蛋白质标准曲线制作

在96孔板中制作蛋白质标准曲线：Bradford法

编号

0 1 2 3 4 5 6 7 BSA标准液

10mg/ml

0 0.1 0.2 1 2 5 7.5 10

蛋白液体积（稀释后）0 1μL 2μL 10μL 20μ

L

5μL 7.5μ

L

10μ

L

蛋白液稀释到0.1μg/μL 蛋白液稀释到1.0μg/

μL

蒸馏水20μ

L 19μ

L

18μ

L

10μ

L

0 15μL 12.5μ

L

10μ

L

Bradford液200

μL 200μ

L

200μ

L

200

μL

200

μL

200μ

L

200μ

L

200

μL

先将BSA标准液10mg/ml也就是10μg/μl稀释十倍到1μg/μl，然后再稀释到0.1μg/μl。根据所要做的组数和重复，确定需要稀释的体积。

如果每组做3个重复，那么则需要90.9μl的0.1μg/μL蛋白液；67.5μl的1μg/μl蛋白液。

10μL的BSA标准液10μg/μl+90μL的水=100μL的1μg/μl蛋白液；

10μL的1μg/μl蛋白液+90μL的水=100μL的0.1μg/μl蛋白液。

将各液体加入96孔板中，震荡摇匀之后，测其吸光度值。

体系的总体积为220μL，横坐标为蛋白的量，纵坐标是吸光度值。

待测蛋白液的体积是20μL，最后将浓度换算为mg/ml.

例：表中的吸光度值为每组三个平行实验的平均值

根据标准曲线和待测蛋白的吸光度值即可求出其浓度：

标准曲线制作考马斯亮蓝法测蛋白质含量

标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量 一、标准曲线 一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。 二、蛋白质含量测定方法 1、凯氏定氮法 2、双缩脲法 3、Folin-酚试剂法 4、紫外吸收法 5、考马斯亮蓝法 三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作 （一）、试剂： 1、考马斯亮蓝试剂： 考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H 3PO 4 ， 加蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝 G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H 3PO 4 。 2、标准蛋白质溶液： 纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。 （二）、器材： 1、722S型分光光度计使用及原理 2、移液管使用 （三）、标准曲线制作： 1、 2、以A 595nm 为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、

40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。 1）、利用标准曲线查出回归方程。 2）、用公式计算回归方程。 3）、或用origin作图，测出回归线性方程。即A 595nm =a×X( )+6 一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。 4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。 （四）、蛋白质含量的测定： 样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测围），依照操作步骤1操作， 测出样品的A 595nm ，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。 一般被测样品的A 595nm 值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A 595nm 值太大， 可以稀释后再测A 595nm 值，然后再计算。（五）、注意事项： 1、玻璃仪器要洗涤干净。 2、取量要准确。 3、玻璃仪器要干燥，避免温度变化。 4、对照：用被测物质以外的物质作空白对照。

标准曲线的绘制样本

标准曲线绘制 在分析化学实验中， 常见标准曲线法进行定量分析，一般情况下的标准工 作曲线是一条直线。 标准曲线的横坐标（X）表示能够精确测量的变量（如标准溶液的浓度）,称为 普通变量，纵坐标（Y）表示仪器的响应值（也称测量值，如吸光度、电极电位 等）, 称为随机变量。当X取值为X1, X2,……Xn时，仪器测得的丫值分别为丫1, 丫2,……Yn。将这些测量点Xi, Yi描绘在坐标系中,用直尺绘出一条表示X 与丫之间的直线线性关系，这就是常见的标准曲线法。用作绘制标准曲线的标准物质，它的含量范围应包括试祥中被测物质的含量，标长准曲线不能任意延。用作绘制标准曲线的绘图纸的横坐标和纵坐标的标度以及实验点的大小均不能太 大或太小，应能近似地反映测量的精度。 由于误差不能完全避免，实验点完全落在工作曲线的的情况是极少的，特别是在误差较大时，实验点比较分散，它们一般并不在同一条直线上，这样凭直觉很难判断怎样才能使所连接的直线对于所有实验点来说误差是最小的，当前较好的方法是对实验点（数据）进行回归分析。 研究随机现象中变量之间相关关系的数理统计方法称为回归分析，当自变 量只有一个或X与丫在坐标图上的变化轨迹近似一直线时，称为一元线性回归。 甦2.6.1 —元线性回归方程的求法 确定回归直线的原则是使它与所有测量数据的误差的平方和达到极小值 设回归直线方法为 9 (2 - 15)

式中a表示截距，b表示斜率 9 (2 - 15)

假设Xi和Yi （i=1,2,3, ……,n）是变量X和Y的一组测量数据。对于每一个Xi值,在直线（卩“+^ ）上都有一个确定的旳“从X】值。但哲值与X 轴上Xi处的实际测定值Yi是不相等的, 与Yi之差为： 筈厂& +返AY’F-碍（2—佝 上式表示与直线（）的偏离程度，即直线的误差程度。如果全部n个测定引起的总偏差用￡（节厂印'表示,则偏差平方和s为 (2 - 17) 在所有直线中，偏差平方和s最小的一条直线就是回归直线，即这条直线 的斜率b和截距a应使s值达到最小，这种要使所有数据的偏差平方和达到最小 的求回归直线法称为最小二乘法。 根据数学分析的极值原理,要使s达到最小,对式（2 —17）中的a、b分别 求偏微分后得到 (2 —18) (2 —19) 是所有变量Xi和Yi的平均值。由于计算离均差较麻烦，可将式（2 — 18）变换为 n是测量的次数，也就是坐标图中实验点的数目。 (2 —20)

