抗体及其应用

　第17卷　第6期

医学研究生学报Vol.17　No.6　2004年6月

Journal of Medical P ostgraduates Jun.2004

?论 著?DNA 免疫制备肝特异新基因FF456

抗体及其应用

何广武,　舒　畅,　沈　浩,　张敏跃

(南京大学生物医药国家重点实验室,江苏南京210093)

摘要:　目的:制备FF456抗体,并研究FF456在正常肝组织和肝癌组织中的表达情况和分布。　方法:将FF456全长基因克隆于pC DNA3.1(-)真核表达质粒,直接免疫6～8周龄雌性BA LB/c 小鼠,并对DNA 的免疫条件进行优化。同时通过原核表达体系表达一段含FF456特异序列的肽段。利用该肽段作为抗原,检测DNA 免疫得到的FF456抗血清的滴度及特异性,最后利用FF456抗血清对正常肝组织和肝癌组织进行免疫荧光染色。　结果:west 2ern blotting 及E LIS A 结果表明,DNA 免疫得到的FF456抗血清特异性良好,最大抗血清滴度为50000左右。　结论:FF456在正常肝组织中广泛表达,在肝癌组织中的表达量明显下调。

关键词:　FF456;　DNA 免疫;　抗血清;　免疫荧光

中图分类号:　Q753 文献标识码:　A 文章编号:　100828199(2004)0620496204

ΞG eneration of high titer antisera of a novel liver 2specific gene FF 456in mice by

DNA immunization and it ’s application

HE G uang 2wu ,SH U Chang ,SHE N Hao ,ZH ANG Min 2yue

(National key Laboratory o f Pharmaceutical Biotechnology ,Nanjing Univer sity ,Nanjing 210093,Jiangsu ,China )

Abstract :　Objective :FF456is a new gene cloned in our lab ,which belongs to c 2type G protein 2coupled receptors and has high hom ology to the olfactory receptor family.Northern blotting and RT 2PCR showed that the expression of FF456was exclusively restricted in liver and was significantly down 2regulated in hepatoma.In an effort to study the function of FF456gene ,high titer antibody is indispensable.　Methods :Full 2length cDNA of FF456was reconstructed into pcDNA3.1(-)vector ,which was used for immunizing 62to 82weeks old female BA LB/c mice.The effects of different injection manners ,s olvents and dosages on the antibody pro 2duction have been com pared.F or detecting the titer and specificity of the antisera produced by DNA immuniza 2tion ,a peptide containing FF456specific sequence was expressed by E.coli expression system.　Results :Fi 2nally specific antisera with titers as high as 1∶50000was obtained.　Conclusion :Immunofluorescence assays showed FF456was expressed in hepatocytes with high tissue specificity.The FF456expression in hepatoma cells was decreased dramatically.

K ey w ords :　FF456;　DNA immunization ;　Antisera ;　Immunofluorescence

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694?收稿日期:　2004202225;　修订日期:　2004203215

基金项目:　江苏省教育厅基金资助项目(批准号:02K JD320021)

作者简介:　何广武(19762),男,江苏靖江人,理学硕士,从事生物化学与分子生物学专业。

0　引 言

FF456是一个未知基因,其全长cDNA尚未见报道。我们已经成功地克隆了该基因的全长cDNA序列,同源性比对发现,该基因与嗅觉受体具有高度的同源性,属于C类G蛋白耦连受体(G protein?coupled receptor,G PCR)。检查12对肝癌标本中FF456的表达情况,发现10个在mRNA水平剧烈下调。

FF456是一个七次跨膜蛋白。我们的前期工作表明,无论是采用原核还是真核表达体系,表达该基因的全长蛋白都相当困难。鉴于上述原因,本研究的目标和实验策略是:构建真核FF456表达质粒,通过DNA直接免疫而获得高特异性和高效价的抗血清。同时,根据氨基酸序列分析结果选取一段FF456最特异的肽段,利用原核表达体系表达,表达产物用于抗体效价及特异性检测。最终,利用得到的FF456抗体,通过免疫荧光染色检查FF456蛋白在正常肝和肝癌组织中的表达情况。

1　材料和方法

1.1　载体构建及G ST2FF4562part的表达　从肝cDNA 文库PCR扩增FF456,接入T载体,酶切鉴定、测序正确后连接入pC DNA3.1(-)得到pC DNA3.1(-)2 FF456。从pC DNA3.1(-)2FF456质粒扩增FF456片段(以下称FF4562part),接入T载体,酶切鉴定,测序正确后连接入G ST融合表达载体p GEX22T,得到p GEX22T2FF4562part。p GEX22T2FF4562part转化BL21,挑单克隆于5ml LB中培养过夜。1%接种过夜菌, 37℃培养2h,1mm ol/L IPTG37℃诱导4h后收集菌体,超声破菌,10000r/min离心10min,收集上清和沉淀。S DS2PAGE结果显示,G ST2FF4562part几乎全部在沉淀中以包涵体形式存在,收集G ST2FF4562part包涵体,4m ol/L尿素洗去杂蛋白,8m ol/L尿素溶解,蛋白定量,存于-20℃备用。G ST2FF4562part为G ST和FF456特异片段融合表达产物,该特异片段含一段细胞外区、一段跨膜区和一段细胞内区。PCR扩增全长FF456的引物:正向引物:5′2G CCG AA TT C A TG C2 G AAG AAAG AACCT C AC AG A23′;反向引物:5′2 G CGGG A T CCTT AGG T C ACTG AG AG AAGG AGG T C-3′。PCR扩增FF456特异片段的引物:正向引物:5′2A T CG2 G A T CC ACC A T C A T CTG C A TTG ACCG23′;反向引物:5′2

G CCG AA TT CTT A TTGGG TGG T AC AACCTG CT AG23′。

1.2　DNA免疫质粒pC DNA3.1(-)2FF456的大量制备　pC DNA3.1(-)2FF456质粒提取采用分子克

隆手册上的方案。A260nm/A280nm的值必须>1.7,倘若<1.7,必须用酚氯仿再次抽提,乙醇沉淀,70%乙醇洗涤,直到A260nm/A280nm的值>1.7。提取的质粒溶于重蒸馏水,浓度为2～3μg/μl,存于-20℃备用。　

