应用PCR_反向斑点杂交法快速检测和鉴定医学重要真菌

文章编号:1002-2694(2004)02-0143-04

应用PCR-反向斑点杂交法快速检测

和鉴定医学重要真菌

郭　梅1,牟兆钦2,谢湘峰2,陈建魁2,尹秀云2

摘　要:目的　建立一种以PCR为基础的的检测和鉴定医学重要真菌的方法。方法　将白念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、季也蒙念珠菌、都柏林念珠菌和新型隐球菌的种特异性探针加尾后固定于硝酸纤维素膜上;用标记生物素的真菌通用引物扩增经提取的各真菌DNA,与固定在膜上的探针杂交。结果　所用的真菌通用引物可扩增12种临床常见的真菌DNA,扩增片段长度在350bp左右。8种特异性探针分别与上述真菌PCR扩增产物杂交,结果表明8种探针具有高度的特异性。通过39例临床标本和25例临床分离菌株的检测,PCR-反向杂交法与真菌培养法的结果基本一致,且鉴定时间也由传统培养鉴定方法约需1周的时间缩短至2天。结论　该方法可快速、正确地将8种临床常见真菌鉴定到种水平,如经大量临床标本的检测验证,可望在临床微生物实验室开展。

关键词:聚合酶链反应;反向杂交;医学真菌;生物素;寡核苷酸探针

中图分类号:R379　文献标识码:A

R apid detection and identif ication of medically important f ungi

by PCR2reverse blot hybridization1

GUO Mei,MU Zhao2qin,XIE Xiang2feng,CHEN Jian2kui,YIN Xiu2yun

(Research Clinic,Academy of Military Medical Sciences,Beijing100039,P1R1China)

ABSTRACT:Objective　A PCR2based assay was developed to detect and identify medically important fungi1Methods　The species2specific oligonucleotide probes to identify eight fungi species,Candida1albicans(pCal),C1glabrata(pGla), C1guilliermondii(pGui),C1parapsilosis(pPar),C1dubliniensis(pDub),C1krusei(p Kru),C1t ropicalis(p T ro),Cryptococ2 cus neof orm ans(pCry),were added homopoly tails and then inoculated on a nitrocellulose filter1Fungi DNA was amplified by PCR with fungi2universal primers labeled with biotin1The PCR products were identified by hybridization with the s pecies2specific probe fixed on the filter1R esults　All12species of fungi were amplified by PCR,and the length of PCR products was about350bp18 species2specific probes only hybridized with its target molecules,and the test manifested these probes were high specific1The method was used to test39different clinical sam ples and25culture isolates1The results agreed with those of culture and phenotyping for all but3specimens(two of which PCR was positive but not included in the panel of probes and one in which PCR was positive,but cul2 ture was negative)1Conclusion　The PCR2reverse blot hybridization assay is a simple,rapid,and accurate method that seems to be suitable for routine use in clinical laboratories1

KE Y WOR DS:Polymerase chain reaction;Reverse blot hybridization;Oligonucleotide probe;Medical fungi;Biotin

近年来,机会性真菌感染呈不断上升趋势,这主要归因于器官移植、骨髓移植的广泛开展,艾滋病患者的大量增多及皮质类固醇激素、免疫抑制剂和广谱抗生素的应用等;另外不同真菌菌种对抗真菌药物具有不同的天然耐药性,这就要求实验室不仅快速检出感染的病原菌,而且还应准确鉴定到种,才能使临床采取有效措施控制感染。目前真菌的分离培养鉴定仍是主要诊断方法,但存在耗时长且不敏感等问题。为建立快速、敏感、特异的检测与鉴定方法,我们用真菌通用引物扩增广范围医学真菌的细胞色素P450羊毛固醇-14α-去甲基化酶(L1A1)基因的一个片段(约350bp)。通用引物以生物素标记,结合种特异性探针进行反向斑点杂交,可鉴定临床常见的8种真菌,其中包括近年来新发现的都柏林念珠菌。

1　材料和方法

作者单位:11中国人民解放军第254医院检验科,天津　300142;

21军事医学科学院附属医院

111　材料

11111　菌种　白念珠菌A TCC14053、光滑念珠菌A TCC701、热带念珠菌A TCC01463、克柔念珠菌A TCC6258、假热带念珠菌A TCC28838、近平滑念珠菌PTF11501、解脂念珠菌PTF11801、季也蒙念珠菌、新型隐球菌、都柏林念珠菌、乳酒念珠菌、无名念珠菌。

细菌包括大肠埃希菌、绿脓假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、阴沟肠杆菌、淋病奈瑟菌、化脓链球菌等7种临床常见的细菌。

11112　引物与寡核苷酸探针　真菌通用引物和8种种特异性探针序列见参考文献〔1〕,其中通用引物P45015′端以生物素标记,引物与探针的序列见表1。

表1　真菌通用引物和特异性寡核苷酸探针序列

T able1　Sequences of universal fungal primers and specif ic oligonucleotide probes Primers and fungal species Sequences of universal primers and specific oligonucleotide probes Universal primers

P45015′-A TG ACT G A T CAA G AA A T Y GCT AA-3′

P45025′-TAA CCT GG A G AA ACY AAA AC-3′

Fungal species

Cryptococcus neof orm ans5′-GGT TG A TCA TCG ACC A TG TC-3′

Candida parapsilosis5′-GTT GCC ACC TTT ACC A G A-3′

Candida guilliermondii5′-TA T A TT TGT TCG GTG A TC TTA A-3′

Candida dubliniensis5′-ACC TTC TGT TAC TAA TAC TA T-3′

Candida krusei5′-TCA CCT AAA ACC G A T TGG-3′

Candida t ropicalis5′-CAC CCT TTT CTT TCA ACA A-3′

Candida albicans5′-CA G GG A TTC TTA A TG GGT-3′

Candida glabrata5′-C T T GGT A TC GT T GT T CA A GA-3′

11113　Taq酶、末端脱氧核苷酸转移酶(T d T)　购自上海生工生物工程技术服务有限公司。11114　硝酸纤维素膜(N C膜)　孔径012μm,购自北京鼎国生物技术公司。

11115　链酶亲和素标记的碱性磷酸酶(S A-A P)　购自北京中山生物技术有限公司

112　方法

11211　真菌DN A的提取　见文献〔2〕。

11212　PCR扩增方法　50μl反应体系中含KCl 50m mol/L,T ris-HCl10m mol/L,T ritonX-100 011%,M gCl2210m mol/L,p H910,dN T Ps各200m mol/L,Taq酶2U,引物1与引物2各50ng,模板DN A5μl;扩增条件为94℃预变性5mi n,然后经35个循环,每个循环为94℃变性45s,50℃退火60s,72℃延伸60s,最后72℃再延伸6mi n。扩增完毕取10μl行115%琼脂糖凝胶电泳观察结果。11213　探针加尾　T d T酶60U,加入200pmol的寡核苷酸探针,用去离子水补至100μl,混匀后放37℃孵育120mi n。

