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紫薇基因组DNA的分离纯化

紫薇基因组DNA的分离纯化
紫薇基因组DNA的分离纯化

植物基因组DNA提取试剂盒(北京天根)

植物基因组DNA提取试剂盒 1 取植物新鲜组织约100 mg或干重组织约30 mg,加入液氮充分研磨。 2 将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700 μL 65℃预热缓冲液GP1的离心管中(实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇,使其终浓度为0.1%),迅速颠倒混匀后,将离心管放在65℃水浴20 min,水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。 3 加入700 μL氯仿,充分混匀,12,000 rpm(~13,400×g)离心5 min。 注:若提取富含多酚或淀粉的植物组织,可在第3步前,用酚:氯仿/1:1进行等体积抽提。 4 小心的将上一步所得水层上相转入一个新的离心管中,加入700 μL缓冲液GP2,充分混匀。 5 将混匀的液体转入吸附柱CB3中,12,000 rpm(~13,400×g)离心30 s,弃掉废液。(吸附柱容积为700μL左右,可分次加入离心。) 6 向吸附柱CB3中加入500 μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12,000 rpm(~13,400×g)离心30 s,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中。 7 向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12,000 rpm(~13,400×g)离心30 s,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中。 8 重复操作步骤7。 9 将吸附柱CB3放回收集管中,12,000 rpm(~13,400×g)离心2 min,倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 注意:这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除,漂洗液中的乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。 10 将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200 μL洗脱缓冲液TE,室温放置2-5 min,12,000 rpm(~13,400×g)离心2 min,将溶液收集到离心管中。 注意:洗脱缓冲液体积不应少于50 μL,体积过小影响回收率。洗脱液的PH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内(可以用NaOH将水的pH值调到此范围),pH值低于7.0会降低洗脱效率;且DNA产物应保存在-20℃,以防DNA降解。为增加基因组DNA的得率,可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中,室温放置 2 min,12,000 rpm (~13,400×g)离心2 min。

基因组DNA提取方法

1 快速微量提取法A.取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中,12000rpm离心1min, 丢去上清夜,收集菌体。 B.加入400ul裂解液(40mMTris-醋酸,20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8)混匀,置于37oC水浴1hr。C.然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液,混匀后于13000rpm离心15min。D.取上清液,用苯酚抽提2次,氯仿抽提1次。E.加两倍体积无水乙醇,1/10体积醋酸钾(3M ,pH8.0),-20度保存1小时后,13000rpm离心15min,弃上清液,沉淀用70%乙醇洗2次;置于室温干燥后,溶于50ulTE 溶液中,置4oC保存备用。 2 蛋白酶/SDS法制备先用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftia sp.,第二天4000rpm离心10min收集菌体,用Washing TE (50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0)洗菌体2次,之后将菌体充分悬浮在5ml 1×TE缓冲液中,先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS,轻轻混匀后50℃放置3h~5h,接着用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次,苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次,氯仿抽提一次后,乙醇沉淀DNA,用自动移液器吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中,70%乙醇洗2次,干燥后溶于适当1×TE或ddH2O中。 3 1) 细菌培养:细菌接种于5ml 液体培养基中,37℃摇床(300rpm)培养过液。2) 细菌收集:取1ml培养物于1.5ml EP 管中,室温8000rpm离心5min,弃上清,沉淀重新悬浮于1ml TE(pH8.0)中(用ddH2O 也行)。3) 菌体裂解:加入6μl 50mg/ml的溶菌酶,37℃作用2h。再加2mol/LNaCl50μl,10%SDS 110μl,20mg/ml的蛋白酶K 3μl,50℃作用3h或37℃过夜。(此时菌液应为透明粘稠液体)4) 抽提:菌液均分到两个1.5ml EP管,加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),混匀,室温放置5-10min。12000rpm离心10min。抽提两次。(上清很粘稠,吸取时应小心,最好枪头尖应剪去)5) 沉淀:加0.6倍体积的异丙醇,混匀,室温放置10min。1 2000rpm离心10min。6)洗涤:沉淀用75%的乙醇洗涤。7) 抽(凉)干后,溶于50μl ddH2O中,取2-5μl电泳。作PCR模板用。