标准曲线的作法

标准曲线的作法

标准曲线的作法 (1)标准液浓度的选择：在制备标准曲线时，标准液浓度选择一般应能包括待测样品的可能变异最低与最高值，一般可选择5种浓度。浓度差距最好是成 倍增加或等级增加，并应与被测液同样条件下显色测定。 (2)标准液的测定：在比色时，读取光密度至少读2-3次，求其平均值，以 减少仪器不稳定而产生的误差。 (3)标准曲线图的绘制：一般常用的是光密度一浓度标准曲线。 ①用普通方格纸作图。图纸最好是正方形(长：宽=l：1)或长方形(长：宽=3 ： 2)，以横轴为浓度，纵轴为光密度，一般浓度的全距占用了多少格，光密度的全距也应占用相同的格数。 在适当范围内配制各种不同浓度的标准液，求其光密度，绘制标准曲线， 以浓度位置向上延长，光密度位置向右延长、交点即为此座标标点。然后，将 各座标点和原点联成一条线，若符合Lambert-Beer氏定律，则系通过原点的 直线。 ②若各点不在一直线，则可通过原点，尽可能使直线通过更多点，使不在 直线上的点尽量均匀地分布在直线的两边。 ③标准曲线绘制完毕以后，应在座标纸上注明实验项目的名称，所使用比 色计的型号和仪器编号、滤光片号码或单色光波长以及绘制的日期、室温。 ④绘制标准曲线：一般应作二次或三次以上的平行测定，重复性良好曲线 方可应用。 ⑤绘制好的标准曲线只能供以后在相同条件下操作测定相同物质时使用。 当更换仪器、移动仪器位置、调换试剂及室温有明显改变时，标准曲线需重新 绘制。 ⑥标准曲线横坐标的标度：从标准液的含量换算成待测液的浓度。 1.5 原子吸收光谱分析的定量方法 原子吸收光谱分析是一种动态分析方法，用校准曲线进行定量。常用的定量方法有标准曲线法、标准加入法和浓度直读法。如为多通道仪器，可用内标法定量。在这些方法中，标准曲线法是最基本的定量方法。 1.5.1 标准曲线法 前面已经指出，原子吸收光谱和原子荧光光

牛血清蛋白标准曲线定制

00.20.40.60.8 2 4 6 8 10 12 14 牛血清蛋白的显色浓度μg/ml A 595处吸光度 A595nm处测得的吸光度 回归方程对应的吸光度 表一 考马斯亮兰G250染色法测定牛血清蛋白标准曲线家养表及样品595nm 处测得的OD 值 项目 试管 编号 1 2 3 4 5 6 7 样1 样2 100μg/mL 牛血清蛋白溶液 /ml 0.00 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 1.00 1.00 各管中血清蛋白显色浓度 μg/mL 0.00 3.33 5.00 6.67 8.33 10.0 11.67 13.33 考马斯亮兰试剂ml 各加 入5ml 后摇匀 3分钟后 开始测 定20分 钟测完 A595处测定各管OD 值 0.000 0.186 0.277 0.365 0.451 0.527 0.596 0.664 0.398 0.404 表二 考马斯亮兰G250染色定制牛血清蛋白标准曲线数据处理统计表 项目 试管 编号 1 2 3 4 5 6 7 牛血清蛋白标准显色浓度 μg/mL 0.00 3.33 5.00 6.67 8.33 10.0 11.67 13.33 A595处测定的OD 值 0.000 0.186 0.277 0.365 0.451 0.527 0.596 0.664 回归方程对应浓度下的OD 值 0.0192 0.185 0.269 0.352 0.435 0.518 0.602 0.684 线性回归方程斜率 0.0192 线性回归方程截距 0.0499 线性回归方程 y=0.0499x+0.0192 实验数据的相关因素 0.9960

