化学奖授予绿色荧光蛋白（GFP）的发现者和推广者。绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，

GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子，发色团是其蛋白质一级序列固有的。近年来在生物化学和细胞生物学中成为应用最为广泛的标记性蛋白之一，蛋白质的分离纯化在生物化学研究应用中使用广泛，是一项重要的操作技术。一个典型的真核细胞可以包含数以千计的不同蛋白质，一些含量十分丰富，一些仅含有几个拷贝。为了研究某一个蛋白质，必须首先将该蛋白质从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来。

材料与方法

1.材料

1.1材料：pGLO质粒DNA，大肠杆菌TOP10菌株。

1.2仪器：制冰机；电子天平；振荡培养箱；超净工作台；凝胶成像仪、酒精灯、培养皿、移液枪、枪头、接种环、烧杯、盐酸、酒精棉球、离心管、高速冷冻离心机、超声波破碎仪、聚丙烯酰氨凝胶电泳装置、恒温水浴锅、柱层析装置等。

1.3试剂：溶液Ⅰ（葡萄糖，Tris-HCl，EDTA），溶液Ⅱ（NaOH，SDS），溶液Ⅲ（KAc HAc）；70%乙醇，无水乙醇，Cacl2氨苄青霉素，阿拉伯糖，LB培养基，冰块和SDS-PAGE 配液等。

2.方法

Fig-1试验流程

2.1 碱裂解法提取质粒

取3ml培养液倒入EPtube中，12000rpm离心1min。弃上清，菌体沉淀悬浮于10ul溶液I中，加入溶液II200ul, 盖紧管口，室温下颠倒混匀大约5min，加150ul溶液Ⅲ，轻柔混匀，冰浴10min，12000rpm离心10min。上清液移入新的EPtube中，加入2倍体积的无水乙醇，震荡混匀，-20℃保存30min，12000rpm 离心10min后弃上清，加500ul70%乙醇洗DNA一次，12000rpm离心5min，弃上清，风干DNA，将沉淀溶于20ulTE缓冲液中,保存在20℃冰箱中。

2.2 感受态细胞的制备

取1.5ml top10菌株冰浴30min，在4 ℃下4000rpm离心10min，弃上清，加500ul预冷氯化钙重悬；4℃下离心5min弃上清，加200ul预冷氯化钙重悬，水浴30min，4℃4000rpm离心4min，弃上清，加100ul预冷氯化钙重悬在4℃下备用。

2.3转化受体细胞并诱导表达

取1ulPGLO质粒，加入至100ul Top10感受态细胞，轻柔混匀，4℃放置30min，42℃热激90”，冰浴10min，涂平板（AMP，100ug/ml；Ara 2mg/ml），在此处留样（诱导前）。培养数小时后，用紫外灯照射观察，重组菌株表达情况，挑取单菌落进行扩大培养，

2.4 细胞破碎处理

取1ml扩大培养后的菌液留样，反复收集1L菌液于4个100ml的EP管中，每个管中加入15ml lysis buffer 缓冲液重悬集中到1个管中，8000rpm离心5min，弃上清，加60ml lysis buffer重悬液氮冻融一次，加15mg溶菌酶，常温放置30min，超声波破碎（300W 5”on 5”off）15-20min。破碎结束后，9000rpm离心15min 上清倒入烧杯（此处留样），沉淀用60ml lysis buffer 重悬（此处留样）。

2.5硫酸铵沉淀法处理

2.5.1硫酸铵浓度的确定

每组取15ml上清共60ml，用lysis buffer 稀释至90ml

硫酸铵饱和度

10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% GFP上清ml

10 10 10 10 10 10 10 10 10

9个不同梯离心后用紫外灯照射，只有上清发光而沉淀不发光的，此时硫酸铵浓度为X，同样的沉淀中发光而上请不发光的硫酸铵浓度为Y。

2.5.2硫酸铵沉淀GFP

向上清中加入硫酸铵至饱和度为X%混匀，室温保存15min，9000rpm离心15min，转以上请至新的EP管中，加硫酸铵至饱和度为Y%混匀，室温静置15min，9000rpm

离心15min，弃上清，沉淀用30ml 2mol硫酸铵溶解，12000rpm离心10min，上清倒入烧杯。

2.6 疏水柱层析

用ddH2O洗柱，用25%乙醇排气泡并装柱，用三倍柱体积2mol硫酸铵平衡柱子，平衡之后，将样品GFP上样，用三倍柱体积1.3mol硫酸铵洗柱，用10mMol

tris-HCl,1mMol EDTA PH8.0洗脱，紫外检测收集流出的GFP（峰值处留样），将收集的GFP放入透析袋中过夜。

2.7 离子柱层析

2.7.1离子交换柱的预处理

用三倍柱体积的DDH2O洗柱，再用100ml 0.5mol NaOH洗柱，并停留15min，用100ml DDH2O洗柱子，用100ml 0.5mol HCl洗柱，并停留15min，用100 DDH2O 洗柱。

2.7.2离子交换柱层析

先用三倍柱体积20mMol Tris-HCl PH7.0平衡柱子，GFP上样，再用三倍柱体积20mMol Tris-HCl PH7.0平衡柱子，使用不同梯度洗脱GFP。紫外检测峰值，收集GFP..

