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胶体金免疫层析法快速检测牛奶_奶粉_饲料中的三聚氰胺_李淑群

胶体金免疫层析法快速检测牛奶_奶粉_饲料中的三聚氰胺_李淑群
胶体金免疫层析法快速检测牛奶_奶粉_饲料中的三聚氰胺_李淑群

DOI :10.3724/SP.J.1096.2013.20972

胶体金免疫层析法快速检测牛奶、奶粉、饲料中的三聚氰胺

李淑群

曹碧云常化仿邓安平

*

(苏州大学材料与化学化工学部,苏州215123)

建立了快速检测牛奶、奶粉、饲料样品中三聚氰胺的胶体金免疫层析分析法。将三聚氰胺进行分子

修饰得到两种衍生物,

分别与牛血清白蛋白(BSA )和卵清白蛋白(OVA )相连制得免疫原和包被抗原。运用杂交瘤抗体制备技术得到抗三聚氰胺的单克隆抗体(mAb )。利用柠檬酸三钠还原法制得平均粒径18nm 的胶体金,将胶体金与抗三聚氰胺单克隆抗体相连,所形成的金标抗体(Au-mAb )包被在胶体金垫上,包被抗原和羊抗鼠二抗分别包被在硝酸纤维素膜(NC )上作为检测线(T 线)和质控线(C 线)。将胶金垫、NC 膜、样品垫和吸水纸组装成免疫层析快速检测试剂条。将标准溶液(或待测液)滴加到样品垫上,

10min 后可在NC 膜C 线和T 线位置上用肉眼观察到胶体金的颜色(红色),通过比对颜色的深浅判断样品中三聚氰胺的含量。结果表明,三聚氰胺的检出限为10μg /L ;选用了其它10种物质对免疫层析试剂条进行了特异性实验,免疫层析试剂条与2-氯-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪和环丙氨嗪的交叉反应率约为1%,与其它8种物质没有交叉反应;加标样品用免疫层析试剂条和酶联免疫吸附分析法(ELISA )同时检查,结果一致。本方法适用于牛奶、奶粉、饲料样品中三聚氰胺的现场快速检测。关键词

三聚氰胺;单克隆抗体;胶体金;免疫层析法

2012-09-26收稿;2013-01-22接受

本文系国家自然科学基金(No.21175097)资助*E-mail :denganping@suda.edu.cn

1引言

三聚氰胺(Melamine ,图1a ),化学名为2,4,6-三氨基-1,3,5-三嗪,是一种重要的氮杂环有机化工原料,

主要用作生产三聚氰胺甲醛树脂的原料,这种树脂被广泛运用于木材、塑料、造纸、纺织、皮革等行业;三聚氰胺还可以作阻燃剂、减水剂、甲醛清洁剂等[1]

。由于三聚氰胺分子中含有大量氮元素,而常

规的

“凯氏定氮法”检测食品或饲料中蛋白质含量时不能排除这类“伪蛋白氮”的干扰,因而一些不法分子为降低成本,在牛奶、奶粉和饲料添加这种非食品性化工原料,以提高其产品中的蛋白质含

量。2008年10月,

我国制定了乳品中三聚氰胺管理限量值,婴幼儿配方乳粉中三聚氰胺的限量值为1mg /kg ;含乳15%以上的其它食品中三聚氰胺的限量值为2.5mg /kg 。

目前,检测三聚氰胺的主要方法有气相色谱-质谱联用法(GC-MS )[2,3]

、高效液相色谱法(HPLC )[4 6]、液相色谱-质谱联用法(LC-MS )[7 9],这些方法虽然准确度高,但样品预处理复杂、设备昂贵,

检测费用高。近年来,酶联免疫吸附法[10 12]

以及胶体免疫层析试剂条[13,14]

等已用于三聚氰胺的检测,但仍存在灵敏度不够高或特异性不够强等不足。本研究对三聚氰胺的分子结构进行了较合理的修饰,合成了两种三聚氰胺衍生物,并分别与牛血清白蛋白和鸡卵清白蛋白相连制得免疫原和包被抗原。利用杂交瘤抗体制备技术得到抗三聚氰胺的单克隆抗体,以所制得的抗体为基础,建立了测定牛奶、奶粉、饲料中三聚氰胺的胶体金免疫层析法。

