Ion torrent 文库构建流程 线粒体DNA PCR建库

基因工程基本过程

基因工程基本过程 基因工程（genetic engineering），也叫基因操作、遗传工程，或重组体DNA 技术。它是一项将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的活性细胞中，并使之无性繁殖（称之为"克隆"）和行使正常功能（称之为"表达"），从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。一般说来，基因工程是专指用生物化学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的DNA片段）与载体系统（病毒、细菌质粒或噬菌体）的DNA 结合成一个复制子。这样形成的杂合分子可以在复制子所在的宿主生物或细胞中复制，继而通过转化或转染宿主细胞、生长和筛选转化子，无性繁殖使之成为克隆。然后直接利用转化子，或者将克隆的分子自转化子分离后再导入适当的表达体系，使重组基因在细胞内表达，产生特定的基因产物。 常用的工具酶 限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。 主要过程有为四步： 一．获得目的基因 有多种方法可获得目得基因 1.构建cDNA文库分离目的基因 过程： （1）从真核细胞中提取mRNA，以其为模板，在反转录酶的作用下合成cDNA的第一条链。 （2）以第一条链为模板，以反转录酶或DNA聚合酶Ｉ作用下合成cDNA的第二条链。 （3）在甲基化酶作用下使cDNA甲基化。

（4）接头或衔接子连接。 （5）凝胶过滤分离cDNA。 （6）通过核酸探针法或免疫反应法从cDNA文库中分离特异cDNA克隆。 2.人工化学合成法 适于已知的核苷酸序列且校小的ＤＮＡ片断合成，常用方法有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法、自动化合成法等。 过程：先用以上方法合成基因DNA不同部位的两条链的寡核苷短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段。然后将这些DNA片段按正确的次序进行退火连接起来形较长的ＤＮＡ片段，再用连接酶连接成完整的基因。 3.利用PCR技术直接扩增目的基因 PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物，类似于DNA的天然复制过程，用ＰＣＲ法进行扩增，特异地合成目的cDNA链，用于重组、克隆。 二．载体的选择与制备 1.载体的选择（以质粒为例） ⑴载体必须是复制子。 ⑵具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。 ⑶具备多克隆位点（MCS），便于外源基因插入。 ⑷自身分子量较小，拷贝数高。 ⑸在宿主细胞内稳定性高。 (6)应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别 (7)应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。 (8)应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因，且所产生的mRNA较为稳定。 (9)所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号。 2.制备有多种分离质粒的方法，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。 目前一般使用碱变性法制备质粒DNA。这个方法主要包括培养收集细菌菌体，裂解细胞，将质粒DNA与染色体DNA分开及除去蛋白质和RNA。

基因工程及其应用教学设计

第2节基因工程及其应用 孝义三中高一生物组张文 一、教材内容分析 基因工程是现代四大生物工程之一。《基因工程及其应用》是人教版高中生物必修2第6章第2节内容。本节内容主要包括三个方面，分两课时讲授。第1课时简要介绍“基因工程的原理”，第2课时介绍“基因工程的应用”及“转基因生物和转基因食品安全性”。本节内容是对前面所学育种内容的补充，是即贴近生活又远离生活的微观内容。由于在选修3中还有基因工程的介绍，因此本节的要求相对简单一些。 二、学情分析 对于基因操作的工具和基本步骤，内容抽象和复杂，学生接触少，会出现掌握不好，甚至理解错误的情况。虽然经过必修1的学习，学生的生物基础知识较扎实，思维的目的性、连续性和逻辑性已初步建立。但基因工程一节对学生来说难点较多，如果处理不好，会变成简单的死记硬背。因此在教学过程中，尽量通过生活化打比喻的方式和模型建构活动及采用多媒体动画形象化教学，并在教师引导下适时加强学生解决问题和运用图解等生物学语言归纳结论等方面的能力。切记不可讲的太多。 三、教学目标 1、简述基因工程的基本概念； 2、简述基因工程的基本工具； 3、简述基因工程的基本操作步骤； 4、通过基因工程的简介，鼓励学生积极探索新知和科学创新，树立一分为二的辩证唯物主义思想； 四、教学重点、难点分析 教学重点：基因工程的基本原理（概念、工具、操作步骤） 教学难点：基因工程的基本原理 五、教学思路 本节课主要解决如下几个问题：1）什么是基因工程？2）基因工程的主要原理是什么？3）基因工程的操作过程如何？4）基因工程有哪些方面的应用？如何看待转基因食品？由于本节内容和前面的育种内容联系比较紧密，因此可以让学生回顾前面几种育种方法的成果，再通过情景展现传统育种方法所不能达到的地方，进而引出基因工程，通过列举生活中的转基因成果让学生知道基因工程就在我们身边。而后通过与学生们所熟知的器官移植做对比，让学生理解基因工程的本质和操作过程。通过对转基因食品的讨论让学生树立辩证唯物主义观念。 六．教学策略及教学媒体 根据激趣原则，通过展示色彩绚丽的转基因生物图片入手，引出基因工程的概念，采取“引导—互动—探究”模式，即采用师生互动探究式教学，借助老师生活化打比喻和多媒体动画并安排学生制作模型活动从而使抽象的课程内容具体化，直观化和形象化。 七、教学设计流程图第1课时“基因工程的原理”

