超详细的Western实验步骤及结果分析

Western实验步骤

1. 电泳(Electrophoresis)

（1）SDS-PAGE凝胶配制

SDS-PAGE凝胶进行配制，配方试剂去离子水，Arc-HCL(29:1)，10%APS，SDS,TEMED。

一般按分子大小配胶，现实验分离胶配12%-15%的胶，浓缩胶10%的胶。

配胶步骤：

1.清洗玻璃板，装好（注意不要漏即玻璃板要对齐）。

2.按比例配分离胶（8ml-10ml）

3.加水压胶，待分离胶凝固后（可见有分离胶与水有分隔线，一般凝固时间30分钟-1小时左右），吸走上层水面

4.按比例配浓缩胶（3ml-4ml），加入分离胶上层，插入梳子，（注意别有气泡），待凝。（如果今日不上样可以放入4°C冰箱）

注意：玻璃板要洗得干净；玻璃板要装好，不要漏；制胶过程中，一定要充分混匀，而且避免有气泡；（2）样品处理

1.准备无菌EP管，向EP管内加入样品蛋白质体积的1/4体积的SDS缓冲液（5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，现样品加 3.5ul），之后加入相应蛋白样品（要制冰，蛋白质样品要放置在冰上），充分吹打混匀

2.100℃水浴加热5分钟，以充分变性蛋白。

3.12000r离心5分钟。

（3）上样与电泳

1.将玻璃板装入电泳槽中，加电泳缓冲液至泳槽的的2/3左右

2.蛋白质样品冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可，样品两边加蛋白质Maker(6ul)（注意上样蛋白质顺序，一定不要弄错）。

3.通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为100分钟（一般为90-120分钟）。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。

通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。（为了避免电泳过头，最好是在电泳设定时间的提前30分钟观察电泳）

注意：上样时尽量避免样本被上漏出孔外；注意电泳时间的把握；最重要的是一定要记录上样顺序，必要时记录在本子上。

电泳常出现的现象：

a.︶条带呈笑脸状，原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。

b.︵条带呈皱眉状，可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。

c.拖尾：样品溶解不好。

d.纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒。

E.条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏斜。

f.条带两边扩散：加样量过多。

3.转膜(Transfer)

1.物品准备，甲醇，转膜缓冲液，滤纸，转膜槽，玻璃皿3个，制冰。

2.取下胶板，用专门的板将玻璃板分离（务必不要将胶弄破，动作轻些，从下面和上面分离玻璃板），切适合大小的胶（不要切掉MAKER）。

3.用专门的板将胶转入事先放有转膜缓冲液的皿中，记录胶的顺序，剪与胶同等大小的滤纸和转膜纸PVDF膜，PVDF膜要放入甲醇中浸15秒（一般1-2分钟），胶要切角做标记（不要切到maker）,一般一个切三个角，一个切一个角，记录顺序

4.铺膜，PVDF膜铺在胶上，在PVDF膜上铺三层滤纸，然后胶的对侧面铺三层滤纸即可（滤纸要大于等PVDF膜，PVDF膜要大于等胶），赶尽气饱。

5.再将铺好的膜胶滤纸，转入转膜夹中，有PVDF膜这面放在正极侧（即无色透明夹这面），再将夹子放入转膜槽里（电极不要放错，蛋白质带负电的）

6.转膜，槽放入冰中，槽内放冰槽，设定转膜电流为300-400mA，电压120伏，转膜时间为40分钟（30-60分钟）。

注意：实验选用PVDF膜但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取，膜不要碰到其他地方特别是手不要碰到膜；动作要轻；赶尽气饱；正负极不要弄错；记录胶的顺序；

通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，电压120伏，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。

在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。

转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。

4．封闭

1.转膜完毕后，将蛋白膜放入，TBS漂洗1-2分钟

2.再用TBST封闭，在摇床上摇1小时，装入薄膜内

配制TBS:1MtriHCL (PH8.0) 10ML,1M NaCL 150ml,dd水 840ml；

TBST(MILLK)：5%millk（脱脂奶粉）,0.1%tween20,TBS

注意：从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景；对于一些背景较高的抗体，可以4℃封闭过夜。

5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)

1.切所需蛋白条带后，参考一抗的说明书，按照适当比例用TBST（有奶粉的）稀释一抗。放置在冰上

2.有薄膜将所需条带封住，立即加入稀释好的一抗后，封口，4℃孵育过夜。

注意：其实室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以4℃缓慢摇动孵育过夜。或更据抗体的说明选择适当的孵育温度和时间。