1.3　DNA免疫小鼠　免疫用6～8周龄雌性BA LB/ c小鼠,分对照、不同剂量(100μg/只和200μg/只)、不同注射方式(肌内注射、皮下注射、皮内注射)和不同质粒溶剂(P BS和150mm ol/L磷酸钠)等共九组。小鼠初次免疫2周后取血测相对滴度,3周后加强免疫1次,以后每2周取血测定抗血清的相对滴度(抗血清稀释1000倍后用E LIS A测出的值)。

1.4　小鼠FF456抗血清分析

1.4.1　E LIS A法　E LIS A分析抗体产生的相对滴度。20μg/ml抗原50μl/孔包被酶联板,4℃过夜,洗液(P BS+0.05%T ween20)洗板3次后,加150μl/孔封闭液(P BS+5g/L BS A)37℃封闭1h;加抗血清(1∶1000稀释于封闭液)50μl/孔,37℃温育1h;洗板3次,加羊抗小鼠HRP标记二抗(1∶1000稀释于封闭液)50μl/孔,37℃温育1h;洗板3次,加OPD显色液(13mg邻苯二胺溶于15ml柠檬酸磷酸缓冲液,加8μl30%H

2

O2后混匀)50μl/孔,37℃温育8min,加2 m ol/L H2S O450μl/孔终止反应。用酶联仪在490nm 波长下测定吸光度。

1.4.2　Western blotting　使用原核表达的G ST2 FF4562part和G ST蛋白样品,12%胶浓度S DS2PAGE 电泳后,在160mA恒流下转膜100min。丽春红染色5min确定蛋白相对分子质量,50g/L脱脂奶粉封闭1h;加入100倍稀释的抗血清,4℃过夜,洗液洗3～4遍;加入羊抗小鼠HRP标记二抗(1∶50稀释),室温2h,洗液洗3～4遍;加入DAB显色液显色,直至条带清晰。

1.4.3　免疫荧光染色　10μm厚的正常肝组织和肝癌组织冷冻切片,在P BS中漂洗30s去除包埋剂OCT;4%多聚甲醛室温固定5min,P BS洗3遍,每遍2min;加入10%羊血清于湿盒中封闭1h;加入1∶50稀释抗血清于湿盒中温育2～3h,P BS洗3遍,每遍2min;加入1∶40稀释的FITC标记羊抗小鼠二抗,湿盒中温育1h;加封片剂封固,荧光显微镜(Leica)观察。

2　结 果

2.1　重组质粒pC DNA

3.1(-)2FF456及p GEX22T2 FF4562part的构建　由上海博亚公司测定,序列完全正确。

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7

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　第6期 何广武,等　DNA免疫制备肝特异新基因FF456抗体及其应用

2.2　重组G ST 2FF4562part 融合蛋白在大肠杆菌中的表达　转化有p GEX 22T 和p GEX 22T 2FF4562part 重组质粒的BL21大肠杆菌经1mm ol/L IPTG,37℃诱导4h 后,表达出G ST 和G ST 2FF4562part 融合蛋白(图1,泳道2、5),其相对分子质量较G ST 略大,而且绝大部分处于破菌沉淀中,以包涵体的形式存在(图1,泳道3)。G ST 2FF4562part 蛋白约占菌体总蛋白量的30%～40%,而在包涵体中约占总蛋白的90%。

图1　p GEX 22T 2FF4562part 转化的BL21大肠杆菌表达产物的

S DS 2PAGE 分析

Figure 1　S DS 2PAGE analysis of FF4562part expressed by E.coli

BL21cells trans formed with p GEX 22T 2FF4562part

第1泳道:蛋白质M arker ;第2泳道:含空载p GEX 22T 的菌株在1mm ol/L IPTG 诱导后的全菌表达产物;第3、4、5泳道:分别为p GEX 22T 2FF4562part 转化菌株在1mm ol/L IPTG 诱导后的破菌沉淀、破菌上清及破菌前的细菌总蛋白;第6泳道:含未经诱导的表达产物

2.3　DNA 免疫在小鼠血清中产生高滴度的抗体　小鼠在肌内、皮下和皮内免疫pC DNA

3.1(-)FF456质粒100μg 或200μg (质粒溶于P BS 或150mm ol/L 磷酸钠)后,2周后就产生抗FF4562part 的抗体。注射P BS 和150mm ol/L 磷酸钠的对照组血清和免疫前血清无抗体产生。加强免疫2周(初次免疫5周)后,肌内注射质粒100μg 的小鼠产生高滴度抗血清,尔后抗血清滴度迅速下降(图2a );皮下和皮内注射组在加强免疫6周(初次免疫9周)后产生较高滴度抗血清,尔后迅速下降(图2b 、c )。肌内注射组产生抗血清滴度高于皮下和皮内注射组(图2)。150mm ol/L 磷酸钠作为质粒溶剂免疫产生的抗血清滴度高于P BS 溶剂组(图2)

。图2　各免疫组小鼠抗血清相对滴度与免疫时间的关系Figure 2　The relationship between time and relative titers of each group 2.4　抗血清的最大滴度测定　取肌内注射100μg 质粒(溶于150mm ol/L 磷酸钠)加强免疫2周后的抗血清1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000、1∶32000,1∶64000、1∶128000稀释,抗体的滴度为减去背景吸光度≥0.2的抗血清稀释倍数。DNA 免疫产生的FF456抗血清的最大滴度为50000左右(图3)。2.5　抗血清与抗原中的FF456片段的特异作用　Western blotting 样品为原核表达的G ST 2FF4562part 和G ST 蛋白,结果显示,抗血清能很好识别G ST 2FF4562part 而不识别G ST (图4),说明抗血清只与G ST 2FF4562part 中的FF456片段相互作用,从而消除了用融合蛋白G ST 2FF4562part 作为抗原来检测血清滴度