基因工程主要内容及流程

基因工程制药 姓名：惠霞 学号：2011506024 班级：2011级生技1 班

基因工程制药 一．基因工程制药常用的工具酶： 基因工程的重要特点之—是在体外实行DNA分子的切割和重新连接。例如要取得所需药物之目的基因并要将此特定目的基因与载体DNA连接在—起，在很大程度上要依赖于某些工具酶。 (一) 限制酶(Restriction enzymes) 限制酶即限制性核酸切酶的简称，是一类专一性很强的核酸切酶。与一般的DNA水解酶不同之处在于它们对碱基作用的专一性上及对磷酸二酯键的断裂方式上具有一些特殊的性质。限制酶的种类 Ⅰ型酶：早期提取的酶类，是一类复杂的多功能酶，在基因工程上的应用价值不大。 Ⅱ型酶：相对分子质量较小，为20000～100000，是简单的单功能酶，作用时无需辅助因子或只需Mg2＋。能识别双链DNA上特异的核苷酸序列，底物作用的专一性强，而且其识别序列与切断序列相一致。这类酶对基因工程中的生化操作特别重要。 (二) DNA聚合酶(DNA polymerase) DNA聚合酶是能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤的一类酶，这类酶作用时大多数需要DNA模板并且优先作用于DNA模板，也可作用于RNA模板，但效率较低。 1．大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 2. 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片断Klenow 片断 3. T4噬菌体DNA聚合酶 4. 经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶（测序酶） 5. T aqDNA聚合酶及AmpiTaqTMDNA聚合酶 6. 反转录酶

（三）DNA连接酶（DNA ligase）：能将两段DNA拼接起来的酶。 1. T4噬菌体DNA连接酶：催化DNA的5'羟基之间形成磷酸二酯键。 2. 大肠杆菌DNA连接酶：用途较窄，不常用。 （四）基因工程中常用的其他酶 1. 末端脱氧核苷酸转移酶（末端转移酶或TDT酶） 2. T4噬菌体多核苷酸酶 3. 核酸酶（Nuclease） 4. 碱性磷酸酯酶（Alkaline phosphodiesterase）：能催化去除单链或双链DNA和RNA 分子中的5' 磷酸基（脱磷酸作用）。分为细菌碱性磷酸酯酶（BAP），牛小肠碱性磷酸酯酶（CIP）。 二．基因工程制药中常用的克隆载体 载体：能在细胞进行自我复制的DNA分子就是外源DNA片段（基因）的运载体（Vector）,又可称为分子载体或无性繁殖载体。基因工程制药中常用的目的基因克隆载体主要有：质粒、λ噬菌体、M13噬菌体和粘粒。 （一）质粒 1.质粒（Plasmid）是一些存在于微生物细胞染色体外的闭合环状双链的小型DNA分子，是能进行独立复制并保持恒定遗传的辅助性遗传单位。 2 常用的几种质粒载体 （1）pBR322及其衍生载体 pBR322 最早构建成功的较理想载体，分子质量2.6×106u，4.36kb，属松弛型复制，含有两个抗性基因（Tetr和Ampr），已确定32个限制酶切割位点的相对位置。BamH I

DNA测序标准实验流程(V1.3版)