植物基因组DNA提取

植物基因组DNA提取 一、实验目的 1、掌握植物基因组总DNA的抽提方法和基本原理。 2、学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。 二、实验原理 通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞,由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响,在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨,材料易于破碎,并减少研磨过程中各种酶类的作用。 十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide,简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,简称SDS)等离子型表面活性剂,能溶解细胞膜和核膜蛋白,使核蛋白解聚,从而使DNA得以游离出来。加入苯酚和氯仿等有机溶剂,能使蛋白质变性,并使抽提液分相,因核酸(DNA、RNA)水溶性很强,经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀,沉淀DNA溶于TE溶液中,即得植物总DNA溶液。 三、实验仪器及试剂 实验仪器:高速离心机;烘箱;冰箱;水浴锅;高压灭菌锅;Nanodrop。 实验试剂:玻璃珠,十二烷基磺酸钠(SDS);三羟甲基氨基甲烷(Tris);乙二胺四乙酸(EDTA);氯化钠;苯酚;氯仿;无水乙醇等。 四、实验步骤 1.SDS提取缓冲液在65℃水浴中预热。 2.将叶片置于1.5ml离心管中,液氮速冻,组织研磨器打样。 3.加入700 l的SDS提取缓冲液,涡旋摇匀。 4.置于65℃的水浴中,每隔10 min轻轻摇动,30 min后取出。

5.加入200 μl KAc溶液,摇匀,放入-20℃冰箱30 min。 6.10000 rpm离心5 min,上清移至新离心管中,12000 rpm离心5 min。 7.上清移至新离心管中,加入700 μl异丙醇,-20℃冰箱30 min。 8.10000 rpm离心5 min,弃上清,加入500 μl 70%乙醇漂洗。 9.弃液体,晾干。 10. DNA纯度与浓度测定(使用nanodrop)。 (1)DNA纯度:DNA的OD260/OD280一般为1.8左右。 OD260/OD280 ≈ 1.8:说明较纯; OD260/OD280 > 1.8:说明可能有RNA污染; OD260/OD280 < 1.8:说明可能有蛋白质污染。 五、注意事项 1. 叶片磨得越细越好。 2. 注意移液器的正确使用。 3. 由于植物细胞中含有大量的DNA酶,因此,除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外,第一步的操作应迅速,以免组织解冻,导致细胞裂解,释放出DNA酶,使DNA降解。 六、结果与分析 1.植物DNA提取所用试剂的作用? 2.植物DNA提取的关键步骤有哪些? 3.植物DNA提取后的用途有哪些? 4.从化学结构、化学性质、存在场所以及功能等方面比较DNA和RNA的异同。

基因组DNA提取步骤

基因组DNA提取步骤 1.从无水乙醇中取出少许组织(约50mg)加入干净灭菌的EP管中, 剪碎; 2.加入400ul 1%的SDS,8ul(20mg/ml)的蛋白酶K,充分浸润, 入55℃摇床(100转/分),期间振荡助溶至澄清(5-6h); 3.取出消化液,加入6mol/L的NaCl300ul,氯仿200ul,轻柔正反 颠倒,使其充分乳化,4℃13000转/分离心30min; 4.取出上清(约400ul),加入等体积氯仿抽提一次,轻柔颠倒后, 4℃13000转/分离心10min; 5.上清加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃10分钟, 除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一 般无影响,可省略该步骤)。 6.取上清加入等体积异丙醇,轻柔混匀后-20℃沉淀10min; 7.4℃13000转/分离心15min,弃上清; 8.用75%乙醇洗涤1-2次(1000ul,11000转/分离心2min),弃上 清; 9.冰冻无水乙醇洗涤1-2次(1000ul,11000转/分离心4min)弃上 清,自然晾干或烘干,DDW溶解,30-50ul。 基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇,