带来假阳性的担忧。同时也不与表达产物中的其他

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杂蛋白相互作用,对FF456片段有特异的识别能力

。图3　抗血清最大滴度测定曲线

Figure 3　The titration curve of the highest titer an

tisera

图4　Western blotting 检测DNA 免疫产生抗血清的特异性Figure 4　S peificity of antisera raised by DNA immunization was de 2

termined by western blotting

1:G ST 2FF4562part ;　2:G ST

2.6　FF456在肝和对应肝癌组织中的表达　免疫荧光染色表明(图5,见插图1),FF456在正常肝组织中大量表达,而在肝癌组织中的表达明显下调。FF456几乎在每个正常肝实质细胞均有表达而且丰度较高,而肝癌细胞只有微弱的表达。

3　讨 论

要开展对FF456基因功能的研究,抗体是不可缺少的工具。DNA 免疫小鼠能产生高滴度和高特异性的抗体。DNA 免疫是简易、经济的方法,并且刺激免疫系统的蛋白是在动物体内产生的,能够正确折叠和修饰,因而其产生的抗体能很好识别天然状态的蛋白。DNA 免疫最好的部位是真皮,因为真皮含大量起抗原呈递作用的树突状细胞,它能吸收DNA 合成蛋白,并直接呈递给免疫系统1～3。肌内注射一般可导致细胞毒性T 淋巴细胞(CT L )反应,文献报道显示肌内和皮下注射产生较弱的体液反应,而皮内注射则能产生强体液反应4,5。为了获得高滴度的FF456抗体,我们比较了不同注射剂量、不同溶剂以及不同免疫途径对抗体产生的影响。我们的实验结果表明,利用肌内注射免疫途径得到较高滴度的抗血清,说明DNA 免疫的最终结果除了免疫途径的影响之外,还可能与特定的基因有关。另外,有人报道,蛋白质在细胞内定位亦影响DNA 的免疫反应,分泌形式的蛋白比膜结合形式产生的抗血清滴度高6,7。细胞内蛋白可以加上信号肽使之分泌到细胞外,从而可以得到较高滴度的抗体。我们用DNA 免疫方法得到新基因FF456的抗血清,最大滴度为50000左右,但检测抗原G ST 2FF4562part 为非活性形式,而且大小只有原蛋白的1/4,失去了一些抗原决定簇,所以E LIS A 检测值偏低。倘若要通过DNA 免疫得到更高滴度的抗体,可以采用佐剂脂质体包裹注射。此外,可采用基因枪注射方式。150mm ol/L 磷酸钠作为质粒溶剂免疫产生的抗血清滴度较高,可能是由于它提高了FF456的表达水平,增强了体液免疫反应,从而提高了抗血清的滴度。我们用FF456抗血清进行了western blot 2ting 和免疫荧光染色,抗血清的特异性较好,免疫荧光染色实验显示大部分正常肝实质细胞均表达FF456,其对正常肝实质细胞可能行使重要功能。致谢本实验得到程霓博士、孙喜太博士和张晓绮博士的大力支持和帮助,在此深表谢意。参考文献:1　C ondon C ,W atkins SC ,Celluzzi C M et al .DNA 2based immunization by in viv o trans fection of dendritic cellsJ .Nat M ed ,1996,2(10):112221128.2　Hengge UR ,W alker PS ,V ogel JC.Expression of naked DNA in hu 2man ,pig ,and m ouse skin J .J Clin Invest ,1996,97(12):291122916.3　Akbari O ,Panjwani N ,G arcia S et al .DNA vaccination :trans fection and activation of dendritic cells as key events for immunityJ .J Exp M ed ,1999,189(1):1692178.4　H inrichs J ,Berger S ,Shaw J G.Induction of antibodies to plant viral proteins by DNA 2based immunization J .J Virol M ethods ,1997,66(2):1952202.5　Y eung SC ,Anders on J ,K obayashi K et al .Production of rabbit poly 2clonal antibody against apobec 21by genetic immunization J .J Lipid Res ,1997,38(12):262722632.6　Boyle JS ,K oniaras C ,Lew AM.In fluence of cellular location of ex 2pressed antigen on the efficacy of DNA vaccination :cytotoxic T lym 2phocyte and antibody responses are suboptimal when antigen is cyto 2plasmic after intramuscular DNA immunization J .Int Immunol ,1997,9(12):189721906.7　Chowdhury PS ,G allo M ,Pastan I.G eneration of high titer antisera in rabbits by DNA immunization J .J Immunol M ethods ,2001,49(122):1472154.(责任编辑:李风华;　英文编辑:徐　军)

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单克隆抗体的制备及应用

单克隆抗体的制备及应用 单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇。单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。 1 单克隆抗体的优点与局限性： 单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。 总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产等。 单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。 (2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。 2 单克隆抗体的制备： 单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。 单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与免疫、细胞融合、选择杂交瘤细胞及抗体检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。 抗原准备 抗原，是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。很多物质都可以成为抗原，抗原的具体分类可以参见抗原，在进行单克隆抗体制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug 重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。 动物的选择与免疫

抗体的制备方法与原理

抗体的制备方法与原理－单克隆抗体的制备 1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。 免疫细胞化学的技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体，由于每种抗原都有几个抗原决定簇，用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体。单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也一致。单克隆抗体（McAb）的特性和常规血清抗体的特性比较见2-3。 表2—3 单克隆抗体（McAb）和常规免疫血清抗体的特性比较 单克隆抗体的制备方法如下。 （一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。

2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～ 1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。 ②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。 （2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。

