高效聚磷菌Alcaligenes_省略__12菌株的分离鉴定及其除磷特性_庄志刚

第34卷第3期2014年3月

环境科学学报Acta Scientiae Circumstantiae

Vol．34，No．3Mar．，2014

基金项目：福建省财政厅资助项目（No．20130421）；福建省大学生创新创业训练项目（No．sjcxcy2012-022）；福建师范大学拔尖人才训练项目（生物学拔尖201004）

Supported by the Funded Project of Finance Department of Fujian Province （No．20130421），the Innovative Entrepreneurial Training Plan for College Students of Fujian Province （No．sjcxcy2012-022）and the Ｒesearch Training Item of Top-Notch Biological Students of Fujian Normal University （Biological top-Notch 201004）

作者简介：庄志刚（1991—），男，

E-mail ：zgzhuangfjnu@163．com ；*通讯作者（责任作者），E-mail ：mli@fjnu．edu．cn Biography ：ZHUANG Zhigang （1991—），male ，E-mail ：zgzhuangfjnu@163．com ；*Corresponding author ，E-mail ：mli@fjnu．edu．cn

DOI ：10．13671/j．hjkxxb．2014．0119

庄志刚，韩永和，章文贤，等．2014．高效聚磷菌Alcaligenes sp．ED-12菌株的分离鉴定及其除磷特性［J ］．环境科学学报，34（3）：678-687Zhuang Z G ，Han Y H ，Zhang W X ，et al ．2014．Isolation ，identification and phosphorus-removal characterization of bacteria Alcaligenes sp．strain ED-12for phosphorus-accumulation ［J ］．Acta Scientiae Circumstantiae ，

34（3）：678-687高效聚磷菌Alcaligenes sp．ED-12菌株的分离鉴定及

其除磷特性

庄志刚1，韩永和1，2，章文贤1，周志华1，陈佳兴1，李敏1，*

1．福建师范大学生命科学学院，福州350108

2．南京大学环境学院生物地球化学与环境修复实验室，南京210046收稿日期：2013-07-05

修回日期：2013-09-10

录用日期：2013-09-20

摘要：利用经典的微生物筛选方法，从福州市闽侯县上街镇高岐村某排污口淤泥中分离出1株高效聚磷菌，并结合16S rＲNA 基因序列分析进行了菌株鉴定．结果表明，

该菌株为产碱杆菌，将其命名为Alcaligenes sp．ZGED-12．理化因素实验显示，在以乙酸钠为碳源、NH 4Cl 为氮源，当C /N 为3?1，pH 为8．0，温度和摇床转速分别为35?和100r ·min －1时，该菌株的生长状态最好，对磷的去除能力也最强，最高除磷率可达80%．此外，该菌株能够耐受较高浓度的磷，当磷浓度超过45mg ·L －1时会产生抑制效应．同时，以聚乙烯醇（PVA ）和海藻酸盐（SA ）制备了聚磷微生物固定化小球，并考察了菌球对氮磷废水的净化效果．结果表明，氮磷的去除包括固定化材料的吸附作用及微生物的生长利用和/或贮存，

显示出了良好的应用前景．关键词：聚磷微生物；产碱杆菌；筛选鉴定；特性；固定化文章编号：0253-2468（2014）03-678-10中图分类号：X172，

X703．1文献标识码：A

Isolation ，identification and phosphorus-removal characterization of bacteria Alcaligenes sp．strain ED-12for phosphorus-accumulation

ZHUANG Zhigang 1，HAN Yonghe 1，2，ZHANG Wenxian 1，ZHOU Zhihua 1，CHEN Jiaxing 1，LI Min 1，

*

1．College of Life Sciences ，Fujian Normal Univiersity ，Fuzhou 350108

2．Biogeochemistry ＆Environmental Ｒemediation Laboratory （BEＲL ），School of the Environment ，Nanjing University ，Nanjing 210046Ｒeceived 5July 2013；

received in revised form 10September 2013；

accepted 20September 2013

Abstract ：A phosphorus-accumulating bacteria was isolated from a drain outlet located in Gaoqi Village ，Shangjie Town ，Minhou County ，Fuzhou ，China．The strain ，named Alcaligenes sp．ZGED-12，was obtained by classic methods for screening microorganisms together with 16S rＲNA gene analysis．The culture conditions showed that the best carbon source and nitrogen source were sodium acetate and NH 4Cl ，respectively ，the optimal pH was 8．0，the optimal temperature was 35?，the best C /N was 3?1，and the optimal shaking rate was 100r ·min －1．Under these optimized conditions ，the maximum removal efficiency for phosphorus was higher than 80%．The strain has a high tolerance for phosphorus ，but its growth was inhibited when the concentration of phosphorus was higher than 45mg ·L －1．Meanwhile ，the immobilized phosphorus-accumulating organisms beads （IMOBs ）were prepared ，and the purification efficiency of IMOBs for nitrogen /phosphorus contaminated wastewater was investigated．The results showed that removal for nitrogen and phosphorus was due to absorption on the immobilized materials and uptake /metabolism of microorganisms ，indicating a good prospective of IMOBs in the treatment of wastewater．

Keywords ：phosphorus-accumulating organisms （PAOs ）；Alcaligenes sp．；screening and identification ；characteristics ；immobilization

3期庄志刚等：高效聚磷菌Alcaligenes sp．ED-12菌株的分离鉴定及其除磷特性

1引言（Introduction）

磷超标是造成水体富营养化的主要原因之一．研究发现，当总磷浓度超过0．1mg·L－1（磷作为限制因素，m TN?m TP＞15?1），藻类会过度繁殖（Abell et al．，2010）；一般情况下，总磷浓度超过0．02 mg·L－1就有可能导致水体富营养化（韩永和等，2012）．由于水体富营养化现象日趋严重，严重破坏了人类赖以生存的自然环境，威胁着人类的健康（Ansari et al．，2011）．常规的生化处理工艺效率低，不能从根本上解决问题．近些年，微生物除磷工艺的研究得到了迅速发展，主要有A/O、A2/O、UCT、五段Bardenpho、Phostrip等（马放等，2011）．为实现微生物除磷工艺的有效实施，筛选出除磷能力较强的聚磷微生物是首要目标．此外，考虑到聚磷微生物对磷的吸收是一个厌氧释磷、好氧吸磷的过程（张培玉等，2011），有必要考察聚磷微生物对溶氧的响应．同时，微生物聚磷过程会受有机质分子大小、pH等的影响（王亚宜等，2005；2006）．因此，考察特定微生物在不同理化条件下的生长情况和除磷特性是实现微生物除磷机理研究及其在工程应用的前提条件．

为获得除磷能力较强的微生物种质资源，自聚磷菌首次被Fuhs等（1975）分离以来，至今已有多种具备聚磷能力的微生物被筛选出来．多项研究表明，产碱杆菌属细菌（Alcaligenes sp．）具备这方面的能力（Flores III et al．，2007；Joo et al．，2006；Zhou et al．，2012）．此外，肠杆菌（Enterobacteriaceae）（张培玉等，2011；赵海泉等，2009）、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus）（南亚萍等，2013）、Accumulibacter （Acevedo et al．，2012；Oehmen et al．，2005）、变形菌（Alphaprotenbacteria）（Nguyen et al．，2012；周明璟等，2012）等也是常见的聚磷微生物，甚至存在兼具反硝化功能的聚磷微生物（Qiu et al．，2012；Yang et al．，2011；杨小龙等，2011）．在此基础上，人们又开展了大量关于溶氧对聚磷菌除磷能力的影响研究（Acevedo et al．，2012；Merzouki et al．，1999；张培玉等，2011），但这些研究较少涉及不同聚磷菌在不同的厌氧时间条件下对好氧吸磷的相关作用．此外，诸如pH和有机质分子大小等理化因素对聚磷菌聚磷能力的影响也已得到较深入研究（Filipe et al．，2001；Oehmen et al．，2005；王亚宜等，2005）．然而，当前的多数研究只局限于对单一因素的考察，抑或集中于研究高浓度废水的生物处理系统，目前，聚磷微生物除磷工艺离工程应用仍有较大的距离（丁炜等，2011）．正如Covarrubias等（2012）研究表明，微生物的固定化能够为其活性持留提供保障．然而，考察固定化聚磷菌对含磷废水的修复实验尚未见相关报道．因此，继续筛选和开发具备高效除磷功能的微生物，开展聚磷微生物的固定化、活性持留及污水修复并开展综合理化因素对聚磷微生物除磷能力的影响等方面的研究对工程实践有重要指导意义．

鉴于此，本研究从排污口淤泥中筛选出1株具备高效除磷能力的聚磷菌，全面考察各理化因素对菌株生长及除磷能力的影响．同时，对微生物进行固定化，并重点考察其对含磷废水的净化效果．

2材料与方法（Materials and methods）

2．1材料

2．1．1样品来源淤泥样品采自福州市闽侯县上街镇高岐村某排污口，立即用于菌种的分离与筛选．2．1．2培养基富集培养基、筛选培养基、微量元素（张培玉等，2011），以及缺磷培养基（马放等，2011）和富磷培养基（李博等，2009）分别按文献进行配制．LB培养基（g·L－1）：蛋白胨10．00，酵母粉5.00，NaCl10．00，琼脂2．00（固基加入），pH=7．2．固定化微生物小球实验培养基（g·L－1）：丁二酸钠0.61，NaNO

3

0．28，KH

2

PO

4

0．1，KCl0．014，

MgSO

4

·7H

2

O0.02，CaCl

2

·2H

2

O0．018，pH=7．2．以上所有培养基均经121?灭菌（碳源实验中，葡萄糖和蔗糖组115?灭菌）20min后使用，微量元素于灭菌前加入．

2．1．3微生物固定化小球制备材料聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol，PVA）、海藻酸盐（Sodium

alginate，SA）、硼酸（H

3

BO

3

）、无水氯化钙（CaCl

2

），除硼酸（分析纯）外其余均为化学纯．

2．2方法

2．2．1聚磷菌的分离鉴定称取0．5g新鲜淤泥，用无菌水水洗后8000r·min－1离心5min，弃上清，此过程重复3次．处理后将样品加入2．1．2节的富集培养基中，添加量及其他条件参考文献（韩永和等，2013）．培养12h后，取1．5mL菌悬液于下一磷梯度的培养基中，磷梯度依次为2、5、8、10、15和20mg·L－1（以P计）．