6.二抗孵育(antibody incubation)

1.回收一抗。

2.取出膜，放入TBST(没MILLK)中摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟（5-10分钟），共洗涤3次

注意：如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数，一般洗膜后以MAKER条带背景变淡一些为好。

3.参考二抗的说明书，按照适当比例用TBST(MILLK)稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。二抗需根据一抗进行选择，例如，一抗是小鼠来源的IgG，则二抗需选择抗小鼠IgG的二抗

4.立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。回收二抗。

5取出膜，放入TBST(没MILLK)中摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟（5-10分钟），共洗涤3次，如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数

7.显色和曝光

1.物品准备：显色试剂A、B(A;B=1ml:25ul)，显影液，定影液，保鲜膜，胶片

2.倒掉脱洗液，在曝光盒里铺好保鲜膜；再在皿里将条带铺好（蛋白面朝上），关灯暗室中配好的显色液，加入铺好的膜上（要完全覆盖膜）

3.将蛋白膜铺好在保鲜膜上（要脱掉些显色液），盖上保鲜膜，剪适当大小胶片，曝光，曝光时间分别是15秒、30秒、60、秒

4.曝光后将膜放入显影液中，显影片刻（看到条带出现即可），放入定影液中定影片刻；

5.曝光结束后，清水洗胶片，晾干

8. 膜的重复利用(Membrane recovery)

如果蛋白膜需要再次利用可以使用strippingbuffer处理蛋白膜。

1.将蛋白膜加入stripping buffer 中50°C摇30分钟

2.倒掉stripping buffer,加入新的stripping buffer在25°C（室温即可）摇10分钟

3.再TBST(没有奶粉)摇洗10分钟，共2次

4.封闭，同上4封闭

westernblot详细图解

Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以

检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材 电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素 膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。

Western超详细实验步骤

Western实验步骤 1. 电泳(Electrophoresis) （1）SDS-PAGE凝胶配制 SDS-PAGE凝胶进行配制，配方试剂去离子水，Arc-HCL(29:1)，10%APS，SDS,TEMED。 一般按分子大小配胶，现实验分离胶配12%-15%的胶，浓缩胶10%的胶。 配胶步骤： 1.清洗玻璃板，装好（注意不要漏即玻璃板要对齐）。 2.按比例配分离胶（8ml-10ml） 3.加水压胶，待分离胶凝固后（可见有分离胶与水有分隔线，一般凝固时间30分钟-1小时左右），吸走上层水面 4.按比例配浓缩胶（3ml-4ml），加入分离胶上层，插入梳子，（注意别有气泡），待凝。（如果今日不上样可以放入4°C冰箱） 注意：玻璃板要洗得干净；玻璃板要装好，不要漏；制胶过程中，一定要充分混匀，而且避免有气泡；（2）样品处理 1.准备无菌EP管，向EP管内加入样品蛋白质体积的1/4体积的SDS缓冲液（5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，现样品加 3.5ul），之后加入相应蛋白样品（要制冰，蛋白质样品要放置在冰上），充分吹打混匀 2.100℃水浴加热5分钟，以充分变性蛋白。 3.12000r离心5分钟。 （3）上样与电泳 1.将玻璃板装入电泳槽中，加电泳缓冲液至泳槽的的2/3左右 2.蛋白质样品冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可，样品两边加蛋白质Maker(6ul)（注意上样蛋白质顺序，一定不要弄错）。 3.通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为100分钟（一般为90-120分钟）。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。 通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。（为了避免电泳过头，最好是在电泳设定时间的提前30分钟观察电泳） 注意：上样时尽量避免样本被上漏出孔外；注意电泳时间的把握；最重要的是一定要记录上样顺序，必要时记录在本子上。 3.转膜(Transfer) 1.物品准备，甲醇，转膜缓冲液，滤纸，转膜槽，玻璃皿3个，制冰。 2.取下胶板，用专门的板将玻璃板分离（务必不要将胶弄破，动作轻些，从下面和上面分离玻璃板），切适合大小的胶（不要切掉MAKER）。 3.用专门的板将胶转入事先放有转膜缓冲液的皿中，记录胶的顺序，剪与胶同等大小的滤纸和转膜纸PVDF膜，PVDF膜要放入甲醇中浸15秒（一般1-2分钟），胶要切角做标记（不要切到maker）,一般一个切三个角，一个切一个角，记录顺序 4.铺膜，PVDF膜铺在胶上，在PVDF膜上铺三层滤纸，然后胶的对侧面铺三层滤纸即可（滤纸要大于等PVDF膜，PVDF膜要大于等胶），赶尽气饱。 5.再将铺好的膜胶滤纸，转入转膜夹中，有PVDF膜这面放在正极侧（即无色透明夹这面），再将夹子放入转膜槽里（电极不要放错，蛋白质带负电的）