基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取出,而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部, 从而达到提取的目的。在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的DNA。一般来说,构建基因组文库, 初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析, DNA长度可短至50kb, 在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下),并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。 不同生物(植物、动物、微生物)的基因组DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同,分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时, 应考虑除去多糖和酚类物质。 本实验以水稻幼苗(禾本科)、李(苹果)叶子、动物肌肉组织和大肠杆菌培养物为材料,学习基因组DNA提取的一般方法。 从植物组织提取基因组DNA 一、材料 水稻幼苗或其它禾本科植物,李(苹果)幼嫩叶子。 二、设备 移液器,冷冻高速离心机,台式高速离心机,水浴锅,陶瓷研钵,50ml离心管(有盖)及5ml和 1.5ml离心管,弯成钩状的小玻棒。 三、试剂 1、提取缓冲液Ⅰ:100mmol/L Tris·Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。 2、提取缓冲液Ⅱ:18.6g葡萄糖,6.9g二乙基二硫代碳酸钠,6.0gPVP,240ul巯基乙醇,加水至300ml。 3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇 4、RnaseA母液:配方见第一章。 5、其它试剂:液氮、异丙醇、TE缓冲液,无水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。 四、操作步骤: (一)水稻幼苗或其它禾木科植物基因组DNA提取 1. 在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ, 60℃水浴预热。 2. 水稻幼苗或叶子5-10g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高), 不时摇动。 3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤),室温下静置5-10分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。 4. 室温下5000rpm离心5分钟。 5. 仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。 6. 在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转

动物基因组DNA的提取

动物基因组DNA的提取 [实验原理] 在EDTA和SDS等去污剂存在下,用蛋白酶K消化细胞,随后用酚抽提,可以得到哺乳动构基因组DNA,用此方法得到的DNA长度为100-150 kb,适用于L嘴菌体构建基因组文库和Southern分析。 通过本实验了解并掌握提取基因组DNA的原理和步骤,以及相对分子质量较大的DNA 的琼脂糖凝胶电泳技术。 [仪器、材料与试剂] (一)仪器 1.台式离心机 2.玻璃匀浆器 3.高压灭菌锅 4.恒温水浴 (二)材料 1.1.5mL微量离心管 2.微量取样器和吸头 3.无菌过滤器(一次性) 4.10 mL注射器 5.鼠肝 6.三羟甲基氨基甲烷(Tris) 7.十二烷基硫酸钠(SDS) 8.乙二胺四乙酸(EDTA)

9.蛋白酶K 10.RNA酶 11.DNA相对分子质量标准物,DNA/EcoRI+HindⅢ相对分子质量标准物 (三)试剂 1、1.5 mol/L NaCl 2、0.5 mol/L Tris·HCI pH8.0 3.0.5 mol/L EDTA pH8.0 4.3 mol/L NaAc pH5.2 以上均高压灭菌。 5.蛋白酶K 10mg/mL配好后用一次性过滤器过滤,-20 保存(教师配制) 6.组织匀浆液100mmol/LNaCI,10mmol/LTris·HCl(pH 8.0),0.25mmol/LEDTA(pH8.0) 7.酶解液200mmol/LNaCI,20mmol/L Tris·HCI(pH 8.O),50mmol/LEDTA(PH 8.0),200~g/mL蛋白酶K,1%SDS 8.无DNA酵的RNA酶:将胰RNA酶溶解于10mmol/L Tris.HCI(pH7.5)、15 mmol /L NaCl溶液中,浓度l0mg/mL,于100℃水浴处理15min,以降解DNA酶,缓慢冷却到室温,-20℃保存 9.TE缓冲液:10mmol/LTris·HCl(pH8.0),25 mmol/LEDTA(pH8.0) 10.平衡酚(pH8.0):氧仿:异戊醇=25:24:1<体积比) 11.氧仿:异戊醇=24:l(体积比) 12.5xTBE 5.4gTris,2.75g硼酸2mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0),加水到100mL;13.6x上样缓冲液o.25%溴酚蓝,40%(W/V)蔗糖水溶液