11214　固定探针　用5×S S C/015%S DS在55℃洗膜30mi n,再用封闭液与膜42℃作用40mi n,此膜可立即杂交或用去离子水浸泡后晾干备用。11215　杂交　将点有8种探针的N C膜放入杂交袋中,加入预杂交液(5×S S C,5×Denhardt′s,015% T riton X-100),50℃预杂交30m i n,然后加入12μl 变性PCR产物50℃杂交60m i n。用2×S S C/ 011%S DS洗液于杂交温度漂洗2次,各5m i n;1×S S C/011%S DS于37℃漂洗2次,各5m i n;011×S S C/011%S DS室温漂洗2次,各5m i n。

11216　显色　S A-A P用稀释液按1∶500配制(稀释液成分与封闭液相同,只3%B S A浓度调至011%),将1m l稀释的S A-A P加入杂交袋中,与杂交后的膜37℃孵育30m i n,轻摇,用稀释液室温洗膜2次,各5m i n,然后封膜于2m l显色液(含NB T和B CI P各10ul)〔3〕,混匀,室温避光30m i n,待DN A斑点呈深兰色,本底未显色时,用蒸馏水洗膜以终止反应。

2　结 果

211　通用引物PCR扩增的广谱性　对于12种临床常见的酵母样真菌,包括光滑念珠菌、近平滑念珠菌、白念珠菌、热带念珠菌、解脂念珠菌、假热带念珠菌、都柏林念珠菌、新型隐球菌、季也蒙念珠菌、克柔念珠菌、无名念珠菌、乳酒念珠菌均可用真菌通用引物扩增出一条约350bp的DN A带(图1)。

图1　真菌通用引物扩增12种真菌DNA的产物电泳图谱Fig11　Agarose gel eletrophoresis patterns of PCR products of species of medical important fungi

Lanes:1C1glabrata;2C1parapsilosis;3C1albicans;4

C1tropicalis;5C1liplytica;6C1pseudotropicalis;7

C1dubliniensis;8Cryptococcus neoformans;9

C1guilliermondii;10C1krusei;11C1famata;12

C1kefyr;13Negative control;14Marker:DL2000

212　通用引物扩增的特异性　用该引物扩增临床常见的细菌,大肠埃希菌、绿脓假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、阴沟肠杆菌、淋病奈瑟菌、化脓链球菌DNA,人白细胞DNA,结果均为阴性(图2)

。

图2　真菌通用引物扩增的特异性电泳图谱

Fig12　eletrophoresis patterns of specif icity for PCR

Lanes:1Escherichia1coli;2Pseudomonas1Aeruginosa;3

Staphylococcus aureus;4K lebsiella1Pneumoniae;5En2

terobacter1Cloacae;6Neisseria1G onorrhoeae;7Strepto2

coccus1Pyogenes;8Human leukocyte DNA;9Negative

control;10C1albicans;11Marker:DL2000

213　反向斑点杂交的结果　将固定于膜上的8种特异性探针与PCR扩增产物进行反向杂交,结果表明8种探针均具有高度的特异性,即每种特异性探针只与其对应的真菌DNA杂交,而不和其它菌杂交。8种真菌的PCR产物,与膜上固定的8种探针杂交,结果在其种特异性探针的位置上均出现杂交斑点(图3),表明此方法可同时检测几种菌的混合感染

。

图3　8种特异性探针与PCR扩增产物杂交结果

Fig13　Analysis by reverse cross blot hybridization of PCR products from8yeast species

Lanes:11C1neoformans clinical isolate;

21C1parapsilosis PTF11501;31C1guilliermondii clini2

cal isolate;41C1krusei A TCC6258;51C1dubliniensis

clinical isolate;61C1tropicalis A TCC01463;

71C1albicans A TCC14053;81C1glabrata A TCC7011

214　临床分离菌株的检测　25例临床分离菌株用PCR-反向斑点杂交法鉴定,其中包括白念珠菌14株,光滑念珠菌6株,热带念珠菌1株,近平滑念珠菌2株。鉴定结果与临床实验室分离鉴定结果一致,表明探针具有高度特异性。另外临床分离并鉴定出乳酒念珠菌1株,无名念珠菌1株,因本实验未设计其特异性探针而不能进行反向杂交鉴定到种,但这2株菌通用引物PCR扩增的结果为阳性。215　39例血液病,肿瘤,放射性肺炎病人的血液、痰、咽拭子等标本分别用PCR-反向斑点杂交法和真菌培养法(API20C)鉴定培养法检测真菌感染12例,阳性率3018%,PCR-反向杂交法检测阳性13例,阳性率3313%。培养阳性的12例,PCR-反向杂交法检测亦阳性。1例血液标本PCR结果为阳性,进一步作杂交则鉴定为白念珠菌,而此临床标本培养结果为阴性。因此真菌培养与PCR-反向杂交法结果基本一致,符合率为9213%。PCR扩增为阳性的临床标本,进一步作反向杂交鉴定到种,杂交结果与培养鉴定结果一致。

3　讨 论

P450L1A1基因是真菌特有的,它是催化羊毛固醇转化成麦角固醇的酶,麦角固醇是真菌细胞膜的必要成分。这一段基因是高度保守的,但在其中还存在特定的核苷酸改变,这些可变区域用来设计种特异性寡核苷酸探针。对于反向杂交来说,设计的前提条件是这些探针必须能够在同一杂交条件下进行杂交分析。经实验验证每一种探针均特异地与相应菌的PCR产物结合显色,而不与其它菌的PCR 产物反应。另外,此方法能很好地鉴别都柏林念珠菌和白念珠菌,这两种菌在形态及生化反应等方面具有相同或相似的特征,难以用一般的鉴定方法区分。

以分子生物学为基础的非培养方法检测真菌,以前多采用种特异性引物对标本进行扩增检测。如果PCR结果阳性则表明标本中有该菌存在,此方法大多用于白念珠菌的检测,如果检测结果为阴性,则不能排除其它真菌感染的可能。而且由于单纯用PCR方法由于其敏感性高而易导致假阳性结果,使得这一方法的使用受到限制。此外,不同种的念珠菌对抗真菌药物的敏感性不同〔4〕,只有将其鉴定到种水平才能为临床提供准确的试验结果。因此,近年来多应用通用引物PCR扩增广范围的真菌DNA,再通过各种分子生物学方法进一步将PCR产物鉴定至种。本文采用Posteraro等人〔1〕的方法,结合本医院实际临床感染情况,选定临床常见的7种真菌和近年来在艾滋病病人中分离出的都柏林念珠菌的种特异性探针进行实验分析,实验结果与文献〔1〕基本一致。为了使这一方法更为适用于临床,在提取临床标本中的真菌DNA(主要是血液中的真菌DNA)时,我们采用了一种简便方法,使提取过程缩短至2～3h即可完成。