聚磷菌含有典型的PHB颗粒和异染颗粒，经强

976

环境科学学报34卷

化释磷、吸磷实验后，PHB颗粒可被脂溶性染料苏

丹黑着色，异染颗粒可被甲苯胺蓝和次甲基蓝染成

紫色，可与其他非颗粒性物质区分开来（李博等，

2009；马放等，2011）．将富集驯化的菌悬液按10－1

10－7梯度进行稀释，涂布平板．挑取形态较特殊

的单菌落进行PHB颗粒染色和异染颗粒染色，确定

含有PHB颗粒和异染颗粒的菌落，进行复筛实验．

挑取经纯化的单菌落于缺磷培养基中，150

r·min－1、30?培养12h．将菌液在8000r·min－1条

件下离心5min，再将菌液转接于富磷培养基中，150

r·min－1、30?培养至菌液变浑浊．计算各株菌的除

磷率．此后，将复筛得到的聚磷菌根据文献（韩永和

等，2013）的方法进行16S rＲNA的测序及系统发育

分析．

2．2．2理化因素对聚磷菌生长及除磷特性的影响

聚磷菌具备高效除磷能力主要基于异染颗粒对

磷的贮存，菌体在生长过程中也能够利用部分磷合

成细胞成分．文献报道显示，聚磷菌在厌氧、缺磷条

件下能够把贮存于异染颗粒中的磷释放出来，经厌

氧释磷后将其投入富磷培养基中进行除磷实验能

够大大提高除磷能力（Merzouki et al．，1999；张培

玉等，2011；周明璟等，2012）．此外，碳源、氮源、

C/N、pH、温度等都会影响聚磷菌的生长．因此，考

察不同理化因素对聚磷菌生长及除磷能力的影响

是必要的，这对实现聚磷菌的工程应用有重要参考

价值．

将菌株ED-12于LB培养基中培养12h（30

?、150r·min－1），按5%的接种量接种于装有30

mL缺磷培养基（PO3－

4

-P质量浓度为12．3mg·L－1）

的150mL三角瓶中，30?、150r·min－1摇瓶培养12

h；再按5%的接种量将菌悬液接种于装有30mL富

磷培养基（PO3－4-P质量浓度为32mg·L－1）的150

mL三角瓶中，30?、150r·min－1摇瓶培养．每隔一

定的时间取样测定菌株ED-12的OD600及剩余的

PO3－

4

-P浓度，计算除磷率并绘制菌株的生长曲

线图．

以聚磷菌的生长特性为基础，以乙酸钠、丁二

酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖和蔗糖为碳源，以NH4Cl、

（NH

4）

2

SO

4

和NH4NO3为唯一氮源，同时考察了不

同C/N、起始pH和摇床转速对聚磷菌生长及除磷能力的影响．在优化过程中，已优化的参数作为后续实验的条件．此外，在最优条件下，探讨了菌株

ED-12对不同起始浓度PO3－

4-P的去除效果，以考察

其工程应用价值．PO3－4-P的起始浓度梯度设置为：

5、15、30、45、60和100mg·L－1．

2．2．3微生物固定化小球的制备及除氮磷初步实

验微生物固定化小球的制备按以下步骤进行：①

称取4g PVA（聚合度1750?50）溶于90mL无菌水

中，待PVA充分溶解后加入2g SA，沸水浴加热至

完全溶解，冷却至室温备用；②分别称取2g反硝化

菌和聚磷菌湿菌体，充分稀释于10mL无菌水中，再

将稀释后的菌液加入PVA-SA体系中，充分混匀；③

根据需要的小球粒径，剪去5mL移液枪枪头尖端，

吸取菌体混合物，匀速滴入5%CaCl2-饱和硼酸溶液

中，交联15min后，将小球用无菌水洗净，备用．

以不添加菌球的组别为空白对照（Blank

control），以不添加微生物的固定化小球组为阳性对

照（PVA+SA），按5%（m/V，g·L－1）投加小球．24

h后取样测定水样的TN和TP浓度，计算脱氮除磷

能力．

2．3测定方法

硝态氮（NO－3）和总氮（TN）的测定采用麝香草

酚分光光度法（韩永和等，2013），总磷（TP）的测定

采用钼锑抗分光光度法（国家环境保护总局，

2002）．

2．4数据处理与统计分析

运用Microsoft Excel2003和Origin8．5进行数

据处理、统计分析及绘图．所有实验均进行3个重

复，结果以Mean?SD表示．

3结果与讨论（Ｒesults and discussion）

3．1聚磷菌的分离鉴定

3．1．1聚磷菌的分离纯化及复筛经富集，聚磷微

生物在平板上的菌落随着磷浓度的升高而减少，当

磷浓度达到20mg·L－1时，平板上已无单菌落．将磷

浓度为15mg·L－1的培养基按10－1 10－7稀释，涂

布平板．根据形态特征，将能够在培养基上生长的

49个单菌落分成4类，分别为EA（12株）、EB（15

株）、EC（8株）和ED（14株）．分别对EA、EB、EC

和ED进行PHB颗粒染色和异染颗粒染色，初筛得

到9个染色效果较明显的聚磷菌单菌落（EA、EB和

ED各3个，EC无受染现象）．

随后，对EA、EB和ED共9株聚磷菌进行复筛

实验．分别缺磷培养12h后，转接于富磷培养基中

继续培养24h，测定除磷率，结果如表1所示．可

知，ED-12对磷的去除能力最强，可达52．2%，因

086

3期庄志刚等：高效聚磷菌Alcaligenes sp．ED-12菌株的分离鉴定及其除磷特性此，选择菌株ED-12作进一步研究．

表1聚磷菌的除磷能力（起始浓度：33．9mg·L－1）

Table1The phosphorus removal ability of phosphorus－accumulating

organisms（initial concentration：33．9mg·L－1）

菌株总磷浓度/

（mg·L－1）

去除率

A-0327．219．70% A-0626．920．60% A-1027．419．10% B-0429．812．10% B-1029．213．90% B-1129．114．50% D-0616．850．40% D-0817．348．90% D-1216．252．20%3．1．2聚磷菌菌株ED-12的16S rＲNA的PCＲ扩增及序列分析经测序，获得片段长度为1463bp 的部分16S rＲNA基因序

列，GenBank登录号为

JX966315．在NCBI数据库的比对结果表明，该菌株

与Alicaligenes sp．的相似性达98%以上，推测其为

Alicaligenes sp．选择序列相关性较高的76个16S

rＲNA序列，用Cluxtal X序列分析软件分析其与

ED-12的序列同源可靠性，选9个可信度较高的序

列用MEGA4．0软件通过N-J法构建系统发育树，

确定ED-12的进化地位，结果如图1所示．

图1基于16S rＲNA序列同源性构建的菌株ED-12和亲缘性相近的其他细菌的系统发育树

Fig．1Unrooted phylogenetic trees based on the16S rＲNA sequence of strain ED-12and the related strains

图2菌株ED-12的生长曲线及除磷特性

Fig．2Growth curve and phosphorous removal characteristic of

strain ED-12

3．2ED-12的生长曲线及除磷特性聚磷菌在缺

氧、缺磷条件下会利用异染颗粒中的磷并合成

PHB，将其转入有氧、富磷的培养基后会将PHB中

的能量释放出来，以便更高效地聚磷，用于菌体生

长并将剩余的磷储存于异染颗粒中（马放等，

2011）．图2展示了菌株ED-12经缺磷培养后在富

磷培养基中的生长情况，以及其对PO3－4-P的去除

率．结果表明，在前16h，菌体生长处于延滞期，16

h后进入对数期，52h后开始进入衰亡期．在整个

过程中，菌体生长特征与除磷率趋势基本吻合．64

h内，磷浓度从30mg·L－1左右降低到（8．12?

0.32）mg·L－1，去除率达73．82%?1．02%．此后，

总磷浓度基本保持不变．

3．3不同理化因素对菌株ED-12的生长及除磷能

力的影响

3．3．1不同碳源对菌株ED-12的生长及除磷能力

的影响有机物特征是影响生物反应器反硝化和

除磷效果的重要因素，与反硝化微生物类似（韩永

和等，2013），大部分聚磷菌只能以低级脂肪酸类的

小分子有机基质作为碳源，并将其合成的PHB以能

量形式储存在细胞内（王亚宜等，2006）．

以乙酸钠、丁二酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖和蔗糖

为碳源，菌株ED-12的生长及除磷能力结果如图3

所示，菌株ED-12在以葡萄糖和蔗糖为碳源时基本

不生长，对PO3－4-P的去除率低于15%．而菌株在以

乙酸钠、丁二酸钠、柠檬酸钠为碳源时长势较好，且

对PO3－4-P的去除率都在50%以上．其中，以乙酸钠

为碳源时，菌株ED-12生长最旺盛，对PO3－4-P的去

除率达到了70%以上．对比5种碳源结构与分子

量，相对而言，在分子结构简单、分子量低的情况

186

环境科学学报34卷

下，聚磷菌的生长较好，且能达到一个较高的除磷

率，这与前述观点相符．此外，

聚磷菌对不同碳源的利用效果可能还与其本身对碳源的亲和性或其

他特性有关

．

图3不同碳源对菌株ED-12生长及除磷能力的影响

Fig．3

Influence of different carbon sources on the growth and phosphorus removal ability of strain ED-12

3．3．2不同氮源对菌株ED-12的生长及除磷能力

的影响氮源是微生物细胞生长的第二大营养物质，对蛋白质、核酸和其他一些成分的合成非常重要（Madigan et al ．，

2009）．多数细菌能以氨盐作为唯一氮源，由图4可知，在以NH 4Cl 、（NH 4）2SO 4和NH 4NO 3为唯一氮源的培养基中，聚磷菌能够良好生长．其中，

在含有NH 4Cl 的培养基中OD 600可在24h 内达到1．4左右．同时，在以上3种氮源培养基中，

菌株ED-12对PO 3－

4-

P 的去除率都在45%以上（NH 4Cl 培养基最高，可达80%）．观察发现，菌株ED-12在24h 时，在以NaNO 3和NaNO 2为唯一氮源的培养基中只能微弱的生长，但经48h 的培养后，开始进入对数期，并能达到较高的OD 600．此外，虽然以NaNO 3和NaNO 2为唯一氮源时微生物生长情况

较差，但培养基中PO 3－

4-

P 浓度分别降低了63．72%?5.57%和34．84%?2．11%，说明微生物在24h 内主要通过分解PHB 并将磷储存于异染颗粒中在

后期用于菌体的生长．但Saito 等（2004）研究认为，NO －2的存在在有氧和无氧两种情况下都会抑制聚磷菌对磷的吸收．图4得出了不同的结论，其机理有待进一步研究．在以蛋白胨为唯一氮源的培养基

中，

菌株ED-12长势较好，但蛋白胨含有含磷杂质，因而影响了PO 3－

4

-P 去除率的计算．由此可知，聚磷菌ED-12菌株能够在以NH 4Cl 、NaNO 3、NaNO 2、（NH 4）2SO 4、蛋白胨和NH 4NO 3为唯一氮源的培养基中生长．根据微生物生长量、生长

周期及对PO 3－

4-P 的去除率，NH 4Cl 是菌株ED-12生长及发挥除磷能力的最佳氮源

．

图4不同氮源对菌株ED-12生长及除磷能力的影响

Fig．4

Influence of different nitrogen sources on the growth and phosphorus removal ability of strain ED-12