常见的自身免疫性疾病

一、自身免疫性溶血性贫血（AIHA）：机体免疫功能异常，或服用某些药物后，红细胞表面抗原性发生变化，产生抗红细胞膜表面抗原的自身抗体。自身抗体与自身抗原结合，激活补体，破坏红细胞，导致贫血。特点：（1）体内出现抗红细胞自身抗体。（2）抗人球蛋白试验（Coombstest）阳性。（3）红细胞寿命缩短。（4）AIHA多见于中年女性。（5）继发性者多继发于淋巴系统恶性病、结缔组织病、感染和药物应用后。（6）引起AIHA的药物有青霉素、奎尼丁、异烟肼、对氨基水杨酸、磺胺类、甲基多巴等。抗红细胞抗体可分为三类：①温抗体，为IgG型，37°C可与RBC结合，不聚集RBC.②冷凝集素，为IgG 型，低温时与RBC结合使其凝集，引起冷凝集素综合征。③DonathLaidsteiner抗体，为IgG 型，低温时与两种补体成分结合，温度升高至37°C时，激活补体链，导致溶血，引起陈发性冷性血红蛋白尿症（PCH）。PCH继发于梅毒或病毒感染后。病毒感染后引起的多见于儿童或年轻患者。二、免疫性血小板减少性紫癜（ITP）：主要表现为皮肤黏膜紫癜，血小板↓，骨髓中巨核细胞可增多，女性多发，发病率1／lOO00，患者有抗血小板抗体，其使血小板寿命缩短。三、重症肌无力（MG）：患者体内存在神经肌肉接头乙酰胆碱受体的自身抗体，该抗体结合到横纹肌细胞的乙酰胆碱受体上，使之内化并降解，使肌细胞对运动神经元释放的乙酰胆碱的反应性降低。引起骨骼肌运动无力。四、肺出血肾炎综合征（Goodpasture综合征）：患者体内可检到抗肾小球基底膜Ⅳ型胶原抗体，由于肺泡基底膜与肾小球基底膜有共同抗原，故肺、肾同时发病。青年男性多见，反复咯血、血尿、蛋白尿，最后发展为肾衰。五、系统性红斑狼疮（SLE）：是一种累及多器官、多系统的炎症性结缔组织病，多发于青年女性。其临床症状比较复杂，可出现发热、皮疹、关节痛、肾损害、心血管病变（包括心包炎、心肌炎和脉管炎）、胸膜炎、精神症状、胃肠症状、贫血等；疾病常呈渐进性，较难缓解。免疫学检查可见IgG、IgA和IgM增高，尤以IgG显著；血清中出现多种自身抗体（主要是抗核抗体系列）和免疫复合物，活动期补体水平下降。抗dsDNA和抗Sm抗体是本病的特征性标志。SLE的实验诊断：（1）抗核抗体1）免疫荧光法检测抗核抗体：该法以小鼠肝细胞、Hep-2细胞（人喉癌上皮细胞株）、Hela细胞（官颈癌细胞株）或小鼠腹水癌细胞等作为抗原片，以Hep-2细胞抗原片敏感性较高。2）抗DNA 抗体：分为天然（双链）DNA（ds-DNA）和变性（单链）DNA（ss-DNA）抗体。Ds-DNA抗体的测定方法有间接免疫荧光法（以短膜虫或马疫锥虫为抗原）、间接酶标抗体法（以短膜虫为抗原）、补体结合抗体法（以短膜虫为抗原，以抗人C3荧光抗体为第二抗体）、酶联免疫吸附试验（ELISA，以DNA为抗原）和放射免疫分析法（即Farr法）等多种方法。前四种方法检测到的都是低亲和力的抗dsDNA抗体，或敏感性低，或检测结果不稳定、重复性差。Farr 法检测dsDNA抗体的特异性最高，结果可靠，重复性好，因此是目前国际上公认的检测抗ds-DNA抗体的标准方法。当抗ds-DNA抗体结合率>20％时对诊断SLE有意义。3）抗可提取性核抗原（ENA）抗体：目前抗ENA抗体的检测方法有双向免疫扩散或对流免疫电泳和免疫印迹法。近年来随着分子生物学技术的发展，可以以重组抗原为底物，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测特异性抗体。4）抗增殖细胞核抗原抗体。（2）抗组蛋白抗体。（3）抗核糖体抗体。（4）抗Ku抗体。（5）皮肤狼疮带试验。与SLE病情判断有关的免疫学检测包括：1）血沉和C反应蛋白（CRP），SLE活动时血沉增快，CRP改变不明显。2）血清蛋白，包括白蛋白、球蛋白、纤维蛋白原、冷球蛋白冷凝集素等。3）血清补体，包括总补体（CH50）和Cl、C3、C4、C2及C9. 4）循环免疫复合物（CIC）聚乙二醇（PEG）沉淀法。5）类风湿因子。6）细胞免疫功能。六、类风湿性关节炎（RA）：一种以关节病变为主的全身性结缔组织炎症，多发于青壮年，女性多于男性。本病的特征是关节及周围组织呈对称性、多发性损害，部分病例可有心、肺及血管受累。免疫学检查可见血清及滑膜液中出现类风湿因子，血清IgG、IgA和IgM水平升高。其他自身抗体也可出现：例如，抗角蛋白抗体；抗RA33抗体；抗环瓜氨酸抗体（抗CCP抗体）；抗核周因子

自身免疫病中多种自身抗体的检测及分析

自身免疫病中多种自身抗体的检测及分析【摘要】目的：通过对自身免疫病患者常用自身抗体的综合检测、分析，评价其在自身免疫病中的意义及价值。方法：选取临床上已确诊为自身免疫病患者216例作为疾病组（其中SLE患者102例，RA患者54例，MCTD患者18例，SS患者16例，PSS患者16，PM/DM患者10例），健康体检者30例作为对照组，抽取血液，分离血清，分别采用间接免疫荧光法、欧蒙免疫印迹法和ELISA法检测ANA、抗ds DNA、ENA多肽谱、RF。结果：6种自身免疫性疾病中，RF的阳性检出率以类风湿性关节炎（RA）患者为最高（74.2%），干燥综合症（SS）患者次之（62.5%），而多发性皮肌炎（PM/DM）患者中未检出；ANA在6种自身免疫病患者中均有较高的阳性检出率，以系统性红斑狼疮（SLE）患者为最高（94.1%），混合性结缔组织病（MCTD）患者次之（88.9%），RA患者最低（33.3%）；抗ds DNA则只在2种自身免疫病患者中检出，其中SLE患者阳性检出率最高（80.4%），而RA患者较低（3.7%）；6种自身免疫病患者中，ENA多肽谱的各种抗体的检出率差别较大，其中，抗SSA/R0均有检出，但阳性率不高（均低于40.0%），而抗Histones只在SLE患者中有检出，抗Scl70只在系统性硬皮病（PSS）患者中有检出，抗J01则只在PM/DM患者中有检出，但抗U1snRNP 则在MCTD患者中检出率较高（88.9%），抗Centromere均无检出。结论：自身免疫病患者同时检测多种自身抗体有助于疾病的特异性诊断和筛查。