DNA测序标准实验流程（V1.2版）1．对DNA的要求 纯度：OD 260 / OD 280 = 1.6 ~ 2.0， PCR产物用量：每反应15 -20ng（片段大于3KB可加两倍DNA）。 质粒DNA用量：每反应20 -25ng（插入片段大于3KB质粒要加两倍DNA）。 1300载体本身序列就比较长，我们建议每反应加50-80ng。 每个小组一次配100份BD MIX(BD 0.4ul,5*buffer 1.8ul,water 2.8ul)长期保存，每个反应体系加5ul 2．P CR产物的测序PCR反应（测序PCR反应中只要加一个引物就可以，需要加热盖） 标准反应体系： 10ul体系 试剂用量 纯化的P CR产物(15-20 ng / μL) 1 μL （片段大于3KB可加两倍DNA） 引物(2 pmol / μL) 1 μL BigDye (2.5 x) 0.4 μL BigDye Seq Buffer (5 x) 1.8μL 灭菌去离子水 5.8μL 96 °C 1 min → (96 °C 10 sec → 50 °C 5 sec → 60 °C 2 min) x 25个循环→ 4 °C保温 质粒DNA的测序PCR反应 标准反应体系： 10ul体系 试剂用量 质粒DNA (20-25 ng / μL) 1 μL （插入片段大于3KB质粒要加两倍DNA） 引物(2 pmol / μL) 1 μL BigDye (2.5 x) 0.4 μL BigDye Seq Buffer (5 x) 1.8 μL 灭菌去离子水 5.8 μL 96 °C 1 min → (96 °C 10 sec → 50 °C 5 sec → 60 °C 2 min) x 25个循环→ 4 °C保温 注意：BigDye (2.5 x)是一种含有DNA聚合酶和荧光物质的混合物，非常昂贵，平时都放在-20度保存。加之前拿出来放在冰上融化，用完马上放回-20冰箱。BigDye (2.5 x)和BigDye Seq Buffer (5 x)可以混合后一起加到反应体系，有多的话可以放在-20冰箱，下次还能使用。 BIGDYE尽量避光，一般用铝珀纸遮盖。P CR样品处理过程中如在室温放置和酒精挥发阶段都尽量用铝珀纸遮盖或者放入抽屉，有利于样品的稳定性。 3．测序产物纯化 单个0.2 mL离心管离心方法： 1. 每孔加入1μL 7.5M NH3Ac，26μL 100%酒精，盖好，震荡4次。（酒精和NH3Ac先混合好，而且要比样品数多预算几个） 2. 台式离心机12000 x g 4°C离心20 min，马上用枪吸尽上清液。(DNA很微量，基本看不到，所以枪头不要碰到DNA沉积处) 3. 每孔加入100μL 75% 酒精，12000 x g 4°C离心10 min，马上用枪吸尽上清液。（如果不是马上操作，DNA沉淀很可能 浮起，被吸走，所以如果没有及时吸去上清的话，要重新离心5MINS。） 4. 让酒精在室温避光（抽屉）挥发干净(至少20mins)，加入10 μL Hi-Di Formamide溶解DNA。 5. 在PCR仪上变性：95 °C 4 min，4 °C 4 min。上机测序。 96孔板整板离心方法： 1. 每孔加入1μL 7.5M NH3Ac，26μL 100%酒精，盖好，震荡4次。（酒精和NH3Ac先混合好，而且要比样品数多预算几个） 2. 板式离心机4000 x rpm 4°C离心30min；马上倒置96孔板，弃上清，倒置在洗水纸上，离心500rpm，1mins。 3. 加100μL 75% 酒精，4000 rpm 4°C离心20 min；马上倒置96孔板，弃上清，离心500rpm,1mins。 4.让酒精在室温避光（抽屉）挥发干净（至少15mins），加入10 μL Hi-Di For mamide溶解DNA。 5. 在PCR仪上变性：95 °C 4 min，4 °C 4 min。上机测序。 4. 部分相关试剂 酒精：100%酒精使用国产分析纯；75%酒精用去离子水配制。 BigDye (2.5 x) -20度保存 BigDye Seq Buffer (5 x) 4度保存 7.5M NH3Ac 4度保存 Hi-Di For mamide -20度保存 黄方亮 2009.10.27日整理

转基因基本步骤

第一步：目的基因的获取 1.目的基因是指：编码蛋白质的结构基因。 2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。 3.PCR技术扩增目的基因 （1）原理：DNA双链复制 （2）过程： 第一步：加热至90～95℃DNA解链； 第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链； 第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。 第二步：基因表达载体的构建 1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。 2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因 （1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。 （2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。 （3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。 第三步：将目的基因导入受体细胞_ 1. 转化的概念： 是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 2.常用的转化方法： 将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。 将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术。此方法的受体细胞多是受精卵。 将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，最常用的原核细胞是大肠杆菌，其转化方法是：先用Ca2+ 处理细胞，使其成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。 3.重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。 第四步：目的基因的检测和表达 1.首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA

基因组重测序分析流程-代码文件

差异位点分析流程步骤分解 数据准备： mkdir 1.QC cd 1.QC ln -s /root/mdna-data/reseq/1.QC/*.fastq . Ls cd .. mkdir 2.mapping cd 2.mapping ln -s /root/mdna-data/reseq/2.mapping/ref.fasta . 步骤1：参考基因建索引 cd 2.mapping ##bwa建索引： bwa index ref.fasta Expected Result：得到一系列BWA 进行alignment 需要的文件。 ##samtools建索引： samtools faidx ref.fasta Expected Result：生成refgene.fasta.fai。每行都是fasta 文件中每条contig 的record，每条record 由contig name, size, location, basesPerLine 和bytesPerLine 组成。 ##生成字典： java -jar /root/mdna_software/picard-tools-1.102/CreateSequenceDictionary.jar R=ref.fasta O=ref.dict Expected Result：生成refgene.dict。描述fasta 文件内容，类似SAM header 格式。 步骤2：bwa比对 ##用bwa作比对： nohup bwa aln -e 3 -i 10 -t 1 -R 100 -q 20 ref.fasta ../1.QC/test_trim1.fastq -f 1.sai & nohup bwa aln -e 3 -i 10 -t 1 -R 100 -q 20 ref.fasta ../1.QC/test_trim2.fastq -f 2.sai & nohup bwa aln -e 3 -i 10 -t 1 -R 100 -q 20 ref.fasta ../1.QC/test_trim_unpaired.fastq -f s.sai & jobs