PCR-反向斑点杂交法有如下优点:1、可同时分析几种来自不同标本的PCR产物;2、结果容易判断;3、该方法操作简单,无需特殊设备;4、探针经加尾后固定于膜上,此膜可干燥后储存备用。检测时,只需加入PCR产物进行杂交,然后加酶显色即可。这样可节省制备膜的时间,减少操作步骤;5、对于混合感染能更好地鉴定;6、如果杂交结果为阴性,通用引物PCR阳性提示病人有其它真菌感染的可能性,应引起临床重视(应在严格控制实验条件排除污染的前提下)。目前常用的真菌培养法需要3-7天的时间才能得到结果,采用PCR-反向斑点杂交法可在2天内完成,为病人的及时治疗争取了时间。

值得注意的是PCR扩增方法可以检出极微量的真菌DNA,非常敏感,因此在检测的全过程中,即DNA提取、PCR扩增、杂交时均要设立阴性对照以避免出现假阳性结果。对有念珠菌正常寄居的标本如痰等,应结合病人临床表现和其它检查指标,才能得出准确的结论。对于在检测中所用探针种类可根据本地区及本医院的真菌感染情况予以确定。

本实验初步探讨了PCR-反向斑点杂交方法快速检测与鉴定临床常见真菌的可行性,若经大量临床标本尤其是血液、脑脊液等正常无菌部位的标本作进一步的验证,可望成为一种较为快速、敏感和特异的临床诊断方法。

参考文献:

〔1〕Posteraro B,Sanguinetti M,Masucci L,et al1Reverse cross blot hy2 bridization assay for rapid detection of PCR-amplified DNA from Candida species,Cryptococcus neoformans,and Saccharmyces cere2 visiae in clinical samples〔J〕1J Clin Microbiol,2000,38:1609-16141

〔2〕Morce G,Sanguinetti M,Posteraro B,et al1Identification of various medically impoprtant Candida species in clinical specimens by PCR-

restrication enzyme analysis〔J〕1J Clin Microbiol,1997,35:667-6721

〔3〕姜　泊,张亚历,周殿元1分子生物学实验方法〔M〕1北京:人民军医出版社,1996,116-1171

〔4〕Pfaller MA1Nosocomial fungal infections:epidemiology of candidasis 〔J〕1J Hosp Infect,1995,30Suppl:329-3381

收稿日期:2003-02-17;修回日期:2003-05-12

乙型肝炎病毒基因分型检测标准操作规程(PCR-反向斑点杂交法)

乙型肝炎病毒基因分型检测标准操作规程（PCR-反向斑点杂交法） 1.目的:乙型肝炎病毒基因分型检测标准操作规程，保证检测结果的准确性。 2.应用范围: PCR实验室。 3.职责: 3.1 文件编写：实验室技术员。 3.2 文件审核：实验室主管。 3.3 文件审批：实验室主任。 3.4 执行：PCR实验室所有工作人员。 4. 参考文献: 4.1《中山大学达安基因股份有限公司乙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒说明书》 4.2 中山大学达安基因股份有限公司核酸扩增荧光检测系统DA7600型使用说明书 5. 内容: 5.1 检测方法：PCR-反向斑点杂交法。 5.2 实验原理：选取人乙型肝炎病毒基因组中编码表面抗原的S基因的编码区为扩增区域，设计特异性引物及B，C，D型特异性探针，预先将特异性探针包被在尼龙膜上，再利用生物素标记的引物对靶片段进行PCR扩增，PCR产物和膜条上的特异性探针杂交，靶标中的型特异性片段会和特异性探针结合，未结合的PCR 产物通过洗膜去除，最后进行显色和结果分析，可检测HBV B、C、D三种基因型DNA. 5.3 标本采集：由合作单位按照以下要求进行采集。 5.3.1 标本类型：血清。 5.3.2 标本采集：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2ml，注入无菌的干燥玻璃管，室温（22～25℃）放置30～60 min，全血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1,500 rpm离心5min；吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管。 5.3.3 标本保存：标本采集后保存于2～8℃。 5.3.4 运送条件：标本运送采用冰壶。 5.3.5 标本拒收标准：污染、严重溶血、脂血类或肝素抗凝剂标本。 5.4 设备和试剂: 5.4.1 设备： DA7600 PCR仪、低速水平离心机、生物安全柜、台式高速离心机、移液器、混匀器、恒温水浴箱/干式恒温器、冰箱（4℃、-20℃）、移动/固定紫外灯、冷冻离心机。 5.4.2 试剂： 5.4.2.1 试剂品牌：中山大学达安基因股份有限公司乙型肝炎基因分型检测试剂盒 5.5.2.2 试剂组成：DNA 浓缩液（2,000μL/管）1 管；DNA 提取液（500μL/管）1 管；HBV 基因分型突变反应管（未贴标签管）10 人份；HBV 基因分型阳性质控品（50μL/管）1管，HBV 基因分型突变阴性质控品（50μL/管）1管，杂交液Ⅰ浓缩液（50ml/瓶）1瓶，杂交液Ⅱ浓缩液（30ml/瓶）1瓶，溶液Ⅰ（100