(一)细菌基因组DNA的提取

(一)细菌基因组DNA的提取 1.试剂 1)CTAB/NaCl溶液:4.1g NaCl溶解于80mL H2 O,缓慢加入10g CTAB,加水至100mL。2)其它试剂:氯仿:异戊醇(24:1),酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),异丙醇,70% 乙醇,TE,10% SDS,蛋白酶K (20mg/mL或粉剂),5mol/L NaCl。 2.操作步骤: 1)100mL 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 去上清液。 2)加9.5mL TE悬浮沉淀, 并加0.5 mL 10% SDS, 50 μL 20mg/mL(或1mg干粉)蛋白酶K, 混匀, 37℃保温1小时。 3)加1.5mL 5mol/L NaCl, 混匀。 4)加1.5mL CTAB/NaCl溶液, 混匀, 65℃保温20分钟。 5)用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管。6)用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干净管中。 7)加1倍体积异丙醇, 颠倒混合, 室温下静止10分钟,沉淀DNA。 8)用玻棒捞出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1mL TE, -20℃保存。如DNA沉淀无法捞出,可5000rpm离心, 使DNA沉淀。 (二)细胞基因组DNA的提取 Each sample + TNES buffer 500 μL +proteinase K 25 μL → 55 °C, 750 rpm, 2hr →+150 μL 6M NaCl, vortex → spin 5 min, Max, romm temperature (RT) →isolate supernatant + 600 μL cold ethanol (95%), vortex → spin 5 min, Max, RT→ precipitation + 75% ethanol, RT, Vortex → spin 5 min, Max, RT →precipitation+50 μL TE buffer (10× stock solution), keep in 4 °C. (三)Chelex法抽提DNA 1.用无菌棉签取双侧颊粘膜拭子,室温下自然干燥过夜,在无菌容器中保存。 2.取1.5mL试管,加双蒸去离子水1mL,将对应的颊粘膜棉签拭子插入试管内,浸泡20 分钟,其间用力搅动棉签,再将棉签用眼科镊挤干取出 3.12000rpm离心5分钟,弃上清 4.加5% chelex-100 200μL、蛋白酶K 5μL,置50℃水浴中30分钟,再置沸水浴中10分钟, 灭活蛋白酶K,冰浴3分钟,使DNA复性 5.取出后12000rpm离心5分钟,取上清液移至另一管中,-20℃保存备用

真核生物基因组DNA的提取和含量测定

实验报告 课程名称: 生物化学实验 实验名称: 真核生物基因组DNA 的提取和含量测定 指导老师: 同组学生: 廖杰 成绩:__________________ 真核生物基因组DNA 的提取和含量测定 【实验原理】 制备具有生物活性的大分子核酸,必需采取温和的制备条件,避免过酸、过碱 的反应环境和剧烈的搅拌,防止核酸酶的作用,并要求在低温下进行操作 。 一、 真核生物基因组DNA 的提取 本实验选用小鼠肝脏细胞作为实验材料,采用匀浆法破碎组织细胞。 DNP 在0.14mol/L NaCl 中不溶解,而RNP 可溶解。 用无菌水溶解沉淀,加入蛋白酶消化液(含有蛋白酶K 和SDS )。 1温和方法的破碎细胞而不产生机械剪切以致破坏DNA 的完整性, 2可以变性Dnase , 3还可以去除部分的蛋白。 4使核蛋白体从DNA 上解离。 然后加RNase 以去除RNA ,再用苯酚:氯仿抽提法反复抽提提取DNA 苯酚:氯仿抽提法: 酚、氯仿是有机溶剂,能有效地使蛋白质变性。纯酚在与水混合时处于下层。然而有机相和水相会难于分开。 专业: 药学 姓名: 阿卜杜合力力 学号: 3100105256 日期: 2012.5.10 地点: 生化实验室 装 订 线