2.8 分子筛层析

将离子柱层析收集的GFP在20mMolTris-HCl PH7.0中透析，浓缩样品至1ml，用三倍柱体积20mMolTris-HCl PH7.0平衡柱子，上样，用20mMolTris-HCl PH7.0洗柱子，紫外检测GFP，收集样品。

2.9 SDS-PAGE电泳检测

分离胶浓缩胶

丙烯酰胺 6.00ml 0.65ml

1.5M Tris-HCl buffer PH8.6 3.75ml

0.5M Tris-HCl buffer PH6.8 1.25ml

10% SDS 0.15ml 0.15ml

O 5.10ml 2.90ml

H

2

10% APS 0.05ml 0.025ml

TEMED 0.001ml 0.005ml 取50ul各样加入50ul上样buffer煮沸10min，上样30ul，marker上样10ul，恒流80mA跑胶。

结果与分析

1.质粒的提取

碱法提取质粒的过程中，加入溶液Ⅰ后混合液呈现乳白色浑浊；加入溶液Ⅱ后混合液变为白色无浑浊现象，溶液Ⅱ中的SDS带有负电荷，和蛋白质结合使蛋白质互斥而不聚沉；加入溶液溶液Ⅲ后有絮状沉淀生成，溶液Ⅲ中的K+与SDS 结合成溶解度更小的沉淀，蛋白质和DNA共沉淀，所以会出现絮状沉淀。

2.感受态的制备

细菌处于 0℃，CaCl2 的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA 形成抗DNase 的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收 DNA 复合物。钙离子的作用是结合于细胞膜上，是细胞膜呈现一种液晶态。在冷热变化刺激下液晶态的细胞膜表面会产生裂隙，使外源DNA进入。

3.GFP的诱导表达

表达载体在基因工程中具有十分重要的作用典型的表达载体应该具有以下几种元件：选择标志的编码序列、可控转录的启动子、转录调控序列（转录终止子，核糖体结合位点）、一个多限制性酶切位点和宿主内自主复制的序列。PGLO

质粒（图谱见fig-2）上有两个基因，一个为编码绿色荧光蛋白的基因，一个为氨苄青霉素抗性基因，此外该质粒还整合有一个特殊的参与受体细胞中绿色荧光蛋白表达的调控系统，转化细胞中的绿色荧光蛋白只有在培养基中存在阿拉伯糖的时候才能启动表达，因此转化成功的受体细胞在培养基上呈绿色荧光，这种绿色荧光可在长波紫外下观察到。

fig-2 pGLO质粒图谱fig-3紫外灯下观察到的表达菌株

4.GFP的分离

在蛋白质水溶液中，加入少量的中性盐[即稀浓度]，如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等，会增加蛋白质分子表面的电荷，增强蛋白质分子与水分子的作用，从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大。这种现象称为盐溶；向蛋白质溶液中加入高浓度的中性盐,以破坏蛋白质的胶体性质,使蛋白质的溶解度降低而从溶液中析出的现象,叫做盐析。本实验使用硫酸铵沉淀法分离GFP，与盐溶刚好相反，在蛋白质溶液中加入硫酸铵，会使得蛋白质的溶解度下降，因而沉淀出来。因为硫酸铵所解离的结合水分子能力很强很大，所带的电子数(NH4+,SO42-)也多，因此当其溶入水中时，会吸引大量水分子与这些离子水合。蛋白质会存在非极性区域，水分子会在这些非极性区的表面聚集形成一层水化膜，以便把蛋白质溶入水中。一旦蛋白质溶液加入硫酸铵，后者吸引了大量水分子，使水化膜无法有效隔离蛋白质的非极性区，造成这些非极性区之间的吸引，因而沉淀下来。因此，分子表面上若有越多的非极性区域，就越容易用硫酸铵沉淀下来。

本实验中使用硫酸铵而不使用氯化钠是因为硫酸铵具有以下优点：

a)硫酸铵温度系数小而溶解度大（25℃下饱和溶液为4.1M；0℃下为3.9M）

在这一溶解度范围内许多蛋白都可以析出来。

b)硫酸铵分段盐析效果比较好（所需量多，梯度较明显）。

c)硫酸铵PH常在4.5-5.5，蛋白质不易变形。

fig-4收集到的GFP

5.疏水层析

蛋白质表面一般有疏水与亲水集团，疏水层析利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合而进行分离。该方法基于的是蛋白质的疏水差异，在高盐溶液中，蛋白质会与疏水配基相结合，而其他的杂蛋白则没有此种性质，利用此种性质，在洗脱时，将盐浓度逐渐降低，因其疏水性不同而逐个地先后被洗脱而纯化，可用于分离其它方法不易纯化的蛋白质。

fig-5疏水层析峰值图fig-6典型疏水层析图谱洗脱时，使用高盐浓度先使疏水性较弱的蛋白洗脱下来，再使用低盐浓度的buffer洗脱（含EDTA），EDTA结合铵离子，铵离子失去水分子，由于疏水相互作用力相对于氢键作用力小，失去的水分子和结合在柱材上的蛋白质结合而恢复蛋白质表面的水化膜，因此目标蛋白被洗脱下来。

6.离子层析

离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阳离子交换树脂；而带有负电荷的称之阴离子树脂。本实验所用为阴离子交换树脂，由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。

fig-7离子交换层析洗脱图谱fig-8线性洗脱图谱

7.凝胶过滤层析

凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)法又称排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖（如葡聚糖或琼脂糖）类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。也叫做分子排阻层析（molecular-exclusion chromatography）。一种利用带孔凝胶珠作基质，按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。一般是大分子先流出来，小分子后流出来。

fig-9分子筛洗脱图谱fig-10分子筛洗脱图谱

8.SDS-PAGE电泳

fig-11SDS-PAGE图

图中第一列是点样maker，箭头所指的一行有较明显的条带，是GFP蛋白的位置，第二列点样样品是诱导前的，可以看出在箭头处没有明显的条带，说明Top10菌株没有表达出GFP，第三列是诱导后未经处理的蛋白，可以看出每一行条带颜色较深，说明杂质蛋白较多，第四列点样样品是细胞破碎后的上清液，蛋白条带颜色较浅，这是因为细胞破碎后蛋白质都沉淀下来，GFP不溶于水，上清中蛋白质含量较少，所以第五列条带相对于第四条较深，之后的几条带差别不是很大，说明分离纯化的效果和分辨率不是很高，或者是因为柱材使用次数较多，导致柱材基团活性降低，同时也可以看出三次层析后图中GFP蛋白条带逐渐变浅，说明GFP在层析过程中有损耗，因此在收集低表达量蛋白质应注意蛋白质纯化所带来的损失。