酵母的分子生物学鉴定

生物技术通报 ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＢＵＬＬＥＴＩＮ ?技术与方法? ２００８年第５期 收稿日期：２００８－０３－１４ 基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３）项目基金（２００３ＡＡ２１４０６１，２００６ＡＡ０２０２０３） 作者简介：唐玲（１９８３－），女，硕士研究生，研究方向：分子生物学；Ｅ－ｍａｉｌ：ｔａｎｇｌｉｎｇ１０１４９９＠１６３．ｃｏｍ通讯作者：闫云君（１９６９－），男，教授，博士生导师；Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｙｕｎｊｕｎ＠ｔｏｍ．ｃｏｍ；Ｔｅｌ：（０２７）８７７９２２１４ 酵母种类繁多，不仅作为一种重要的工业微生物被广泛应用于各个领域，近年来，人们还利用酵母发酵来生产抗生素，维生素和酶等高附加值的产品，但酵母也会引发食物、制造物的腐坏变质，从而给人们带来巨大的经济损失，有的酵母还是人体和动物的致病菌（如，Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）。近两个世纪以来，酵母菌分类主要依据形态学鉴定和生理生化特性。目前，已发展起来各种用于酵母快速检测的商业化的试剂盒，可实现部分酵母（多是针对导致疾病的部分致病酵母）的鉴定，但是该类试剂盒对酵母的检测不仅费时，而且鉴定结果准确性不高。由于受到环境因素的影响，某些酵母菌属、种在形态学及生理生化特性方面差异极不显著，在这样的背景下，以化学为基础的分类法建立起来，通过细胞壁的成份、生物合成以及同功酶电泳图谱分析来 对酵母进行分类鉴定。现在，随着分子生物学的发展，ＤＮＡ－ＤＮＡ杂交，染色体组型分析（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｋａｒｙｏｔｙｐｉｎｇ），染色体ＤＮＡ的限制性片段长度的多 态性分析（ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎＦｒａｇｍｅｎｔＬｅｎｇｔｈＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍａ ｏｆｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌＤＮＡ），线粒体ＤＮＡ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＤＮＡ）及核糖体ＤＮＡ序列分析（ｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ），实时ＰＣＲ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ），基因芯片 （ｇｅｎｅｃｈｉｐｓ）等分子生物学的方法广泛地应用于酵母的鉴定中。分子生物学的方法不仅能够快速的将各种酵母鉴定到属或种，而且鉴定的结果精确度更高。随着数据库中分子信息量的增加，近年来应用分子生物学技术鉴定酵母菌种的研究越来越广泛。 １核糖体ＤＮＡ鉴定法 核糖体ＤＮＡ普遍存在于生物中，真核生物的 核糖体ＲＮＡ中包括２６Ｓ、１８Ｓ、５．８Ｓ和５Ｓ４种不同 酵母的分子生物学鉴定 唐玲 刘平黄瑛杨江科闫云君 （华中科技大学生命科学与技术学院分子生物物理教育部重点实验室，武汉４３００７４） 摘 要： 酵母种类繁多，与人类的关系极其密切，但目前由于研究方法的不同，对于酵母的分类还存在着不同的分 类体系。而准确快速的对酵母进行鉴定，既可以有效防止食品腐化变质，又可以增加经济效益，同时也为酵母的分类鉴定奠定一定的理论基础。对常用的核糖体ＤＮＡ鉴定法、ＤＮＡ指纹图谱鉴定、脉冲场电泳鉴定、实时ＰＣＲ和基因芯片等分子生物学鉴定方法在酵母鉴定工作中的研究情况进行了比较。 关键词： 核糖体ＤＮＡ ＤＮＡ指纹图谱脉冲场凝胶电泳实时ＰＣＲ基因芯片 ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒＹｅａｓｔ ＴａｎｇＬｉｎｇＬｉｕＰｉｎｇＨｕａｎｇＹｉｎｇＹａｎｇＪｉａｎｇｋｅＹａｎＹｕｎｊｕｎ （ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，ＨｕａｚｈｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ４３００７４） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｙｅａｓｔｓｈａｖｅｗｉｄｅｒａｎｇｅａｎｄａｒｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｔｏｈｕｍａｎｂｅｉｎｇｓ．Ｔｈｅｒｅｅｘｉｓｔｓｏｍｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｓｏｆ ｙｅａｓｔｓｂａｓｅｄｏｎｒｅｓｅａｒｃｈｍｅｔｈｏｄｓ．Ｉｔｉｓｎｅｃｅｓｓａｒｙｔｏｆｉｎｄａｎａｃｃｕｒａｔｅａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔｍｅｔｈｏｄｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｙｅａｓｔｓ，ｔｈｕｓｂｅｉｎｇａｂｌｅｔｏｐｒｅｖｅｎｔｆｏｏｄｃｏｒｒｕｐｔｉｏｎ，ａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｅｃｏｎｏｍｉｃｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ａｌｓｏ，ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｂｏｕｔｔｈｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｏｕｌｄｂｅｐｒｏｖｉｄｅｄ．Ｔｈｉｓｐａｐｅｒｄｅｓｃｒｉｂｅｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｙｅａｓｔ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡ，ＤＮＡｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ，ｐｕｌｓｅｄｆｉｅｌｄｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲａｎｄｇｅｎｅｃｈｉｐｓ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ： ＲｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡＤＮＡｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇＰｕｌｓｅｆｉｅｌｄｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ Ｇｅｎｅｃｈｉｐｓ

菌种鉴定

?（1）常规鉴定 常规鉴定内容有形态特征和理化特性。形态特征包括显微形态和培养特征；理化特性包括营养类型、碳氮源利用能力、各种代谢反应、酶反应和血清学反应等。 ?（2）BIOLOG碳源自动分析鉴定 BIOLOG鉴定系统以微生物对不同碳源的利用情况为基础，检测微生物的特征指纹图谱，建立与微生物种类相对应的数据库。通过软件将待测微生物与数据库参比，得出鉴定结果。 该系统已获美国FDA认可，已逐步应用于食品和饮品企业、环保、海洋生物/水产品、制药、农业微生物、生物治理、化妆品、临床等领域的微生物鉴定试验中。 CICC拥有国内最全的BIOLOG数据库，涉及革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、厌氧菌、酵母、丝状真菌在内近2000种微生物。 ?（3）分子生物学鉴定 应用分子生物学方法从遗传进化角度阐明微生物种群之间的分类学关系，是目前微生物分类学研究普遍采用的鉴定方法。CICC拥有微生物菌种分类鉴定的分子生物学实验室，配有PCR仪、高速冷冻离心机、电泳仪、HPLC、凝胶成像系统、紫外控温分析系统等先进仪器设备，以及DNAMAN、 BIOEDIT、CLUSTALX、TREEVIEW等序列分析软件。目前CICC可采用核酸序列分析法分析细菌16S rDNA/16S-23S rDNA区间序列、酵母18S rDNA/26S rDNA（D1/D2）序列及丝状真菌的18S rDNA/ ITS1-5.8S-ITS2序列，提供科学的鉴定结果。 ?（4）API细菌数值鉴定系统 API鉴定系统涵盖15个鉴定系列，约有1000种生化反应，目前已可鉴定超过600种的细菌。鉴定过程中，可根据细菌所属类群选择适当的生理生化鉴定系列，通过软件将待测细菌与数据库参比，得出鉴定结果。 CICC目前可应用API 50CH系列、API 20 E系列、API Staph系列对乳酸杆菌（Lactobacillus sp.）和相关细菌、芽孢杆菌（Bacillus sp.）、葡萄球菌属（Staphylococcus sp.）、微球菌属（Micrococcus sp.）和库克菌属（Locuria sp.）进行鉴定。 ?（5）功能性分析及功能基因

习题2核酸分子杂交技术

第二章核酸杂交技术 （一）名词解释 1．原位杂交 2．核酸分子杂交技术 3．探针 4．反向点杂交 5．缺口平移标记法 6．随机引物标记法 7．末端标记法 8．Southern blot杂交 9．荧光原位杂交 10．菌落杂交 （二）选择题 【A型题】 1．DNA链的Tm值主要取决于核酸分子的（） A G－C含量 B A－T含量 C A－G含量 D A－C含量 E T－G含量 2．液相杂交是下列哪一种（） A Southem印迹杂交 B Northem印迹杂交 C Dot印迹杂交 D Slot印迹杂交 E RPA实验 3．研究得最早的核酸分子杂交种类是（） A 菌落杂交 B Southern杂交 C Northern杂交 D 液相杂交 E 原位杂交 4．Southern杂交通常是指（） A DNA和RNA杂交 B DNA和DNA杂交 C RNA和RNA杂交 D 蛋白质和蛋白质杂交 E DNA和蛋白质杂交 5．最容易降解的核酸探针是( ) A cDNA探针 B dsDNA探针 C ssDNA探针 D gDNA探针 E: RNA 6．探针基因芯片技术的本质就是（） A 核酸分子杂交技术 B 蛋白质分子杂交技术 C 聚合酶链反应技术 D 基因重组技术 E 酶切技术 7．DNA探针的长度通常为( ) A 1000 ～ 2000个碱基 B 500 ～ 1000个碱基 C 400 ～ 500个碱基 D 100 ～ 400个碱基 E. <100个碱基 8．寡核苷酸探针的最大的优势是（） A 杂化分子稳定 B 可以区分仅仅一个碱基差别的靶序列 C 易标记 D 易合成 E 易分解 9．在Southern印迹中常用的核酸变性剂是( ) A 甲醛