基因工程的基本过程

基因工程的基本过程 基因工程主要包括几个过程： 1、目的基因的制备； 2、选择合适的载体，将目的基因与载体相连接生成重组DNA分子； 3、将重组DNA片段导入受体； 4、选择目的基因； 5、目的基因的表达。 对于整个基因过程来讲，目的基因的获取是关键，它直接涉及到产物，而且还影响到产物的量。很多在基因操作过程中，目的基因是很难获得的，所以通常采取先生成基因文库的方法，然后从基因文库中筛选。如果目的基因的序列以及它的调控等信息很清楚，可以直接通过PCR或cDNA获取，这样就大大减少了选择目的基因的盲目性，可以将整个过程简化为以下步骤： 图10-3-8 基因工程过程

(1)目的基因的分离和制备 目的基因是指准备导入受体细胞内的，以研究或应用为目的所需要的外源基因称目的基因。获得目的基因的方法很多，但也是十分困难的一步。目前获得目的基因有4条途径： 1.从生物基因组群体中分离目的基因 原核生物基因组较小，基因容易定位，用限制性内切酶将基因组切成若干段后，用带有标记的核酸探针，从中选出目的基因。真核生物一般通过基因组文库的方法获得目的基因。 图10-3-1 限制性内切酶

限制性内切酶(restrictive enzyme)是20世纪60年代末在细菌中发现的，能水解DNA分子骨架的磷酸二酯键，使一个完整的DNA分子切成若干段，每一种限制酶，都有自己特定的作用位点，而且切口或切下来的序列，往往是回文结构（palindromes）。例如Eco RI把GAATTC在GA之间切开，形成粘性末端。也有一些限制酶作用的结果产生不含粘性末端的平整末端，如HapI。多在原核生物中存在，能识别4～6个特苷酸特定的碱基序列。限制酶对细菌有保护作用，某些入侵的噬菌体可因DNA链被限制性酶切断而不能在细菌中繁殖，“限制”因此而得名。限制酶不能切开细菌本身的DNA，这是因为细菌DNA的腺嘌呤和胞嘧啶甲基化（-CH3）而受到保护之故。 这样就可以用限制性内切酶把一个基因组DNA分成很多片段，对于原核生物比较小的基因组来说，可以直接用标记地探针来获取在通过特定的方法，对于比较大的基因组，可以先制作基因文库，然后钓取所需要的带有目的基因的片段。 2.人工合成目的基因DNA片段 人工合成目的基因DNA片段有化学合成和酶促合成法两条途径。一般是采用DNA合成仪来合成长度不是很大的DNA片段。 3.PCR反应合成DNA 聚合酶链式反应（PCR)是以DNA变性、复制的某些特性为原理设计的。通过PCR技术获取所需要的特异DNA片段在实际应用用得非常多，但是前提条件是必须对目的基因有一定的了解，需要设计引物。PCR技术的原理如下：

基因工程的基本操作程序教案

一、教材分析 《基因工程的基本操作程序》是专题1《基因工程》的第二节，也是《基因工程》的核心，上承《DNA重组技术的基本工具》，下接《基因工程的应用》。本节课主要介绍了基因工程的基本操作程序的四个步骤，教学内容多，难点多，最好化整为零、各个击破。 二、教学目标 1．知识目标： 简述基因工程原理及基本操作程序。 2．能力目标： 尝试设计某一转基因生物的研制过程。 3．情感、态度和价值观目标： （1）关注基因工程的发展。 （2）认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。 三、教学重点和难点 1、教学重点 基因工程基本操作程序的四个步骤。 2、教学难点 （1）从基因文库中获取目的基因 （2）利用PCR技术扩增目的基因 四、学情分析 本节课内容较多，难点较多，学生学习起来有一定困难，所以之前应该要求学生做好预习，尽量采用化整为零、各个击破的教学策略。 五、教学方法 1、学案导学：见学案。 2、新授课教学基本环节：预习检查、总结疑惑→情境导入、展示目标→合作探究、精讲点拨→反思总结、当堂检测→发导学案、布置预习 六、课前准备 1．学生的学习准备：预习《基因工程的基本操作程序》，初步把握基因工程原理及基本操作程序。 2．教师的教学准备：多媒体课件制作，课前预习学案，课内探究学案，课后延伸拓展学案。 七、课时安排：2课时 八、教学过程 （一）预习检查、总结疑惑 检查学生落实预习的情况并了解学生的疑惑，使教学具有针对性。 （二）情境导入、展示目标 教师首先提问： （1）什么是基因工程？（基因工程的概念） （2）DNA重组技术的基本工具有哪些？（限制酶、DNA连接酶、载体） （3）运载体需要具备哪些条件？（有一个或多个限制酶切割位点；有标记基因；能在受体细胞中稳定存在并自我复制或者整合到受体细胞染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制） 上节课我们学习了DNA重组技术的基本工具，本节课我们将继续学习《基因工程》的核心内容——基因工程的基本操作程序。我们来看本节课的学习目标。（多媒体展示学习目标，强调重难点） （三）合作探究、精讲点拨

