缺氧预处理对不同鼠龄大鼠海马神经干细胞增殖和分化的影响_赵久红

D OI :CN K I :46-1049/R .20110329.1159.041

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[收稿日期]2011-02-28 [修回日期]2011-03-20 网络出版时间:2011-03-2911:59:59[基金项目]海南医学院科研基金资助学报项目(0020110062)[作者简介]赵久红(1980-),女,辽宁葫芦岛人,助理实验师,硕士,电话:130********,电子信箱:zhjh2005627@https://www.sodocs.net/doc/371404413.html, 。

缺氧预处理对不同鼠龄大鼠海马神经干细胞增殖和分化的影响

赵久红

(海南医学院人体解剖实验室,海南海口　571101)

[摘要]目的:探讨缺氧预处理对不同鼠龄大鼠海马神经干细胞(NSCs )增殖和分化的影响。方法:随机

选取新生1天(Q 1组)、新生7天(Q7组)、新生14天(Q14组)大鼠各6只,分别缺氧2小时。将各组大鼠海马在无血清培养液中,进行原代、单克隆和传代培养;单克隆培养细胞进行巢蛋白(Nestin )免疫荧光染色;传三代细胞诱导分化3d 后分别行神经元特异性烯醇化酶(NSE )、胶质纤维酸性蛋白(GFAP )免疫荧光染色,计数NSE 阳性细胞,进行统计学分析。结果:单克隆培养的细胞均呈Nestin 阳性,诱导分化的细胞部分呈NSE 或GFAP 阳性表达。Q1组、Q7组、Q14组细胞原代培养克隆球直径达为200μm 所需时间分别为:7d 、11d 、40d ;Q1组与Q14组神经干细胞分化为神经元的比例存在显著差异。结论:缺氧预处理后新生1天比14天大鼠海马神经干细胞增殖快及向神经元的分化比例高。[关键词]缺氧预处理;海马;神经干细胞;增殖;分化;新生大鼠

[中图分类号]Q813　[文献标识码]A [文章编号]1007-1237(2011)03-0309-03

Influen ce of hypoxia on proliferation and differentiation of neural stem cells from hippocam -pus of neonate rats

ZH AO Jiu -hong

(Department o f Anatom y ,Hainan Med ical College ,H aikou H ainan 571101China )

[Foundation Proje ct ]:Hainan M edical Unive rsity Sc ie ntific Re searc h Fund Supported Proje ct of the Journal (0020110062)[Author ]:Z H AO J iu -hong (1980-),Female ,H uludao Liaoning ,E x perimentalist ,M .M .,Tel :130********,Email :zhjh 2005627@https://www.sodocs.net/doc/371404413.html, .Received :2011-02-28 Revised :2011-03-20

J H MC ,2011;17(3):309-311

View from specialist :It is creative ,and of certain scientific and educational value .

[ABSTR ACT ]Objective :To explore the influence of hypox ia on proliferation and differentiatio n of neural stem cells (NSCs )of hippocam pus in neo nate rats .Methods :Eighteen neo nate rats (g roup Q1,6rats ,1day after birth ;gro up Q7,6rats ,7days after birth ;g roup Q14,6rats ,7days after birth )w ere e xposed to hypoxia status for 2hours .Then hippocampi of each g roup w ere put in the serum -free medium fo r monoclonal culture or subcultivatio n .Then ,m onoclo ned cells w ere induced to be differentiated by fetal bo vine serum fo r 3day s ,and then nestin po sitive cells w ere identified by im muno fluo rescence .Neuron specific eno lase (NSE )po sitive or glial fibrillary acidic protein (GFAP )po sitive cells of 3G subcultivated NSC s w ere calculated .R esults :All mo noclonal cells we re nestin positive ;w hile o nly par ts of the subculti -v ated cells w ere NSE po sitive or GFAP po sitive .It too k 7d ,11d and 40d fo r the mo noclonal cells of group

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海南医学院学报　2011,17(3)

J ournal of Hainan Medical University

DOI :10.13210/j .cn ki .jh m u .2011.03.010

Q1,Q7and Q14to develop into a diameter of200μm.The percentage o f NSE po sitive cells w as significant hig her in Q1than that in Q14.Conclusion s:Hy po xia pretreatment can promo te proliferation of hippocam-pus NSCs and increase the pe rcentage of NSE positive cells mo re o bvio usly Q1rats than that in Q14rats.

[KEY WORDS]H ypoxia;Neona te rats;H ippocam pus;Neural stem cells;Proliferation;Differentia-tion

Anderson等1989年首先提出了神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的概念,并通过实验首次证实神经干细胞的存在。神经干细胞是具有自我更新和多向分化潜能的细胞,存在于哺乳动物中枢神经系统的多个部位,包括皮质、海马结构、纹状体、室下区/室管膜等[2,3]。在一定的微环境中神经干细胞具有自我更新和向神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞分化的潜能,具有极强的可塑性。有人提出应用神经干细胞移植治疗神经系统疾病[4,5],为神经系统疾病的治疗开创了一条新的道路。神经干细胞体外大量增殖成为热点,国内外实验证实新生大鼠神经干细胞体外培养易于成年大鼠神经干细胞[5,6]。Zhang、Zhao等报道缺氧能促进体外培养神经干细胞的存活和增殖[7,8]。然而缺氧对神经干细胞体外培养的影响与新生大鼠出生天数是否有相关性还未见报道。