2

实验部分

2.1

仪器与试剂

UV-2300型紫外-可见分光光度计(上海天美科学仪器有限公司);Dura 12FV 纯水机(美国THE

LAB 公司);Sunrise Remote 酶标仪和M12/2R 洗板机(奥地利Tecan 公司);硝酸纤维素膜(Whatman 公

司),底板,吸水纸,玻璃纤维素膜(上海杰一生物有限公司);三聚氰胺(成都长征化学试剂有限公司);

第41卷2013年7月

分析化学(FENXI HUAXUE )研究报告Chinese Journal of Analytical Chemistry

第7期1025 1030

柠檬酸三钠,氯金酸,二甲亚砜(上海国药有限公司);牛血清白蛋白(Bovine serum albumin ,BSA )、鸡卵

清白蛋白(Ovalbumin ,OVA )、酪蛋白、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(3,3,'5,5,'-tetramethylbenzidine ,TMB )、二环己基碳二亚胺(N ,N -dicyclohexylcarbodiimide ,DCC )、N -羟基琥珀酰亚胺(N -hydroxysuc-ci-nimide ,NHS )和二甲基甲酰胺(Dimethylformamide ,DMF )均购自美国Sigma 公司;羊抗鼠IgG (北京中杉金桥生物技术有限公司);2-氯-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪(2-Chloro-4,6-diamino-1,3,5-triazine ,CAAT ,比利时Acros Organics 公司);三聚氰酸、三聚氰氯(上海国药有限公司);环丙氨嗪(浙江国邦医药有限公司);阿特拉津(浙江中山化工有限公司)。其余试剂均为分析纯。

2.2实验方法2.2.1

三聚氰胺衍生物的制备本研究对三聚氰胺的分子结构进行了较合理的修饰,制备了两种三聚

氰胺衍生物。衍生物1(分子结构如图1b ):称取CAAT 加入反应瓶,用无水甲醇溶解,再加入对氨基苯

甲酸(溶于KOH-无水甲醇中);反应回流5 12h ,直到CAAT 反应完全;反应混合物过滤,并用无水乙醇和蒸馏水各洗3次,得到白色粗产物;再用甲醇-二氯甲烷过柱,得到纯品。衍生物2(分子结构如图1c 所示)的制备过程与制备衍生物1相同,但溶剂为无水乙醇,衍生试剂为3-巯基丙酸

图1三聚氰胺(a )、衍生物1(b )和衍生物2(c )的分子结构式

Fig.1

Molecular structures of melamine (a ),derivative 1(b )and derivative 2(c )

2.2.2免疫原和包被抗原的制备分别称取衍生物1(或衍生物2)和DCC 、NHS ,共溶于DMF 中,室温

下搅拌过夜,将混合液离心5 20min ,取上层清液,缓慢加入到0.01% 0.02%的BSA (或OVA )中,

搅拌1 10h ,离心分离,取上层清液,透析4 5d ,溶液冷冻干燥,置冰箱中存放,其中,衍生物1-BSA 为免疫原,衍生物2-OVA 为包被抗原。2.2.3

单克隆抗体的制备

抗三聚氰胺的单克隆抗体由杂交瘤技术制备

[15]

。经免疫原免疫小鼠,取

免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,细胞培养、筛选等过程,筛选出能分泌抗三聚氰胺抗体的

杂交瘤细胞,再将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔产生腹水,用硫酸铵沉淀法纯化腹水中的单克隆抗体,纯化抗体与等体积甘油1?1混合,并置于"20?保存。2.2.4

胶体金的制备

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金

[16]

:称取1g 氯金酸,溶于100mL 水中,配

成1%氯金酸溶液。取1mL 1%氯金酸溶液,加入装有100mL 沸腾的超纯水的圆底烧杯中。继续加热

搅拌,

快速加入2.5mL 1%柠檬酸三钠溶液。当溶液的颜色变为透明的酒红色时,加热5min 后,停止加热。冷却至室温,用补充至原体积。4?贮存备用。2.2.5

胶体金标记单克隆抗体

取100mL 胶体金溶液,用0.1mol /L K 2CO 3溶液调节胶体金溶液至

pH 7.0 9.0,缓慢加入400μL 饱和硫酸铵纯化的1.45mg /mL 单克隆抗体,继续搅拌30min 。在4?