基因组DNA测序文库构建

基因组DNA测序文库构建 1.对收到的DNA样品进行检测，取2-3ul样品，用1%的琼脂糖胶检测，对于纯度不够（含 RNA或蛋白）的DNA样品需要柱纯化后重新检测。 对于细菌基因组需要扩增16S全长序列，进行验证。 对于噬菌体或者质粒样品，若用16S全长引物扩增，无目的条带则无细菌基因组污染，若出现目的条带则存在污染，需要去除后建库。 2.用Qubit检测DNA样品浓度。 3.吸取部分DNA样品，用TE或Elution Buffer稀释，终浓度在10ng/ul-30ng/ul之间， 体积为130ul。用Covaris破碎，破碎时请根据需要片段大小，按标准操作流程操作。 4.样品足够多的情况下，可以取适量破碎后的产物进行PAGE胶或者琼脂糖胶检测。 5.对破碎后的产物进行柱式法（5倍体积的B3+100-200ul异丙醇）浓缩回收，加入50-100ul TE或Elution Buffer洗脱。回收产物用Qubit测值。 6.修平和磷酸化 100ul体系

DNA 1ug 5 X T4 polymerase buffer 20ul BSA (5mg/ml) 2ul ATP (100mm) 1ul dNTP（10mm）10ul T4 DNA Polymerase (5U/ul) 1ul Klenow（10U/ul）1ul T4 PNK (10U/ ul) 1.5ul 22°C反应20min，柱式法纯化,50-100ul TE洗脱。纯化后Qubit测值。 7.加‘A’ 100ul体系 DNA 0.5-2.5ug 10 X klenow buffer 10ul dATP(10mm) 1-3ul Klenow(exon-)（5U/ul）1-3ul 37°反应20min，柱式法纯化，50-100ul TE洗脱。纯化后Qubit测值。 8.连接头 200ul体系 10 X T4 DNA ligase buffer 20ul PEG4000 30ul ATP(100mm) 2ul DNA X 接头 Y T4 DNA ligase 1.5-2ul 加水至 200ul DNA与接头的摩尔比约在1:3至1:10之间。 9.连接产物用柱式法纯化后，跑琼脂糖胶切割目的区域回收。 10.PCR扩增 10 X TagE buffer 5ul Mg2+ 4ul dNTP(10mm) 1ul lib-PCR-F 0.5ul

二代测序流程

Illumina测序的化学原理 目前我们接触到的很多生物信息学的技术，都是基于NGS技术的，比如RNA-Seq，ChIP-Seq，FAIRE-Seq，ChIA-PET，Hi-C等等。所谓的NGS就是Next Generation Sequencing，翻译为“下一代测序技术”，或者是“第二代测序技术”。之所以这么叫，是因为相比较于第一代测序技术其测序通量有了很大的提升 一些常用的基本概念介绍： flowcell：是指Illumina测序时，测序反应发生的位置，1个flowcell含有8条lane lane：每一个flowcell上都有8条泳道，用于测序反应，可以添加试剂，洗脱等等tail：每一次测序荧光扫描的最小单位 reads：指测序的结果，1条序列一般称为1条reads bp：base pair 碱基对，用于衡量序列长度 双端测序：是指一条序列可能比较长，如500bp，我们可以两端各测150bp junction：在进行双端测序时，中间会留有200bp测不到的东西，我们称其为junction adapter：就是在测序时需要的一段特定的序列，有类似于引物的功能 primer：PCR中的引物 测序反应基本流程介绍： 1、建库 A、将基因组DNA用超声波打断（由于Illumina测序策略本身的问题，导致其测序长度不可能太长，目前最好的X Ten测序仪也就只能双端各测150bp，所以不可能直接拿整个基因组去测序，因此在测序的时候就需要先将其打断成一定长度的片段，这个根据需要使用不同的策略，一般测人的基因组，我们是先将其打断成300-500bp长度的片段，这个是根据跑胶控制的） B、打断以后会出现末端不平整的情况，用酶补平，所以现在的序列是平末端 C、完成补平以后，在3'端使用酶加上一个特异的碱基A D、加上A之后就可以利用互补配对的原则，添加adapter，这个adpater可以分成两个部分，一部分是测序的时候需要使用的引物序列，另一部分是建库扩增时候需要用到的引物序列 E、进行PCR扩增，使得DNA样品浓度能够满足上机要求 建库示意图如下：