八年级生物下册第7单元第2章现代生物技术单元综合测试新版济南版

第7单元第2章现代生物技术 一、选择题 1. 下列应用实例与必须采用的生物技术，搭配错误的是应用实例生物技术 A. 培养无病毒植株组织培养 B. 制作酸奶发酵技术 C. 培育能产生人生长激素的大肠杆菌基因工程 D. “试管婴儿”的诞生克隆技术 2. 在克隆哺乳动物的过程中，常用到（） A．发酵技术B．胚胎移植技术 C．人工授精技术D．转基因技术 3. 科学家成功地把人的抗病毒干扰素基因连接到烟草细胞的DNA分子上，使烟草获得了抗病毒能力。这项技术称为（） A．克隆技术 B．嫁接技术 C．组织培养 D．转基因技术 4. 以下有关基因工程的叙述，正确的是（） A．基因工程是细胞水平上的生物工程 B．基因工程的产物对人类都是有益的 C．基因工程产生的变异属于人工诱导变异 D．基因工程育种的优点之一是目的性强 5. 实施基因工程的最终目的是（） A．定向提取生物的DNA B．在生物体外对DNA进行改造 C．定向分离DNA D．定向地改造生物的遗传性状 6. 可以生产转基因食品的生物是一类（） A．提供外源基因的生物 B．转基因动植物 C．获得外源基因的生物 D．转基因微生物 应用实例生物技术 A. 培养无病毒植株组织培养 B. 制作酸奶发酵技术 C. 培育能产生人生长激素的大肠杆菌基因工程 D. “试管婴儿”的诞生克隆技术 8. 下列生物均是在现代生物技术作用下形成的，其中利用的技术与其他不同的是（）A．巨型小鼠B．抗虫棉花 C．多利羊D．抗虫烟草 9. 可以创造出地球上原先不存在的生物的技术是 A.无性繁殖 B. 克隆 C .基因工程 D 组织培养. 10. “试管婴儿”技术在生物学上依据的原理是( ) 。A．有性生殖B．无性生殖C．克隆技术 D．基因工程 11. 人奶营养成分的优越性是牛奶永远无法比拟的。最近中国工程院院士李宁教授率领的科研团队将人乳基因导入奶牛中，使之产生人乳化的牛奶。这种生物技术称为A．发酵技术 B．克隆技术 C．转基因技术 D．仿生技术 12. 生物的生殖方式分为有性生殖和无性生殖，下列个体的产生是通过有性生殖形成的是（） A．克隆绵羊B．组织培养的小麦幼苗 C．嫁接的柑橘D．试管婴儿 13. 据英国《每日邮报》 2010年12月26日报道，一位英国妇女在1998年通过试管婴儿技术受孕后，于次年产下两女，并将其余受精卵冷冻保存；11年后，她和丈夫成功利用当初保存的受精卵再获一个千金。“试管婴儿”技术在生物学上依据的原理是（）。

生物技术综合大实验

2013-2014学年生命科学综合大实验GFP分离与纯化

1.文献综述 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）是由238个氨基酸组成，分子量是26.9kDa，最初是从维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria )中分离出来的，在蓝光照射下会发出绿色荧光。来源于水母的野生型GFP在395nm和475nm分别有主要和次要的激发峰，它的发射峰在509nm，处于可见光谱的绿色区域，来源于海肾的GFP只在498nm有单个激发峰。 GFP是典型的β桶形结构，包含β折叠α和螺旋，将荧光基团包含在其中。严密的桶形结构保护着荧光基团，防止它被周围环境淬灭，内部面向桶形的侧链诱Ser65-Tyr66-Gly67三肽环化，导致荧光基团形成。 北京时间10月8日下午5点45分，2008年诺贝尔化学奖揭晓，三位美国科学家，美国Woods Hole海洋生物学实验室的Osamu Shimomura(下村修)、哥伦比亚大学的Martin Chalfie和加州大学圣地

亚哥分校的Roger Y.Tsien（钱永健）因发现并发展了绿色荧光蛋白（GFP）而获得该奖项。 下修村首次从Aequorea victoria中分离出GFP。他发现该蛋白在紫外线下会发出明亮的绿光。Martin Chalfie证明了GFP作为多种生物学现象的发光遗传标记的价值。在最初的一项实验中，他用GFP使秀丽隐杆线虫的6个单独细胞有了颜色。钱永健的主要成就在于让人们理解了GFP发出荧光的机制。同时，他拓展出绿色之外的可用于标记的其他颜色，从而使科学家能够对各种蛋白质和细胞施以不同的色彩。这一切，令在同一时间跟踪多个不同的生物学过程成为了现实。

生物社会实践报告

生物社会实践报告 实践者：宋继达 所属学校：武汉理工大学 专业班级：生物技术0901班 实践单位：广东省惠州市惠东县平海镇港口国家级海龟自然保护区 实践日期：XX年7月21日——XX年7月27日 实践时间：7天 实践原因：保护区位于家乡港口，地理位置适宜；海龟是港口所特有的海洋动物，身为港口人对之有着特殊的情感；个人的成长经历及兴趣爱好涉及海洋生物和海洋生态方面。 实践目的：增进对海龟保育工作的认识，增强爱护海洋生态环境的观念，加强学习和动手能力，增加社会实践的经验以及完成这次暑期社会实践的作业。 实践内容：到海龟保护区的海龟馆里体验海龟管理员的日常工作：给海龟投喂食物，清洗海龟池，维护海龟馆的清洁卫生，维持游客在海龟馆里的参观秩序，劝阻游客一些不文明的、对海龟有伤害性的不良行为，以及协助海龟管理员完成其他一些工作。 实践结果：虽然此次社会实践为期只有7天，其深入程度也仅仅是体验保护区内海龟管理员工作生活的浅层水平，但