中静置2h 后,边搅拌边逐滴加入BSA 封闭剂,持续搅拌10min 后,4?放置过夜。金标抗体溶液常温低速离心,

弃去沉淀。取红色上清溶液于低温高速(14000r /min )离心40min 。取管底可流动的暗红色沉淀,用PB 溶液(0.02mol /L 磷酸盐缓冲液,pH 7.4,含一定浓度的蔗糖,

BSA 和吐温-20)将沉淀混悬为原体积的1/10,

4?保存备用。2.2.6胶体金免疫层析试剂条的组装、检测及结果判定在2.5cm ?0.5cm 的玻璃纤维素膜上喷涂用PB 溶液稀释的30μL 金标抗体,37?干燥2h ,即为胶金垫。将包被抗原(1g /L )和羊抗鼠IgG (稀释比为1?50)在硝酸纤维素膜(NC )上点样,分别作为检测线(T )和质控线(C ),室温干燥。取出一块底板,将喷有T 线和C 线的硝酸纤维素膜粘贴在中央区,分别将吸水纸和胶金垫粘贴于硝酸纤维素膜的上方和下方。两者之间重叠约2mm ,再在胶金垫的下方粘贴喷有缓冲溶液的玻璃纤维素膜作为样品垫,组

6201分析化学第41卷

装成胶体金免疫层析试剂条,如图2a 所示。

取100μL 三聚氰胺标准溶液(或样品试液)于样品垫中,溶液将沿吸水纸方向移动。首先与胶金垫上的金标抗体结合,并一同继续向吸水纸方向移动,到达T 线区域。在T 线处,溶液中的三聚氰胺与包被抗原竞争金标抗体,溶液中的三聚氰胺浓度越大,能够与包被抗原相结合的金标抗体的量越少,胶体金的颜色(红色)越浅,通过比对颜色的深浅从而判断三聚氰胺的含量。当金标抗体到C 线区域,将与羊抗鼠IgG 结合,

故在C 线处总会出现胶体金的颜色(红色)。整个检测过程仅需10min 就可完成。胶体金免疫层析法的结果判定(图2b ):当检测线和质控线均出现红色条带,判定为阴性;当检测线无红色条带,质控线出现红色条带,判定为阳性;当检测线和质控线均未出现红色条带或只有T 线有红色条带,试剂条无效

图2胶体金免疫层析试剂条的组装示意图(a );免疫层析法的结果判定(b )

Fig.2

Cross-section of immunochromatographic strip (a )and result judgment of immunocromatographic strip assay

(ICA )(b )

2.2.7

样品采集、预处理及检测

从当地市场上购得牛奶(样1、样2),奶粉和饲料(鸡、猪)3种样品,经简单的样品处理后用所制备的免疫层析条检测。

样品处理:(1)牛奶:取1mL 牛奶,加入1mL 样品稀释液(0.02mol /L PBS ,含0.5%吐温-20,pH 7.4)稀释。(2)奶粉:取1g 奶粉,倒入50mL 离心管中,加入10mL 去离子水,涡旋2min ,取1

mL 混合的牛奶样品至5mL 离心管中,用1mL 的样品稀释液稀释。(3)饲料:碾磨均匀,取1g 至5mL

离心管中,加入2mL 甲醇-水(2?3,V /V ),涡旋2min ,7500g 离心5min ,取上清液100μL 至1mL 离心管中,加入300μL 样品稀释液。

取100μL 样品试液于样品垫中,

10min 后观察T 线和C 线中颜色(红色)的深浅作判定。3

结果与讨论

3.1

三聚氰胺衍生物的制备

在衍生物1(图1b )中,三聚氰胺原有分子结构保留较完整,且连接桥为苯基,这种修饰方式将使所

制备的免疫原具有更强的免疫原性,且产生的抗体特异性将得到提高。在衍生物2(图1c )中,

1位上的N 被S 所取代,且连接桥为直链,将使抗体与包被抗原的结合力减弱,从而提高检测的灵敏度[17]