第五章 核酸杂交 学习小结

第五章核酸杂交 一、学习目标 掌握掌握核酸分子杂交的类型；Southern印迹杂交技术、Northern印迹杂交技术、点杂交技术包括反向点杂交技术和荧光原位杂交技术的基本概念、原理、技术流程及临床应用。 熟悉镰状细胞贫血症的分子杂交检验技术、主要流程及结果分析。 了解Western印迹杂交技术在艾滋病检验中的重要应用。 二、重点和难点内容 （一）原理 1.Southern印迹杂交技术是指利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。 2.Northern印迹杂交技术Northern印迹杂交和Southern印迹杂交的过程基本相同，区别在于靶核酸是RNA而非DNA。

3.荧光原位杂交技术是指应用核酸探针与组织或细胞中的核酸按碱基配对原则进行特异性结合形成杂交体，然后应用组织化学或免疫组织化学方法在显微镜下进行细胞内定位的检测技术。用荧光素标记探针进行的原位杂交技术称为荧光原位杂交技术。 （二）核酸分子探针的分类 1.DNA探针是指长度在几百碱基对以上的双链DNA 或单链DNA片段，是最常用的核酸探针。 2.RNA探针可以是标记的分离的RNA，但常常是重组质粒在RNA聚合酶作用下的转录产物。 3.寡核苷酸探针一般由17～50个核苷酸组成。可以是寡聚脱氧核糖核酸、寡聚核糖核酸，也可以是修饰后的肽核酸。多聚脱氧核糖核酸是常用的寡核苷酸探针，易于大批量生产和标记。 （三）核酸分子杂交的临床应用 1.Southern印迹杂交的临床应用 （1）单基因遗传病的基因诊断 （2）基因点突变的检测 2.Northern印迹杂交的临床应用 （1）RNA病毒的检测 （2）基因表达的检测 3.反向点杂交的临床应用

真菌学实验指导

本课程，本课程是大学本科生物技术、生物科学专业的选修课程。介绍真菌分类现状、分类方法（包括传统与现代分类方法的比较）、分类依据及其原则。本课程的教学不限于介绍研究的成果，重在介绍分析和解决问题的方法，以培养学生分析问题和创新的能力。所以在理论学习的同时开设综合性实验，培养学生观察、分析和动手能力。基本掌握真菌分离、鉴定的方法，并应用于真菌其它领域的研究。 本指导书适用于生物技术和生物科学专业。

1、实验：内生真菌的分离及鉴定 ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????3 2、实验报告基本内容要求 ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????7 3、实验报告格式????????????????????????????????????????????????????????????????8

实验内生真菌的分离及鉴定 实验学时：18 实验类型：综合 实验要求：选修 一、实验目的 1.了解真菌形态的基本特征。 2.掌握丝状真菌制片方法和真菌鉴定方法。 二、实验内容 采集植物样品包括叶、茎、根、花、种子或果实，然后对分离样品的内生真菌，并进行形态和分子生物学方法的鉴定。 三、实验原理、方法和手段 （一）实验原理 根据真菌的形态特征和ITS序列等分子证据对分离到真菌进行归类和鉴定。 （二）实验手段和方法 1、内生真菌分离纯化方法 1.1样品的表面消毒及预处理 分别取根、茎、叶、果实，用洗涤剂在自来水下洗净。 老树皮用75%酒精进行表面消毒后，用镊子取出，于酒精灯上烧灼15秒至表面焦糊，切成1×1cm2大小置于PDA固体培养基上。 对于根、茎、叶、果实按下列程序进行表面消毒： 75%的酒精漂（浸）洗2-3min→无菌水冲洗4-6次→0.1%升汞不同的消毒时间（共设置7个梯度）→无菌水冲洗4-6次→用灭菌滤纸吸干多余水分→无菌刀片将材料切成小块 将根、茎的表皮、韧皮部、木质部大致分开，并切成0.5×0.5cm2大小。将果实的外种皮去掉，消毒之后将内种皮去掉。 灭菌时，沥干的植物材料转放到烧杯中，记好时间，倒入消毒溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡，使消毒彻

习题2核酸分子杂交技术

. 第二章核酸杂交技术 （一）名词解释 1．原位杂交 2．核酸分子杂交技术 3．探针 4．反向点杂交 5．缺口平移标记法 6．随机引物标记法 7．末端标记法 8．Southern blot杂交 9．荧光原位杂交 10．菌落杂交 （二）选择题 【A型题】 1．DNA链的Tm值主要取决于核酸分子的（） A G－C含量 B A－T含量 C A－G含量 D A－C含量 E T－G含量 2．液相杂交是下列哪一种（） A Southem印迹杂交 B Northem印迹杂交 C Dot印迹杂交 D Slot印迹杂交 E RPA实验 3．研究得最早的核酸分子杂交种类是（） A 菌落杂交 B Southern杂交 C Northern杂交 D 液相杂交 E 原位杂交 4．Southern杂交通常是指（） A DNA和RNA杂交 B DNA和DNA杂交 C RNA和RNA杂交 D 蛋白质和蛋白质杂交 E DNA和蛋白质杂交 5．最容易降解的核酸探针是( ) A cDNA探针 B dsDNA探针 C ssDNA探针 D gDNA探针 E: RNA 6．探针基因芯片技术的本质就是（） A 核酸分子杂交技术 B 蛋白质分子杂交技术

. C 聚合酶链反应技术 D 基因重组技术 E 酶切技术 7．DNA探针的长度通常为( ) A 1000 ～2000个碱基 B 500 ～1000个碱基 C 400 ～500个碱基 D 100 ～400个碱基 E. <100个碱基 8．寡核苷酸探针的最大的优势是（） A 杂化分子稳定 B 可以区分仅仅一个碱基差别的靶序列 C 易标记 D 易合成 E 易分解 9．在Southern印迹中常用的核酸变性剂是( ) A 甲醛 B 乙醛 C 氢氧化钠 D 碳酸钠 E 盐酸 10．盐酸硝酸纤维素膜最大的优点是（） A 脆性大 B 本底低 C 共价键结合 D 非共价键结合 E 高结合力 11．最常用的DNA探针标记方法是( ) A 随机引物 B 切口平移 C 3′-末端标记 D 5′-末端标记 E PCR法 12．为了除去探针，重复使用滤膜，以下哪种情况不可以发生（） A 探针在预杂交与除去探针之间的过程中曾经干燥过 B 探针在预杂交与除去探针之间的过程中曾经湿润过 C 探针在预杂交与除去探针之间的过程中曾经温浴过 D 探针在预杂交与除去探针之间的过程中曾经漂洗过 E 探针在预杂交与除去探针之间的过程中曾经标记过 13．5′一末端的DNA探针标记主要依靠的酶是( ) A T4多聚核苷酸激酶 B 末端转移酶 C AKP