蛋白质的定量法与标准曲线的制备

蛋白质的定量法与标准曲线的制备 A. Folin-phenol(lowry method)定量法 此法以Biuret方法反应为基础发展而起，因此会严重干扰Biuret测定方法的因 子都会影响此测定法的准确度。这些干扰因子包括：含-CS-NH2，-CH2-NH2，-CRH-NH2，-CH2-NH-CHNH2-CH2OH，-CHOH-CH2NH2等基团的物质以及 缓冲剂如Tris、蔗糖、低浓度的酚类、柠檬酸等，但低浓度的尿素、硫酸胺可以增加碳酸钠-氢氧化钠的浓度来校正显色结果。1951年Lowry对于 Folin-Ciocalteu 试剂在不同的pH值条件下得到此试剂作用的最佳反应条件， 此法的灵敏度较Biuret方法高约100倍，反应时间只要约15分钟即可显色，颜色的稳定度可达数小时，故目前多用Folin-phenol法测定待测样本的蛋白质浓度。 原理：蛋白质与Folin试剂作用分成两个阶段： 1.蛋白质先与碱性铜离子作用 Cu2+ + Protein- Cu-Protein 当碱性的铜离子试剂和蛋白质中的peptide bond反应时会产生biuret test 的初步呈色反应，此蛋白质铜复合物会再由Phosphomolybdic-phosphotungstic试剂(Folin-Ciocalteu Reagent)作用形成蓝色物质。 蛋白质分子中可和Folin – Ciocalteu 试剂作用的团基有：Histidine的Imidazole Group、Tyrosine的Phenolic Hydroxyl Group、Cysteine的Sulfhdryl Group、Arginine的Guanidino Group。在这些团基中，Tyrosine的Phenolic Hydroxyl Group最为重要，碱性蛋白质与Folin-Ciocalteu Reagent复合物的颜色强度与 蛋白质中的芳香族官能基(aromatic group) 成正比。 值得注意的是当Folin-Ciocalteu 试剂在强碱的环境中易使phosphomolybdate 解离而丧失作用的能力，所以此剂须新鲜配制并避免与蛋白质中的Tyrosine 及Tryptophan 反应前置于强碱的环境中，依比色的方法测其吸亮度，换算蛋白质的量。 * 注意 Folin-Ciocateu phenol 试剂在酸性环境中才稳定，但Lowry method 必须在 pH=10 才会发生，所以Folin - Ciocalteu Reagent 一加入碱性的硫酸铜-蛋白质溶液中(alkaline cooper protein )必须马上混合均匀，以确保还原反应在phosphomolybdic- phosphotungstate 分解之前发生。 以上两种蛋白质显色定量法均会破坏样本中的蛋白质，故当蛋白质样本量少又需要回收时，不可以使用此种方法定量。 B.紫外线吸收值测定法

标准曲线的制作方法

标准样品的准备 由于你做的是基因表达分析，样品的准备就比较简单了，因为你要知道都是相对的数值（你的对照样品和实验样品中基因表达的比值），这样就不需要知道精确的拷贝数，所以标准品也就无须知道精确的拷贝数，只需知道稀释的倍数就可以了。 你实验中的标准品可以是来源比较丰富的细胞或组织的RNA转录得到的cDNA。将这种cDNA进行梯度的稀释，可以是稀释10倍，100，1000，10000等倍（具体到你的实验要根据具体的情况来调整稀释倍数。最好能作一个预实验来看看什么样的稀释倍数比较适合你的这种基因的扩增）。而对于各个稀释倍数我们要对它的拷贝数进行赋值，这个值当然不是标准品中真实含有的基因数量（在基因表达分析中也不需要），而是我们根据稀释倍数给每一个稀释度人为赋予的拷贝数，这只是为了方便实验最终结果的计算而已。比如我们把前面稀释十倍的样品赋值为10000个拷贝，100倍的赋值为1000个拷贝依次类推把10000倍的赋为10等。要注意，赋值的数目的倍数差异和你稀释的倍数是一样的，比如前面是10稀释，后面赋值也是10倍变化。 如何做标准曲线 在定量实验中标准品是要和你的未知样品一起进行定量实验的，这样在实验结束，无论是标准品还是未知样品都将跑出曲线，获得Ct值。那么我们先可以把未知样品放到一边，对于标准品来说，我们既获得了Ct值，还知道他们的拷贝数（虽然这个拷贝数是我们自己赋予的）。这样我们可以通过标准品的Ct值和拷贝数做一条标准曲线（以拷贝数为横坐标，而Ct值为纵坐标）。一旦作出了标准曲线，而未知样品的Ct值我们知道（通过实验求得的），这时候就在标准曲线上进行定位，就可以得到未知样品的拷贝数了。 事实上，操作起来没有那么复杂，你只需要告诉软件你的哪个孔是标准品，哪个是未知样品，以及标准品的拷贝数等必要信息，软件会自动帮你把标准曲线和未知样品的拷贝数计算出来。 举例来说如何进行设置 先进入软件，在板设置中选择所放样品的位置，并标上unknow或standard等信息。 选择要使用的荧光染料。

蛋白质标准曲线测试方法

试剂与器材 一、试剂 考马斯亮蓝试剂： 考马斯亮蓝G―250 100 mg溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000 mL。 二、标准和待测蛋白质溶液 1. 标准蛋白质溶液 结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用9gl/L NaCl配制成 0.1 mg/mL蛋白溶液。 三、器材 试管1.5×15 cm(×6)，试管架，移液管管0.5 mL(×2);1 mL(×2);5 mL(×1);恒温水浴;分光光度计。 操作方法 一、制作标准曲线 取7支试管，按下表平行操作。 试管编号0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白溶 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 液（mL） 9gl/LNaCl 0.1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 （mL） 考马斯亮蓝 4mL 试剂 蛋白质浓度 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ug/ml 摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595 nm处比色 绘制标准曲线：以A595 nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。 二、未知样品蛋白质浓度测定 测定方法同上，取1样品，加4ml考马斯亮蓝溶液，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595 nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度(ug/mL)。（超出范围应稀释样品。） 注意事项 在试剂加入后的5-20 min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。 测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。 利用考马斯亮蓝法分析蛋白必须要掌握好分光光度计的正确使用，重复测定吸光度时，比色杯一定要冲洗干净，制作蛋白标准曲线的时候，蛋白标准品最好是从低浓度到高浓度测定，防止误差。