3．3．3

不同C /N 对菌株ED-12的生长及除磷能力

的影响碳源和氮源是微生物生长的重要物质，不同微生物对碳源和氮源的需求量不同．细菌对氮源的需求量大，真菌和放线菌等对碳源的需求量大（周德庆，2002）．在脱氮除磷工艺中，必须考虑C /N 以实现微生物对废水中氮、磷的有效利用．考察C /N 对聚磷菌ED-12菌株生长及除磷能力的影响，结果（图5）表明，随着C /N 的升高，菌体

生物量增大，同时对PO 3－

4-P 的去除率也随之提高，C /N 为3?1时达到最大值．此后，微生物的生长及

对PO 3－

4-P 的去除率又随着C /N 的升高而缓慢降低，说明过高的C /N 导致氮源不足，微生物生长也

因此受到了抑制

．

图5不同C /N 对菌株ED-12生长及除磷能力的影响

Fig．5

Influence of different C /N on the growth and phosphorus removal ability of strain ED-12

3．3．4

不同pH 对菌株ED-12的生长及除磷能力

的影响在好氧条件下，聚磷菌能分别以醋酸和

2

86

3期庄志刚等：高效聚磷菌Alcaligenes sp．ED-12菌株的分离鉴定及其除磷特性

PO 3－4为碳源和磷源，生成聚合态磷作为储能物质，储存于细胞内并伴随着产生OH －

，导致发酵液的pH 值逐渐升高（周明璟等，2012）．其聚磷过程可

用式（1）表示（连丽丽，

2009；周明璟等，2012）．C 2H 4O 2+0．16NH +4+1．2O 2+0．2PO 3－

4→

0．16C 5H 7NO 2+1．2CO 2（HPO 3）（胞内聚磷）+0．44OH －+1．44H 2O

（1）

有研究表明，

pH 对聚磷菌聚磷过程非常重要，pH ≈8最适宜聚磷菌生长及除磷作用的发生（Filipe et al．，2001；Oehmen et al．，2005）．本研究发现，当pH 值＜7．0时，聚磷菌ED-12菌株基本不生长，对

PO 3－4-P 的去除率为0；当pH ＞8．0时，会抑制菌体的生长，但对PO 3－

4-P 的去除率却在持续地升高．有文献报道，

pH 升高（在碱性条件下）会导致PO 3－4-P 以磷酸盐沉淀的形式析出（王亚宜等，2005）．在本研究中，当pH ＞8．0时，培养基中有沉

淀产生，推测沉淀物即为文献中所报道的磷酸盐沉淀，因此出现了以上现象（升高）

．

图6不同起始pH 对菌株ED-12生长及除磷能力的影响Fig．6

Influence of different initial pHs on the growth and phosphorus removal ability of strain ED-12

3．3．5不同温度对菌株ED-12的生长及除磷能力的影响

温度是除有机物特征外影响微生物生长

的另一重要因素，但王亚宜等（2006）和姜体胜等（2007）认为，温度不会影响聚磷菌发挥聚磷作用．

由图7可知，随着温度的升高，聚磷菌ED-12菌株的生物量也增大，

35?时最适宜ED-12菌株的生长．相应地，ED-12菌株对PO 3－

4-

P 的去除率也呈先增后减的趋势，在35?时达到最大值（73．14%?1．65%）．由此可知，不同温度对聚磷菌ED-12菌株除磷效果的影响比对其生长的影响大得多．温度对聚磷效果存在影响，这与Panswad 等（2003）的研究结果相符，即35?最有利于聚磷菌发挥聚磷作

用，过高或过低的温度都会抑制其效果，说明不同

的微生物聚磷特性存在差异

．

图7不同温度对菌株ED-12生长及除磷能力的影响Fig．7

Influence of different temperatures on the growth and phosphorus removal ability of strain ED-12

3．3．6

不同摇床转速对菌株ED-12的生长及除磷

能力的影响研究表明，溶氧是影响生物除磷效果的一个重要因素（方茜等，

2008；荣宏伟等，2008）．为了满足聚磷菌生物膜内对氧的需求量，加快氧的传递速率，增加活性生物膜的厚度，加快聚磷菌的好氧吸磷速率，必须提高液相主体中溶解氧的含量（荣宏伟等，2008）．此外，低溶氧有利于反硝化除磷，高溶氧有利于好氧吸磷（在含硝酸盐或亚硝酸盐培养中可以进行厌氧生长）（方茜等，

2008）．如图8所示，摇床转速在0 200r

·min －1之间，菌株ED-12都能生长．当摇床转速为50r ·min －1

时，菌体OD 600最高，达2．60?0．62；当摇床转速为

100r ·min －1时，对PO 3－4-

P 的去除率最高，达59.05%?7.26%．在各培养条件下，菌体的生长与

除磷率趋势不尽相同，

说明二者是彼此独立的过程．静置培养时，

储存于异染颗粒的磷被分解，用于菌体的生长，此时对PO 3－

4-P 的去除率近50%，说明

菌株ED-12在厌氧条件下还能将环境中的磷用于生长．好氧条件下，菌体将部分磷用于生长，并将剩

余的磷储存于异染颗粒中，因此，在转速≥50r

·min －1时也能维持一个较高的除磷率．观察发现，摇床转速过高未必能提高除磷率．

微生物固定化小球脱氮除磷实验表明（详见3.5节），ED-12菌株在低溶氧与高溶氧时都存在除磷或聚磷作用，二者作用能力的强弱导致了图8所

示的结果，即高溶氧时对PO 3－

4-P 的去除率与低溶氧时相近．当摇床转速为100r ·min －1

时，培养基中

3

86

环境科学学报34卷

的溶氧最适合ED-12菌株对磷的反硝化去除或储

存于异染颗粒中．低溶氧和高溶氧条件下，则分别表现为对磷的生长利用和积聚．因此，对废水中的

磷的有效去除可以通过调节溶氧而实现，此过程包括生长利用和聚磷作用

．

图8不同摇床转速对菌株ED-12生长及除磷能力的影响Fig．8

Influence of different shaking speeds on the growth and phosphorus removal ability of strain ED-12

3．4菌株ED-12对不同起始浓度PO 3－

4

-P 的去除效果

聚磷菌对磷的去除包括两条途径：生长利用和

异染颗粒贮磷．根据聚磷菌分离筛选原理，过高浓度的PO 3－

4

-P 会抑制聚磷菌的生长与繁殖．因此，考

察不同起始浓度的PO 3－

4-P 对聚磷菌生长的影响及相应条件下聚磷菌对PO 3－

4-P 的去除效果，对分析聚磷菌生长与聚磷过程的关系及指导聚磷菌在富

营养化水体中的工程应用有实际意义．

如图9所示，随着PO 3－

4-P 浓度的升高，菌株ED-12的OD 600呈先增后减的趋势．当PO 3－

4-

P 浓度为45mg ·L －1时，菌株ED-12的长势最好，过高的

PO 3－4-P 反而会抑制菌体的生长．这是由于微生物生长受到了基质自抑制作用（王茹等，2013），这与聚

磷菌分离筛选的结论相符．观察发现，

除5mg ·L －1组，随着PO 3－4-P 浓度的升高，菌株ED-12对PO 3－

4-P 的去除率与聚磷菌生物量成正相关（图中未显示），

但PO 3－4-P 的变化浓度始终呈一递增趋势．当PO 3－

4-P 浓度＞45mg

·L －1

时，培养基中出现了部分沉淀

物．正如3．3．4节的结论，聚磷过程会释放OH －

，微

生物生长越快，在相同的时间内产生的OH －

也越多，因此，就有越多的PO 3－

4-P 形成了沉淀（王亚宜等，

2005），这合理地解释了以上的现象．以上结论说明，

Alcaligenes sp．ED-12对磷的吸收是一个复杂的过程，

在菌体生长及聚磷过程中，不仅会受理化因素尤其是pH 的影响，

溶液中的磷浓度也是影响聚磷菌生长与聚磷效果的一个关键因素．由以上分析可知，菌株ED-12对PO 3－

4-P 的去除能力很强，在

不同PO 3－

4-P 起始浓度梯度条件下，最高去除率可达81．02%?2．27%，此时的PO 3－

4-

P 浓度变化量为（36.46?1．02）mg ·L －1

．

图9菌株ED-12对不同起始浓度PO 3－

4-

P 的去除效果Fig．9

Ｒemoval efficiency of strain ED-12on different initial

concentrations of PO 3－

4-

P 表2所示为典型的聚磷菌对不同起始浓度PO 3－4-P 的去除效果．由表可知，除耳葡萄球菌（Staphyloccocus

auricularis ）、Accumulibacter

和

Competibacter 外，其他菌株对浓度＜50mg

·L －1的PO 3－4-P 去除效果一般．在当前所报道的产碱杆菌除磷能力实验中，都未开展磷浓度梯度实验；除Bao 等（2007）的报道外，其余产碱杆菌菌株对浓度＜30

mg ·L －1的PO 3－4-

P 去除效果都低于90%．本研究所得菌株不仅在磷浓度为45mg

·L －1

时具有较高的去除率，

当浓度高达60mg ·L －1甚至100mg ·L －1时还能维持较高的活性及去除率．因此，菌株ED-12是一株较理想的聚磷菌，具有广阔的应用前景．然而，微生物聚磷过程比较复杂，今后的研究工作可围绕精确定量菌株Alcaligenes sp．ED-12的磷吸收在生长利用及贮存方面的比例及吸收与释放的关系上．3．5

固定化聚磷微生物小球除氮磷实验

微生物的固定化是实现微生物活性持留的途径之一，同时，固定化也有助于目标微生物的投加与回收（Covarrubias et al．，

2012）．当前应用最广泛的固定化材料是聚乙烯醇和海藻酸盐（Covarrubias et al．，2012；

Munjal et al．，2002；

Wu et al．，

2004），固定化交联剂通常选择2% 5%的CaCl 2-饱和硼酸溶液（Long et al．，2004；Wu et al．，

4

86

3期庄志刚等：高效聚磷菌Alcaligenes sp．ED-12菌株的分离鉴定及其除磷特性

2004）．

表2

不同微生物对磷的去除效率

Table 2

Ｒemoval efficiency of phosphorus for different microbes

微生物

PO 3－4-

P 起始浓度/（mg ·L －1）

PO 3－

4-

P 去除率参考文献金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus ）1065%南亚萍等，2013耳葡萄球菌（Staphyloccocus auricularis ）50＞90%Choi et al．，2000肠杆菌（Enterobacter sp．）10．2594．6%张培玉等，2011Accumulibacter ＆Competibacter 53．3＞80%Oehmen et al．，2005克雷伯氏菌（Klebsiella terrigena ）27＜80%赵海泉等，2009约氏不动杆菌（Acinetobacter johnsonii ）1065．24%连丽丽，2009产碱杆菌（Alcaligenes sp．）7．590%刘亚男等，2005产碱杆菌（Alcaligenes sp．）10＞90%Bao et al．，2007产碱杆菌（Alcaligenes sp．）20．2582．3%孙梦，2011产碱杆菌（Alcaligenes sp．）28．7377．1%焦中志等，