一代测序规范操作规范

P C R产物测序实验操作流程一、实验试剂和耗材准备 （一）实验试剂 （二）、实验耗材

二、实验仪器 三、实验操作具体步骤 （一）核酸的提取 按照DNA或RNA提取试剂盒操作（具体操作步骤参考试剂盒操作说明书），如是RNA需进一步反转录为cDNA。-20℃保存备用。 （二）测序PCR模板的制备 （1）、预先制备适量冰 （2）、在冰上融化模板DNA、引物以及Extender PCR-to-Gel Master Mix （3）、按照以下反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上 （4）将反应体系放入PCR仪，执行以下反应程序 95℃5min→

（95℃ 30sec，67℃ 30sec -0.5 ℃/循环，72℃ 1min）x14循环→ （95℃ 30sec，57℃ 30sec，72℃ 1min）x 30循环→ 72℃ 7min→4℃ Forever （5）琼脂糖凝胶电泳检测:量取适量1×TBE缓冲液并称取一定量琼脂粉溶于其中制成1%-2%的琼脂糖凝胶，在微波炉上加热溶化，待温度降至60℃-70℃左右加入荧光染料，温度降至40℃-50℃左右将琼脂粉溶液倒入插有梳子的凝胶槽中冷却，待凝胶完全凝固备用。将凝胶置于水平电泳槽中，取少量PCR产物上样电泳，将电泳好的样品置于凝胶成像系统中进行检测和分析。 （6）将检测合格的PCR产物用酶解法进行纯化。根据核酸外切酶I (Exo I)，碱性磷酸酶(AIP)的作用浓度，加入到PCR反应产物中，37℃消化15min，85℃使酶失活15min。纯化体系如下： （三）、纯化后的PCR产物的测序反应 1、纯化后的PCR产物按照1:3~1:6稀释（若琼脂糖凝胶电泳条带非常亮，可以适当增大稀释倍数） 2、测序反应用引物稀释到1μM （1）PCR产物测序反应体系（10μl）： PCR产物测序体系中PCR产物的加入量如下表： DNA纯度：OD260/OD280=1.6~1.8；DNA含量（ng/μl）=OD260×50

基因工程的基本操作步骤

水寨中学生物自主探究学案 内容：基因工程的基本操作程序课时：2课时年级：高二编号64 一、教学目标 1．知识目标： 了解基因工程原理及基本操作程序。 2．能力目标： 尝试设计某一转基因生物的研制过程。 3．情感、态度和价值观目标： （1）了解基因工程的发展。 （2）认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。 二、教学重点和难点 1、教学重点 基因工程基本操作程序的四个步骤。 2、教学难点 （1）从基因文库中获取目的基因 （2）利用PCR技术扩增目的基因 第一课时 三、教学过程 （一）复习上节内容 1、什么是基因工程？DNA重组技术的基本工具有哪些？运载体需要具备哪些条件？ 以上问题可以不展示 （二）讲授新课 1、基因工程的基本步骤包括那四步？ 2、第一步：目的基因的获取 （１）为什么要有目的基因的获取这一步骤？ （２）目的基因的获取方法有哪些？ （3）为什么要建立基因文库？怎么建立的？

（4）如何从基因文库中获取目的基因？ （5）为什么要建立cDNA文库？如何获取cDNA？ （5）PCR技术的原理是什么？利用PCR技术扩增目的基因的前提是什么？ （6）如何获取引物？ （7）请你用文字和箭头描述PCR技术扩增的过程？ 3、第二步：基因表达载体的构建（基因工程的核心步骤） （1）在基因工程的操作过程中，为什么要构建基因表达载体？单独的DNA片段能不能稳定遗传？ （2）参考课本P11页图1—10基因表达载体模式图，在学案上绘出基因表达载体的模式图，并标出其组成部分。并了解什么是启动子、终止子？他们位于哪里？有什么作用？标记基因的作用是什么？

思考:1、作为基因工程的表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么 2、完成教材P11页的“寻根问底” 第二课时 4、第三步：将目的基因导入受体细胞 （1）为什么要把目的基因导入受体细胞而不是在外界培养让其维持稳定和表达？（2）什么是转化？ （3）将目的基因导入植物细胞的方法有哪些？最常用的方法是哪种？（结合示意图，了解农杆菌转化法的基本过程） （4）将目的基因导入动物细胞的基本操作程序是怎样的？要用到什么技术？ （5）早期的基因工程为什么选择原核生物作为受体细胞？大肠杆菌细胞最常用的转化方法是？

Sanger测序流程

Sanger测序 一、原理 Sanger法测序是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G 结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA 碱基序列。 ABI 3730XL测序仪是高质量的长片段读取和序列分析的测序平台，应用灵活而广泛，可同时分析96个样品。该仪器采用4色荧光同时检测，可不间断24小时运行，自动灌胶，上样，电泳分离，检测及数据分析。 二、技术路线 三、操作流程 1、DNA的提取 一般采用试剂盒提取（参考试剂盒提供的protocol）。 2、PCR扩增与电泳 ①配置PCR体系（25ul体系） DNA浓度大于30ng/ul（DNA浓度需要测定）: 试剂名称用量 H2O15.2μl 10*PCR buffer 2.5μl 2.5Mm dNTPs3μl primer（前后引物各1ul）2μl LA Taq酶0.3μl DNA模板2μl 注意: 对于CEBPA和NOTCH1此类GC含量高的将10*PCR buffer 2.5ul换为2*GC buffer 12.5ul, H2O 为5.2ul。