这一个星期的实践的确让我了解了不少关于海龟生活习性和保育方面的知识，以及保护区在建设发展方面面临的问题和艰辛。感谢他们为我提供的实践机会，让我拓展了知识和视野，对海龟这一海洋爬行动物以及海洋生态保育有了更深一步的了解，为以后的学习与就业留下难得的经验与启发。 体会总结：生态环境和物种是这个地球上一旦失去后就难以复得的宝贵财富。港口人民一直以来与海龟为邻，见证了从发现海龟湾、盗挖海龟蛋、捕杀海龟到共同携手保护海龟，与海龟和谐共处的百年历史。作为一个从小认识海龟的港口人，中国大陆乃至亚洲大陆漫长海岸线上唯一的海龟产床的独特之处让我既自豪又担忧。全球的海龟数量在下降，而港口海龟自然保护区近年海龟上岸产卵的情况不容乐观，我国海域的海龟生境和数量形势严峻。海龟保护需要不断努力下去，希望有更多有志于这方面的年轻人投身于这方面，同时向正在为海龟保护付出努力的工作者致敬！ 导语：广东省惠东县港口国家级海龟自然保护区是今天中国大陆18000公里海岸线上最后的一个海龟产床，也是亚洲大陆唯一的海龟自然保护区。1985年6月，广东省渔业行政主管部门批准成立海龟自然保护区。1986年12月，广东省人民政府批准海龟自然保护区晋升为省级保护区。1992年10月经国务院批准晋升为国家级自然保护区，主要保护对象为以国际濒危、国家二级保护动物海龟，及其产卵繁殖栖息

现代生物学实验技术实验报告

现代生物学实验技术实验报告 实验一、超薄切片 一、实验目的 学习掌握常规生物样品前处理技术及样品包埋块的制备技术。 二、实验材料 植物幼嫩叶片、小鼠肝脏细胞 三、实验试剂 2.5％戊二醛、PBS、1％锇酸、30％丙酮、100％丙酮、 Epon812包埋液、蜡油 四、实验器材 离心管、玻璃棒、滴管、移液枪、刀片、镊子、牙签、烘箱、切片机、 五、实验步骤 1、取材固定：从植株上取叶片或者取小鼠肝脏细胞，切取 1mm3左右大小的组织块，立即放入PBS（pH7.2)配制 的2.5%戊二醛中固定1小时。 2、用0.1molPBS缓冲液冲洗三次每次3～5分钟。 3、1％锇酸固定1小时，然后用缓冲液冲洗三次每次3～5 分钟。 4、丙酮脱水：30％－50％－70％－80％－90％－100％－ 100％每级5～10分钟

5、浸透：脱水剂：包埋剂=3：1 1小时 脱水剂：包埋剂=1：3 过夜 6、聚合：45 ℃12h 60 ℃24h 磷酸缓冲液0.2molL-1 PBS 配制 A液：Na2HPO4 .2H2O 35.61g 加DDW 至1000ml B液：NaH2PO4 .H2O 27.6g 加DDW 至1000ml 不同pH磷酸缓冲液的配制 pH 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 A液(ml) 18.8 24.5 30.5 36.0 40.5 43.5 B液(ml) 31.2 25.5 19.5 14.0 9.5 6.5 Epon812包埋液的配制 Epon812树脂20ml DDSA 4.6ml MNA 15.3ml DMP-30 0.8ml

2、支持膜的制备 将一个干净的载玻片垂直放入含有0.3~0.5%氯仿配制的聚乙烯醇缩甲醛制模剂中，放置两三秒后将载玻片垂直取出。用刀片在含有膜的载玻片上划出所需要的正方形，然后将载玻片45度倾斜放入水溶液中，使膜飘在水面上，选取厚薄合适的膜，将膜放在载网上，以备后面用。 3、切片 首先制刀，将玻璃片制成梯形的刀片，以备切片时使用。将包埋块置于显微镜下进行修整，将其修为最上端为正方体。在切片机上进行切片操作，使切下来的样品片漂浮在水槽中。对切下来的样品块进行染色并观察。 六、注意事项 1、取材的时候动作要迅速，组织离体后应将其快速放入 固定液中。并且要尽量减少损伤，减少牵拉或挤压组 织。组织块的大小一般为1mm3。 2、用固定液固定的样品若漂浮在溶液表面，应通过抽真 空的方法让样品沉入溶液中。 3、饿酸为剧毒、极易挥发的试剂，使用时要注意安全。 4、脱水时要逐级脱水，而不能急剧脱水，更换液体时动 作要快，不要让组织离开溶液，否则会在组织内外产 生气泡。

分子生物学实验报告

分子生物学实验 院系：生命科学与技术学院 专业：生物科学（基地） 班级： 201101班 学号： 姓名： 分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。 实验一质粒DNA的小量制备 一、实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具

有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColE Ⅰ衍生的质粒。 所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA 缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。 质粒DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106，质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。在细胞内，共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA（open circular DNA，简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。 二、实验目的 1．掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。 2．了解制备原理及各种试剂的作用。 三、实验材料和试剂