2009产碱杆菌（Alcaligenes sp．）

45

81%

本研究

图10

固定化聚磷微生物小球对氮磷的去除效果

Fig．10

Ｒemoval efficiency for TN and TP by the immobilized-PAOs

beads

根据赖子尼等（2008）的实验配方制备的固定

化聚磷微生物小球的弹性与机械强度较好，对含氮磷废水的净化效果表明，菌球对磷有较强的去除能力（从（19．91?1．81）mg

·L －1降至（6．19?0．76）mg ·L －1），同时能够去除一定的氮（从（215．82?35.29）mg

·L －1降至（183．42?15．35）mg ·L －1）（图10a ）．二者的去除率分别达56．21%和

15.01%（图10b ）．其中，固定化材料对氮的吸附比例较小，而对磷的吸附较显著（p ＜0．01），这可能与

固定化材料的表面官能团及CaCl 2等对PO 3－

4的亲

和力强于NO －

3有关．同时，

固定化微生物（IMOs ）对磷的去除效果也优于氮，说明菌株ED-12可能不具备反硝化能力，对氮的利用仅是生长所需．由

PVA +SA +IMOs 组与PVA +SA 组比较可知（图10b ，#表示），无论是氮还是磷，都存在显著差异，说明固定化微生物是氮磷去除的主要贡献者．4

结论（Conclusions ）

1）本研究成功从高岐村某排污口筛选出1株

典型的聚磷微生物，

鉴定发现其属于产碱杆菌属（Alcaligenes sp．）细菌，将其命名为Alcaligenes sp．ZGED-12．

2）研究发现，菌株ED-12能在高磷浓度下生长，

16h 时进入生长对数期．理化因素实验确定了聚磷菌ED-12的最适生长及发挥除磷能力的条件，其中，碳源、氮源和pH 对其影响最大．磷浓度实验表明，

低浓度磷不利于菌株ED-12的生长，但过高浓度反而会抑制菌体生长及发挥聚磷功能，最优磷

浓度为45mg

·L －1．3）本研究成功实现了聚磷微生物的固定化，该固定化小球对氮磷的去除显示出了良好的效果，作用机理包括固定化材料对氮磷的物理化学吸附及微生物的吸收利用（或贮存）．其中，微生物在这个过程中起着关键作用．

5

86

环境科学学报34卷

致谢（Acknowledgements）：感谢南京大学环境学院崔昕毅副研究员在英文摘要修改过程中提供的宝贵意见，一并感谢福建师范大学余鸿婷在文稿润色方面所提供的帮助．

责任作者简介：李敏（1955—），女，博士，福建师范大学教授、博士生导师，方向为主要研究生物材料与生物技术环境修复．已主持多项课题，发表文章80余篇，授权专利9项．

参考文献（Ｒeferences）：

Abell J M， zkundakci D，Hamilton D P．2010．Nitrogen and phosphorus limitation of phytoplankton growth in New Zealand lakes：Implications for eutrophication control［J］．Ecosystems，13（7）：966-977

Acevedo B，Oehmen A，Carvalho G，et al．2012．Metabolic shift of polyphosphate-accumulating organisms with different levels of polyphosphate storage［J］．WaterＲesearch，46（6）：1889-1900 Ansari A A，Gill S S，Khan F A．2011．Eutrophication：Threat to Aquatic Ecosystems//Ansari A A，Gill S S，Lanza GＲ，et al．Eutrophication：Causes，Consequences and Control［M］．Berlin：Springer．143-170

Bao L L，Li D，Li X K，et al．2007．Phosphorus accumulation by bacteria isolated from a continuous-flow two-sludge system［J］．Journal of Environmental Sciences，19（4）：391-395

Choi S S，Yoo Y J．2000．Ｒemoval of phosphate in a sequencing batch reactor by Staphylococcus auricularis［J］．Biotechnology Letters，22（19）：1549-1552

Covarrubias，S A，de-Bashan L E，Moreno M，et al．2012．Alginate beads provide a beneficial physical barrier against native microorganisms in wastewater treated with immobilized bacteria and microalgae［J］．Applied Microbiology and Biotechnology，93（6）：2669-2680

丁炜，朱亮，徐京，等．2011．好氧反硝化菌及其在生物处理与修复中的应用研究进展［J］．应用与环境生物学报，17（6）：923-929方茜，张朝升，张可方，等．2008．溶解氧对反硝化聚磷菌的影响研究［J］．中国给水排水，24（1）：35-39

Filipe C D M，Daigger G T，Grady Jr C P L．2001．pH as a key factor in the competition between glycogen-accumulating organisms and phosphorus-accumulating organisms［J］．Water Environment Ｒesearch，73（2）：223-232

Flores III A，Nisola G M，Cho E，et al．2007．Bioaugmented sulfur-oxidizing denitrification system with Alcaligenes defragrans B21for high nitrate containing wastewater treatment［J］．Bioprocess and Biosystems Engineering，30（3）：197-205

Fuhs G，Chen M．1975．Microbiological basis of phosphate removal in the activated sludge process for the treatment of wastewater［J］．Microbial Ecology，2（2）：119-138

国家环境保护总局．2002．水和废水监测分析方法（第4版）［M］．北京：中国环境科学出版社

韩永和，李敏．2012．植物-微生物联合修复技术治理水体富营养化［J］．水处理技术，38（3）：1-6，11

韩永和，章文贤，庄志刚，等．2013．耐盐好氧反硝化菌A-13菌株的

分离鉴定及其反硝化特性［J］．微生物学报，53（1）：47-58

姜体胜，杨琦，尚海涛，等．2007．温度和pH值对活性污泥法脱氮除磷的影响［J］．环境工程学报，1（9）：10-14

焦中志，李相昆，张立成，等．2009．反硝化聚磷菌菌种筛分与除磷特性分析［J］．沈阳建筑大学学报（自然科学版），25（3）：535-539

Joo H S，Hirai M，Shoda M．2006．Piggery wastewater treatment using Alcaligenes faecalis strain No．4with heterotrophic nitrification and aerobic denitrification［J］．WaterＲesearch，40（16）：3029-3036赖子尼，崔英德，严兆强．2008．PVA-海藻酸钠-活性炭共聚物水凝胶氧气渗透性能研究［J］．材料导报，22（4）：152-155

李博，赵敏，李宝赫，等．2009．高效聚磷菌的筛选及除磷特性分析［J］．东北林业大学学报，37（10）：85-87

连丽丽．2009．聚磷菌的筛选及其对污水的除磷特性研究［D］．沈阳：辽宁师范大学

刘亚男，于水利，薛罡，等．2005．聚磷菌PAO1-1的筛选及除磷特性［J］．中国给水排水，21（10）：13-17

Long Z E，Huang Y H，Cai Z L，et al．2004．Immobilization of Acidithiobacillus ferrooxidans by a PVA-boric acid method for ferrous sulphate oxidation［J］．Process Biochemistry，39（12）：2129-2133马放，杨菲菲，李昂，等．2011．1株高效反硝化聚磷菌的生物学特性研究［J］．环境科学，32（9）：2710-2715

Madigan M T，Martinko J M编．李明春，杨文博译．2009．BＲOCK微生物生物学［M］．北京：科学出版社

Merzouki M，Delgene's J-P，Bernet N，et al．1999．Polyphosphate-accumulating and denitrifying bacteria isolated from anaerobic-anoxic and anaerobic-aerobic sequencing batch reactors［J］．Current Microbiology，38：9-17

Munjal N，Sawhney S．2002．Stability and properties of mushroom tyrosinase entrapped in alginate，polyacrylamide and gelatin gels ［J］．Enzyme and Microbial Technology，30（5）：613-619

南亚萍，袁林江，王洋．2013．金黄色葡萄球菌聚磷特性研究［J］．环境科学学报，33（4）：1028-1034

Nguyen H T T，Nielsen J L，Nielsen P H．2012．‘Candidatus Halomonas phosphatis'，a novel polyphosphate-accumulating organism in full-scale enhanced biological phosphorus removal plants ［J］．Environmental Microbiology，14（10）：2826-2837

Oehmen A，Teresa Vives M，Lu H B，et al．2005．The effect of pH on the competition between polyphosphate-accumulating organisms and glycogen-accumulating organisms［J］．WaterＲesearch，39（15）：3727-3737

Panswad T，Doungchai A，Anotai J．2003．Temperature effect on microbial community of enhanced biological phosphorus removal system［J］．WaterＲesearch，37（2）：409-415

Qiu X F，Wang T W，Zhong X M，et al．2012．Screening and characterization of an aerobic nitrifying-denitrifying bacterium from activated sludge［J］．Biotechnology and Bioprocess Engineering，17（2）：353-360

荣宏伟，彭永臻，张朝升，等．2008．曝气量对SBBＲ生物除磷的影响研究［J］．中国给水排水，24（5）：72-76

孙梦．2011．三株轻度嗜盐聚磷菌的分离鉴定及其除磷特性分析［D］．青岛：青岛大学

686

3期庄志刚等：高效聚磷菌Alcaligenes sp．ED-12菌株的分离鉴定及其除磷特性

王茹，郑平，厉巍，等．2013．耐碱反硝化菌株的分离鉴定与功能检测［J］．微生物学报，53（4）：372-378

王琳，李季，康文力，等．2009．河流沉积物中反硝化细菌的分离及脱氮除磷研究［J］．环境科学，30（1）：91-95

王亚宜，王淑莹，彭永臻．2005．MLSS、pH及NO-F2-N对反硝化除磷的影响［J］．中国给水排水，21（7）：47-51

王亚宜，王淑莹，彭永臻，等．2006．污水有机碳源特征及温度对反硝化聚磷的影响［J］．环境科学学报，26（2）：186-192

Saito T，Brdjanovic D，Van Loosdrecht M．2004．Effect of nitrite on phosphate uptake by phosphate accumulating organisms［J］．Water Ｒesearch，38（17）：3760-3768

Wu K Y A，Wisecarver K D．2004．Cell immobilization using PVA crosslinked with boric acid［J］．Biotechnology and Bioengineering，39（4）：447-449

杨小龙，李文明，陈燕，等．2011．一株好氧反硝化菌的分离鉴定及其除氮特性［J］．微生物学报，51（8）：1062-1070Yang X P，Wang S M，Zhang D W，et al．2011．Isolation and nitrogen removal characteristics of an aerobic heterotrophic nitrifying-denitrifying bacterium，Bacillus subtilis A1［J］．Bioresource Technology，102（2）：854-862