若使用酚:氯仿混合物抽提,由于氯仿的比重较大(1.47),可在很大程度上解决这个问题,促进两相的分离。 异戊醇则可减少操作过程中产生的气泡。 变性蛋白一般集中在两相之间的界面层,而脂类则有效地分配在有机相中,核酸则被留于上层水相。 该法其具有操作条件比较温和,能迅速使蛋白质变性并同时抑制核酸酶的活性,可得到具有生物活性的高聚合度的核酸等优点。 但其操作步骤较为繁琐,去除蛋白质需要反复进行多次。 砷盐、氟化物、柠檬酸、EDTA等可抑制DNase的活性;皂土等可抑制RNase 的活性。 收集上清液后用乙醇沉淀DNA,最后用TE缓冲液溶解DNA,并用紫外吸收法测定DNA的含量及纯度。 二、紫外吸收法测定基因组DNA的含量及纯度 1.紫外分光光度法测定核酸含量: 由于DNA在260nm处有最大的吸收峰,因此,可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度,吸光度A值为1相当于大约50μg /ml双链DNA。 2.紫外分光光度法测定DNA纯度: 由于DNA在260nm处有最大的吸收峰,而蛋白质在280nm处有最大的吸收峰,DNA纯品的算A260/ A280为1.8(1.7~1.9),故根据算A260/ A280的值可以估计DNA的纯度。 若比值较高说明含有RNA,比值较低说明有残余蛋白质存在。

基因组DNA提取方法

基因组DNA提取方法 HOM buffer:80mM EDTA,100mM Tris-HCl,0.5%SDS,pH8.0 称取29.8g EDTA2Na-2H2O,溶于700ml双蒸水中,加入12.1g Tris base(分 子量:121.1),加入5g SDS,用NaOH调节pH至8.0,定容至1000ml,高压灭 菌,室温保存。 Proteinase K(蛋白酶K):15 mg/ml(10-15mg/ml的浓度都可以) 已有蛋白酶K 浓度:10mg/ml,每次使用15-20微升 温度为室温,离心时也是室温离心 1. 加入500微升的HOM buffer和10-15微升的蛋白酶K,在55℃消化至少3小时。每隔1小时摇动一次。 2. 加500微升氯化钠(4.5M),300微升氯仿,混20分钟。 3. 在13000 rpm下离心10分钟。 4. 转移上清液到一个新管里(大概有850微升左右的样子)。 5. 加595微升无水异丙醇(pure isopropanol)(0.7倍体积),混20分钟。 6. 在13000 rpm下离心10分钟,倒掉上清。 7. 加0.5毫升75%的乙醇,并消化5分钟(提的时候因为我同时在做酶切,烘箱温度酶要求37℃,所以消化了大概二十多分钟,温度高一些的话时间可以短一些),在13000 rpm 下离心20分钟,倒掉上清。 8. 凉干,加50-100μL的TE buffer或者双蒸水溶解,第二天检测。 上面是我们实验室的改进方法,效果不错。原方法中:混的时候只用了10分钟,第三步的离心是10000 rpm,第七步的乙醇是70%的浓度。 用酚抽提后,按步骤9-10重沉淀DNA: 9. 加0.1倍体积3mol/L NaAc(pH5.2)及2倍体积无水乙醇,颠倒混合沉淀DNA,室温下静置10-20分钟,DNA沉淀形成白色絮状物。 10.用玻棒钩出DNA沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水纸上吸干,溶解于1ml TE中,-20℃保存。 11.如果DNA溶液中有不溶解颗粒,可在5000rpm短暂离心,取上清;如要除去其中的RNA,可加5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃保温30分钟。 熊小飞的经验:凝胶检测结果如果是点样孔那里特别亮,且跑出来的带有拖影(比较亮且长),说明你提的DNA中蛋白质杂质比较多,这种DNA一般不适合用来做微卫星和PCR。 放置几天后,其中的RNA、蛋白质会降解一部分,也有可能可以拿来用。其实 你只要把这种DNA用PCR回收试剂盒来处理一下,效果就非常的好,试剂盒中的 TE和EB都可以用灭菌水代替,最后洗脱DNA的EB要用50-60度的灭菌水(你只要