HPLC标准曲线的制作

HPLC标准曲线的制作 你可以随便弄一个浓度进一针样品看一看你这个样品的吸收度如何，再根据你样品的吸收度配置适当的底浓度样品逐个稀释这样可以连检测线定量限一起做了，一举3得(最后将你得到的峰面积根据你的进样浓度做一个线性回归就行啦，线性好的话R的平方一般接近于1 。 请问下各位在上样的时候是进同浓度的不同体积的样液绘制标准曲线好还 是先配好不同浓度的样液再以相同体积进样好呢, 这2个有什么区别吗, 请你看看分析化学书，有关精密度和线性的关系就知道了，实在不行，可以查看2005版药典一部附录新药质量标准的技术要求项下。自己看看就知道了。 我觉得进不同浓度相同体积好.因为你进样体积不同.在同样的方法下,系统的 各项参数可能会发生变化.而且你要通过进样体积的变化来控制浓度范围,这样也不大可行.一般我们进样的体积是5到20微升.而这个狭小的范围我们能调控的浓度线性范围非常窄.而通过事先调配不同浓度的话,就简单可行,而且浓度范围可以任意去控制.在实际操作中,老师也一直是教我们通过控制不同浓度来制作标准曲线的.以上只是个人的粗浅看法,欢迎高手们前来批评指正!!!!!!!!!! 前面几个站友说得都很好。我简单再补充一点自己的看法。 一般而言，还是不同浓度进相同体积做标曲是最规范的做法，而且可以有效避免人为误差。比如说，你的一个浓度配错了，如果以这个浓度为基准进不同的体积，会导致你最后的结果会整体偏大或偏小。所以要特别注意。 但实际工作中，如果你们的产品做得比较成熟了，而且做实验的经验比较丰富，大家为了省事还是多采用配一个浓度进不同的体积。 以进样量做标准曲线和以不同浓度进样相同体积做标准曲线差别不大。

标准曲线制作考马斯亮蓝法测蛋白质含量

标准曲线制作考马斯亮蓝法测蛋白质含量

标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量 一、标准曲线 一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。 二、蛋白质含量测定方法 1、凯氏定氮法 2、双缩脲法 3、Folin-酚试剂法 4、紫外吸收法 5、考马斯亮蓝法 三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作 （一）、试剂： 1、考马斯亮蓝试剂： 考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，雍蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。 2、标准蛋白质溶液： 纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。 （二）、器材： 1、722S型分光光度计使用及原理（）。 2、移液管使用（）。 （三）、标准曲线制作： 1、 试管编号0 1 2 3 4 5 6 100ug/ml标准蛋白（ml）0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.15mol/L NaCl （ml） 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 考马斯亮蓝试剂（ml） 5 5 5 5 5 5 5 摇匀，1h内以1号管为空白对照,在595nm处比色 A595nm 2、以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、

药品的配制（磷酸缓冲液的配制） 一、药品的配制步骤 （一）、实验准备： 1、准备所需的药品和玻璃仪器。 2、洗涤。（怎样洗涤算干净？） （二）、计算： 1、百分比浓度计算： 1)、G/V比 例如配1% NaCl，称1g NaCl溶于100ml 水。 2）、V/V比： 例如配75%乙醇100ml，75%×100%=100%×X, X=75ml。取75ml无水乙醇，加25ml蒸馏水。 乙醇：乙醚：丙酮=2：1：2配500ml，各取200 ml，100 ml，200 ml混合。3）G/V比：用的较少，如计算灰分中某种元素如Fe的含量。 2、摩尔浓度计算：注：药品的分子量一般在标签中注明。 1）、0.1M或0.1mol/L NaCl配100ml。 M=质量/体积（L）称取NaCl0.1×0.1×40=0.4g 摩尔数=G（g）/摩尔质量2）、0.1mMNaCl配100ml mM=毫摩尔数/体积（L）称取NaCl0.1×0.1×40=0.4g 毫摩尔数=G（mg）/摩尔质量 3）、0.1uNaCl配100ml mM=微摩尔数/体积（L）称取NaCl0.1×0.1×40=0.4mg 微摩尔数=G（ug）/摩尔质量称取NaCl0.1×0.1×40=0.4ug 3、混合溶液配制的计算： 如配3uMEDTA，2.25mM NBT以及60uM 溶液100ml，用50mM磷酸缓冲液配制。 注意：1、分别标定体积计算 2、分别配制再混合，但总体积不能为100ml