利用ITS序列鉴定真菌

北方民族大学实验论文 题目：利用ITS序列鉴定真菌 学院：生物科学与工程学院 专业：生物技术 班级： 082 姓名：李晓飞李妍吾木尔古丽 张瑞莉陈波艾克拜尔 指导老师：刘建利 完成日期：2011年5月18日——2011年6月5日

利用ITS序列鉴定真菌 李晓飞李妍吾木尔古丽张瑞莉艾克拜尔陈波 （北方民族大学生物科学与工程学院银川750021） 摘要：采用实验室提供的两株酵母菌，活化培养后，经基因组DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测，以ITS1和ITS2为引物构成的PCR反应体系对目的DNA片段（ITS1区）进行扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测后送至测序公司测序，所测序列经Genbank比对后，两株菌分别为掷孢酵母属TY-241菌株(Sporobolomyces sp)和假丝酵母ST-50菌株（Candida sp）。 关键词：ITS序列酵母菌PCR 菌种鉴定 1 材料与方法 1.1试验材料与试剂 实验室提供的红色掷孢酵母菌[1]和白色产香酵母菌。 YEPD液体培养基[2]配方：酵母浸粉10g，葡萄糖20g，蛋白胨20g，配成1L溶液，分装100/250ml，121℃灭菌15min。 裂解液[3]：1L裂解液中需加Tris1.2114g，EDTA8.767g，SDS5g，用1M的NaOH调至8.0，121℃灭菌30min备用。 醋酸钾溶液：1L溶液中含醋酸钾245.35g。 氯仿-异戊醇（24：1）：现配现用。 70%乙醇：用95%乙醇配制，现配现用。 10×TAE溶液：1L溶液中含Tris1.2114g，EDTA29.22g，用HCl调pH至8.0。 1%琼脂糖凝胶：取1g琼脂糖溶于100ml1×TAE溶液中，微波炉加热至沸腾三次。1.2主要仪器与设备 表一实验中使用的主要仪器 仪器名称型号产地 立式自控高压蒸汽灭菌器LDZX-40SSI 上海申安医疗器械厂 数显恒温水浴锅HH-4 国华电器有限公司 电泳仪DYY-12 北京市六一仪器厂 制冰机AF200PSC50R ΜSA 生物安全柜HFsafe 1200/C 上海力申科学仪器有限公司电冰箱BCD-219D 青岛海尔股份有限公司Sigma高速离心机3K30 Germany 电子精密天平HR-200 上海精科天平 酸度计DELTA302 上海 电子可调电炉101RF-3 天津市泰斯特仪器有限公司双层恒温振荡器THZ-9511K 太仓市实验设备厂 紫外分析仪WD-9403C 北京市六一仪器厂

菌种鉴定方法及手段 真菌细菌检测

菌种鉴定方法及手段真菌检测/细菌检测 菌种鉴定一般就只要提取基因组DNA，然后PCR扩增16srDNA片段，上GeneBank 或者Eztaxon对比即可。一般序列相似度在97%以上就可以认为是同种细菌。 常规鉴定 常规鉴定内容有形态特征和理化特性。形态特征包括显微形态和培养特征；理化特性包括营养类型、碳氮源利用能力、各种代谢反应、酶反应和血清学反应等。 自动鉴定 BIOLOG鉴定系统以微生物对不同碳源的利用情况为基础，检测微生物的特征指纹图谱，建立与微生物种类相对应的数据库。通过软件将待测微生物与数据库参比，得出鉴定结果。该系统已获美国FDA认可，已逐步应用于食品和饮品企业、环保、海洋生物/水产品、制药、农业微生物、生物治理、化妆品、临床等领域的微生物鉴定试验中。拥有国内最全的BIOLOG数据库，涉及革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、厌氧菌、酵母、丝状真菌在内近2000种微生物。 分子生物学鉴定 应用分子生物学方法从遗传进化角度阐明微生物种群之间的分类学关系，是微生物分类学研究普遍采用的鉴定方法。科标生物检测中心拥有微生物菌种分类鉴定的分子生物学实验室，配有PCR仪、高速冷冻离心机、电泳仪、HPLC、凝胶成像系统、紫外控温分析系统等先进仪器设备，以及DNAMAN、BIOEDIT、CLUSTALX、TREEVIEW等序列分析软件。可采用核酸序列分析法分析细菌16S rDNA/16S-23S rDNA区间序列、酵母18S rDNA/26S rDNA（D1/D2）序列及丝状真菌的18S rDNA/ITS1-5.8S-ITS2序列，提供科学的鉴定结果。API细菌鉴定 API鉴定系统涵盖15个鉴定系列，约有1000种生化反应，已可鉴定超过600种的细菌。鉴定过程中，可根据细菌所属类群选择适当的生理生化鉴定系列，通过软件将待测细菌与数据库参比，得出鉴定结果。可应用API50CH系列、API20E系列、API Staph系列对乳酸杆菌（Lactobacillus sp.）和相关细菌、芽孢杆菌（Bacillus sp.）、葡萄球菌属（Staphylococcus sp.）、微球菌属（Micrococcus sp.）和库克菌属（Locuria sp.）进行鉴定。 技术分析 功能性分析及功能基因不断致力于工业微生物资源的功能及其功能基因研究，通过木聚糖酶、纤维素酶、葡萄糖异构酶、β-甘露聚糖酶等功能基因的克隆进行菌种产酶的功能性