【关键词】 RF； ANA；抗ds DNA； ENA多肽谱；自身免疫病 ［ABSTRACT］Objective: To evaluate the significance of multiple autoantibody detection and analysis in the process of diagnosing and screening autoimmune diseases. Methods: 216 cases of autoimmune diseases were compared with 30 health volunteers. 102 out of these cases are SLE, 54 are RA, 18 are MCTD, 16 are SS, 16 are PSS and 10 are PM/DM, Autoantibody including ANA, anti ds DNA, ENA antibodies and RF were detected. Results: Among six kinds of autoimmune diseases mentioned above, RA has the highest positive rate of RF (74.2%) followed by SS (62.5%). On the contrary, in PM/DM, RF was detected as negative. SLE has the highest positive rate of ANA (94.1%) followed by MCTD (88.9%) and RA (33.3%). Anti ds DNA was only detected in SLE and RA with a positive rate of 80.4% and 3.7%, respectively. The positive rates of ENA antibodies in autoimmune diseases are obvious different among each other. Conclusion: Detection of multiple autoantibodies is a useful way of diagnosis and screening autoimmune diseases. ［KEY WORDS］ RF； ANA； Anti ds DNA； ENA antibodies；Autoimmune diseases

自身抗体检测项目及临床意义

一、抗核抗体 抗核抗体（antinuclearantibodies，ANA）泛指抗各种核成分的抗体，是一种广泛存在的自身抗体。ANA的性质主要是IgG，也有IgM和IgA，甚至IgD和IgE。ANA可以与不同来源的细胞核起反应，无器官特异性和种属特异性。ANA主要存在于血清中，也可存在于其他体液如滑膜液、胸水和尿液中。 ANA在SIE患者的滴度较高，但也出现在其他许多自身免疫病中，在许多研究报告中，都将检出ANA作为自身免疫甚至自身免疫病存在的依据。这种现象的机制尚未明了，有待于进一步研究。 （一）ANA的类型及意义 由于细胞核成分的复杂性，不同成分的抗原性也不同；因此就会有多种不同的ANA。 1．抗核蛋白抗体核蛋白抗原（DNP）由DNA和组蛋白组成。由于DNP抗原存在不溶性和可溶性两个部分，可分别产生相应的抗体。不溶性DNP抗体通常不完全被DNA和组蛋白所吸收，它是形成狼疮细胞的因子；可溶性抗原存在于各种关节炎病人的滑膜液中，其相应抗体也出现于RA病人的滑膜液中。 2．抗DNA抗体可以分为两大类：①抗天然DNA（nDNA）抗体，或称抗双链DNA （dsDNA）抗体；②抗变性DNA抗体，或称抗单链DNA（ssDNA）抗体。抗dsDNA抗体对SLE有较高的特异性，70％～90％的活动期SLE病人该抗体阳性，效价较高，并与病情有关。抗ssDNA抗体可见于多种疾病中，特异性较差。 3．抗ENA抗体可提取性核抗原（ENA）多从动物的胸腺中提取。先将胸腺匀浆并破碎细胞，分离出细胞核；再经盐水或磷酸盐缓冲液处理后，很容易从胞核中提取出来。ENA 不含DNA，对核糖核酸酶敏感。近年来的研究表明，ENA可分为十几种，现仅介绍几种主要的ENA及其相应抗体。

第二十四章自身免疫性疾病及其免疫检测

第二十四章自身免疫性疾病及其免疫检验 autoimmune diseases and immunoassay 第一部分目的要求和教学内容 一、目的要求： 掌握自身免疫性疾病的概念特征及几种常见的自身免疫性疾病；掌握ANA、RF的检测方法及其临床意义。熟悉自身免疫病的发病机制及免疫病理机制。 二、教学内容 1、自身免疫病的概述：自身免疫和自身耐受、自身免疫病的概念及特征；AID的发病机理 及免疫病理机制。 2、自身免疫性疾病的分类：器官特异性AID；非器官特异性AID（SLE、RA）。 3、自身抗体的检测及其临床意义：抗核抗体的类型检测及意义；类分湿因子的检测及意义； 抗甲状腺球蛋白抗体、抗甲状腺微粒体抗体的检测及意义；其它自身抗体检测及意义。第二部分测试题 一、选择题： (一)单项选择题(A型题) 1．免疫系统对自身成分不发生免疫应答，称为自身耐受，这与T细胞（） A.在胸腺发育时不能遇到自身MHC分子有关。 B.在胸腺发育时不能遇到自身成分有关。 C.在胸腺发育时首先遇到外来抗原有关。 D.在胸腺发育时经历的阳性选择有关。 E.在胸腺发育时经历的阴性选择有关。 2．自身成分一般情况下对机体无免疫原性，主要是因为：（） A．免疫系统对自身成分不能识别 B．体内有针对自身成分的T抑制细胞 C．它不是外来物质 D．胚胎期形成了对自身成分的免疫耐受 E．自身成分分子量小 3.免疫耐受性的特点是：（） A.成年期易于诱导耐受性 B.T细胞比B细胞易于诱导耐受性 C.抗原经皮下注射易于诱导耐受性 D.免疫系统处于抑制状态时易于诱导耐受性 E.颗粒性抗原比可溶性抗原易于诱导耐受性 4．下列哪项疾病属于器官特异性AID：（） A.SLE B.类风湿关节炎 C.干燥综合症 D.桥本氏甲状腺炎