3.2胶体金纳米颗粒的表征

胶体金纳米颗粒的粒径大小与胶体金探针稳定性密切相关。用紫外-可见分光光度计可以测出胶

体金纳米颗粒的最大吸收波长。从图3a 可见,

合成的不同批次的胶体金其最大吸引波长几乎没有变化,即λmax 均为520nm 。从透射电子显微镜(TEM )照片(图3b )可见,胶体金的平均粒径为18nm ,符合

胶体金免疫层析法中胶体金颗粒粒径大小的要求。3.3

免疫层析试剂条检测三聚氰胺的检出限

配制浓度为0,

0.1,1,10,100和1000μg /L 三聚氰胺标准溶液。取100μL 标准溶液于样品垫中,10min 后观察结果(图4)。随着三聚氰胺的浓度升高,在C 线区胶体金颜色(红色)强度较大,并且无明显变化,但在T 线区胶体金颜色(红色)强度逐渐降低,在1μg /L 时T 线颜色明显变浅,而在10μg /L 时T 线颜色基本消失。若将T 线颜色基本(或完全)消失所对应的浓度定义为胶体金免疫层析法的检出限,则可判定本研究所制备的三聚氰胺试纸条的检出限为10μg /L ,远低于国家所制订的

7

201第7期李淑群等:胶体金免疫层析法快速检测牛奶、奶粉、饲料中的三聚氰胺

图3不同批次胶体金紫外-可见扫描图谱(a ),胶体金的透射电镜图(b )

Fig.3

UV-Vis spectra of different batches of colloidal gold (a ),image of colloidal gold under TEM (b )

三聚氰胺的限量值,也低于文献[14,15]报道的检出限,表明制备的三聚氰胺试纸条灵敏度高。

图4胶体金免疫层析试剂条检测不同浓度的三聚氰胺标准溶液

Fig.4

Colloidal gold immunochromatographic strips for

detecting melamine standard solutions

3.4免疫层析试剂条检测三聚氰胺的特异性选取了10种物质(CAAT 、三聚氰氯、三聚氰酸、环丙氨嗪、阿特拉津、盐酸克伦特罗、氯霉素、吡虫啉、林可霉素和左旋-18-甲基炔诺酮)进行特异性实验,前5种物质均含有三嗪类物质的分子骨架,为三聚氰胺的类似物。将这10种物质均配成浓度为1000μg /L 的溶液,并取100μL 溶液于样品垫中,

10min 后观察结果(图5)。从图5a 可见,1000μg /L CAAT 和环丙氨嗪可使T 线颜色基本(或完全)消失,即与10μg /L 三聚氰胺所产生的C 线颜色变浅(甚至消失)的效果相当,因此CAAT 和环丙氨嗪与三聚氰胺试纸条的交叉反应率(CR )约为1%。从

图5还可见,1.0μg /L 其它8种物质用三聚氰胺试

纸条检测,T 线颜色与C 线颜色基本相近,表明其它8种物质与三聚氰胺试纸条均无交叉反应,说明制

备的三聚氰胺试纸条不仅灵敏度高,而且特异性强

图5胶体金免疫层析试剂条检测浓度均为1000μg /L 的10种物质。从左至右依次为CAAT 、三聚氰氯、三聚氰酸、环丙氨嗪、阿特拉津(a ),盐酸克伦特罗、氯霉素、吡虫啉、林可霉素和左旋-18-甲基炔诺酮(b )Fig.5

Colloidal gold immunochromatographic strips for detecting 10different compounds at the same concentration

of 1000μg /L.From left to right are 2-chloro-4,6-diamino-1,3,5-triazine (CAAT ),cyanuric chloride ,cyanuric acid ,cyromazine and atrazine (a ),clenbuterol ,chloramphenicol ,imidacloprid ,lincomycin and levonorgestrel (b )