考马斯亮蓝G-250标准曲线法测定蛋白含量

考马斯亮蓝G-250标准曲线法测定蛋白含量 实验目的： 学习和掌握考马斯亮蓝G-250 测定蛋白质含量的原理和方法。 实验原理： 考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250 在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h 内保持稳定。该法是1976年Bradford 建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry 法还高4 倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。 材料、主要仪器和试剂 1．实验材料 新鲜绿豆芽 2．主要仪器 （1）分析天平、台式天平 （2）刻度吸管 （3）具塞试管、试管架 （4）研钵 （5）离心机、离心管 （6）烧杯、量筒 （7）微量取样器 （8）分光光度计 3．试剂 （1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg 牛血清白蛋白，溶于100mL 蒸馏水中，即为1 000μg／mL 的原液。 （2）蛋白试剂考马斯亮蓝G-250 的配制：称取100mg 考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。此溶液在常温下可放置一个月。 （3）乙醇 （4）磷酸（85％） 四、操作步骤 1．标准曲线制作 （1）0~100μg／mL 标准曲线的制作：取6 支10mL 干净的具塞试管，按表1 取样。盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min 后用1cm 光经的比色杯在595nm 波长下比色，记录各管测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。

ELISA标准曲线制作方法.pdf

ELISA标准曲线制作方法 一般而言，我们拟合ELISA标准曲线选用比较经典的Curve Expert 1.3或者Curve Expert 1.4软件。现在我们以Curve Expert 1.4为例，对ELISA标准曲线绘制方法进行详述。 Generally speaking, the standard fitting curve of ELISA is based on the classic software of Curve Expert 1.3 or Curve Expert 1.4. Now we will use the Curve Expert 1.4 to illustrate how to construct the ELISA standard curve. 1.点击Curve Expert 1.4，打开应用程序，截图界面如下： Click Curve Expert 1.4, and then open the application programs. You will see the following screen shot.

2.在X轴输入标准品的OD值，Y轴输入相应的标准品的浓度，截图界面如下： Input the value of OD on the X-axis against the concentration of samples on the Y-axis. The following screen shot will appear like this.

3.单击上图界面中的图标，出现如下界面 Click the icon showed on the above screen shot and you will see the following picture. 4.单击上图界面中的ALL OFF 按钮，出现如下界面 Click the ‘All Off’ button , you can see the following screen shot.

标准曲线的绘制

标准曲线绘制 在分析化学实验中，常用标准曲线法进行定量分析，通常情况下的标准工作曲线是一条直线。 标准曲线的横坐标(X)表示可以精确测量的变量(如标准溶液的浓度)，称为普通变量，纵坐标(Y)表示仪器的响应值(也称测量值，如吸光度、电极电位等)，称为随机变量。当X取值为X1, X2,…… Xn时，仪器测得的Y值分别为Y1, Y2, …… Yn。将这些测量点Xi, Yi描绘在坐标系中，用直尺绘出一条表示X与Y 之间的直线线性关系，这就是常用的标准曲线法。用作绘制标准曲线的标准物质，它的含量范围应包括试祥中被测物质的含量，标准曲线不能任意延长。用作绘制标准曲线的绘图纸的横坐标和纵坐标的标度以及实验点的大小均不能太大或太小，应能近似地反映测量的精度。 由于误差不能完全避免，实验点完全落在工作曲线的的情况是极少的，尤其是在误差较大时，实验点比较分散，它们通常并不在同一条直线上，这样凭直觉很难判断怎样才能使所连接的直线对于所有实验点来说误差是最小的，目前较好的方法是对实验点(数据)进行回归分析。 研究随机现象中变量之间相关关系的数理统计方法称为回归分析，当自变量只有一个或X与Y在坐标图上的变化轨迹近似一直线时，称为一元线性回归。 2.6.1一元线性回归方程的求法 确定回归直线的原则是使它与所有测量数据的误差的平方和达到极小值，设回归直线方法为 (2－15) 式中a表示截距，b表示斜率。 假设Xi和Yi (i=1,2,3,……,n)是变量X和Y的一组测量数据。对于每一个Xi值，在直线() 上都有一个确定的值。但值与X轴上Xi处的实际测定值Yi是不相等的，与Yi之差 为： (2－16) 上式表示与直线()的偏离程度，即直线的误差程度。如果全部n个测定引起的总偏 差用表示，则偏差平方和s为 (2－17)

标准曲线的绘制吸光度标准曲线绘制

标准曲线的绘制-吸光度标准曲线绘 制 生物化学实验报告ALT与其吸光度的标准曲线绘制 采集样本：广西医科大学口腔医学2016级13班四个组中7组生物化学实验数据采集时间：2016年11月15日2016~2016上学期第十一周周一下午采集人：何洁梅 一、几组ALT与其吸光度的标准曲线数据记录 ALT活力单位A520吴修团1组A520黎丁菱1组A520杨璇璇1组A520谢晓兰2组A520莫雪玲2组A520李文良3组A520文全海4组 00000000

二、各采集样本汇总图 样本1测定得待测血清ALT活力单位为50U/L 样本2测定得待测血清ALT活力单位为 97U/L 样本3测定得待测血清ALT活力单位为 135U/L 样本4测定得待测血清ALT活力单位为 70U/L 样本5测定得待测血清ALT活力单位为 148U/L 样本6测定得待测血清ALT活力单位为