1　材料与方法

1.1　材料与试剂

新生1天、7天、14天Wistar大鼠各6只,(中国医科大学实验动物中心提供)。DMEM/F12(1:1)无血清培养液、B27添加剂购于Gibco公司,bFGF、E GF购于R&D公司,Nestin抗体、GFAP抗体、NSE抗体均购于博士德公司,Hoechst33342、二抗免疫荧光试剂盒购于北京中杉金桥公司,8%氮氧混合气体由中国医科大学设备处提供。

1.2　实验组动物模型的制作及分组

新生1d(Q1组)、新生7d(Q7组)、新生14d (Q14组)大鼠分别放入充满8%氮氧(92%氮气: 8%氧气v/v)混合气的密闭容器中2h,每组6只。

1.3　细胞的原代培养

无菌条件下分离出各组大鼠海马组织放入DH ank′s液中,剪碎.消化,离心,弃上清,台盼蓝计数活细胞比例,以1×106个/mL密度接种于50m L 培养瓶中,放入37℃、5%CO2孵箱中静置培养,隔天换液1次。

1.4　细胞的单克隆培养

利用有限稀释法进行单克隆培养.每天观察细胞增殖情况。1.5　细胞的传代培养

单克隆培养克隆球直径为200μm时,传代培养,隔天换液1次,每隔5天左右传代1次。

1.6　诱导分化

传3代后克隆球直径达200μm时,将克隆球再次制成单细胞悬液,台盼蓝计数活细胞比例后,以5×105个/m L密度接种于已涂布多聚赖氨酸的六孔板内,每天观察,隔天半量换液,培养3d。

1.7　免疫荧光染色

部分细胞在在诱导分化4h后,4%多聚甲醛固定,进行Nestin免疫荧光染色,H oechst33342复染;部分细胞诱导分化3d后,分别进行NS E、GFAP免疫荧光染色,Ho echst33342复染。

1.8　统计学处理

显微镜下随机选取6个视野计数NSE阳性细胞比例,数据用(x±s)表示,组间比较采用t检验。2　结果

2.1　原代培养结果

Q1组、Q7组细胞生长速度较Q14组快,分别在原代培养3d、5d见到细胞聚集,数量较多;原代培养7d、11d,克隆球直径达到200μm(图1)。Q14组细胞生长速度慢,原代培养40d时可见大部分克隆球直径达到200μm;细胞贴壁明显。

2.2　单克隆培养结果

各组细胞单克隆培养初期细胞增殖缓慢,随着细胞数增多,细胞增殖也相应加快。

2.3　诱导分化

诱导分化的细胞大部分贴壁生长,密布于孔板内,伸出较长突起,细胞间突起相互连接。各组细胞诱导分化为神经元的比例:1组为(22.67±4.08)%,2组为(17.33±2.03)%,3组为(13.17±

1.65)%。

2.4　免疫荧光染色

Nestin染色:阳性细胞胞质呈红色荧光,胞体多角形或梭形(图2A);NS E染色:阳性细胞胞质呈红色荧光,胞体三角形、圆形、梭形或锥形,有的细胞有较长的突起(图2B);GFAP染色:阳性细胞胞质呈红色荧光,胞体长梭形或多角形,有较长的突起

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(图2C ).细胞核呈蓝色荧光

。

图1　

神经干细胞原代培养

注:A :nes tin 染色;B :NS E 染色;C :GFAP 染色。

图2　神经干细胞诱导分化后免疫荧光(标尺100μm )。

3　讨论

神经干细胞具有自我更新和多向分化能力,存在于中枢神经系统多个部位,神经系统的多种疾病影响它的增殖分化。本实验新生大鼠分离海马进行原代培养、单克隆培养及诱导分化。鉴定结果为Nestin 阳性、GFAP 阳性、NSE 阳性。上述结果表明本实验所培养的细胞具有自我更新及多项分化潜能为神经干细胞。

本实验Q1组Q7组、Q14组细胞原代培养克隆球直径达为200μm 所需时间分别为:7d 、11d 、40d 。说明缺氧预处理后新生1d 比新生7d 或新生14d 大鼠脑海马神经干细胞增殖快。

本实验结果Q1组神经元分化比率明显高于Q7组和Q14组;其中Q1组与去4组间统计学差异显著。表明缺氧预处理后新生1d 大鼠海马神经干细胞向神经元分化明显高于新生14d 大鼠。

Zhang 、Zhao 等报道缺氧能促进体外培养神经

干细胞的存活和增殖[9,10]

本实验显示不同出生天数

的新生大鼠神经干细胞对缺氧预处理的反映也有差异。表现为同是新生鼠,不用出生天数缺氧预处理对神经干细胞的影响也不同:即缺氧预处理后新生1d 大鼠神经干细胞增殖及向神经元分化明显优于新生14d 大鼠;而与新生7d 大鼠差异无统计学意义。

Q1组较Q 7组和Q14组神经干细胞增殖迅速并神经元分化比例高的机制尚不清楚。如果研究出这一机制就可大量体外培养神经干细胞,为神经干

细胞的移植奠定实验基础。参考文献

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(责任编辑　伍平)

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赵久红.缺氧预处理对不同鼠龄大鼠海马神经干细胞增殖和分化的影响