生物技术大实验考试复习题

生物技术大实验 一、核酸凝胶电泳的基本原理是什么？ （1）核酸分子糖—磷酸骨架中的磷酸集团，呈负离子化状态；核酸分子在一定电场强度的电场中，他们会向正极移动。 （2）电泳中使用无反应活性的稳定支持介质，电泳迁移率与与分子摩擦系数成反比。物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。 因此，可在同一凝胶中、一定电场强度下分离出不同分子量大小或相同分子量而构型有差异的核酸分子。 二、CTAB法提取植物总DNA中CTAB的中文名称及其作用原理是什么？ CTAB的全称是十六烷基三甲基溴化铵 基因组DNA的提取包括组织粉碎，细胞膜破坏，蛋白质去除和DNA的沉淀.一般取植物的幼嫩组织，其DNA含量丰富，组织易于破碎。组织破碎方法有很多种，可以研磨，捣碎机捣碎，超低温冷冻使组织细胞间结冰，稍加研磨即可以粉碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。DNA提取缓冲液主要是由对DNA有稳定作用的盐如Tris,EDTA和破坏细胞的试剂SDS或者CTAB组成。蛋白质的去除是用苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入异丙醇或无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，之后用RNase处理去除少量的RNA，即得植物总DNA溶液。 三、SDS-PAGE电泳的基本原理是什么？ SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）是蛋白分析中最经常使用的一种方法，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠），它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS）以及巯基乙醇一起加热，SDS能断裂分子内和分子间氢键，使蛋白变性，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b 均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 用SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白质的分子量和纯度。在4%浓缩胶和12%分离胶上，以标准分子量蛋白（Protein Marker,High 29-205 kDa）为对照，电泳分离。经考马斯亮蓝-R250染色和脱色液脱色后，比较样品与标准分子量蛋白的迁移率，确定蛋白质的分子量及酶制剂纯度。 四、RNA提取过程中的注意事项有哪些？ RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。 注意事项 1. 从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800ml TRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml 是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。 2. 匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。

生物技术实验报告

生物技术实验报告 篇一：生物技术实验报告 组别：第六组 组员：苏琳伟、陈治、陈家和、陈硅 报告人：陈硅 学号：10349069 词汇&释义： Parafilm 封口膜 Chloroform 氯仿（三氯甲烷） Isopropanol 异丙醇 DEPC 焦碳酸二乙酯 TRIZOLa mono-phasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate Phenol苯酚 isthiocyanate 异硫氰酸胍 MCS multiple cloning site （polycloning site） 注：MSC是DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有

多个限制内切酶识别位点。能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。 实验任务： 1. 从猪肌肉纤维中提取RNA; 2. 2对RNA上EGFP基因密码子片段进行RT-PCR扩增; 3. 将经RT-PCR技术扩增的cDNA与插入载体质粒，并将其转化入大肠杆菌进行克隆； 4. 从大肠杆菌中提取含目的基因的载体质粒。 实验目的: 1.掌握提取纯化总RNA的原理和技术； 2.掌握RT-PCR原理和技术； 3.掌握TA克隆原理和技术。 实验原理： A．总RNA提取和纯化 RNA 分离的最关键因素是尽量减少RNA 酶的污染。但RNA 酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性RNA 酶外，环境中也存在大量RNA 酶。因此在提取RNA 时，应尽量创造一个无RNA 酶的环境，包括去除外源性RNA 酶污染和抑制内源性RNA 酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去

除外源性RNA 酶，通过RNA 酶的阻抑蛋白Rnasin 和强力的蛋白质变性剂如异硫氰酸胍抑制内源性RNA 酶。 Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂，是一种由苯酚和异硫氰酸胍组成的单相溶液它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，裂解细胞并释放出RNA,酸性条件使RNA与DNA分离,加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。 无论是人、动物、植物还是细菌组织，各种样品最大使用量（1ml Trizol），动物组织( 50mg)，植物组织(100 mg)，丝状真菌( 100mg)，动物细胞(5×106～1×107)，酵母(1×107) 。 TRIZOL试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA 的析出。例如，从大鼠肝脏抽提的RNA琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色，可见许多介于7 kb和15 kb之间不连续的高分子量条带，（mRNA和hnRNA成分）两条优势核糖体RNA 条带位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S)，低分子量RNA介于0.1 和 0.3 kb之间 (tRNA, 5S)。当抽提的RNA用TE稀释时其

细胞原代培养细胞生物学实验报告

细胞生物学实验报告 细胞原代培养 姓名： 学号： 班级： 专业： 同组成员： 一、实验原理

细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。 原代培养的方法： 1、组织块法在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。用Hanks 液洗涤2—3次，自然沉淀。用吸管吸去上清液。将组织块贴于培养瓶进行培养。 2、酶消化法将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的%的胰蛋白酶。370C磁棒搅拌消化20－30分钟。然后终止消化。用几层无菌纱布过滤。取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。 取材注意事项： 取材要注意新鲜和保鲜。取材应严格无菌。取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。 二、实验目的 1、理解细胞原代培养原理 2、熟悉细胞原代培养方法与过程 3、了解细胞原代培养的应用 4、独立进行细胞原代培养操作 三、实验材料 手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯。 动物：9-12日龄的鸡胚蛋 四、实验步骤

生物技术应用中心实验室建设方案

生物制药技术中心实验室 建 设 方 案 为进一步提高实验实训教学质量的水平，推进实验实训教学的改革和建设，贯彻落实教育部关于实验室工作“巩固、深化、提高、发展”的要求，引入有效的竞争激