基因组DNA的提取

基因组DNA的提取 概述 基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇,基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取出,而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部, 从而达到提取的目的。在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的DNA。一般来说,构建基因组文库, 初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析, DNA长度可短至50kb, 在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下),并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。 不同生物(植物、动物、微生物)的基因组DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同,分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时, 应考虑除去多糖和酚类物质。 本实验以水稻幼苗(禾本科)、李(苹果)叶子、动物肌肉组织和大肠杆菌培养物为材料,学习基因组DNA提取的一般方法。 第二节从植物组织提取基因组DNA 一、材料 水稻幼苗或其它禾本科植物,李(苹果)幼嫩叶子。 二、设备 移液器,冷冻高速离心机,台式高速离心机,水浴锅,陶瓷研钵,50ml离心管(有盖)及5ml和1.5ml离心管,弯成钩状的小玻棒。 三、试剂 1、提取缓冲液Ⅰ:100mmol/L Tris·Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。

基因组DNA的提取与分离鉴定课后研讨题(手写)

基因组DNA的提取与分离鉴定 课后研讨题 1、动植物DNA提取的方法主要有哪些?并说明各方法的原理。 答: (1).浓盐法 利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同,将二者分离,常用的方法是用1M 氯纳提取化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间,而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来. 也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白. 两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些. 以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA 的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA. (2).阴离子去污剂法: 用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA .由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以 常用阴离子去污剂提取DNA. (3).苯酚抽提法: 苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相,而DNA 溶于水相。离心分层后取出水层,多次重复操作,再合并含DNA 的水相,利用核酸不溶于醇的性质,用乙醇沉淀DNA 。此时DNA是十分粘稠的物质,可用玻璃漫漫绕成一团,取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态 . ( 4).水抽提法: 利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA,然后将沉淀溶于水中,使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66% ?80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,既得DNA样品.此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS. 2、苯酚、氯仿和异戊醇在基因组DNA的提取中各有什么作用? 答:苯酚:使蛋白质变性,同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相,而DNA溶于水相。

植物基因组DNA的提取及其定性、定量分析

《分子生物学》实验报告 实验一植物基因组DNA的提取及其定性、定量分析【实验目的】

通过本实验学习利用CTAB法从植物组织中提取DNA并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法对DNA进行定性定量分析。 【实验原理】 CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子型去污剂,可溶解细胞膜,在高离子强度下(大于0.7 M NaCl),与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。利用液氮对植物组织进行研磨,从而破碎细胞。然后加入CTAB缓冲液将DNA溶解出来,再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白,最后经乙醇沉淀得到DNA。 琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中,并置于静电场上。DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此,在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即DNA分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系,分子量小的DNA分子比分子量大的DNA分子迁移速率快,迁移距离远,由此得到分离。凝胶电泳也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子,超螺旋质粒DNA(cccDNA)泳动最快,其次为线状DNA(L DNA),最慢的为开环质粒DNA(ocDNA)。 核酸分子(DNA或RNA)由于含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键,在260 nm波长处有特异的紫外吸收峰,其吸收强度与核酸的浓度成正比,这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。1 OD260相当于dsDNA 50 μg/mL,ssDNA 33 μg/mL和ssR NA 40 μg/mL。可以此来计算核酸样品的浓度。紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度,还可通过测定260 nm和280 nm 的紫外线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度,若DNA的A260/A280比值高于2.0,则可能有RNA污染,低于1.8则有蛋白质污染。 【仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材 离心机、恒温水浴器、台式离心机、电子天平、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、高压灭菌锅、紫外线透射仪、微波炉、紫外分光光度仪、微量移液器(10、100、1000 μL 量程各一支)、100 mL或250 mL锥形瓶、量筒、液氮、研磨棒、点样板或parafilm、吸头、 1.5 mL EP管、PE手套和乳胶手套。 二、药品

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