张培玉，孙梦，张晨．2011．一株嗜盐聚磷菌的筛选及除磷性能初探［J］．环境科学学报，31（11）：2368-2373

赵海泉，胡子全．2009．一株聚磷菌GP44的筛选，鉴定及其聚磷特性研究［J］．土壤，41（5）：757-763

周德庆．2002．微生物学教程［M］．北京：高等教育出版社

周明璟，纪树兰，崔丹红，等．2012．厌氧/好氧交替快速筛选聚磷菌及其生理特性的研究［J］．中国环境科学，32（10）：1838-1844 Zhou Y，Lim M，Harjono S，et al．2012．Nitrous oxide emission by denitrifying phosphorus removal culture using polyhydroxyalkanoates as carbon source［J］．Journal of Environmental Sciences，24（9）：1616-1623

786

高效聚磷菌的筛选

磷矿废水中高效聚磷菌的筛选 近年来我国水体富营养化越来越严重，水体受到污染不仅破坏了环境与动植物的生存也影响了人们的生活和人们的工农业发展。而水体富营养化都与水中的磷含量剧增有关，所以除去水中的磷对治理水体富营养化特别重要，这也是个社会非常关注的问题。我校的南湖水体污染特别严重是我校的美中不足。 关键词：生物去磷聚磷菌筛选环境污染污水处理 目前城市污水处理主要使用生物除磷，它是利用聚磷菌一类的微生物从水中摄取磷，并将磷存于体内，在水低形成高磷的污泥，达到了去磷防水体富营养化的效果。聚磷菌是生物除磷的决定生物，而聚磷菌的工作受到环境的影响，如氧浓度，PH值，温度等，且不同的聚磷菌的聚磷能力不同，所以要想达到高去磷的效果就必须筛选出聚磷效率高的菌种 .实验材料与方法 1.1主要的的仪器设备 摇床，超净工作台，全自动高压灭菌锅，培养箱，电子天平，酸度计，离心机,可见分光光度计，培养皿20个，细菌过滤器，移液枪（100ul和1000ul），量筒（10ml和50ml各一个)，锥形瓶（150ml,250ml和500ml），草酸铵结晶紫，革兰氏碘液，95%的酒精，石碳酸复染红，显微镜，载玻片及盖玻片。 1.2主要的试剂 微生物分离纯化用的试剂均是国产分析纯，主要有牛肉膏，蛋白胨，琼脂，乙酸钠，磷酸氢二钾，硫酸镁，硫酸亚铁，氢氧化钠硫酸铵，钼酸钾，抗坏血酸，酒石酸锑钾，磷酸二氢钾，氢氧化钾过硫酸钾，MOPSHighPurityGrade,Tricine,X--Pi. 1.3样本采集 磷矿废水 1.4培养基及溶液 （1)YG培养液：酵母侵膏1g,葡萄糖1g，K2HPO4 0.3g KH2PO4 0.25g 七水硫酸镁0.2g, 蒸馏水1000ml. （2)MOPS培养基:100ml的10*MOPS 8.370g, tricine 0.717g, 30ml的去离子水，10mol/L KOH调PH到7.4. 总体积44ml. 0.01mol/L, 硫酸亚铁1ml，按下列加：氯化铵（1.9mol/L)5ml, 硫酸钾（0.276mol/L)1ml,二水氯化钙0.02mol/L)0.025ml, 六水氯化镁（2.5mol/L)0.21ml, NaCl(5mol/L)10ml, 微量元素混合液0.02ml, 葡萄糖0.1g, )取25ml置于两个500ml的三角瓶中，向一个三角瓶加0.0087gK2HPO4，成为限磷培养基。另一个加0.1732gK2HPO4成为过磷培养基。两瓶分别加离子水后用细菌过滤器过滤分别装于灭菌的150ml三角瓶中。 （3)LB培养基：酵母清膏5g蛋白胨10g，氯化钠5g，水1000ml，pH7.0~~~7.2 实验方法 1.聚磷菌的筛选： （1)聚磷菌的分离，纯化与保存。将水样充分摇匀后，用移液枪取0.5ml水样于4.5ml的无

低碳源浓度条件下聚磷菌特性_林海

低碳源浓度条件下聚磷菌特性 林 海 李 萍 陈月芳 王 倩 侯瑞荣 张 艳 北京科技大学土木与环境工程学院,北京100083 摘 要 从北京城市排水集团高碑店污水处理厂二沉池回流污泥中分离获得两株高效聚磷菌株,确定出稀释倒平板分离技术更有利于聚磷微生物的筛选.经形态特征及生理生化实验初步鉴定为不动杆菌属(acinetobacter sp.).确定出A 、E 两菌的最优碳源选择分别为乙酸钠和谷氨酸钠;并在降低碳源质量浓度,即COD 小于100mg L -1的条件下进行最佳生长条件优化:A 、E 两菌的最适pH 值分别为8和7,最适温度分别为20 和25 ;金属镁、钾和锰离子对聚磷微生物具有积极促进作用.聚磷微生物呈现出较好的厌氧放磷、好氧摄磷的特性.关键词 聚磷菌(PAO );低碳源;筛选;生物除磷分类号 X 703 1 Characteristics of phosphorus accu mulating organisms at low carbon level L IN H ai,L I Ping,C H EN Y ue -f ang,W A N G Qian,H O U Rui -rong ,ZH A N G Yan S chool of Civil and Environmental Engineering,Universi ty of Science and Technology Beijing,Beijing 100083,China ABSTRAC T T wo efficient polyphosphate accumulating organisms,A and E,w ere screened from the returned sludge w hich comes from the final sedimentation tank in Beijing Gaobeidian Sewage T reatment Plant.At the same time,the reversing dilution plate sepa -ration t echnolog y w as identified to be beneficial to screening the polyphosphate accumulating organisms.Observations of their morpho -log ical,physiological and biochemical features indicate that they are acinetobacter sp.By exper iment,the optimal choices for car bon of the polyphosphate accumulating organisms A and E are CH 3COON a and C 5H 8NN aO 4,respectively.Exper imental data show the best g rowth condit ions of polyphosphate accumulating org anisms in reducing carbon concentrations,i.e.less than COD 100mg L -1:t he optimal pH v alues and temperatures of the polyphosphate accumulating org anisms A and E are 8and 7,20 and 25 ,respec -tiv ely.M etal ions M g 2+,K +and M n 2+can be helpful to accumulate polyphosphate.T he effect o f ox ygen on the phosphate accumu -lating microorganisms was discussed,and the character i stics o f P removal in anaerobic co ndition and P uptake in aerobic condition could be obser ved. KEY WORDS phosphor us accumulating organisms (PAO);low carbon sources;screening;biolog ical phosphorus r emoval 收稿日期:2008-07-04 基金项目:国家 十一五 科技支撑计划重大资助项目(No.2006BAC19B01)作者简介:林 海(1966 ),男,教授,博士生导师,E -mail:linhai@https://www.sodocs.net/doc/3a836832.html, 目前磷是影响水体富营养化的重要因素,对污水中磷的质量浓度进行有效的控制处理是十分必要的[1-2].生物除磷法主要利用聚磷菌聚磷作用,相比化学除磷,具有运行费用低,减少二次污染,减少活性污泥膨胀现象,是目前大多数污水处理厂所采用的除磷方法[3]. 最早从活性污泥中分离出的是不动杆菌属[4],迄今为止分离出的聚磷菌为数不多.大部分污水处理厂在除磷工艺处理中由于碳源含量过低即COD 值较低,降低了聚磷微生物的除磷效率,并最终导致出水磷含量不达标.因此,本实验筛选高效聚磷微生物,并以磷为目标污染物,在降低碳源质量浓度的 条件下,对微生物的聚磷能力及生理生化特性进行 实验研究. 1 材料与方法 1 1 材料 (1)采样:北京城市排水集团高碑店污水处理厂二沉池回流污泥. (2)培养基:合成废水培养基[5],分离培养基采用牛肉膏蛋白胨基础培养基. 1 2 方法 (1)聚磷菌富集及分离纯化.通过连续培养的方式,不断增加培养液中磷的含量,淘汰聚磷效果差 第31卷第6期2009年6月北京科技大学学报 Journal of University of Science and Technology Beijing Vol.31No.6Jun.2009

酵母菌的分离纯化

酵母菌的分离纯化-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN

酵母菌的分离纯化、固定化和酒精发酵 第一部分酵母菌的分离纯化 一、实验目的 应用酵母菌的生理生化和生态学的特点，从自然环境中分离酵母菌，并掌握微生物分离纯化的基本方法。 二、实验原理 酵母菌常见于含糖份比较高的环境中，如果园土、菜园土及果皮等的表面。多数酵母菌喜欢偏酸条件，最适pH为酵母菌生长迅速，容易分离培养。在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长快，利用酸性条件则可以抑制细菌的生长。因此常用酸性液体培养基获得酵母菌的加富培养，然后在固体培养基上划线分离纯化。 三、器材和用品 1、甘蔗、苹果皮、葡萄皮、果园土、菜园土等。 2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200g（煮开10min后过滤取汁），葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，pH自然。分装三角瓶；试管斜面1支/组 3、乳酸马铃薯葡萄糖培养液：配方同上，不加琼脂加乳酸，按1000ml培养基加入5ml乳酸，pH为左右，再分装试管9ml2支/组。 4、无菌吸管3支/组、无菌培养皿、100ml无菌水1瓶/组、涂棒、美兰染液、显微镜、接种环等。 四、实验方法 1、接种：取果皮（不需冲洗）或土壤5克，加入到100ml无菌水中，充分搅拌后，用无菌吸管取1ml接入到9ml乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-30℃培养箱中培养24h，可见培养液变浑浊。 2、加富培养：用无菌吸管取上述培养液1m l，注入另1管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-30℃培养箱中培养24h。 3、镜检：用无菌操作法用接种环取少量菌液置于载玻片上，中央滴一滴美兰染液，混合均匀后制成水浸片，在高倍镜下观察酵母菌的形态及出芽方式，并可根据菌体是否染色来区分酵母菌的死活细胞，因活细胞使美兰染液还原，故菌体不着色。 4、涂皿：用马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用无菌吸管取加富培养液到平板中，用涂棒涂匀后培养24h。 5、分离纯化：用接种环挑取单个酵母菌菌落，在平板上四区划线，培养后分

生物化学实验五 酵母核糖核酸的分离及组分鉴定

实验五酵母核糖核酸的分离及组分鉴定 一、目的要求 学习和掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法；了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。 二、实验原理 酵母核酸中RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。 核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。 三、器材与试剂 1〉材料 酵母粉。 2〉器材 乳钵、150ml锥形瓶、水浴锅、量筒、吸管、洗耳球、漏斗、滴管、试管、试管架、烧杯、离心机、滤纸、试管夹。 3〉试剂 (1) 0.04mol/L氢氧化钠溶液。 (2)酸性乙醇溶液：将0.3ml浓盐酸加入30ml的乙醇中。 (3)95%乙醇。 (4)乙醚。 (5)