励机制，充分调动实验技术人员的积极性和创造性，构建高水平的实验技术平台，特制定本建设方案。 一、建设背景与目标 2006年12月学院为了适应21世生物应用技术人才的培养和资源共享理念的需要，在学校高校中率先对管理体制进行改革，成立了详详细细学院实验实训中心，将原生物科学系中心实验室更名为生物技术应用中心实验室并隶属该实验实训中心管理。 生物技术应用中心实验室下设化学、生物化学、畜牧业生产技术应用、生物化学制药与检测技术、园艺技术应用、食品营养与检测技术、生物技术应用等6大类18 个实验室，承担我院生物制药、食品营养与检测、畜牧兽医、园林和园艺5个专业、多层次的生物技术实验教学任务。并利用该中心实验室，开展了食品检验工、花卉工、园艺工、动物疫病防治员、动物检验检疫员、药物分析工和药物制剂工的职业技能培训与鉴定工作。每年接纳学生约2000人，年均总实验人时数在109500万左右。 中心实验室累计投入170万元购置了一大批先进教学仪器设备，增强了实验教学手段，改善了教学环境，提高了实验技术水平，为培养适应21世纪国家建设与社会 发展需要的、具有高技能、高素质创新、实践性生物技术人才创造条件，提供良好的实验教学技术平台。 中心实验室形成了独立设课与管理的运转模式。各实验室由生物技术应用中心实验室实行统一管理和调配，仪器设备共享，全面负责生物科学系各专业专业基础、专业课的实验教学和各专业的职业技能鉴定培训与鉴定工作。同时，不断增加从事实验教学的高职称、高学历的教师，优化实验教学体系、调整实验内容，学生通过实验课程的学习获得了良好的技能训练，他们的动手能力，创新思维，综合技能能得到显著提高。 通过院系的共同建设和发展，先后取得了具有积极示范推广意义的科技成果，即xxx省科技进步三等奖和xxx市科技进步二等奖。在理论与实践教学改革中勇于探索 和创新，获xxx省教学成果一等奖。突出的实验教学改革成果促进了畜牧兽医专业精品课程的建设(《xxxx》和《xxxx》于2004年和2006年分获省级精品课程)。本中心设施齐全先进、实验教学团队优秀、管理体制规范高效、环境人文安全，实验教学成绩显著，2004年和2006年度被评为xx省优秀实验室。经过多年的改革与建设，生 物技术应用中心实验将向海南省实验教学示范中心的目标迈进。

南方科技大学生物小鼠解剖英文实验报告

姓名班级学号实验日期2014.5.21 科目实验名称Mouse Dissection 合作者指导教师成绩 LAB 10: Mouse Dissection Introduction: In biomedical research, animal models are always regarded as indispensable tools. They contribute to the scientific discovery in biology and our understanding of the functions of individual genes, even the mechanism of different diseases. Typically, although mice are different from humankind in size and appearance, they have a distinct genetic similarity. At the same time, mice have an efficient ability to reproduce, so they are important research tools for experiments in the lab. In this experiment, we will exercise to dissect a mouse, so that we can observe the inside of a mammalian body to identify the female and male mice. Learning and recognizing the anatomical structure of mice, including. Materials and Methods: Materials: Operation plate, Scissor, Forceps, Alcohol cotton, Mouse. Methods: [we get a male mouse] Part 1: Observations of external features. Make a table T-1. 1．Having an overhead view, identify the mouse’s head, neck, truck, and tail; observe the dorsal and ventral surfaces. Roughly record what is seen. 2．Observe the thorax which is supported by the rib cage, and the abdomen, and the details of appendages attached to the abdomen. 3．Find the mouth, two external nostrils, two external auditory canals, and anus, which are on the body surface. 4．Have a simply look at the surface of reproductive organ, prepuce, urethral and penis including. And locate the saclike scrotum; feel for the paired testes in the scrotum. Note the rough features. Part 2: Observation of organs and structures inside the mouse. [Open the Ventral Body Cavities, Thoracic Cavity, and Abdominopelvic Cavity in order. We must break the ribs near the attachment to the vertebral column to fold back the upper flaps.] Make a table T-2. 1.Ventral Body Cavities. a. Make a longitudinal incision through the skin with a dissecting scissor, from the neck to the preputial opening. Pierce the body wall below the ribs, with the blades angled upward, so that it won’t damage the internal organs. b. Pull the sides of the longitudinal incision, and look for the diaphragm. Then make two

生物化学实验报告

实验一糖类的性质实验 （一）糖类的颜色反应 一、实验目的 1、了解糖类某些颜色反应的原理。 2、学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法。 二、颜色反应 （一）α-萘酚反应 1、原理糖在浓无机酸（硫酸、盐酸）作用下，脱水生成糠醛及糠醛衍生物，后 者能与α-萘酚生成紫红色物质。因为糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，故此反应不是糖类的特异反应。 2、器材 试管及试管架，滴管 3、试剂 莫氏试剂：5％α-萘酚的酒精溶液1500mL.称取α-萘酚5g，溶于95％酒精中，总体积达100 mL，贮于棕色瓶内。用前配制。 1％葡萄糖溶液100 mL 1％果糖溶液100 mL 1％蔗糖溶液100 mL 1％淀粉溶液100 mL ％糠醛溶液100 mL 浓硫酸 500 mL 4、实验操作 取5支试管，分别加入1％葡萄糖溶液、1％果糖溶液、1％蔗糖溶液、1％淀粉溶液、％糠醛溶液各1 mL。再向5支试管中各加入2滴莫氏试剂，充分混合。倾斜试管，小心地沿试管壁加入浓硫酸1 mL，慢慢立起试管，切勿摇动。 观察记录各管颜色。 （二）间苯二酚反应 1、原理 在酸作用下，酮醣脱水生成羟甲基糠醛，后者再与间苯二酚作用生成红色物质。此反应是酮醣的特异反应。醛糖在同样条件下呈色反应缓慢，只有在糖浓度较高或煮沸时间较长时，才呈微弱的阳性反应。实验条件下蔗醣有可能水解而呈阳性反应。 2、器材 试管及试管架，滴管 3、试剂 塞氏试剂：％间苯二酚－盐酸溶液1000 mL，称取间苯二酚0.05 g溶于30 mL 浓盐酸中，再用蒸馏水稀至1000 mL。 1％葡萄糖溶液100 mL 1％果糖溶液100 mL 1％蔗糖溶液100 mL 4、实验操作