临床免疫学自身抗体检测及应用

第二十章自身抗体检测及应用 本章考点 1.概念 2.自身抗体的特性、概念 3.常见自身抗体的检测 4.自身抗体检测的临床应用 自身免疫：当机体免疫系统受某种因素作用使自身免疫耐受削弱或破坏时，免疫系统会对自身成分包括：正常或变性的组织、器官、细胞、蛋白质或酶类等自身抗原产生免疫应答反应，出现自身抗体或致敏淋巴细胞的这种现象称为自身免疫。 自身免疫性疾病：当某种原因使自身免疫应答过分强烈时，也会导致相应的自身组织、器官损伤或功能障碍，这种病理状态称为自身免疫性疾病。 自身抗体；血循环中针对自身组织、器官、细胞及细胞内成分的抗体称为自身抗体。 正常人血清中可有多种微量的自身抗体或致敏淋巴细胞，它能清除体内衰老细胞而起到免疫稳定的效应。 第一节自身抗体的特性 自身抗体是自身免疫性疾病的重要标志。每种自身免疫性疾病都伴有特征性的自身抗体谱。患者血液中存在高效价自身抗体是自身免疫性疾病的特点之一，也是临床确诊自身免疫性疾病的重要依据。 产生自身抗体的抗原包括以下几种：化学修饰的组织抗原；与自身组织成分存在交叉反应的外来抗原；隐蔽抗原；自身细胞HLA-DR抗原的表达以及低分化的组织抗原等，在一定条件下，均可刺激机体产生自身抗体。自身抗体与疾病的关系：某些自身抗体对某种疾病的诊断具有高度特异性，已经成为该病的血清标记性抗体或特异性抗体；某些自身抗体与疾病的活动性有相关性；少数自身抗体参与了免疫病理性损伤。 测定自身抗体的意义：自身免疫性疾病的诊断；疾病活动性的判断；疗效的观察；指导临床用药等。 第二节常见自身抗体的检测 自身抗体种类很多，这里只是简单介绍几种常见的自身抗体的检测。 一、类风湿因子 （一）概念 类风湿因子（rheumatoid factor，RF）是一种抗人或动物IgG分子Fc片段抗原决定簇的抗体，是以变性IgG为靶抗原的自身抗体。可与人或动物的变性IgG结合，而不与正常IgG发生凝集，最多见于类风湿性关节炎患者。 Rose等1984年在RA（rheumatoid arthritis）患者血清中发现RF。RF有IgM、IgG、IgA和IgE型，IgM型为主要类型。 （二）检测方法 1.胶乳凝集试验：以IgG吸附于聚苯乙烯胶乳颗粒上，如血清中含有RF，可与乳胶颗粒出现凝集反应。该法只能定性或半定量，灵敏度及特异性不高，只能检测IgM型RF。 2.速率散射比浊法：定量检测、准确、快速，准确性和敏感性高于胶乳凝集实验。也只能检测IgM型RF。 3.ELISA法：可检出不同Ig类型的RF，在酶标记抗体时，分别标记IgG、IgA或IgM。 （三）临床应用

自身抗体谱检测

关注自身免疫性疾病——关注自身抗体谱检测检验科宣 一、什么是自身抗体？ 自身抗体是指针对自身组织，器官、细胞及细胞成分的抗体，分为天然自身抗体和病理性自身抗体。天然自身抗体存在于健康人和动物血清中，多为IgM型，病理性自身抗体是受抗原刺激生成，多为IgG型，特异性强，与自身抗原的亲和力高，可引起自身组织的病理性损伤。 二、什么是自身免疫性疾病？ 自身免疫性疾病(AID)是指由于某些原因造成免疫系统对自身成分的免疫耐受减低或破坏，致使自身抗体或／和致敏淋巴细胞损伤自身器官组织而引起的疾病，表现为相应组织器官的功能障碍。 AID总体发病率占世界人口的3%，中国:3-4千万，临床表现复杂，疑难病，误诊误治多。 临床上AID分两大类： 器官特异性:１型糖尿病、炎症性肠病、多发性硬化、自身免疫性肝炎等； 全身性（或系统性）：系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、干燥综合征等。 三、开展自身抗体检测的临床价值： 自身抗体参与了自身免疫性疾病(AID)的发生；自身抗体有助于自身免疫性疾病的诊断、临床分型、判断预后；自身抗体导致自身免疫性疾病的机制逐渐被阐明；未来方向——有可能做到预防自身免疫性疾病的发生。 四、我院开展的自身抗体谱检测项目： 用于体外定性检测人血清或血浆中的抗 nRNP、Sm、SS-A（天然 SS-A 和 Ro52）、SS-B、Scl-70、PM-Scl、Jo-1、CENP B、PCNA、dsDNA、核小体、组蛋白、核糖体 P 蛋白和 AMA M2 共 14种不同抗原 IgG类抗体。 五、自身抗体谱检测的临床意义： 诊断自身免疫性疾病（包括硬皮病、系统性红斑狼疮、混合结缔组织病、干燥综合征、类风湿性关节炎、多发性肌炎和皮肌炎等） 详细的临床检测意义可咨询你的临床医生哦

抗体制备-自己整理

制备单克隆抗体是复杂而费时的工作，整个技术流程如图： 单克隆抗体制备（免疫2-3月，总周期4-6月） 准备抗原 动物免疫选择免疫动物 Elisa测抗血清 细胞融合（融合剂:PEJ） HAT培养基筛选杂交瘤细胞 筛选阳性细胞 （三天内做完流式） 阳性克隆并扩大培养细胞冻存 扩大培养收集上清 单克隆抗体纯化保存 （一）抗原提纯与动物免疫 对抗原的要求是纯度越高越好，尤其是初次免疫所用的抗原。如为细胞抗原，可取1×107个细胞作腹腔免疫。可溶性抗原需加完全福氏佐剂并经充分乳化，如为聚丙烯酰胺电泳纯化的抗原，可将抗原所在的电泳条带切下，研磨后直接用以动物免疫。选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠龄在8～12周，雌雄不限。为避免小鼠反应而不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3～4只小鼠。免疫过程和方法与多克隆抗血清制备基本相同，因动物、抗原形式、免疫途径不同而异，以获得高效价抗体为最终目的。免疫间隔一般2～3周。一般被免疫动物的血清抗体效价越高，融合后细胞产生高效价特异抗体的可能性越大，而且单克隆抗体的质量（如抗体的浓度和亲和力）也与免疫过程中小鼠血清抗体的效价和亲和力密切相关。末次免疫后3～4天，分离脾细胞融合。（二）骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 选择瘤细胞株的最重要的一点是与待融合的B细胞同源。如待融合的是脾