1.5mol/L硫酸溶液。 (6)浓氨水。 (7) 0.1mol/L硝酸银溶液。 (8)三氧化铁-浓盐酸溶液： 将2ml 10%三氧化铁溶液(用FeCl 3·6H 2O配制)加入到400ml浓盐酸中。 (9)苔黑酚乙醇溶液： 溶解6g苔黑酚于100ml 95%乙醇中。 (10)定磷试剂。 a.17%硫酸溶液： 将17ml浓硫酸(比重 1.84)缓缓加入到83ml水中。 b. 2.5%钼酸铵溶液：将2.5g钼酸铵溶于100ml水中。 c.10%抗坏血酸： 将10g抗坏血酸溶于100ml水中，储于棕色瓶保存。溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄色或棕色则失效。 临用时将上述3种溶液与水按比例混合：17%硫酸溶液︰ 2.5%钼酸铵溶液︰10%抗坏血酸︰水=1︰1︰1︰2(体积分数)。

四、实验步骤 1〉RNA提取 将10g酵母悬浮于90ml 0.04mol/L氢氧化钠溶液中，并在乳钵中研磨均匀。将悬浮液转移至150ml 锥形瓶中。在沸水浴上加热30min后，冷却。(3000r/min)离心10分钟，将上清液缓缓倾入30ml酸性乙醇溶液中。注意要一边搅拌一边缓缓倾入。待核糖核酸沉淀完全后，(3000r/min)离心5分钟。弃去上清液。用95％乙醇洗涤沉淀两次，每次10ml。乙醚洗涤沉淀一次后，再用乙醚将沉淀转移至漏斗中过滤。沉淀即为粗RNA，可在空气中干燥。作鉴定或测定含量用。 2〉鉴定 取200mg提取的RNA，加入 1.5mol/L硫酸溶液10ml，在沸水浴中加热10min制成水解液并进行组分的鉴定。 (1)嘌呤碱： 取水解液1ml加入过量浓氨水，然后加入约1mL 0.1mol/L硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。 (2)核糖： 取一支试管加入水解液1mL、三氯化铁浓盐酸溶液2ml和苔黑酚乙醇溶液 0.2ml。放沸水浴中10分钟。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。 (3)磷酸： 取一支试管，加入水解液1ml和定磷试剂1ml。在沸水浴中加热10min，观察若溶液变成蓝色，说明有磷酸存在。 五、结果处理

芦丁的提取分离及鉴定A4

2011届本科生毕业论文 题目芦丁的提取分离及鉴定作者单位陇东学院化学化工学院指导老师胡浩斌 作者姓名张娜娜 专业班级2007级化学本科(2)班提交时间二〇一一年四月

2011届本科生毕业论文 芦丁的提取分离及鉴定 张娜娜，胡浩斌 （陇东学院化学化工学院，甘肃庆阳745000）摘要：目的以芦丁为例学习黄酮类化合物的提取方法，掌握黄酮类成分的主要性质及黄酮甙，甙元和糖的部分鉴定方法。方法采用水提法、碱水(石灰水) 提取法、有机溶剂(乙醇) 回流法对芦丁进行提取分离，并对其进行定性分析及色谱鉴定。结果水提法、碱水(石灰水) 提取法、有机溶剂(乙醇) 回流法，三种方法均可制的芦丁，且质量合格。结论从提高芦丁产率和纯度的角度出发，乙醇回流是较理想的提取方法。制得芦丁产率高，且测定方法简单、迅速、灵敏度高。 关键词：槐花米；芦丁；槲皮素；提取；分离；鉴定 Extraction, Seperation and Identification of Rutin Zhang Nana, Hu Haobin (College of Chemistry and Chemical Engineering, Longdong University, Qingyang 745000, Gansu) Abstraction: Objection Rutin as an example to learn the extraction of flavonoids square. Grasp the main properties and flavonoids ingredients flavonoids glucoside. Method W ith the water extraction method, buck (limewater) extraction,organic solvent (alcohol) extraction to extraction and separation of rutin and chromatographic identification. Result With water formulation,Buck (limewater) extraction,organic solvent (alcohol) method of extraction rutin backflow separation,three methods are made rutin and obtaining rutin quality qualified. Conclusion From improve yield and purity of rutin angle, ethanol refluxing was ideal extraction method. Preparation of rutin of high yield,high sensitivity. determination method is simple to rutin rapid. Key word: Sophora japonica; rutin; quercetin; extraction; separation; identification 引言 随着人们生活水平及质量的不断提高，心脑血管病的发病率也呈上升趋势，而且死亡率居各种疾病之首，因此，对治疗和预防心脑血管病的药品与保健品的开发研究就显得尤为重要， 1

聚磷菌的培养(借鉴材料)

聚磷菌的培养 背景：污水中的磷和氮含量过高是造成水体富营养化的主要因素。而其中的磷不像氮那样可以结合氧转化为气体，含磷的气态物质（PH3）又不易转化，所以污水除磷一直都用生物除磷法。即用细菌等微生物来摄取水中的磷，达到除磷的效果。而为了提高微生物除磷的效率、便于和其他材料协同使用，筛选、培养除磷细菌也是必不可少的工作。 培养菌种\菌落：聚磷菌（PAOs） 菌落来源：废水除磷工艺中的活性污泥 菌落组成：主要由β—2亚群紫色细菌、不动杆菌、红环菌属和绿单胞菌属组成；其中不动杆菌为主导细菌，除磷作用突出 聚磷菌除磷机理： ①好氧条件下，聚磷菌不断摄取并氧化分解有机物，产生的能量一部分用 于磷的吸收和聚磷的合成，一部分则使ADP与H3PO4结合，转化为ATP 而储存起来。细菌以聚磷的形式在细胞中储存磷，其量可以超过生长所 需，这一过程称为聚磷菌磷的摄取。处理过程中，通过从系统中排除高 磷污泥以达到除磷的目的。 ②在厌氧条件下，聚磷菌体内的ATP进行水解，放出H3PO4和能量，形成 ADP。这一过程称为聚磷菌磷的释放。 聚磷菌除磷则就是通过以上两种过程完成的。 培养过程： 1、材料准备 1.1取样： 从实验室运行稳定的厌氧\缺氧SBR反应器中，取富含反硝化聚磷菌的 活性污泥做为实验样品。 1.2培养基配方： ( 1 ) 牛肉膏蛋白胨培养基（L1-）：蛋白胨10 g；牛肉膏3 g；NaCl 5 g；琼 脂20 g ；p H 7.2 ，用于反硝化聚磷菌的分离、纯化 ( 2) 缺磷培养基（L1-）：CH3COONa 2g ；Na2HPO4·2H2O 23 mg； CaCL2·2H2O 11 mg；NH4C1 152.8mg；MgSO4·7H2O 81.12 mg； K2SO4 17.83 mg；HEPES缓冲液7 g；微量元素)1( 2 mL；p H 7.2

实验 酵母RNA的分离及组分鉴定

※实验六酵母RNA的分离及组分鉴定 【实验目的】 了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。 【实验原理】 酵母核酸种RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀。由此即得到RNA的粗制品。 核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。 鉴定依据：磷酸与定磷试剂反应产生蓝色物质。核糖与苔黑酚作用产生绿色物质。嘌呤碱与硝酸银能产生白色的嘌呤碱银化合物沉淀。 【实验器材】 150 ml锥形瓶、水浴、量筒、漏斗及抽虑瓶、吸管7、滴管8、试管及试管架9、烧杯、离心机、漏斗 【试剂和材料】 1、0.04 mol/L氢氧化钠溶液； 2、酸性乙醇溶液：将0.3毫升浓盐酸加入30毫升乙醇中； 3、95%乙醇； 4、乙醚； 5、1.5 mol/L硫酸溶液； 6、浓氨水； 7、0.1 mol/L硝酸银溶液； 8、三氯化铁浓盐酸溶液：将2 ml 10% 三氯化铁溶液（用FeCl3·6H2O配制）加入到400 ml浓盐酸中； 9、苔黑酚（地衣酚）乙醇溶液：溶解6 g苔黑酚于100 ml 95% 乙醇中（可在冰箱中保存一个月）； 10、定磷试剂：（1）17% 硫酸溶液：将19 ml浓硫酸（比重1.84）缓缓加入到83 ml 水中（2）2.5% 钼酸铵溶液：将2.5 g钼酸铵溶于100 ml水中（3）10% 抗坏血酸溶液：10 g抗坏血酸溶于100 ml水中，贮棕色瓶保存（溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄或棕色则失败，需纯化抗坏血酸）。临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合。17% 硫酸溶液：2.5%

酵母菌的分离筛选方法

酵母菌的分离筛选方法 酵母菌多数为腐生，一般生长在含糖较高，偏酸的环境中，在通气条 件下，液体培养比霉菌快。菌落与细菌相似，较大而厚，多数不透明， 菌落光滑湿润粘稠，乳白色，少数干皱，边缘整齐，呈红色或粉红色， 圆形椭圆卵形，液体培养基生长会生成沉淀或菌膜。 含高糖浓度（45%），分离蜂蜜酵母，球拟酵母属等嗜高渗透压的酵母。 1.培养基： 葡萄糖 50g/L 尿素1g/L （NH4）2SO41g/L L L MgSO41g/L FeSO4 L 酵母膏 L 孟加拉红 L （富集用） ★乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基：马铃薯200g/L 葡萄糖（霉菌用蔗 糖）20g/L 乳酸5ml马铃薯去皮切片200g，加水煮沸30min，纱布 过滤，补足蒸馏水1L，PH自然。（去掉乳酸可用于酵母菌和霉菌培养 用）（富集用） ★麦芽汁培养基：1：4水60-65℃水浴3-4小时，4-6层纱布过 滤，可加一个蛋清加水20mL调均生泡沫，倒入糖化液中，煮沸过滤， 10-15波林，氯霉素L 121℃ 20min （分离保存 用） 灭菌后加入300u/ml硫酸链霉素（集菌用） ★虎红（孟加拉红）培养基：蛋白胨L 葡萄糖10g/L L L 孟加拉红L 氯霉素L 琼脂15g/L PH自然 （分离纯化用）

★豆芽汁培养基：黄豆芽100g/L 葡萄糖50g/L PH自然。100g黄豆芽，加水煮沸30min，纱布过滤，补足蒸馏水1L 察氏培养基：主要培养霉菌观察形态用 蔗糖30g/L 硝酸钠3g/L 磷酸氢二钾1g/L 氯化钾L 硫酸镁 L 硫酸亚铁L 琼脂15-20g/L 121℃ 20min PH自然 一般分离黄酒酵母酒精酵母使用曲汁培养基，啤酒酵母用酒花麦汁培养基，葡萄酒酵母用葡萄汁培养基。 2.集菌：研究酵母菌生态和某种基物或样品中的酵母菌区系，一般不进行集菌，以免改变其中不同种类数量间的对比，将样品制成菌悬液按常规法分离。若从样品中分离特定种类时先集菌。集菌发酵力强菌株，加酸性含糖的培养基，酸性豆汁，必要时注入高浓度的酒精（13-17%），霉菌在液体中形成菌丝体，酵母不形成菌丝，25-28℃2-3d，遇到菌丝体用接种环挑去烧掉，去掉上清液，取沉淀酵母一至两环移植另一液体培养基中，集菌连续两至三次才能完成，要配合镜检。 实例：将待分离的样品10g（ml）放入90ml无菌水或生理盐水/150ml 三角瓶（玻璃珠），摇床振荡20-30min，取上清液接种于酸性培养液（乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基酸性麦芽汁或酸性豆芽汁）25-28℃2-3d，培养过程中若出现菌丝体跳出烧掉，集菌连续两至三次，培养液变成混浊，产生菌膜和沉淀物。镜检：美兰染液染色，活菌可还原美兰染液，菌体无色。 3.筛选：