《环境生物学及现代生物技术实验》教案

实验六、植物种群自疏的内因和外因效应 一、目的 通过阅读文献材料，学习验证型实验设计、结果表达和分析的方法。掌握通过测定不同栽培密度和不同盐度的因子作用下，影响植物种群生长自疏效应的内因和外因的表达方式和强度。 二、原理 生态系统的结构与功能受到来自系统内部和外部的调节与控制，如森林植被过密时会产生自疏作用，间伐后的疏林会很快重新郁闭；生态系统中各营养级间生物的数量关系常常相对稳定等。这类受控的稳态是生态系统借助生物与环境的相互作用，达到稳态的作用结果。 种群在一定的生境条件下，种群数量会增长，但是并不是无限制的增长，会受到种群最大容量的制约，种群内部个体间的竞争会产生自疏作用使种群维持在一定的水平。自疏作用为种内斗争和资源供给状况的综合反映，森林植物、藤壶等是自疏效应的明显例子。 本实验将开展经济作物红麻（Kenaf，Hibiscus cannabinus）的模拟栽培试验。通过设定不同栽培密度，对其进行短时间的栽培试验记录，评价种群密度（内因）对种群自疏效应的影响。 三、材料与仪器： 实验材料：实验室将提供统一购置的红麻种子。种植所需土壤在校区内采集。 仪器：塑料盆4个/组、电子天平、烘箱、标签纸、记号笔等。 试剂： 海盐。 四、实验内容 4.1 试验设计 每个组自行设定不同的幼苗种植株行距处理3组，进行栽培和浇灌。

4.2 观察记录 八周内，每周固定时间对每盆内的作物幼苗进行观察，记录每棵植株的叶片数，以及每个处理的存活株数，每次每个处理需拍照记录1张。 4.3 生物量的测定 第八周将所有植株个体收获，小心地洗净，去除叶片、根上的砂粒泥土，放入烘箱烘干24h后，分成地上部和根部，进行称重。 4.4 分析数据，撰写报告 记录描述不同时间、不同处理的作物幼苗个体叶片数、存活率，以及八周内的生物量积累情况。

生物技术实验解析

实验一酵母细胞的固定化 1.实验目的 掌握酵母细胞的固定化方法。 2.原理 利用固定包埋法将酵母物细胞用物理的方法包埋在载体之中。这种方法既操作简单，又不会明显影响生物活性，是比较理想的方法，目前应用最多。其理想的固定化载体应是应对微生物无毒性，传质性能好，性质稳定，不易被生物分解，强度高、寿命长，价格低廉等。通常选用海藻酸钙、角叉藻聚糖、聚丙烯酰胺凝胶、光硬化性树脂、聚乙烯醇等。 3.试剂和仪器设备 鲜酵母、海藻酸钠、无水氯化钙，烧杯、尼龙布、注射器带7号平针头、搅棒、恒温水浴、试管、分光光度计 4.实验步骤 （1）称取海藻酸钠0.75g于100mL烧杯中，加25mL蒸馏水搅匀，在沸水浴中溶胀15min，得A液。 （2）取一个50mL烧杯，加入鲜酵母5g和25 mL馏水，搅匀，得B液。 （3）待A液冷却后，将B液与A液混合，用尼龙布过滤，得C液。 （4）称取2.2g无水CaCl2，溶解于200 mL蒸馏水中。 （5）用注射器带7号平针头将C液垂直注入CaCl2溶液中制备固定化细胞，固化30min，过滤、洗涤，称重。 5.实验数据及其处理 记录固定化酵母细胞的质量。 固定化酵母细胞的质量为：0.75g 6.问题讨论 如何验证固定化酵母细胞的催化能力？ (1)观察制作的凝胶珠的颜色和形状 如果制作的凝胶珠颜色过浅，呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定化的酵母细胞数目较少。如果形成的凝胶珠不是圆形或者椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败。 （2）观察发酵的葡萄糖溶液 利用固定酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生很多气泡，同时会闻到酒味。 （3）检查凝胶的黏性和弹性。

关于生物技术综合实验报告

关于生物技术综合实验报告生物技术综合实验 甘薯γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因的克隆和原核表达 学生：学号： 同实验者： 谷胱甘肽(glutathione, GSH) GSH具有多种重要生理功能, 抗自由基和抗氧化应激作用, 保护细胞膜的完整性等。γ-GCS是植物细胞中GSH生物合成的限速酶, 可以调控GSH 的生物合成量。GSH在生物体抵御冷害、干旱、重金属、真菌等胁迫过程中起着重要作用, 说明γ-GCS也与植物抗逆过程密切相关。 实验一甘薯叶片RNA提取 一、实验目的 1. 了解真核生物RNA提取的原理； 2. 掌握Trizol提取的方法和步骤。 二、实验原理 Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，

核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。%的8－羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。用这种方法得到的总 RNA中蛋白质和DNA污染很少。 三、实验材料 1. 材料 甘薯叶片，品种为徐薯18 2. 试剂 ①无RNA酶灭菌水：加入%的DEPC，处理过夜后高压灭菌； ② Trizol试剂； ③氯仿； ④异丙醇、75％乙醇； ⑤ TBE缓冲液； ⑥上样缓冲液 3. 仪器