45U/L 样本7测定得待测血清ALT活力单位为 98U/L 四、采集数据处理结果分析 1．数据总结 样本编号测定的ALT活力单位是否大于40U/L正常/非正常 150是非正常 297是非正常 3135是非正常 470是非正常 5148是非正常 645是非正常 798是非正常 平均值92均为“是”均为“非正常” 2.针对数据处理结果的分析 采集的7组数据经标准曲线测量后，得到的ALT活力单位值均大于40，即均为非正常值，综上，认为待测血清中ALT 含量超于正常值。 3.针对源数据的分析

采集的7组数据中样本4、5、6的数据经画图后可基本分布呈过原点的线性关系，符合理论规律，但其他的数据误差较大。另外，比较符合理想标准曲线的4、5、6样本的三个ALT活力单位值也存在较大的出入。 4.经分析，总结可能的误差来源如下 配置丙酮酸标准溶液、底物溶液、磷酸缓冲液的混合溶液时，丙酮酸标准溶液的剂量都很小，容易造成误差。 加入2,4—二硝基苯肼的时间可能有误差，保温的时间，以及加入NaOH 以停止反应的时间都有可能有偏差，容易造成较大。如何用EXCEL绘制标准曲线 Excel是Microsoft offices系统的重要组成，它是界于WORD字处理软件与ACCESS数据库软件之间的电子表格工具，功能十分强大，特别适合于日常工作使用。使用得好，完全比目前所有的检验科办公系统优秀。 现就先介绍一下如何使用Excel绘

标准曲线制作

1 葡萄糖测定 （1）1mg/mL 葡萄糖标准液 小烧杯取分析纯葡萄糖置于烘干箱中烘干至，于分析天平中准确称取80℃烘至恒重的分析纯 葡萄糖10mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到10mL 容量瓶中，用蒸馏水定 容至10mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。 （2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂 将6.3g DNS （分析天平中称取于小烧杯）和262mL 2M NaOH 溶液（大量筒称取250ml+ 小量筒称取12ml），加到500mL（量杯量取）含有185g 酒石酸钾钠的热水溶液中（在微波 炉中加热1min溶解），再加5g 结晶酚和5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。 1．制作葡萄糖标准曲线 取7 支10mL 具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL 的葡萄糖标准液、蒸馏水 和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。 1mg/ml葡萄糖标准溶液蒸馏水 DNS 葡萄糖含量光密度值 管号（ml）（ml）（ml）（mg/ml）（OD540） 0 0 1 0.75 0 1 0.1 0.9 0.75 0.01 2 0.2 0.8 0.75 0.02 3 0.3 0.7 0.75 0.03 4 0.4 0.6 0.7 5 0.04 5 0.5 0.5 0.75 0.05 6 0.6 0.4 0.75 0.06 将各管摇匀，取试管架置于水浴锅中，在沸水浴中准确加热5min，取出，冷却至室温，用蒸馏水定容至10mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色（分光光度计预热20分钟）。调波长540nm，用0 号管调零点，测出1~6号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。 发酵取样：1ml 样品+0.75mlDNS 沸水浴5min,冷却后，定容到10ml. 540nm测定 2 酒精度测定 称取优级纯无水乙醇0.1000g （取小烧杯置于分析天平中，去皮，以微量移液枪小心添 加至0.1000g）于100ml 容量瓶中（蒸馏水洗涤小烧杯导入容量瓶）, 加水至刻度。此溶液 每毫升相当于1.0mg 乙醇。 5 %重铬酸钾溶液: 称取5g 重铬酸钾(AR) 溶于50ml 水中, 加10ml 浓硫酸（用20ml量 筒量取，边加边用玻璃棒搅拌）, 放冷, 取100ml容量瓶，加水至100ml。 试剂均为分析纯, 水为蒸馏水。 分别取乙醇标准溶液（1mg/mL）0, 0.2，0.4，0.6, 0.8, 1.0mL于带刻度的10mL试管中，分别加入重铬酸钾1.0ml，用蒸馏水补足至5.0ml，在100 ℃水浴中加热10min (加塞防止乙 醇挥发), 取出用流水冷却5min ,充分反应，测吸光度。

标准曲线制作操作步骤共12页word资料

标准曲线制作操作步骤 一、单点法 1、打开要制作标准曲线的色谱图 点击左侧工具栏的图标， 出现下图 点击“下一步”，出现下图，在下图左侧选中要做标准曲线的色谱峰， 然后点击“下一步”，出现下图，在“定量方法”栏选择“外标法”；“校准级别”选择“1”；“零点”选择“强制通过” 然后点击“下一步”，出现下图， 然后点击“下一步”，出现下图，在浓度栏中输入样品浓度 然后点击“完成” 点击左侧工具栏的图标，出现如下图

点击“是”，出现如下图 在“文件名”中输入名称，本次以“咖啡因”命名，点击“保存”，出现如下图 点击“确定”，然后点击左侧工具栏的图标，出现如下图 双击数据栏里，刚刚保存的文件“咖啡因” 出现如下图 把该图中，“数据文件”下面的数据“00.1cd”“02.1cd”，点击鼠标右键 删除，然后点击图中左下角的 图标，出现如下图 在左侧数据栏中，鼠标左键点住起初要制作标准曲线的色谱图，把该数据