细胞，各种骨髓瘤细胞株均可应用，但应用最多的是Sp2/0细胞株。该细胞株生长及融合效率均佳，此外，该细胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链。细胞的最高生长刻度为9×105/ml，倍增时间通常为10～15h。 融合细胞应选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞（活性应大于 95％）。骨髓瘤细胞株在融合前应先用含8-氮鸟嘌呤的培养基作适应培养，在细胞融合的前一天用新鲜培养基调细胞浓度为2105/ml，次日一般即为对数生长期细胞。在体外培养条件下，细胞的生长依赖适当的细胞密度，因而，在培养融合细胞或细胞克隆化培养时，还需加入其他饲养细胞（feedercell）。常用的饲养细胞为小鼠的腹腔细胞，制备方法为用冷冻 果糖液注入小鼠腹腔，轻揉腹部数次，吸出后的液体中即含小鼠腹腔细胞，其中在巨噬细胞和其他细胞。亦有用小鼠的脾细胞、大鼠或豚鼠的腹腔细 胞作为饲养细胞的。在制备饲养细胞时，切忌针头刺破动物的消化器官，否则所获细胞会有严重污染。饲养细胞调至1×105/ml，提前一天或当天置板孔中培养。 （三）细胞融合 细胞融合是杂交瘤技术的中心环节，基本步骤是将两种细胞混合后加入 PEG（融合剂）使细胞彼此融合。其后把培养液稀释PEG，消除PEG的作用。将融合后的细胞适当稀释，分置培养板孔中培养。融合过程中有几个问题应特别注意。①细胞比例：骨髓瘤细胞与脾细胞的比值可从1:2到1:10不等，常用1:4的比例。应保证两种细胞在融合前都具有较高活性。 ②反应时间：在两种细胞的混合细胞悬液中，第1min滴加4.5ml培养液； 间隔2 min滴加5 ml培养液，尔后加培养液50ml。③培养液的成分：对融合细胞，良好的培养液尤其重要，其中的小牛血清、各种离子和营养成分均需严格配制。如融合效率降低，应随时核查培养基情况。 （四）有限稀释法 筛选阳性株一般选用的骨髓瘤细胞为HAT敏感细胞株，所以只有融合的细胞才能待续存活一周以上。融合细胞呈克隆生长，经有限稀释后（一般稀释至0.8个细胞/孔），按Poisson法计算，应有36％的孔为1个细胞/孔。 细胞培养至覆盖0％～20％孔底时，吸取培养上清用ELISA检测抗体含量。

单克隆抗体的制备及应用

单克隆抗体的制备及应用 The latest revision on November 22, 2020

单克隆抗体的制备及应用 单克隆是由杂交瘤产生的、只针对复合上某一单个。技术(monoclonalantibodytechnique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的，并以此生产抗体。是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。1单克隆抗体的优点与局限性： 1.1单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA 等。(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。 总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产等。 1.2单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。(2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。 2单克隆抗体的制备： 单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。 单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与、细胞融合、选择杂交瘤细胞及检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。 2.1抗原准备 抗原，是指能够刺激产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生（特异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。很多物质都可以成为抗原，抗原的具体分类可以参见抗原，在进行单克隆抗体制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。 2.2动物的选择与 2.2.1动物的选择纯BALB/c小鼠，较温顺，离窝的范围小，体弱，食量及排污较小，一般洁净的实验室均能饲养成活目开展杂交瘤技术的实验室多选用BALA/c小鼠。 2.2.2免疫方案选择合适的免疫方案对于杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据的特性不同而定。 （1）可溶性抗原性较弱，一般要加，应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml，0.2ml/点），3周后第二次免疫，剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml），3周后第三次免疫，剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后测其），2～3周加强免疫，剂量50～500μg宜，ip或iv（内

单克隆抗体的制备及应用教学提纲

单克隆抗体的制备及 应用

单克隆抗体的制备及应用 单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇。单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。 1 单克隆抗体的优点与局限性： 1.1 单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。 总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产等。1.2 单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。(2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。 2 单克隆抗体的制备： 单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。 单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与免疫、细胞融合、选择杂交瘤细胞及抗体检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。 2.1 抗原准备 抗原，是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。很多物质都可以成为抗原，抗原的具体分类可以参见抗原，在进行单克隆抗体制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug 重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。 2.2动物的选择与免疫

自身抗体检测在自身免疫性疾病中的临床应用专家建议

自身抗体检测在自身免疫性疾病中的临床应用专家建议 自身抗体检测是自身免疫性疾病诊治中的重要工具，随着早期诊断、规范化治疗的开展，自身抗体检测在疾病诊断、监测及预后评估中发挥的作用也日益受到重视。但是，由于目前自身抗体检测缺乏统一的标准化检验方法，加上工作条件、传统诊疗习惯、结果判读以及医疗保险限制等方面的因素影响，导致自身抗体检测在临床应用上存在着不统一、不规范现象。因此，制定适合我国国情的自身抗体临床应用建议十分必要，可为广大临床医生和检验医师提供参考。《自身抗体检测在自身免疫性疾病中的临床应用专家建议》（以下简称为《建议》）形成分3步进行。首先由来自全国大型教学医院风湿免疫科医师通过检索国内外文献并结合中国 实际情况起草《建议》草案，然后将该草案提交由风湿免疫科、检验科、消化科、血液科、神经内科等组成的专家组讨论，补充和提出修改意见，修改后的草案再次由起草成员讨论，形成初步建议，并对每项建议条目进行解读。最后提交由中国免疫学会临床免疫分会专家进行投票评分（Delphi评分，分值从0分到10分，0分表示完全不赞同，10分表示完全赞同），计算所有专家打分的（平均值±标准差）作为每条建议的专家认可度。《建议》包括13条，每一条都附有基于GRADE法[1]的证据分级、证据质量和专家认可度及其

95%的可信区间。 一、自身免疫性疾病概述自身免疫性疾病是由于免疫功能紊乱，机体产生针对自身抗原的病理性免疫应答反应而引起器官或系统损伤的一类疾病。根据临床表现和病变累及的范围，自身免疫性疾病可以分为系统性和器官特异性，前者以系统性红斑狼疮（SLE）、系统性硬化症（SSc）、类风湿关节炎（RA）、抗磷脂综合征（APS）等为代表；后者包括自身免疫性肝炎（AIH）、原发性胆汁性肝硬化（PBC）、自身免疫性甲状腺炎（AIT）、胰岛素依赖性糖尿病（IDDM）等。自身免疫性疾病的发病机制尚不完全清楚，目前认为是遗传易感个体在环境因素如感染、紫外线及肿瘤、药物等多种因素共同作用下发生。自身免疫性疾病通常伴随免疫系统功能紊乱、自身反应性T细胞、B细胞的活化和自身抗体、炎性因子的产生。由于自身抗体的产生是自身免疫性疾病的基本特征之一，因而，自身抗体本身就成为大多数自身免疫性疾病的血清学标记物。 二、自身抗体的分类、临床意义和检测方法1.系统性自身免疫性疾病相关自身抗体 (1)抗核抗体（ANA）抗核抗体（ANA）是一组将自身真核细胞的各种成分脱氧核糖核蛋白、DNA、可提取核抗原和RNA等作为靶抗原的自身抗体的总称，是自身免疫性疾病最重要的诊断指标之一。ANA的检测方法很多，目前间接免疫