WB实验步骤

Western blotting实验步骤 1．蛋白质的样品制备： 取心肌组织50mg，待组织块自行溶解，用滤纸吸去其表面水分，将组织块放入玻璃匀浆器球状部位，用组织剪尽量将其剪碎，将剪碎的心肌组织放入玻璃匀浆器的杆状部，按1mlRIPA+10ulPMSF/100mg心肌组织的比例加入RIPA和PMSF（先加RIPA再加PMSF），将玻璃匀浆器插入冰中，匀浆约30分钟。 将心肌组织匀浆转移到离心管中，4℃12000g离心5分钟，收集上清（如有粘稠物进一步用超声处理），样品分装冻存于-20℃备用。 2 .测定蛋白浓度： 2.1 按50：1配置BCA工作液。 2.2 10ulC液（蛋白标准）+90ulPBS液稀释成0.5mg/ml的蛋白标准液。 2.3 分别以0、1、2、4、8、12、16、20ul将蛋白标准液加入96孔板的第1~8标准孔中，在其他样品孔中加入10ul待测样品。 2.4 分别加PBS定容至20ul。 2.5 各孔中加入200ulBCA工作液，室温放置2小时。 2.6 用酶标仪测定蛋白浓度：测定A562，依标准曲线算出蛋白浓度。 3 SDS-PAGE电泳： 3.1 制胶: 按比例配制分离胶，缓缓地摇动溶液，使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水，以阻止氧气进入凝胶溶液中，静置40min。同前按比例配制浓缩胶，但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，连续

平稳的注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静制60min以上以保证完全聚合。 3.2 预电泳：将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入电泳缓冲液后低电压10-20V的预电泳20-30min。（目的是清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通）。 3.3 样品准备：首先计算上样体积，然后按样品：上样buffer=4：1的比例加入上样bufer混匀，沸水煮10分钟，冰上5分钟。 3.4 加样：预电泳后依次加入标准品（Marker）和待分析样品。（加样时间要尽量短，以免样品扩散，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免边缘效应。每个泳道加5ul。 3.5 电泳：加样完毕，选择80V恒压进行电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿到达两胶交界处（一般约20分钟），更换至100V恒压电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳（一般约为1小时20分钟）。 4．转膜： 4.1 切胶：将电泳完毕的胶完整的放在盛有电转液的玻璃皿中，将目的蛋白所在区域切下来，测量其长宽，并记录。 4.2 剪膜和滤纸：按胶的尺寸剪膜和滤纸（滤纸长宽较凝胶小0.5~1mm，PVDF 膜长宽较凝胶大0.5~1mm），滤纸浸入盛有电转液的玻璃皿中10秒钟，膜放入盛有10%甲醇的玻璃皿中10秒钟，然后将两者都放入盛有去离子水的玻璃皿中3分钟，进一步放入盛有电转液的玻璃皿中3分钟。 4.3 向电转槽中倒入部分电转液，将海绵浸入。按如下顺序制作“三明治”（注意避免两边滤纸相互接触，以免发生短路）。从正极到负极按如下顺序排列：

(完整版)WesternBlot(免疫印迹法)实验方法步骤

Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤 发布日期:2008-8-25 热门指数:4360 Western Blot(免疫印迹法) 主要包括以下4个基本步骤： n 样品制备 n 电泳分离 n 蛋白的膜转移 n 免疫杂交与显色――蛋白检测 溶液和试剂 n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS) n Modified RIPA buffer Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;P MSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mM n 1X SDS 样品缓冲液 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝 n 转移缓冲液 25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3) n 10X Tris缓冲盐(TBS) 准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6 n 脱脂奶粉或BSA n 甲醇 n TBS/T缓冲液 1X TBS, 0.1% Tween-20 n 封闭缓冲液（TBS/T）