拖到上图中“数据文件级别：”下面，然后松开鼠标左键，出现如下图点击确定，出现如下图 该标准曲线的方法就建立好了。 打开要分析的色谱图，鼠标左键点住左侧的刚刚建立的标准曲线方法“咖啡因”，把它拖到右侧的色谱图中， 出现如下图 点击“确定”，结果出现在下图右下角的“结果”栏中 未知样的定量完成。 二、外标法 1、打开要制作标准曲线的色谱图 2、 点击左侧工具栏的图标， 出现下图

点击“下一步”，出现下图，在下图左侧选中要做标准曲线的色谱峰， 然后点击“下一步”，出现下图，在“定量方法”栏选择“外标法”；“校准级别”选择“5”；“零点”选择“未强制” 然后点击“下一步”，出现下图， 然后点击“下一步”，出现下图，在浓度栏中依次输入样品浓度 然后点击“完成” 点击左侧工具栏的图标，出现如下图 点击“是”，出现如下图 在“文件名”中输入名称，本次以“咖啡因”命名，点击“保存”，出现如下图 点击“确定”，然后点击左侧工具栏的图标，出现如下图 双击数据栏里，刚刚保存的文件“咖啡因” 出现如下图 删除上图中“数据文件级别下的数据” 然后点击

标准曲线制作考马斯亮蓝法测蛋白质含量

标准曲线制作考马斯亮蓝法测蛋白 质含量 标准曲线制作一考马斯亮蓝法测蛋白质含量 一、标准曲线 一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出 所测物质的含量。因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。 二、蛋白质含量测定方法 1、凯氏定氮法 2、双缩脲法 3、Foli n-酚试剂法 4、紫外吸收法 5、考马斯亮蓝法 三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量一标准曲线制作 （一）、试剂： 1、考马斯亮蓝试剂： 考马斯亮蓝G —250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4,雍蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V） 考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V ）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。 2、标准蛋白质溶液： 纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度 同0.15mol/LNaCI配制成100ug/ml蛋白溶液。 （二）、器材： 1、722S型分光光度计使用及原理（）。

2、移液管使用（）。 （三）、标准曲线制作： 1、 2、以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、

40 ugx 50 ug、60 ug）,在坐标轴上绘制标准曲线。 1）、利用标准曲线査出回归方程。 2）、用公式计算回归方程。 3）、或用origin作图，测出回归线性方程。即A595nm=aXX（）+6 一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。 4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。 （四）、蛋白质含量的测定： 样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1 操作，测出样品的A595E，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。 一般被测样品的A595nm值在0?1一0?05之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算。 （五）、注意事项： 1、玻璃仪器要洗涤干净。 2、取量要准确。 3、玻璃仪器要干燥，避免温度变化。 4、对照：用被测物质以外的物质作空白对照。

标准曲线的作法

标准曲线的作法 (1)标准液浓度的选择：在制备标准曲线时，标准液浓度选择一般应能包括待测样品的可能变异最低与最高值，一般可选择5种浓度。浓度差距最好是成倍增加或等级增加，并应与被测液同样条件下显色测定。 (2)标准液的测定：在比色时，读取光密度至少读2-3次，求其平均值，以减少仪器不稳定而产生的误差。 (3)标准曲线图的绘制：一般常用的是光密度一浓度标准曲线。 ①用普通方格纸作图。图纸最好是正方形(长：宽=l：1)或长方形(长：宽=3 ： 2)，以横轴为浓度，纵轴为光密度，一般浓度的全距占用了多少格，光密度的全距也应占用相同的格数。 在适当范围内配制各种不同浓度的标准液，求其光密度，绘制标准曲线，以浓度位置向上延长，光密度位置向右延长、交点即为此座标标点。然后，将各座标点和原点联成一条线，若符合Lambert-Beer氏定律，则系通过原点的直线。 ②若各点不在一直线，则可通过原点，尽可能使直线通过更多点，使不在直线上的点尽量均匀地分布在直线的两边。 ③标准曲线绘制完毕以后，应在座标纸上注明实验项目的名称，所使用比色计的型号和仪器编号、滤光片号码或单色光波长以及绘制的日期、室温。 ④绘制标准曲线：一般应作二次或三次以上的平行测定，重复性良好曲线方可应用。 ⑤绘制好的标准曲线只能供以后在相同条件下操作测定相同物质时使用。当更换仪器、移动仪器位置、调换试剂及室温有明显改变时，标准曲线需重新绘制。 ⑥标准曲线横坐标的标度：从标准液的含量换算成待测液的浓度。 1.5 原子吸收光谱分析的定量方法 原子吸收光谱分析是一种动态分析方法，用校准曲线进行定量。常用的定量方法有标准曲线法、标准加入法和浓度直读法。如为多通道仪器，可用内标法定量。在这些方法中，标准曲线法是最基本的定量方法。 1.5.1 标准曲线法 前面已经指出，原子吸收光谱和原子荧光光谱分析是一种相对测定方法，不能由分析信号的大小直接获得被测元素的含量，需通过一个关系式将分析信号与被测元素的含量关联起来。校正曲线就是用来分析信号（即吸光度）转换为被测元素的含量（或浓度）的“转换器”，此转换过程成为校正。之所以要进行校正，是因为同一元素含量在不同的试验条件下所得到的分析信号是不同的。校准曲线的制作方法是，用标准物质配制标准系列溶液，在标准条件下，测定各标准样品的吸光度值Ai，以吸光度值Ai（i＝1，2，3，4，5）对被测元素含量ci（i＝1，2，3，4，5）绘制校准曲线A＝f（c）。在同样条件下，测定样品的吸光度值Ax，根据被测元素的吸光度值Ax从校准曲线求得其含量Ci。校准曲线如图1－4所示。 校准曲线的质量直接影响校准效果和样品测定结果的准确度。正确地制作一条高质量校准曲线是非常重要的，为此需要：（1）合理的设计校准曲线；（2）分析信号的准确测定；（3）正确绘制校准曲线。 首先，从数理统计的观点出发合理设计校准曲线。根据一组实验点绘制校准曲线所遵循的原则是最小二乘原理，即要让实验点随机地分布在校正曲线的周围，并有尽可能多的实验点落在标准曲线上，使得由这些实验点绘制的标准曲线的标准偏差最小。从校准曲线的置信范围考虑，当实验点数目，<4时，置信系数较大且变化速率较快，置信范围较宽，由校正