反向斑点杂交

核酸杂交技术根据检测目的和检测手段的不同，可分为液相杂交、固相杂交及细胞内定位(原位)杂交。固相杂交又可分为斑点杂交、凝胶电泳印迹转移杂交。而反向斑点杂交(reverrsedotblot，RDB)是Saiki等提出的一种斑点杂交技术，该技术较正向斑点杂交和凝胶电泳印迹转移杂交具有快速、简便、高敏感性、特意性强的特点，尤其是基因分型、基因突变检测，病原体的检测等方面有其独特的优势。 1 检测原理 反向斑点杂交工作原理，利用生物素等标记的探针和特意性扩增PCR产物(靶DNA序列)杂交。但是不同于一般的斑点杂交。一般的点印迹杂交是靶DNA固定于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，标记的探针和靶DNA杂交显色。这种方法每次杂交反映只能判断待测DNA是否含有某一种探针的同源序列，对于某些基因座位可能含有十几至几十个等位基因(如HLADRB位点或地中海贫血突变基因等)，用这种点杂交方法就会很繁杂，甚至可能做不到。而RDB正是解决了这一难题。RDB是先将待用的探针分别点到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，每个探针一个点并编上号，再将待测的DNA样本(一般是经PCR特意性扩增的产物，在PCR 引物5’端预先进行生物素标记，使扩增产物相应标记有生物素)与之杂交，这样待检样本就会与具有同源序列的探针结合，经洗涤去除未结合的DNA样本，由于待测的DNA样本具有生物素类的标记物，结合了待测DNA的探针点上就带有生物素类的标记物，再经相应的显色反应就能显出杂交信号。这样一次就可以判断某一基因座位的大部分或全部等位基因，因此利用这样的工作原理还可以用于基因分型、病原体检测、肿瘤研究等。 2 RDB检测 RDB是将多种探针固定在同一膜上，同时参与检测的样品DNA又互不干扰，故能一次性筛查出多种不同的序列，而不是像传统的杂交法，一次仅能检测一个未知序列。同一条膜上的多种探针同时与不同扩增的PCR产物进行杂交，并要求所有结合于膜上的探针应有大约相同的Tm值。因此尽可能使设计的探针Tm值变动在较小范围内。降低了假阳性率和假阴性率。本法操作安全、简单、快捷，膜条植被时间较短，只需几小时，可大量预先制备放于4 ℃保存待用。PCR扩增产物目的片段后，仅需杂交、洗膜(实现了洗膜条件同一化，无需不同洗膜条件)、显色、结果判定。应用凯普HybrimaxDNA快速杂交仪使整个杂交过程在1.5 h即可完成。既适用于少量标本的分型检测，也可适用于大量标本的同时分型，具有敏感性高、特异性强、稳定性好的特点。 3 应用范围 由于RDB具有高灵敏性、高特异性和准确性好的特点，目前该项技术已被用于病原体、肿瘤基因检测、病毒基因分型、基因突变以及多态性的研究等多个领域。 3.1 病原体检测 应用RDB可以检出10 ng的细菌DNA，如对肺炎链球菌检出率高、敏感性和特异性都很好［1］。RDB可用来鉴定临床常见的8种医学真菌［2］。对沙眼衣原体，在不能得到血清型抗体或者不能进行衣原体培养的情况下来检测标本中存在的衣原体血清型，应用RDB 对衣原体检测是一项简便而有效的技术［3］。 3.2 基因分型检测 国内外常用的基因分型方法包括：限制性片段长度多态性(RFLP)；序列特异性寡核苷酸探针(PCRSSOP)；序列特异性引物(PCRSSP)；单链构象多态性(PCRSSCP)；序列测定(DNASeguence)。这些方法各有其优缺点。主要缺点是包括技术复杂、成本昂贵、效率低及分辨率不足。而RDB却较上述方法显示了其优越性，有广泛的应用价值。 3.2.1 RDB应用于人类白细胞抗原的分型 检测HLA分子的多态性对于移植配型和科研有十分重要的意义［4］。 3.2.2 用于人类乳头瘤病毒(HPV)的基因分型

病原真菌的观察和鉴定

病原真菌分类鉴定方法包括表型鉴定法和分子生物学鉴定法两大类。经典的病原真菌的分类鉴定以孢子形态和子实体特征为主要依据,同时参照菌丝的细胞结构及生理生化特征。近年来,由于分子生物学的飞速发展,分子生物学方法在植物病原真菌的分类鉴定中已经成为当前真菌分类研究的热点。真菌在生长过程中受到环境选择的压力,其少数形态特征和生理生化指标随着环境的变化而不稳定,使得其形态特征复杂化,这给表型分类鉴定带来了困难和不准确性。分子生物学方法则是从遗传进化的角度阐明真菌种群间的内在关系及其亲缘关系,能客观地反映出系统发育规律,对真菌的自然分类鉴定具有特异性高、操作简便和准确性高的特点。 1．载片培养法 载片培养方法是实验室观察真菌形态的基本方法。此法的基本步骤是：在无菌条件下，用无菌吸管吸取融化的培养真菌的固体培养基，快速地滴一滴于无菌的载玻片上，待其冷却以后，用接种环沾取少许孢子或者挑取一点菌丝段于凝固的培养基上，上面放上无菌的盖玻片。然后，将此片子放入干净的培养皿中，培养皿底部放入潮湿的吸水滤纸，或者将培养皿底放入一些水，中间用玻璃棒隆起，将做好的培养片子搭放在上面，合适温度下培养。将培养好的片子取出，用小镊子轻轻地取下上面的盖玻片，把盖玻片转放于另一干净的载玻片上，待自然干燥后，两边用透明胶固定，用棉蓝染色液染色。载片培养法还可以这样进行：将厚度约0.5mm的平板培养基用小刀切成大小0.5cm2的小块，挑取一小块培养基放于干净的载玻片上，同样的方法接种、培养观察。还可以用刀片将培养好的载玻片上的多余培养基割去，自然干燥后，用大一点的盖玻片盖上菌丝，用同样方法两边固定，染色观察，这种方法特别适用于产生无性孢子的真菌的形态观察。该方法要注意以下几点：滴的培养基不能太多，接种物不能太多，防止污染。 2．插片培养法 插片培养法是实验室观察真菌形态的另一种基本方法。这种方法的基本步骤是：将菌丝块接种于固体平板的中间。假如是以孢子接种，则将孢子稀释液涂布于固体平板上，然后，用小镊子夹起一块无菌的盖玻片，以45度角的角度斜插入培养基中，不要插入培养基太深，让菌丝爬上盖玻片；培养好了以后，再用小镊子将盖玻片取出，自然干燥以后，将盖玻片转移到一干净的载玻片上，用同样的方法两边固定，染色观察。该方法要注意：插片的角度要掌握好，不能太直或太平；当两面都有菌丝时，擦去背对中心的那面的菌丝，以避免干扰。3．粘片法 粘片法是用透明胶粘贴菌丝或者孢子进行观察的方法。用剪刀剪取一小段透明胶，用小镊子夹住一个角，轻轻地粘一些菌丝或者孢子，然后将其放入一干净的载玻片上，在载玻片上滴一滴染色液，可以染色观察。此法要注意：粘贴时，不要用力粘的太多；粘上菌丝或者孢子的透明胶放入载玻片上，不要移动，要一次放好。 4．平板观察法 平板观察法是在平板上直接观察真菌的方法。对菌丝生长得比较稀疏的真菌和观察基内菌丝。此法比较直接真实地反映菌丝的形态特征，观察时将平板的上盖拿开，倒置于显微镜的载物台上。这种方法可以消除由于培养体变干或者放在菌丝表面的盖玻片等可能出现的影响。此方法要注意不要倒太多的培养基，直径10cm的平皿倒10ml的培养基就可以了。5．玻璃纸观察法 玻璃纸观察法是一种观察真菌生长特性的一种特殊方法。这种方法一般用于下列情况：研究菌丝生长的促进和阻碍作用，将无菌的玻璃纸放入刚倒好的平板中，用L型玻璃棒将玻璃纸表面铺平，然后用小刀将玻璃纸和培养基一起切成从中心向外辐射的2～4个区域。将菌丝块接入平板中心，此时用小针头的注射器滴一滴抑制或促进生长的营养液（例如不同浓度的CuSO4或者2，4-二硝基苯）于玻璃纸下面的各个区域中，培养一定时间待菌丝生长到滴加