每次96孔板加样后都必须贴封口膜，离心混匀（2000g 1min）, 防止挂壁。EP管与96孔板等都为商品型一次性产品, 注意标记板号, 样本号和引物号。 ②设置PCR反应程序 一般程序：96℃预变性2min, 96℃30s, 57℃30s, 72℃2min, 35cycles; 72℃延伸5min; 4℃/15℃∞。CEBPA和NOTCH1程序：96℃预变性5min, 95℃40s, 64℃/66℃40s, 72℃1min, 35cycles; 72℃延伸5min; 4℃/15℃∞。 ③琼脂糖凝胶电泳 配置1.5%（60ml 0.9g, 大胶板150ml 2.25g）的琼脂糖凝胶, 再分别取2ul loading buffer与4ul DNA 扩增产物混合后进行电泳, 160V 35min。 3、PCR产物纯化 ①配制消化液 TaKaRa Alkaline Phosphatase 虾碱酶0.5μl TaKaRa Exonuclease I 外切酶0.5μl 配置消化液, 分别取虾碱酶与外切酶1:1混合。PCR产物离心后，每个孔中加入1μl以上消化液到PCR反应液中。 ②纯化反应：上PCR仪进行程序反应。 程序为SAP: 37℃60min, 80℃15min, 4℃/15℃∞。 4、测序反应 ①SEQ MIX配置 试剂：ABI PRISM? BigDye? Termina tor v3.1 cycle Sequencing Kit 根据PCR反应的数量按照下表配制MIX： 试剂名称用量 BigDye 0.4μl Sequencing Buffer 0.8μl H2O 1.8μl Primer（3.2pmol/μl）（引物可单加）1μl 模板（即3-②中的产物）1ul 按照测序反应表在96孔板中加入3μl以上MIX，1μl对应引物，1μl对应PCR产物（注意封膜后要求压膜）,离心。（测序反应只有一个引物，为避免加样过程中的液体消耗，体系需要超量配置）。 ②SEQ程序: 96℃预变性2min, 96℃10s, 55℃5s, 60℃90s, 25cycles; 4℃/15℃∞。 5、纯化 此步骤是将测序反应体系中除目标单链核酸片段之外的杂质尽可能去除, 以减少ABI 3730毛细管电泳时杂质对峰图质量的影响。 ①试剂准备：

基因工程主要内容及流程

基因工程制药 姓名：刘惠霞 学号：2011506024 班级：2011级生技1 班

基因工程制药 一．基因工程制药常用的工具酶： 基因工程的重要特点之—是在体外实行DNA分子的切割和重新连接。例如要取得所需药物之目的基因并要将此特定目的基因与载体DNA连接在—起，在很大程度上要依赖于某些工具酶。 (一) 限制酶(Restriction enzymes) 限制酶即限制性核酸内切酶的简称，是一类专一性很强的核酸内切酶。与一般的DNA水解酶不同之处在于它们对碱基作用的专一性上及对磷酸二酯键的断裂方式上具有一些特殊的性质。 限制酶的种类 Ⅰ型酶：早期提取的酶类，是一类复杂的多功能酶，在基因工程上的应用价值不大。 Ⅱ型酶：相对分子质量较小，为20000～100000，是简单的单功能酶，作用时无需辅助因子或只需Mg2＋。能识别双链DNA上特异的核苷酸序列，底物作用的专一性强，而且其识别序列与切断序列相一致。这类酶对基因工程中的生化操作特别重要。 (二) DNA聚合酶(DNA polymerase) DNA聚合酶是能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤的一类酶，这类酶作用时大多数需要DNA 模板并且优先作用于DNA模板，也可作用于RNA模板，但效率较低。 1．大肠杆菌 DNA聚合酶Ⅰ 2. 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片断Klenow 片断 3. T4噬菌体DNA聚合酶 4. 经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶（测序酶） 5. TaqDNA聚合酶及AmpiTaqTMDNA聚合酶 6. 反转录酶 （三）DNA连接酶（DNA ligase）：能将两段DNA拼接起来的酶。 1. T4噬菌体DNA连接酶：催化DNA的5'羟基之间形成磷酸二酯键。 2. 大肠杆菌DNA连接酶：用途较窄，不常用。 （四）基因工程中常用的其他酶 1. 末端脱氧核苷酸转移酶（末端转移酶或TDT酶） 2. T4噬菌体多核苷酸酶