单克隆抗体的制备及应用

单克隆抗体的制备及应 用 Company number：【0089WT-8898YT-W8CCB-BUUT-202108】

单克隆抗体的制备及应用 单克隆是由杂交瘤产生的、只针对复合上某一单个。技术(monoclonal antibody technique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的，并以此生产抗体。是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。 1 单克隆抗体的优点与局限性： 单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。 总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产等。 单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。(2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。 2 单克隆抗体的制备： 单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。 单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与、细胞融合、选择杂交瘤细胞及检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。 抗原准备 抗原，是指能够刺激产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生（特异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。很多物质都可以成为抗原，抗原的具体分类可以参见抗原，在进行单克隆抗体制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug 重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。 动物的选择与 动物的选择纯BALB/c小鼠，较温顺，离窝的范围小，体弱，食量及排污较小，一般洁净的实验室均能饲养成活目开展杂交瘤技术的实验室多选用BALA/c小鼠。 免疫方案选择合适的免疫方案对于杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前

自身抗体检测及质量控制

自身抗体检测及质量控制 摘要】自身抗体种类繁多，检测方法较为丰富，已有效应用到多种自身免疫性 疾病中，以辅助临床诊疗。做好自身抗体全面、全程、全员参与的质量控制，如 实验环境、仪器设备、试剂耗材、实验方法、实验人员的培训、能力验证、室内 质控及室间质评，能够为临床诊疗提供更准确、更有效的依据。本文介绍了自身 抗体检测的现状、技术，分析了其临床应用范围，建设性地提出了分析前、分析中、分析后质量控制建议，旨在为日后自身抗体的检测及临床诊疗提供有效的质 量保证。 【关键词】自身抗体；临床应用；质量控制 中图分类号：R446.6 文献标识码：A 目前，各实验室开展检查的自身抗体种类较多，检测方法也较丰富，已经获 得各专业各级临床医师的高度认可。但是，有一些实验室由于所具有的设备、耗材、试剂以及检验工作者的不确定性，可能会发生一些检测不当结果可疑的现象。本文分析各种检测抗体及检验方法的临床应用价值，更重要的是提出一些相关的 质量控制的建议，目的是为日后临床检测及临床诊疗提供有价值的参考。 1 自身抗体及检测 1.1内分泌疾病相关自身抗体：抗胰岛细胞抗体、抗胰岛素抗体主要发现于1 型糖尿病患者。自身免疫性甲状腺炎是一种以自身甲状腺组织为抗原的慢性炎症 性自身免疫性疾病，抗甲状腺球蛋白与抗甲状腺过氧化物酶抗体、抗促甲状腺激 素受体抗体为其相关自身抗体。 1.2. 胃肠道疾病相关自身抗体：慢性炎症性肠病包括溃疡性结肠炎和克罗恩病, 抗小肠杯状细胞抗体为溃疡性结肠炎特异性抗体，抗胰腺腺泡抗体是其可靠 标志物，pANCA阳性率可达76%；抗酿酒酵母菌抗体在克罗恩病中的阳性率可达70%。抗胃壁细胞抗体及抗内因子抗体与慢性萎缩性胃炎及恶性贫血相关。抗肌 内膜抗体是麸质敏感性肠病标志性抗体，阳性率可达90%-100%。 1.3自身抗体的检测对自身免疫性疾病的诊断和鉴别诊断及愈后评估具有重要的临床意义。随着对自身抗体的了解越来越深入，自身抗体检测已是临床免疫检 测的一项重要的实验室指标。其他抗体如抗Hu抗体、抗Ri抗体、抗Yo抗体等 与副瘤性神经系统综合征相关，另外，还有皮肤病相关自身抗体、神经系统疾病 相关自身抗体、不孕不育相关自身抗体。 2 检测方法 目前自身抗体检测存在各方面的问题：一是自动化程度低、结果重复性差、 容易出现假阳性或假阴性；二是做室内质量控制时选择合适的质控品的问题；三 是室间质评目前开展的项目少、结果不太理想；四是国内参考实验室的建立、人 员培训缺乏统一标准，造成检测结果的报告和解释与临床实际应用脱离；最重要 的一点是自身抗体的特点，表现的复杂性，临床检验质量控制是以准确性为目的，全程管理、全员参与、全面监督的过程，尽管自身抗体检测在AID临床应用中取 得重大进步，但仍存在标准化和正确应用的新挑战。在此，我们将从检验全程质 量控制，包括分析前、分析中、分析后质量控制三方面进行阐述。 2.1分析前的质量控制临床医师选择检测项目、提出检查申请单直到待检标本运送到实验室这一过程的质量控制称为分析前质量控制，包括临床医师申请单的 提出、患者的准备、标本采集及运送、保存等环节，任何一个环节处理不当，都 有可能会影响检验结果。分析前阶段在全面质量管理整个过程中极易被忽视但非

单克隆抗体的制备及应用

单克隆抗体的制备及应用单克隆抗体技术是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合 抗原分子上某一单个抗原决定簇。单克隆抗体B淋巴细胞antibody technique)同骨髓肿瘤细胞杂交，获：一种免疫学技术，将产生抗体的单个(monoclonal 得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。 1 单克隆抗体的优点与局限性： 1.1 单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。 总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产等。 1.2 单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。(2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。 2 单克隆抗体的制备： 单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。 单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与免疫、细胞融合、选择杂交瘤细胞及抗体检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。 2.1 抗原准备 抗原，是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。很多物质都可以成为抗原，抗原的具体分类可以参见抗原，在进行单克隆抗体制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug 重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。 2.2动物的选择与免疫 2.2.1 动物的选择纯BALB/c小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的 开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/c实验室均能饲养成活目小鼠。 2.2.2免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融