1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSA n 一抗的稀释 1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗) Note:一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。 n 预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率 样品制备 原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。 1．培养细胞或药物处理。 2．弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。 3．加入1X SDS样品缓冲液(6-well plate, 100 μl /w或75 cm2plate, 500-1000 μl/瓶)，刮落细胞，转移到Ep管。注意：冰上操作。 4．超声10~15秒剪切DNA以减低样品粘性。 5．煮沸样品5 minutes。 6．离心12000g, 5 min，取上清。 7．电泳分离：上样15μl~20 μl 至SDS-PAGE 胶(10 cm x 10 cm)电泳。 如要定量检测某蛋白的表达水平，应用RIPA裂解液(1 ml per 107cells/100 mm dish/150 cm2flask)裂解细胞，收集裂解液至离心管中，在振荡器上混匀4～15min，14000g离心15min（4℃），弃沉淀，用B radford法或其它蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度以调整上样体积和上样量，进行Western杂交时还需设置内或外参照，通常用beta-actin。 注意：一般上样20~30 μg已足够，如待检蛋白为低丰度蛋白，可加大上样量至100μg，但电泳条带易拖尾，可制备亚细胞组份或采用更敏感的检测方法。 电泳分离（参照SDS-PAGE电泳方法） 转膜 杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于Western blot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜(NC) 和PVDF膜。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被

Western操作步骤

Western-Blot 操作流程 （一）组织中总蛋白的提取 用干净的剪刀剪取绿豆大小的组织块于1.5ml的EP管中，加入200uLRIPA裂解液(含PMSF，比例为97：1：1：1)，用杵子研磨3-4min, 段事先在酒精里浸泡至少30min，用之前用滤纸吸干酒精，） 20-30s,每隔5min 后在 4℃下12000rpm 离心 5min，取上清分装于 1.5mlEP管中并置于-80℃冰箱保存。 （二）BCA法蛋白含量的测定 (1) 从-20℃取出 1mg/ml BSA，室温融化后，备用。 (3)以上步骤完成后，在所有加样的孔里各加上200uLBCA蛋白浓度测定试剂（按试剂A：试剂B=50：1的比例配置），然后置于37℃水浴锅30min后取出。 (4)酶标仪测定OD值。 (5)EXCEL表格制作标准曲线，按照标准曲线计算各样本的蛋白浓度。 （三）稀释蛋白及蛋白变性 如果计算出的样本的蛋白浓度偏高，需要用RIPA裂解液将蛋白稀释（一般将蛋白浓度稀释至5-10ug/uL）;稀释完后取10-30uL的样本蛋白置于新的1.5mLEP管中，加入新EP管中总体积1/4体积的上样缓冲液，置于99-100℃的干式恒温器中加热5-10min,使蛋白变性。（注意：将EP管的盖子盖紧，插入加热器的大圆孔中）煮过的蛋白置于-20℃冰箱保存。 （四）制作SDS电泳胶 ⑴清洗玻璃板，双蒸水冲洗晾干后，根据厂家说明安装玻璃板。 ⑵配置10%的分离胶 配方：H2O2 4.0ml 30%丙烯酰胺液 3.3ml 1.5mol/l Tris （ PH8.8） 2.5ml 10%SDS 100ul 10%过硫酸胺 100ul TEMED 4ul ⑶分离胶溶液中加入 TEMED 以及 10%过硫酸胺后需立即混匀（防止未灌胶就发生凝固），将混合液立即加入玻璃板内，距梳子下缘约 lcm 处即可，蒸馏水封顶，待凝胶完全聚合（约30min）后，倒去双蒸水。 ⑷制备5%的浓缩胶 配方；H2O2 3.4ml 30%丙烯酰胺液 0.83ml 1.5mol/l Tris （ PH6.8） 0.63ml 10%SDS 50ul

westernblot实验详细步骤(1)

Western Blot实验技术一、制胶 SDS-PAGE分离胶配方表 1、检查制胶器是否漏水，吸干玻璃中水分

2、配置分离胶，加入玻璃板中（注意：不能有气泡和杂物），距离玻璃上口1.5mL停止加胶。 3、再加ddH2O或异丁醇水封除去气泡，凝胶后倒掉水，吸干水到浓缩胶插梳。 二、上样 1、先在内槽加满电泳液才可以拔梳子。 2、拔梳子时垂直向上拔出，不可左右摇晃梳子。 3、拔完梳子后观察梳子孔，是否有缺口和歪，用针头拨正。 4、上样时从左到右依次上样。 5、若上样组不多时，左右第一孔不加样。 6、要预留Marker的上样孔。 三、电泳 四、转膜

PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。 （转膜缓冲液：需4度预冷，现配现用，不能放太久。） 1、转印滤纸：全胶长8.5cm，宽5.5cm，需剪裁成7层滤纸，压平后约3mm。需在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 2、海绵垫：在转膜液中平衡浸泡备用。 3、PVDF膜：剪裁8.5cm*5.5cm ，需在甲醇中浸润2min（活化膜上正电基团），然后在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 4、凝胶：凝胶也需要在预冷的转膜转膜缓冲液中平衡浸泡3－5分钟。否则在转膜过程中会出现皱缩，导致出现转移的条带变形。 三明治夹心法：负极（黑）-海绵垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-正极（白） 转膜时间：通电恒流，60V，一个槽100mA左右，1h

（注意：在操作过程中用玻棒赶走气泡。 装置转膜仪时注意黑对黑（负对负），白对红（正对正）。 装置运行时需冰浴。） 五、封闭 在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止抗体对非转印蛋白区域的非特异性吸附。 封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，本实验室常用的有5%BSA，10%脱脂奶等，至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测目的相适应（做l酪氨酸磷酸化时不推荐non-fat milk 封闭）。 1、将脱脂奶粉封闭液（1xTBST:脱脂奶粉=20mL：2g一块膜用量。牛血清蛋白、5%BSA 效果更好）倒好。 2、将PVDF膜取出放入封闭液中，盖子改好。 3、封膜一般常温1-2小时即可，也可4℃封闭过夜。 六、一抗 抗体反应主要采用间接法: 即先加入未标记特异性一抗与膜上抗原结合后，再加入标记的二抗进行杂交检测，标记二

western blot实验步骤

Western bolt 一、实验目的 通过实验了解western blot技术的原理和操作。 二、实验原理 SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。 PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称NC膜)，在胶体金试纸中用做C/T线的承载体，同时也是免疫反应的发生处。NC膜是生物学试验中最重要的耗材之一。 第一抗体就是能和特异性抗原特异性结合的蛋白。第二抗体是能和抗体结合，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。 化学发光HRP底物（辣根过氧化物酶底物，也常被称为ECL试剂）是目前Western blot检测中最为灵敏的试剂。显影液的A液主要成分为鲁米诺（Luminol）及发光增强剂，B液主要成分为过氧化物溶液。二抗上含有HRP（辣根过氧化物酶），可以催化A液和B液反应发光。 三、实验器材 1.电泳槽，胶板架子 2.转膜仪 3.NC膜 4.电泳电源 5.滤纸 6.摇床 7.X射线摄影暗匣 8.X射线胶片 9.塑料薄膜 四、实验试剂 1.runningbuffer 5xrunningbuffer(1L) Tris 15.1g

蛋白印迹——western-blot-实验流程及注意事项

蛋白印迹——Western blot 实验流程及注意事项 各种凝胶电泳方法可以直接了解蛋白的某些性质如迁移率、电荷、大小、丰度以至蛋白的亲疏水性等。此外，特异染色方法可用于识别不同种类的蛋白质。Western blot技术大大扩展了凝胶电泳后识别和鉴定蛋白的可能性。这一技术首先将电泳分离后的蛋白质条带或斑点从凝胶介质转移到固相支持膜上，然后用特异性配体进行检测。特异性抗体和凝集素等已被广泛应用检测印迹膜上的蛋白。印迹技术还常常作为电泳分离后用化学方法（如蛋白氨基端序列分析等）鉴定蛋白的一个重要步骤。 一、聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE或SDS-PAGE） 聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。

PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCL。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCL。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。 实验步骤 1.配制分离胶5ml（配方见图1）； 2.将液体用1ml移液器加入玻璃板（从玻璃板的边缘加入，速度适中，尽量不 要产生气泡）； 3.用去离子水压胶（利用重力作用把胶压平，否则如果有气泡，胶就不平了， 影响电泳效果。注意上面盖一保鲜膜，防止液体挥发）； 4.大约1第二天一早配制堆积胶）， 5.倒掉玻璃板上面的水并用滤纸吸干，加入堆积胶，并插入梳子； 6.约1小时后堆积胶凝固，把玻璃板转移到电泳装置并加紧（防止漏液）； 7.将电泳装置内加入电泳缓冲液并观察是否漏液； 8.拔掉梳子，用微量注射器冲洗上样孔，加入和上样缓冲buffer混合变性的蛋 白；①蛋白上样量：20-50μg；②上样缓冲液：加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×；③上样最大体积：根据梳子孔径和玻璃板的距离而定，一般我们用的上样最大体积在30ul左右；④蛋白变性：上样前要将样品于沸水中煮5-10min 使蛋白变性。可以使用PCR仪进行变性，99℃5分钟，加快速度，这样就不用将水煮沸了，同时在水中煮蛋白样品有下面弊端：a. EP 管容易炸开，样品丢失；b. 容易进水，使样品体积增加，超过电泳最大上样量； 9.在电泳槽中加入电泳缓冲液； 10.恒压80V 30分钟，100V 2小时左右，溴酚蓝跑到底即可（电泳时间可以根 据自己目的蛋白的具体条件设置，一般4～5 h，电压为40V 较好，也可用60V。）；

Westernblot基本操作步骤

W e s t e r n b l o t基本操作步骤 一、细胞蛋白的提取 弃去培养基，加入预冷的PBS洗一遍，加入的RIPA裂解液（含1mM PMSF(100×)，每10ml加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂各一片，六孔板每孔150-250μl，60mm×15mm 培养皿300-400μl，），于冰上裂解约5分钟，裂解总液12000rpm离心10 min。取上清，用BCA法测定蛋白浓度。用于western blot的蛋白样品取一定量加4×loading buffer，10×reducing，再用裂解液补齐到所需上样体积。离心，使蛋白沉底。将EP管于沸水中煮5min，变性，之后再离心后准备上样。 二、BCA法测蛋白浓度操作步骤 将蛋白标准配制溶液溶解蛋白标准（BSA），配制成5mg/ml的蛋白标准溶液，10μl 分装，-20℃冷冻保存。 完全溶解蛋白标准品，取10μl用PBS稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。 据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μl加到96孔板的标准品孔中，加稀释标准品的溶液补足到20μl。 加适当体积样品到96孔板的样品孔中（可以通过预实验摸索稀释倍数），加PBS 到20μl。 各孔加入100μl BCA工作液，37℃放置30分钟。 测定580nm条件下吸光度。根据标准曲线计算出蛋白浓度。 三、Western blot基本操作步骤 1、溶液配制： ①Runnig Buffer(1×)：SDS Runnig Buffer（20×）50mL，加MiliQ水至1L； ②Transfer Buffer(1×): Transfer Buffer(10×)100mL,甲醇200mL（20%，v/v），加MiliQ水至1L； ③TBST缓冲液 1M Tris·HCl（pH7.6）：60.5g Tris-base，加入约30ml浓盐酸，调PH至7.6，加MiliQ 水至500ml。 TBS缓冲液（10×）：1M Tris·HCl 100ml+80g NaCl加MiliQ水1L TBST缓冲液（1×）：TBS缓冲液（10×）100ml+0.5ml Tween-20（0.05%，v/v），加MiliQ水至1L。 ④封闭液：5% BSA（5g/100ml，称取1g BSA至20ml TBST，充分混匀溶解） 2、样品准备与加样 ①用4×SDS loading buffer, 10×reducing与蛋白质样品混合，并将此EP 管放在水浴锅中沸水煮5min，使蛋白质变性。 ②将预制胶固定到电泳装置中，并在装置中加满Runnig Buffer(1×)，内槽加入0.5mL 抗氧化剂，小心拔下梳子； ③向上样孔中加入一定体积的蛋白样品（总蛋白量20μg以上）。向marker孔中加入2.5μl marker（按照实验要求设定marker量），向空白孔中加入一定体积的加样缓冲液(loading buffer)。注意采用相同（或相近）的上样体积，以保证蛋白的各带宽度相同。防止体积较大的上样孔中的蛋白质将向相邻的泳道扩散。 3、电泳