芦丁的提取分离和鉴定

综合化学实验: 芦丁的提取分离和鉴定 芦丁简介: 芦丁（Rutin）又名芸香苷化学式: C27H30O16·3H2O，是一种浅黄色针状结晶有机化合物，广泛存在于自然界植物中，是一种被人们广泛使用的有机天然产物。目前已发现含有芦丁的植物至少在70种以上，常见的如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英中均有不同含量。尤其以中药槐米（豆科、槐属，槐树Sophorajaponica的花蕾）和荞麦中含量最高，因此槐米可作为大量提取芦丁的天然植物原料。 中药槐米（炒碳）味苦性凉、具清热凉血、止血之功。常用于治疗多种出血症：肠风便血、痔血、尿血、衄血、崩漏下血、赤血下痢等。西医研究其主要有效成分为有机化合物“芦丁”而中药槐米中芦丁的含量可高达12~16%，是主要的芦丁天然来源。槐米中还含有槲皮素、三萜皂苷、槐花米甲素、槐花米乙素、槐花米丙素等。研究文献证明芦丁具有VitP（维生素P）样作用（VitP具有生物类黄酮的功能，可防止维生素C被氧化而受到破坏，增强维生素功效；增加毛细血管壁强度，防止瘀伤。有助于牙龈出血的预防和治疗，有助于因内耳疾病引起的浮肿或头晕的治疗等）。而芦丁具有类似作用如可降低毛细血管脆性和调节通透性等，在医学临床上常将其用作毛细血管脆性引起的出血症以及防治高血压病等的辅助治疗药物。 芦丁是由槲皮素（quercetin）3位上的羟基与芸香糖（rutinose，一种由葡萄糖glucose与鼠李糖rhamnose组成的双糖）脱水合成的苷，是一种浅黄色粉末或极细的针状结晶，含有三分子的结晶水，熔点为174~178℃，无结晶水时188~190℃。溶解度：冷水中为1:10000；热水中1:200；冷乙醇1:650；热乙醇1:60；冷吡啶1:12。微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚，溶于碱而呈黄色。 补充知识:

反硝化聚磷菌同步解决脱氮除磷两大问题

反硝化聚磷菌同步解决脱氮除磷两大问题 01 反硝化除磷机理 反硝化除磷就是在厌氧 /缺氧环境交替运行的条件下，易富集一类兼有反硝化作用和除磷作用的兼性厌氧微生物，该聚磷菌能利用 NO3-作为电子受体，通过它们的代谢作用同时完成过量吸磷和反硝化过程。最大限度地减少碳源需求量，实现了能源和资源的双重节约。反硝化除磷能节省 COD 约 50%，节省氧约 30%，剩余污泥量减少 50%左右。 大量实验室和生产性规模的生物除磷脱氮研究也表明，当微生物依次经过厌氧、缺氧和好氧 3个阶段后，约占 50%的聚磷菌既能利用氧气又能利用NO3-作为电子受体来聚磷，即反硝化聚磷菌（DPB的除磷效果相当于总聚磷菌的 50%左右）。这些发现一方面说明了硝酸盐亦可作为某些微生物氧化PHB 的电子受体，另一方面也证实了在污水的生物除磷系统中的确存在着 DPB 属微生物，而且通过驯化可得到富集 DPB 的活性污泥。 02 反硝化除磷工艺 该技术对城市污水特别是 C/N 比较低的污水有很好的处理效果。目前满足 DPB 所需环境和基质的工艺有单双两级。在单级工艺中，DPB 细菌、硝化细菌及非聚磷异养菌同时存在于悬浮增长的混合液中，顺序经历厌氧／缺氧／好氧 3种环境，最具代表性的是 BCFS 工艺。在双级工艺中，硝化细菌独立于DPB 而单独存在于某一反应器中，Dephanox 工艺和A2N 工艺是最具代表性的双级工艺。

1、BCFS 工艺 BCFS 工艺是在 UCT 工艺及原理的基础上开发的。 其工艺流程如图 1。改进在于增加了 2个反应池，接触池与混合池；增加了 2个混合液循环 Q1和Q3 。 接触池的功能为：回流污泥和来自厌氧池的混合液在池中充分混合，吸附剩余 COD；有效防止污泥膨胀。 混和池的功能为：最大程度地保证污泥再生而不影响反硝化或除磷；容易控制 SVI；最大程度地利用 DPB 以获得最少的污泥产量。 混合液循环Q1 的功能是为了增加硝化或同时反硝化的机会，从而获得良好的出水氮浓度。Q3则是起辅助回流污泥向缺氧池补充硝酸盐氮的作用。 BCFS 将生物、化学除磷工艺合并，是在线磷分离与离线磷沉淀的生物与化学除磷结合方式，充分利用反硝化聚磷菌的反硝化除磷和脱氮双重作用，来实现磷的完全去除和氮的最佳去除过程。由于充分利用BCFS 工艺中的污泥龄易满足硝化细菌增长所需的生长条件，污泥产

聚磷菌的除磷机理及影响因素

聚磷菌的除磷机理及影响因素！ 污水生物除磷的原理就是人为创造生物超量除磷过程，实现可控的除磷效果。整个过程必须通过创造厌氧与好氧交替环节利用聚磷菌的作用来实现生物除磷过程。 一、聚磷菌除磷机理 聚磷菌也叫做摄磷菌、除磷菌，是传统活性污泥工艺中一类特殊的细菌，在好氧状态下能超量地将污水中的磷吸入体内，使体内的含磷量超过一般细菌体内的含磷量的数倍，这类细菌被广泛地用于生物除磷。 1）厌氧条件下释磷 在没有溶解氧或硝态氮存在的条件下，兼性细菌通过发酵作用将可溶性BOD5转化为低分子挥发性有机酸VFA。聚磷菌吸收这些发酵产物或来自原污水的VFA，并将其运送到细胞内，同化成胞内碳能源储存物质

PHB，所需的能力来源于聚磷的水解以及细胞内糖的酵解，并导致磷酸盐的释放。 2）好氧条件下摄磷 好氧条件下，聚磷菌的活力得到恢复，并以聚磷的形式存储超过生长所需的磷量，通过PHB的氧化代谢产生能量，用于磷的吸收和聚磷的合成，能量以聚磷酸高能键的形式捕集存储，磷酸盐从水中被去除。 3）富磷污泥的排放 产生的富磷污泥通过剩余污泥的形式排放，从而将磷去除。从能量角度来看，聚磷菌在无氧条件下释放磷获取能量以吸收废水中溶解性有机物，在好氧状态下降解吸收溶解性有机物获取能量以吸收磷。 除磷的关键是厌氧区的设置，聚磷菌能在短暂的厌氧条件下，由于非聚磷菌吸收低分子基质并快速同化和储存这些发酵产物，即厌氧区为聚磷菌提供了竞争优势。 这样一来，能吸收大量磷的聚磷菌就能在处理系统中得到选择性增殖，并可通过排除高含磷量的剩余污泥达到除磷的目的。这种选择性增殖的另一好处是抑制了丝状

菌的增殖，避免了产生沉淀性能较差的污泥的可能，因此厌氧/好氧生物除磷工艺一般不会出现污泥膨胀。 二、聚磷菌代谢的影响因素 生物除磷中通过聚磷菌在厌氧状态下释放磷，在好氧状态下过量地摄取磷。经过排放富磷剩余污泥而除磷，其影响聚磷菌代谢的影响因素包括：温度、pH值、厌氧池DO、厌氧池硝态氮、泥龄、CP比、RBCOD含量、糖原、HRT等。 1、温度 温度对除磷效果的影响不如对生物脱氮过程的影响那么明显，在一定温度范围内，温度变化不是十分大时，生物除磷都能成功运行。试验表明，生物除磷的温度宜大于10℃，因为聚磷菌在低温时生长速度会减慢。 2、pH值 在pH在6.5一8.0时，聚磷微生物的含磷量和吸磷率保持稳定，当pH值低于6.5时，吸磷率急剧下降。当pH值突然降低，无论在好氧区还是厌氧区磷的浓度都急剧上升，pH降低的幅度越大释放量越大，这说明pH降低引起的磷释放不是聚磷菌本身对pH变化的生

聚磷菌

生物强化除磷中的聚磷菌利用比较普遍，目前也是生物除磷的主要研究方向，本文详细介绍聚磷菌的除磷原理及影响因素！ 一、除磷原理 聚磷菌也叫做摄磷菌、除磷菌，是传统活性污泥工艺中一类特殊的细菌，在好氧状态下能超量地将污水中的磷吸入体内，使体内的含磷量超过一般细菌体内的含磷量的数倍，这类细菌被广泛地用于生物除磷。 在厌氧条件下，除磷菌能分解体内的聚磷酸盐而产生ATP，并利用ATP将废水中的有机物摄入细胞内，以聚b-羟基丁酸等有机颗粒的形式贮存于细胞内，同时还将分解聚磷酸盐所产生的磷酸排出体外。而好氧条件下，除磷菌利用废水中的BOD5或体内贮存的聚b-羟基丁酸的氧化分解所释放的能量来摄取废水中的磷，一部分磷被用来合成ATP，另外绝大部分的磷则被合成为聚磷酸盐而贮存在细胞体内。 二、影响因素 生物除磷的影响因素包括：温度、pH值、厌氧池DO、厌氧池硝态氮、泥龄、RBCOD含量、糖原。 （1）温度 温度对除磷效果的影响不如对生物脱氮过程的影响那么明显，在一定温度范围内，温度变化不是十分大时，生物除磷都能成功运行。试验表明，生物除磷的温度宜大于10℃，因为聚磷菌在低温时生长速度会减慢。 （2）PH值 在pH在6.5一8.0时，聚磷微生物的含磷量和吸磷率保持稳定，当pH值低于6.5时，吸磷率急剧下降。当pH值突然降低，无论在好氧区还是厌氧区磷的浓度都急剧上升，pH降低的幅度越大释放量越大，这说明pH降低引起的磷释放不是聚磷菌本身对pH变化的生理生化反应，而是一种纯化学的“酸溶”效应，而且pH下降引起的厌氧释放量越大，则好氧吸磷能力越低，这说明pH下降引起的释放是破坏性的，无效的。pH升高时则出现磷的轻微吸收。