现代生物技术考题

江苏省南通市2009届高三生物最后冲刺之三 专题三现代生物科技专题 一、选择题 1．以下说法正确的是（） ①发酵工程获得优良菌种的方法有：诱变育种、杂交育种、细胞工程等 ②吞噬细胞和效应B细胞都能识别抗原 ③紫茉莉遗传物质的载体是染色体、线粒体、叶绿体 ④发生过敏反应时，往往会使细胞损伤、破坏和引起支气管痉挛等 A．①②③④B．③④C．②④D．③ 2．如图，在一定时间内使某种动物细胞吸收放射性同 位素标记的氨基酸依次先后出现在图中1、2、3、4、 5部位。在这一过程中分泌蛋白通过的生物膜磷脂分 子层数是（） A．4层 B．3层 C．2层 D．0层 3．下面对生物工程的应用成果说法正确的是（） ①用白血病患者细胞中分离出的癌基因制备DNA探针可检测肝炎 ②鸡蛋白基因可在大肠杆菌或酵母菌中表达出卵清蛋白 ③在单抗上连接抗癌药物可制成定向消灭癌细胞的“生物导弹” ④利用发酵工程可获得大量微生物的代谢产物即单细胞蛋白 A．①②B．③④C．②③D．①④ 4．运用下列各种细胞工程技术培育生物新品种，操作过程中能形成愈伤组织的是（） ①植物组织培养②植物体细胞杂交⑧动物细胞培养④转基因植物的培育 A．①②⑧ B．①②④ C．①⑧④ D．①②⑧④ 5．原核生物中某一基因的编码区起始端插入了一个碱基对。在插入位点的附近，再发生下列哪种情况有可能对其编码的蛋白质结构影响最小（） A．置换单个碱基对 B．增加4个碱基对 C．缺失3个碱基对 D．缺失4个碱基对 6．某同学在学习“细胞工程”时，列表比较了动植物细胞工程的有关内容，你认为错误的 7.有三个盛放葡萄糖液的密封瓶，已知一瓶混有酵母菌，一瓶混有乳酸菌，一瓶只有葡萄糖，

西北农林科技大学-生物技术综合大实验

生物技术综合大实验——原核系统表达的 绿色荧光蛋白的纯化 宋捷（69）纪成功孔令浩王玉康王鹏程董奉新 （西北农林科技大学） 摘要：绿色荧光蛋白（GFP）的提纯是一套十分成熟的蛋白质提纯系统，本教学实验使用原核的大肠杆菌系统，通过转化带有GFP基因的原核表达载体到BL21表达菌株中，通过氨苄抗性筛选，用阿拉伯糖诱导表达。通过硫酸铵盐析，疏水层析，阴离子交换柱层析，凝胶过滤层析，各级纯化用紫外显色和SDS凝胶电泳检测，终末纯化后纯度较高。本实验较为成功的提取提纯了GFP，并较好训练蛋白质提纯技术。 关键词：GFP 蛋白提纯疏水层析离子交换层析凝胶过滤层析 — 1.介绍：GFP最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发 现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。分子质量约为27kd，有238各氨基酸基团］，三维结构为β圆柱，圆柱两端由一些较短的α螺旋盖住，圆柱中央是几段α螺旋，生色团位于圆柱中央。该结构性质稳定。本实验通过该分子的较为稳定，疏水特性，易电离成阳离子，分子较小的体征，选择盐析，疏水层析，阴离子交换层析，凝胶过滤层析逐级提纯GFP。 2.材料和方法 2.1.pGFP质粒克隆及提取 质粒是已经构建完成的，GFP基因表达由易受阿拉伯糖诱导的启动子控制，及常表达的氨苄抗性。碱裂解法（试剂实验室自配）提取。取1ml菌液于离心管，1000rpm离心30s，弃上清——加入100μl提质粒溶液I，震荡混匀——加入200μl溶液II，温和混匀置至于冰上5min——加入150μl溶液III，混匀，置于冰上5min——1000rpm 离心3min，转移上清于另一新离心管，加入900μl无水乙醇，混匀，室温静置3min ——12000rpm离心5min，弃上清，待其干燥——于30μl TE中溶解，冰上暂存。 2.2.转化 取 OD600 ~ BL21，冰浴30min——4000rpm离心10min，弃上清——加入200μl CaCl2——悬浮沉淀，冰浴15min——4000rpm离心10min，弃上清——加入200μl CaCl2悬浮沉淀，备用。取1μl质粒DNA加入制备好的感受态细胞，温和混匀，置于冰上30min——42°C水浴锅，热击45-60s——冰浴10min——加入900μl LB培养基，37°C，150rpm震荡培养30min——涂板（LBp/ara），37°C温育过夜。 2.3.筛选重组子及扩大培养 <

生物制药综合性实验实验报告

广东药学院 基因工程（跨课程）综合性实验论文 姓名 班级 学号 指导教师 广东药学院 生命科学与生物制药学院生物制药研究所

目录 摘要 (2) 前言 (3) 一、材料与方法 (3) 1.1 材料 (3) 1.1.1 重组蛋白质药物单元的实验材料 (3) 1.1.2重组DNA药物单元的实验材料 (3) 1.2 方法 (4) 1.2.1 重组蛋白质药物单元 (4) 1.2.1.1 工程菌构建（已由老师完成） (4) 1.2.1.2 工程菌表达筛选 (6) 1.2.1.3 制备IL-18工程菌甘油种 (8) 1.2.1.4 GST工程菌生长曲线分析 (8) 1.2.1.5 GST工程菌表达影响因素试验 (8) 1.2.1.6 表达进程分析 (9) 1.2.1.7 凝胶扫描分析 (9) 1.2.1.8 发酵工艺（观摩） (9) 1.2.2 重组DNA药物单元 (9) 1.2.2.1 质粒TCRVα12.2-Vβ7.1-EYFP的大规模制备 (9) 1.2.2.2 TCR质粒-脂质体复合物制备与分析 (10) 1.2.2.3 TCR体外转染活性检测 (11) 1.2.2.4 TCR转染体内试验 (12) 二、结果与讨论 (12) 2.1 重组蛋白质单元结果与讨论 (12) 2.1.1 IL-18工程菌表达筛选SDS-PAGE (12) 2.1.2 GST工程菌生长曲线分析 (14) 2.1.3表达影响因素试验 (15) 2.1.4 表达进程试验 (16) 2.2 重组DNA药物单元结果与讨论 (18) 2.2.1质粒阴离子交换层析纯化 (18) 2.2.2 质粒柱层析样品琼脂糖电泳分析 (19) 2.2.3 质粒-脂质体复合物制备 (20) 2.2.4 TCR转染基因表达荧光检测 (20) 2.2.5 TCR体外转染活性检测 (21) 2.2.6 TCR转染体内试验 (23) 三、小结 (25) 致谢 (25)