western-blot-全过程-详细步骤复习课程

w e s t e r n-b l o t-全过程-详细步骤

一：提蛋白： 1.PBS洗2遍，加RIPA 80-100ul（含10xcooktail）。 2.在冰上刮到离心管中，在冰上裂解20-30min。 3.4度离心，13000rpm、10-15min（准备新的离心管、配BCA 200ul/每孔(A:B=50：1)、96孔板加 PBS(2个对照组20ul，实验组18ul)）。 4.取上清转移到新离心管中，记住转移的体积。 5.96孔板中每孔加2ul蛋白液。 6.每孔加200ulA/B混合液。 7.37度半小时。 8.测浓度以及标化用一起在libo文件夹找模板，最后得到每组需要加的RIPA以及loding buffer，还 有标化后的浓度。562波长0.046斜率（实验组值-对照组值）/斜率=浓度浓度最好在4-8ug/ul最好，跑胶时就可以只加10ul蛋白液（蛋白含量40-80ug） 9.加好对应的RIPA以及loding buffer后，煮蛋白5-15min，-20度保存。 二：跑胶 1. 1.0玻板，洗干净 2.配制10%或者12%分离胶一块胶需要5ml 3.灌分离胶，在分离胶上层灌无水乙醇 4.配制5%浓缩胶 2块胶需要4ml 5.待分离胶干后，灌浓缩胶，插梳子 6.待胶干后，将胶及玻板一起放入电泳槽，拔梳子，倒入1*running buffer（上腔灌满，下腔过电线 丝） 7.预电泳，100v，10-15min 8.加样（蛋白样品及marker）10ul，marker 5ul 9.60v 10-20min，之后100-110v 三：转膜

1.配transfer buffer ，用10*transfer buffer 稀释10倍，并加20%甲醇 2.transfer buffer浸泡海绵、滤纸 3.pvdf膜，甲醇泡1分钟，清水洗2次，泡在transfer buffer里20min 4.胶取出，在transfer buffer里泡10min 5.黑胶白膜（一层海绵，2层滤纸） 6.转膜100v，1—1.5h（黑对黑，冰板，在冰里跑） 四：封闭、一抗、二抗 1．5%脱脂奶粉（pbst溶）1h 37度 2.一抗4度12h 3.pbst洗膜，3次，每次10min 4.二抗（1:5000）1h 37度 5. pbst洗膜，3次，每次10min 6.显影剂A和B各300ul PBST：1000ml’PBS+1mltween 5%脱脂奶粉：100mlPBST+5g脱脂奶粉 10*running buffer：tris 30.3g 甘氨酸 144.1g sds 10g 加水至1000ml 10*transfer buffer：tris 30.3g 甘氨酸 144.1g 加水至1000ml 1* transfer buffer：100ml10*transfer buffer 200ml甲醇加水至1000ml

Western blot实验操作步骤

Western blot实验步骤 一、制备蛋白样品（单层贴壁细胞总蛋白提取） 1.倒掉细胞培养液,加3ml预冷的PBS洗涤细胞，重复两次，弃掉PBS 后将细胞培养瓶置于冰上。 2.裂解液RIPA(强)1ml +PMSF10ul(100:1),两者混匀后加入培养瓶中裂解细胞，冰上裂解30min,为使细胞充分裂解,培养瓶要经常来回摇动。 3.裂解完后，用细胞刮将细胞刮于一侧（动作要快），转移至ep管中. 4.4度，12000rpm,离心5min.离心后取上清至新的ep管中，用于后续实验（-80保存） 常用蛋白收样：倒掉细胞培养基后，预冷PBS洗涤细胞2次，弃去，再加入1ml PBS，用细胞刮轻轻刮取细胞，转移至1.5ml ep管中，12000rpm，离心5min，尽量吸净上清，沉淀于-80保存，用于后续实验。融化蛋白样品，加入RIPA+PMSF细胞裂解液（200ul/ep管），充分混匀，冰上裂解20min，4度离心，5min ，12000rpm，小心吸取上清至新的ep管中。 二、蛋白浓度测定(BCA法) BCA(碧云天)蛋白浓度测定试剂盒灵敏度高，检测浓度下限达到25ug/ml，最小检测蛋白量达到0.5ug，待测样品体积为1-20ul。在50-2000ug/ml浓度范围内有较好的线性关系。 标准蛋白BSA浓度：5mg/ml (-20保存),完全溶解蛋白标准品，取10ul 稀释至100ul，使终浓度为0.5mg/ml(ug/ul)。蛋白样品在什么溶液中，