酵母菌的分离与纯化

酵母菌的分离与纯化 土壤是微生物生活的大本营，是寻早有重要应用潜力的微生物的主要菌源。不同图样中各类微生物的含量不同，一般土壤中细菌数量最多，其次为放线菌和霉菌。放线菌一般在较干燥、偏碱性、有机质较多的土壤中较多；霉菌在含有机质丰富、偏酸性、通气性较好的土壤中较多；酵母菌在一般土壤中的数量较少，而在酒曲、面肥、水果表皮、果园土壤中数量多些。（一）菌源 1土样用无菌的采样小铲在橘树果园中取土壤表层下1~10cm土壤10g，装入灭菌的牛皮纸袋内。封好袋口，记录取样地点、环境及日期。图样采集后应及时分离，饭不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥的条件下，以减少其中菌相的变化。 2面肥 （1）面粉500克，白酒100克，水250，和好静置发酵就可以了。冬季10个小时。（2）在温水中兑一点酒，倒入适量面粉拌匀后放入绝缘保温盛器（陶瓷，砂锅）中，用布将整个盛器盖好置于温度较高处，6小时后即成面肥。 *以上方法做出的面肥只能保存几天，不宜放置太久。 3水果果皮 桔子和葡萄等的果皮上含有数量较多的酵母菌，既可单独作为菌源也可以和果园土壤作为混合菌源。 （二）酵母菌的分离 1制备菌悬液 称取菌源1g，加入盛有99ml无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的锥形瓶中。振荡20min，即成10-2的菌源悬液。再一次稀释成10-4、10-5、10-6三个稀释度。 2涂布法分离 取融化并冷却至45~50度左右的豆芽汁葡萄糖培养基，每皿分别倾注约12ml培养基到培养皿内。注意，温度过高易将菌烫死，皿盖上冷凝水太多也会影响分离效果；低于45度培养基易凝固，平板高低不平。呆平板冷却后，用无菌移液管分别吸取上述已经制好的菌源稀释液10-4、10-5、10-6三个稀释度菌悬液各0.1ml，依次滴加于相应编号的豆芽汁葡萄糖培养基平板上。每个稀释度做2~3个平行皿。左手拿培养皿，并用拇指将皿盖打开一缝，再火焰旁右手持无菌玻璃涂棒将菌液自平板中央均匀向四周涂布扩散。注意，切忌用力过猛，这样会将菌液直接推向平板边缘或将培养基划破。3培养 接种后，平版倒置于30度恒温箱中，培养2~3天，观察结果。 4纯化 用接种环挑取单个单个酵母菌菌落，在平板上四区划线，培养后分离得到单个菌落。 酵母扩培方案 一、培养基制备 (一)麦芽汁培养基的配制 1．培养基成分 新鲜麦芽汁一般为10-15波林。 2．配制方法 (1)用水将大麦或小麦洗净，用水浸泡6-12h，置于15℃阴凉处发芽，上盖纱布，每日早、中、晚淋水一次，待麦芽伸长至麦粒的两倍时，让其停止发芽，晒干或烘干，研磨成麦芽粉，贮存备用。 (2)取一份麦芽粉加四份水，在65℃水浴锅中保温3-4h，使其自行糖化，直

酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵3(DOC)

酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵 吴英玲 10197020 10生物创新班 摘要：酵母菌喜欢酸性环境，可利用乳酸豆芽葡萄糖培养基富集培养酵母菌，然后在YPG培养基上用划线法分离纯化出酵母菌。将分离的酵母菌转接于YPG斜面培养基上培养，待长好后置于冰箱内 4 ℃下保存。用TTC显色剂及杜氏小管观察法筛选出发酵能力高的酵母菌。并通过菌落形态、细胞形态、生化分析及分子生物学手段进行微生物鉴定。采用PVA-海藻酸钠固定化技术固定酵母细胞进行酒精发酵。 关键词：酵母菌分离鉴定固定化酒精发酵 Abstract: Yeast like acid environment, the use of lactic acid glucose medium enrichment culture yeast, bean sprouts and purification by marking method on the YPG culture medium of yeast will transfer separation of the yeast in the YPG cant medium cultivation, staying long placed in the refrigerator after use the TTC chromogenic agent, save and duchenne tubular observation screen high fermentation ability by colony morphology of yeast cell morphological and biochemical analysis and molecular biology means to identify the microorganisms using PVA - sodium alginate immobilized technology fixed yeast cells for ethanol fermentation。 前言 酵母菌（yeast）是一类单细胞真菌。一般呈圆形、卵圆形、圆柱形，其菌落呈乳白色或红色，表面湿润、粘稠，易被挑起。酵母菌多数为腐生，专性或兼性好氧，广泛生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中，例如水果、蔬菜、蜜饯的内部和表面以及在果园土壤中最为常见。酵母菌在有氧环境下将葡萄糖转化为水和二氧化碳，主要用于馒头、面包等食品发酵；在工业上，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）将葡萄糖、果糖、甘露糖等单糖吸

聚磷菌

科技名词定义 中文名称：聚磷菌 英文名称：poly-P bacteria 定义：一类可对磷超量吸收的细菌，磷以聚磷酸盐颗粒(异染粒)的形式存在 于细胞内。 应用学科：生态学（一级学科）；污染生态学（二级学科） 以上内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 聚磷菌也叫做摄磷菌，是传统活性污泥工艺中一类特殊的兼性细菌，在好氧或缺氧状态下能超量地将污水中的磷吸入体内，使体内的含磷量超过一般细菌体内的含磷量的数倍，这类细菌被广泛地用于生物除磷。 当活性污泥中的聚磷菌生活在营养丰富的环境中，在将进入对数生长期时，为大量分裂作准备，细胞能从废水中大量摄取溶解态的正磷酸盐，在细胞内合成多聚磷酸盐，如具有环状结构的三偏磷酸盐和四偏磷酸盐；具有线状结构的焦磷酸盐和不溶结晶聚磷酸盐；具有横联结构的过磷酸盐等，并加以积累，供下阶段对数生长时期合成核酸耗用磷素之需。另外，细菌经过对数生长期而进入静止期时，大部分细胞已停止繁殖，核酸的合成虽已停止，对磷的需要量也已很低，但若环境中的磷源仍有剩余，细胞又有一定的能量时，仍能从外界吸收磷元素，这种对磷的积累作用大大超过微生物正常生长所需的磷量，可达细胞重量的6%-8%，有报道甚至可达10%。以多聚磷酸盐的形式积累于细胞内作为贮存物质。

但当细菌细胞处于极为不利的生活条件时，例如使好氧细菌处于厌氧条件下，即所谓细菌“压抑”状态时，聚磷菌能吸收污水中的乙酸、甲酸、丙酸及乙醇等极易生物降解的有机物质，贮存在体内作为营养源，同时将体内存贮的聚磷酸盐分解，以P043—P的形式释放到环境中来，以便获得能量，供细菌在不利环境中维持其生存所需，此时菌体内多聚磷酸盐就逐渐消失，而以可溶性单磷酸盐的形式排到体外环境中，如果该类细菌再次进入营养丰富的好氧环境时，它将重复上述的体内积磷。

高效聚磷菌筛选综述

高效聚磷菌的分离、筛选和效率研究进展摘要：高效聚磷菌的获得是深入把握生物除磷的复杂机制以及优化生物除磷工艺设计的基础。该文对比分析了近年来对高效聚磷菌的分离筛选与效率等方面的研究进展。 关键词：富营养化；生物除磷；聚磷菌 Research Progress of Isolation.Screening and Efficiency of High-efficient Polyphosphate-accumulating Organisms Abstract:Acquisition of high－efficient polyphosphate－accumulating organisms (PAOs) could lay foundation for exploring the complex mechanisms of biological phosphorus removal and optimization of its processing design. This article reviews the methods used in the isolation，screening and genetic building of high－efficient PAOs in recent year. Keywords:eutrophication; biological phosphorus removal; polyphosphate－accumulating organism

我国磷矿资源丰富, 储量约14Gt,仅次于美国、摩洛哥,居世界第三位,是世 界上重要的磷化工产品生产国,年产量近9Mt(以P 2O 5 含量计)[1]。尽管我国磷矿资 源十分丰富,但大部分属沉积磷块岩矿床,以P 2O 5 计占90%以上,这类矿石品位低, 杂质多,P 2O 5 的含量平均值只有17%-22% ,且80%磷矿含镁量偏高,嵌布粒度细[2]。 在开采利用磷矿山的过程中,会产生大量的废水,但是选矿过程是排放废水的主要环节,这是因为在选磷矿的过程中要求磨矿细度高,药耗大,需要大量的工业清水和产生大量工业废水(尾矿水),而且选磷废水中溶有残留的多种浮选药剂(有机物及无机物)和大量选别后的尾矿固体颗粒悬浮物,是具有一定稳定性的多相分散体系[3],其CODcr 、BOD、SS、P等严重超出国家规定的工业废水排放标准,废水的硬度也较大。原成都科技大学磷复肥室开发的弱酸脱镁工艺可使矿中MgO 含量降到0.5 %以下, 但该工艺每处理1t磷矿约产生4t含 MgO、CaO、P 2O 5 、SO 3 、 Fe 2O 3 、Al 2 O 3 和F的废水[4]。 水体富营养化是一类世界性的环境污染问题，在我国，处于富营养化状态的 湖泊有80%以上[5]，而73%以上都达到严重污染程度[5].太湖巢湖和滇池等大型水体多年来都处于富营养化状态，造成巨大经济损失的同时也严重影响周边居民的生产与生活对富营养化防治的关键在于除磷，而强化生物除磷(Enhanced Biological Phosphorus Removal，EBPR) 生态效应与经济效益良好，具有效率高减少二次污染等优点，是目前得到广泛研究与发展的除磷方法，它利用具有超量吸磷能力的聚磷菌(Phosphorus Accumulating Organisms，PAOs)来实现对污水中磷的去除。 聚磷菌不是细菌分类学中的概念，只是对具有超量吸磷特征的一类微生物的总称，所谓超量吸磷，是因为指它们可以把多余的磷以多聚磷酸盐的形式储藏在体内，以备在不良环境中提供能量与营养所以有些聚磷菌菌体的磷含量可达干重的10%以上而且，因为在超量吸磷的过程中可以使外界环境中的磷含量明显减少，聚磷菌就成为了污水生物除磷的主要执行者，目前已报道较多的聚磷菌主要分离自活性污泥，包括:不动杆菌(Acinetobacter sp.)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)[7]、假单胞菌(Pseudomonas sp.)[8]克雷伯氏杆菌(Klebsiellasp.)和产碱杆菌(Alcaligenes sp.) 和节杆菌(Arthrobacter sp.)[9]等。另外，近年来随着分子生态学技术的发展，人们还发现了活性污泥中多种仍未获得纯培养的聚磷菌类群，