PCR-反向点杂交法结核分枝杆菌利福平耐药相关基因rpoB突变

PCR-反向点杂交法结核分枝杆菌利福平耐药相关基因rpoB突变 发表时间：2016-05-24T14:39:28.370Z 来源：《医师在线》2016年1月第2期作者：黄丽静陈焯彬李崇建 [导读] 广西钦州市第一人民医院 PCR-反向点杂交法是一种能直接快速检测结核杆菌基因突变情况的技术，其特异性强，灵敏度高，适合临床快速检测。 （广西钦州市第一人民医院广西钦州535000） 【摘要】目的探究对结核分枝杆菌利福平耐药相关基因rpoB突变以PCR-反向点杂交法检测的效果。方法设计结核分歧杆菌rpoB基因引物，采用PCR-反向点杂交法对40例结核杆菌临床菌株耐药性进行检测，对照由DNA测序法检测的标准结核分歧杆菌（H37Rv）rpoB基因，确定rpoB基因的变异情况，对PCR-反向点杂交法的灵敏度和准确性作出评价。结果 40株临床菌株中有11株利福平敏感株的基因序列与对照的H37Rv相同，剩下的29株耐药株中检测到变异基因27株，其特异性为100%，阳性率为93.1%。结论 rpoB基因本身高度保守,但由于rpoB 基因突变导致结核分枝杆菌对利福平耐药。本研究使用PCR-反向点杂交法针对rpoB基因高突变区设计引物，此方法快速、简便、准确, 能有效监测临床标本中结核分枝杆菌, 对临床早期诊治结核病有极大帮助。 【关键词】PCR-反向点杂交法；rpoB 基因；利福平；结核分歧杆菌 结核病是一种由分歧杆菌导致的常见可致命传染病，它不仅能感染并破坏人体对淋巴系统，还能对人体神经系统、泌尿系统、循环系统、皮肤、骨骼、关节等其他部位造成伤害，表现为发热、盗汗、呼吸障碍、咳嗽、咯血、胸痛等，因此，必须及时对结核病进行诊治，防止其对机体造成更大伤害。利福平（RFP）是临床上治疗结合病的常用药物，但由于结核杆菌常常对其具有耐药性且各地区耐药情况不同，普通的结核杆菌培养耗时较长、过程繁琐，已经不足以满足及时诊治的需求。PCR-反向点杂交法是一种能直接快速检测结核杆菌基因突变情况的技术，其特异性强，灵敏度高，适合临床快速检测。本研究中，通过用PCR-反向点杂交法对40株结核杆菌耐RFP分离株rpoB基因突变情况，对照结核杆菌标准株，了解rpoB基因突变与结核杆菌耐药性关系，并对PCR-反向点杂交法效果进行分析，现报道如下：1 资料和方法 1.1来源及特性选取40株于2013年1月-2015年1月在我院治疗的活动性肺结核患者痰液标本分离的结核杆菌菌株，标准菌株同样来源于我院病原生物实验室，根据国家结核病诊断及细菌学检验标准[1]，对结核杆菌进行培养、鉴定及药敏试验。其中对利福平敏感菌株11株，结核杆菌耐药菌株29株，单耐药菌株18株，含量>50μg/ml,多耐药菌株11株，含量50~250μg/ml。 1.2方法①模板制备及PCR：40株实验菌株及标准菌株均从培养平板上挑取菌落5个，用5ml生理盐水混匀沸水浴10min，6000r/ min离心5min，上清液为PCR模板。PCR扩增rpoB基因引物，范围包括RFP耐药决定区，上游引物DNA序列:5'-AAGGAGTTCTTCGGCACCAG-3'，下游引物:5'-GGTTTCGA TCGGGCACATCC-3'。引物250mmol/L、dNTP 2.5mol/升，模板2μL、10×PCR缓冲液。条件：先94 ℃ 3min 预变性，再 94℃ 30s、52 ℃ 30 s、72 ℃30s，循环35次，最后72 ℃7min延伸。检测扩增产物：溴乙锭预染的2%琼脂糖凝胶电泳。②反向斑点杂交（RDB）：将膜条与PCR产物加入杂交试剂盒杂交液（2×SSC）中，水浴加热10min，42℃杂交4h，转移膜条至0.5×SSC液中，42℃轻摇并洗涤15min，避光显色20min，观察结果。若单链和H37Rv标准株单链位置不同，称运动变位，判定突变。 1.4 统计学分析采用SPSS15.0软件进行数据处理和统计分析，计数资料用百分比（%）表示。 2 结果 若扩增成功（40株临床菌株均获得189bp阳性扩增产物）,则此引物对结核杆菌有特异性。对照标准菌株H37Rv,对比临床菌株RFP敏感株标准图谱，与对照相同的有11株,无rpoB 基因突变,其他29株RFP耐药株有27株SSCP带谱与对照不同,则有rpoB 基因的突变，对比药敏试验结果，其阳性检出率为93.1%。见表1 3 讨论 结核病是临床上常见传染病之一，严重的甚至导致死亡，利福平是治疗结核病的关键药物，它可以能结合RNA聚合酶β亚基，从而抑制转录起到杀菌效果,有研究表明，虽然结核杆菌RFP耐药性可能由多种原因导致，但RNA聚合酶β亚基通过rpoB基因编码，rpoB基因的耐药区发生突变是其产生耐药性的主要原因，因此如何快速、有效的检测出rpoB基因的突变是判断结核杆菌RFP耐药性的关键[2]。 传统RFP利福平耐药性检测方法一般通过培养的方法进行药物敏感实验，这个过程大约需要6~12周，极为耗时，容易贻误患者治疗，为满足现代短程化疗需要，通过PCR-反向点杂交法可以快速检测rpoB基因RNA聚合酶β亚基507~533位氨基酸耐药区点突变，这个过程大约只需要1~2d，具有特异性高、快速、简便等优点，并且与DNA测序检测结果的符合率高，能为医师用药提供有效指导作用，使患者得到及时治疗，减轻病人负担，符合临床上对结核杆菌快速检测的需求。本研究中发现，采用PCR-反向点杂交法检测的40例临床菌株，耐药菌株29例，其中又27株检测出阳性反应，阳性检出率高达93.1%,可见对结核分枝杆菌RFP耐药采用PCR-反向点杂交法具有操作简便、时间较短、检出率高等优点，与相关文献报告相一致[3]。 综上所述，采用PCR-反向点杂交法检测结核分枝杆菌利福平耐药性，快速有效，有临床推广价值。 参考文献 [1] 褚美芬,严杰,钟雅文等.快速检测结核分枝杆菌异烟肼和利福平耐药相关基因mPCR-SSCP建立及应用[J].中华微生物学和免疫学杂