运用EXCEL做标准曲线

运用E X C E L做标准曲线 TPMK standardization office【 TPMK5AB- TPMK08- TPMK2C- TPMK18】

E x c e l绘制标准曲线全图片教程 随着计算机的日益普及，越来越多的检验工作者希望能从一些烦琐的工作中解脱出来，如：绘制标准曲线、绘制质控图、计算检测值等等。当然借助检验科办公系统理论上是最方便的，但很多单位是没有检验科办公系统的。其实借助Microsoft的Excel电子表格工具对检验工作也会带来很大的便利。 Excel是Microsoft offices系统的重要组成，它是界于WORD 字处理软件与ACCESS数据库软件之间的电子表格工具，功能十分强大，特别适合于日常工作使用。使用得好，完全比目前所有的检验科办公系统优秀。 现就先介绍一下如何使用Excel绘制标准曲线。 首先，将数据整理好输入Excel，并选取完成的数据区，并点击图表向导，如下图所示。 点击图表向导后会运行图表向导如下图，先在图表类型中选“XY散点图”，并选了图表类型的“散点图”（第一个没有连线的）。 点击“下一步”，出现如下图界面。如是输入是如本例横向列表的就不用更改，如果是纵向列表就改选“列”。

如果发现图不理想，就要仔细察看是否数据区选择有问题，如果有误，可以点击“系列”来更改，如下图。 如果是X值错了就点击它文本框右边的小图标，结果如下图：出现上图后，如图在表上选取正确的数据区域。然后点击“下一步”出现图表选项界面，如下图，上应调整选项，以满足自己想要的效果。 点击“下一步”，现在一张带标准值的完整散点图就已经完成，如下图。 完成了散点图，现在需要根据数据进行回归分析，计算回归方程，绘制出标准曲线。其实这很简单，先点击图上的标准值点，然后按右键，点击“添加趋势线”。如下图。 由于本例是线性关系，在类型中选“线性”如下图 点击“确定”，标准曲线就回归并画好了。 标准曲线是画好了，可是我们怎么知道回归后的方程是什么样呢？这了简单，点击趋势线（也就是我们说的标准曲线）然后按右键，选趋势线格式，如下图：

标准曲线绘制方法

ELISA的标准曲线一般使用专门的曲线拟合工具，如：Curve Exert1.3 下面以Curve Exert1.3为例说明怎么样制作： 1 启动“Curve Expert1.3” 2 X轴输入标准品的OD值，Y轴输入所对应的浓度值，如图： 2 X轴输入标准品的OD值，Y轴输入所对应的浓度值，如图： 3．单击[运行] 按钮，出现如下对话框 4．单击[ok]按钮，出现如下两个对话框，关闭下面一个对话框

关闭下面一个对话框 5. 在对话框的右上角出现一些曲线的名称，从“1”开始依次点击曲线名称，在右下角会出现相应拟合的曲线，。

根据拟合的曲线选取ELISA拟合度最佳的曲线双击，出现如下对话框：注意：选择系数（即“r”值）最好的曲线方程来进行运算。在下面的对话框右上角有“r”值，当“r”值越接近1拟合度越好 7．按[Ctrl]键[L]键，出现如下对话框：

8．输入标准的OD值，单击[Calculate]按忸，即可得到待测蛋白的实际含量。（标本稀释了N倍，运算出的数值应在成以N）。 9. 如想得到ELISA拟合曲线的方程，可在步骤6的对话框空白处右击，选择”Information” 10. 得到如下对话框：点击“Copy” 在你需要的位置粘贴即可得到如下数据： Rational Function: y=(a bx)/(1 cx dx^2) Coefficient Data: a = b = c = d =

当抗原或抗体浓度过高时，对应的ELISA读数不会再显著升高，这时会达到一个平台期，同样在低浓度时也有一个平台期。只有在适当的浓度时才会出现类似直线的曲线，所以一般数据都要进行多参数拟和，才能得到能更准确反映实验结果的曲线，常用的有sigmoid、logistic曲线等，一半的软件如sigmaplot 或origin 都有这个功能