3.5

加标样品的检测

对牛奶样1,牛奶样2、奶粉、鸡饲料和猪饲料进行了加标回收实验。牛奶样品的加标浓度为0.5,

2.0和4.0mg /L ,奶粉和饲料的加标浓度为0.5,2.0和4.0μg /g 。加标样品预处理后,稀释200倍,使样品稀

8201分析化学第41卷

表1胶体金免疫层析法和酶联免疫吸附分析检测加标样品中三聚氰胺的结果(n =3)

Table 1Comparison of ELISA and immunochromatographic assay for mela-mine determination in spiked samples (n =3)

样品Sample 加标浓度Spiked (μg /L )ELISA 测定浓度Found by ELISA

(μg /L )

试剂条检测结果*Found by strips

(n =3)

奶样1Milk 1

奶样2

Milk 2奶粉

Milk powder

鸡饲料Chicken feed

猪饲料Pig feed

2.52.48---108.97???2020.27+++2.52.51---1010.13??+2018.13+++2.52.29---1010.04???2019.72+++2.52.28---109.90???2022.06+++2.52.47---109.39???20

19.02

+++

*:“-”阴性,三聚氰胺的浓度在10μg /L 以下;“?”弱阳性,三聚氰胺的浓度在10μg /L 附近;“+”阳性,三聚氰胺浓度大于10μg /L

*:“-”negative ,

concentration of melamine was less than 10μg /L ;“?”posi-tive /negative ,concentration of melamine was around 10μg /L

;“+”positive ,concen-tration of melamine was more than 10μg /L.

释后的最终浓度为2.5,

10和20μg /L 。取100μL 样品液加入样品中,10min 后观察结果。样品稀释液同时用酶联

免疫吸附分析法(ELISA )进行检测。表1为两种方法对加标样品的测定结

果。从表1可见,试剂条的检测结果与ELISA 的检测结果相一致。3.6

免疫层析试剂条的稳定性

将所制备的试剂条装入充有氮气

和放有干燥剂的小袋中,

4?密封保存150d ,检测0μg /L 浓度的三聚氰胺,结

果T 线的颜色与当天做的试剂条T 线的颜色一致,

表明试剂条稳定性良好。本研究合成了两种三聚氰胺衍生

物,分别用于制备免疫原和包被抗原,并利用杂交瘤抗体制备技术得到抗三聚氰胺的单克隆抗体,建立了灵敏度、特异性强、简单、快速的测定三聚氰胺的胶体金免疫层析法,可用于食品和饲料中三聚氰胺的快速检测。

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A Colloidal Gold Immunochromatographic Assay for Rapid

Detection of Melamine in Milk,Milk Powder and Animal Feeds

LI Shu-Qun,CAO Bi-Yun,CHANG Hua-Fang,DENG An-Ping*

(College of Chemistry,Chemical Engineering and Materials Science,Soochow University,Suzhou215123,China)

Abstract A colloidal gold immunochromatographic strip for rapid detection of melamine in milk,milk powder and animal feeds was presented.The molecular structure of melamine was rationally modified.Two melamine derivatives were synthesized and coupled to bovine serum albumin(BSA)and ovalbumin(OVA)for the production of immunogen and coating antigen.Monoclonal antibody(mAb)against melamine was produced by hybridoma technology.Colloidal gold nanoparticles with the average particle diameter of18nm were linked with mAb to form the Au-mAb conjugate.The formed Au-mAb was coated on glass fiber;while the coating antigen and goat anti-mouse IgG were separately sprayed onto the nitrocellulose(NC)membrane as the test (T)line and the control(C)line.The Au-mAb pad,NC membrane,sample pad and absorptive paper were assembled into an immunochromatographic strip.Standard(or sample)solution was added to the sample pad.After10min,the colloidal gold color(red)was visually observed at C line and T line,and the content of the melamine was evaluated by comparing the intensity of the color on these two lines.The results demonstrated that the limit of detection(LOD)of the melamine was10μg/L.Ten compounds were selected for specificity testing.The cross-reactivity(CR)of the immunochromatographic strip with2-chloro-4,6-diamino-1,3,5-triazine(CAAT)and cyromazine was about1%,and there was no CR of the strip with other eight compounds.The samples spiked with melamine at different concentrations were detected by immunochromatographic assay and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)simultaneously.The results obtained by these two methods were in a good agreement.The proposed immunochromatographic assay can be utilized as a promising tool for rapid detection of melamine in milk,milk powder and feed samples.Keywords Melamine;Monoclonal antibody;Colloidal gold;Immunochromatographic assay