一代测序规范流程

一代测序规范流程 Jenny was compiled in January 2021

P C R产物测序实验操作流程一、实验试剂和耗材准备 （一）实验试剂 （二）、实验耗材

二、实验仪器 三、实验操作具体步骤 （一）核酸的提取 按照DNA或RNA提取试剂盒操作（具体操作步骤参考试剂盒操作说明书），如是RNA需进一步反转录为cDNA。-20℃保存备用。 （二）测序PCR模板的制备 （1）、预先制备适量冰

（2）、在冰上融化模板DNA、引物以及Extender PCR-to-Gel Master Mix （3）、按照以下反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上 （4）将反应体系放入PCR仪，执行以下反应程序 95℃ 5min→ （95℃ 30sec，67℃ 30sec -0.5 ℃/循环，72℃ 1min）x14循环→（95℃ 30sec，57℃ 30sec，72℃ 1min）x 30循环→ 72℃ 7min→4℃ Forever （5）琼脂糖凝胶电泳检测:量取适量1×TBE缓冲液并称取一定量琼脂粉溶于其中制成1%-2%的琼脂糖凝胶，在微波炉上加热溶化，待温度降至60℃-70℃左右加入荧光染料，温度降至40℃-50℃左右将琼脂粉溶液倒入插有梳子的凝胶槽中冷却，待凝胶完全凝固备用。将凝胶置于水平电 泳槽中，取少量PCR产物上样电泳，将电泳好的样品置于凝胶成像系统 中进行检测和分析。 （6）将检测合格的PCR产物用酶解法进行纯化。根据核酸外切酶I (Exo I)，碱性磷酸酶(AIP)的作用浓度，加入到PCR反应产物中，37℃消化15min，85℃使酶失活15min。纯化体系如下：

一代测序规范流程

PCR产物测序实验操作流程一、实验试剂和耗材准备 （一）实验试剂 实验试剂主要用途 核酸提取试剂盒主要用于DNA或RNA的提取（详细步骤参考相应说明书） 上、下游引物PCR或测序反应 Extender PCR-to-Gel Master Mix，2×PCR ddH2O PCR、测序反应及其它用途核酸荧光染料(4s Green) 琼脂糖凝胶电泳 DNA Marker 琼脂糖凝胶电泳 TBE电泳缓冲液琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖琼脂糖凝胶电泳 核酸外切酶I (Exo I) PCR产物的纯化 碱性磷酸酶(ALP) PCR产物的纯化 经纯化后的PCR产物测序反应 BigDye v3.1 测序反应 100%酒精测序产物纯化 125mM EDTA（PH=8）测序产物纯化 70%酒精测序产物纯化 POP7胶上机测序过程（毛细管电泳） Hi-Di甲酰胺上机测序过程（毛细管电泳）毛细管电泳Buffer 上机测序过程（毛细管电泳）Sequence Standard（3500）测序标准品（阳性对照） （二）、实验耗材 实验耗材主要用途 1.5ml EP管各种试剂的分装、盛放、储存等 1.5mlEP管支架 1.5ml或2mlEP管的支撑或存放 0.2mlPCR管PCR 八连管及八连管盖PCR 96孔板PCR、测序反应及上机测序各种规格微量移液器微量试剂的定量和移取 各种规格移液器吸头配合移液器的使用（吸附试剂）96孔板支架固定和支撑96孔板、八连管以及PCR单管 96孔板封垫封板用 封板滚轮封板用 冰维持待反应试剂低温环境各种规格量筒溶液的稀释或试剂的配置 锥形瓶琼脂糖凝胶的熔化

容量瓶溶液的稀释与试剂的配置 药匙和称量纸试剂的称量 凝胶槽和凝胶梳琼脂糖凝胶的凝固和加样孔的形成计时器计时 记号笔做各种记号或标记 一次性手套防污染和保护作用 铝箔封96孔板 二、实验仪器 实验仪器主要用途 制冰机制冰 电冰箱试剂的储存 高速台式离心机试剂的离心 Mini式离心机瞬离试剂 旋涡式混合振荡器混匀试剂 电子分析天平试剂的称量 核酸检测仪核酸纯度和浓度的检测 PCR仪PCR 电泳仪和水平电泳槽琼脂糖凝胶电泳 凝胶成像仪核酸琼脂糖凝胶电泳的检测和分析 基因分析仪DNA的测序或片段分析蒸汽式高压湿热消毒器试剂、实验耗材及用具的消毒电热鼓风干燥箱实验用品的干燥 恒温水浴锅提供恒温环境 三、实验操作具体步骤 （一）核酸的提取 按照DNA或RNA提取试剂盒操作（具体操作步骤参考试剂盒操作说明书），如是RNA需进一步反转录为cDNA。-20℃保存备用。（二）测序PCR模板的制备 （1）、预先制备适量冰 （2）、在冰上融化模板DNA、引物以及Extender PCR-to-Gel Master Mix （3）、按照以下反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上

(完整版)宏基因组测序讲解

宏基因组测序 目的 研究藻类物种的分类，研究与特定环境与相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部，微生物与环境，与宿主的关系。技术简介 宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。一般包括从环境样品中提取基因组 DNA, 进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。 宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究