(Received26September2012;accepted22January2013)櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫

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书号:9787122162953定价:88.0元

开本:16出版日期:2013年6月,化学工业出版社出版

胶体金免疫层析试纸条在临床诊断中的 研究进展

Hans Journal of Nanotechnology纳米技术, 2019, 9(2), 55-59 Published Online May 2019 in Hans. https://www.sodocs.net/doc/6a12448204.html,/journal/nat https://https://www.sodocs.net/doc/6a12448204.html,/10.12677/nat.2019.92006 Colloidal Gold Immunochromatography Strip Technique and Its Application in Clinical Diagnosis Ping Meng Laboratory of Nephrology, Huadu District People’s Hospital of Guangzhou, Huadu Hospital of Southern Medical University, Guangzhou Guangdong Received: Apr. 9th, 2019; accepted: Apr. 23rd, 2019; published: May 6th, 2019 Abstract Colloidal gold immunochromatography strip (CGIS) is a new immunoassay technique in clinic. It combines the visualization of colloidal gold technique and the specificity of immunochromatography. It has been extensively applied in clinic, laboratory and family with its excellent features at present. It has good prospects for development especially in infectious diseases and autoimmune diseases. This paper will introduce and summarize the development of CGIS technique in the disease diagno-sis. Research and development of CGIS will be in the direction of more sensitive specificity and mul-tiplexed detection in the future. Keywords Colloidal, Colloidal Gold Immunochromatography Strip, Disease Diagnosis 胶体金免疫层析试纸条在临床诊断中的 研究进展 孟萍 南方医科大学附属花都医院,广州市花都区人民医院肾病实验室,广东广州 收稿日期:2019年4月9日;录用日期:2019年4月23日;发布日期:2019年5月6日 摘要 胶体金免疫层析试纸条技术(colloidal gold immunochromatography strip, CGIS)作为近年来临床上兴

人绒毛膜促性腺激素(HCG)检测试纸(胶体金免疫层析法)产品技术要求jinwofu

人绒毛膜促性腺激素(HCG)检测试纸(胶体金免疫层析法) 适用范围:用于体外定性检测人尿液中人绒毛膜促性腺激素(HCG)的含量。1.1 产品型号/规格:笔型/卡型/条型。完整最小包装规格1人份。 1.2 主要组成成分:本品系由包被有抗HCG单克隆抗体及抗鼠IgG的固相硝酸纤维膜和 胶体金标记的抗HCG单克隆抗体包被的玻璃纤维膜、样本垫及吸水纸组成。2.1 物理性状 2.1.1 外观:检测HCG试纸应整洁完整、无毛刺、无破损、无污染;材料附着牢固。 2.1.2 宽度:检测HCG试纸的宽度应≥2.5mm。 2.1.3 移行速度:液体移动速度应不低于10 mm/min。 2.2 最低检测限 用HCG国家标准品进行检测,应不高于25 mIU/ml。 2.3 特异性: 2.3.1 阴性特异性:分别用含500 mIU/ml人促黄体生成素(hLH)、1000 mIU/ml 人卵泡刺激素(hFSH)和1000 μIU/ml人促甲状腺素(hTSH)的0 mIU/ml人绒毛促性腺激素(HCG)液进行检测,结果应均为阴性。 2.3.2 阳性特异性:分别用含500 mIU/ml hLH、1000 mIU/ml hFSH 和1000 μIU/ml hTSH的25 mIU/ml HCG液中进行检测,结果应均为阳性。 2.4 重复性 取同一批号的HCG试纸10支,以浓度为25 mIU/ml的HCG液测定,反应结果一致,显色度均一。

2.5 批间差 取3个批号的HCG试纸,对重复性进行检测,3个批号HCG试纸的检测结果都应符合2.4项的要求。 2.6 稳定性 试剂盒4~30℃避光保存,有效期为24个月,对到效期后的试剂盒,分别检测2.1~2.4项,结果应符合各项的要求。

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