标准品也宜用什么溶液稀释。但为了简便起见，也可以用0.9%NaCl 或PBS稀释标准品。 1.配置BCA工作液 A液： B液= 50 :1 ，混匀 A液+B液=200ul (每个样本) 样本数量： 7个标准品 + N 个待测蛋白样本 2.先将每孔加入200ul BCA工作液，再加入蛋白样本。（96孔板）, 总体积为10ul.待测蛋白样本先10倍稀释。 3.37度，温箱中孵育30min。562nm波长，测OD值。待测蛋白样品浓度在50-2000ug/ml浓度范围内有较好的线性关系。 4.根据所测样品的OD值，绘制标准曲线。根据标准曲线即可计算样本相应的蛋白含量，除以样本稀释液总体积（10ul）,再乘以样本稀释倍数，即为样本的实际浓度（ug/ul） 5.蛋白定量后，以最小蛋白浓度为标准，将各组蛋白样本调至相同浓度（ddH2O补齐） 绘制标准曲线：X轴为蛋白质量，Y为OD值 插入—XY散点图,选中图上一点，右键，添加趋势线—选项（显

最详细的WesternBlot过程步骤详解

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Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答) Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术: 一、原理 二、分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL ECF iv.底物DAB呈色 三、主要试剂 四、主要步骤 五、实验常见的问题指南 1.参考书推荐 2.针对样品的常见问题 3.抗体 4.滤纸、胶和膜的问题 的相关疑问 6.染色的选择 7.参照的疑问

8.缓冲液配方的常见问题 9.条件的摸索 10.方法的介绍 11.结果分析 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、分类 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

Western基本步骤

Westen blot 一、配胶 （一）安装胶架 （二）配胶 1、分离胶：10%（10ML） O 4 ml DdH 2 30%Acr 3.3ml Tris-Hcl(8.8) 2.5ml 10%SDS 0.1ml 10%过硫酸铵AP 0.1ml TEMED O.OO4ML 2、积层胶: 4ml O 2.7 ml DdH 2 30%Acr 0.67ml Tris-Hcl(6.8) 0.5ml 10%SDS 0.04ml 10%过硫酸铵AP 0.04ml TEMED O.OO4ML 注意事项：1、TEMED催化AP产生自由基，加速Acr凝胶聚合，一般于4度存放。 不宜多加，否则胶易变硬脆裂。 2、TEMED易燃、腐蚀性、神经毒性，要注意防护。易挥发，使用后立 即盖紧瓶盖，佩戴PE手套。 3、每加完一样晃匀，TEMED最后加。 （三）灌胶 1、分离胶1ml枪吹打均匀，避免气泡，尽快灌入固定好的玻璃板中。 O，压平分离胶界面。待胶凝后可见分割折线。 2、分离胶上灌满ddH 2 O，分隔线先清楚后不清楚，待胶凝后又可见。 可用乙醇代替ddH 2 O，用滤纸吸干。 3、分离胶凝后，倒去顶部ddH 2 4、积层胶1ml枪吹打均匀，灌入玻璃板中至顶部。 5、插入梳子，注意梳子底部应无气泡。略倾斜插入梳子可避免出现气泡 6、20-30分钟后胶凝。 二、电泳 （一）准备 1、装上电泳装置，倒入1*电泳液。先倒内槽（新）没过短玻璃板，如内槽不漏液再加外槽，没过钢丝电极即可，内外槽不能相通。 2、拔出梳子（用力均匀缓慢拔出），用10vl枪点样。 （二）上样和电泳 1、10vl枪点样。（1.0胶最大上样量30vl，0.75胶最大上样量25vl） 2、样尽量点在中间孔位，空孔位用残样或5*buffer填补，避免边缘效应，使电流在胶板中均匀分布。

western步骤

1、组织蛋白的提取 取上述用于Mn含量测定中另外4只大鼠剩余的纹状体组织置于2ml EP管中，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎，加400μl单去污剂裂解液（含PMSF）于超声器中进行裂解，然后置于冰上。几分钟后再超声数秒再置于冰上，要重复几次使组织尽量碾碎。裂解30min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，去上清分装于新的离心管中并置于-20℃保存。 2、蛋白含量的测定 （1）制作标准曲线 从-20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。取96孔板，按下表加入各种试剂。混匀后，室温放置2min。在酶标仪上比色分析，测量OD值。 表2，标准曲线的制备 0μg 2.5μg 5.0μg10.0μg20.0μg40.0μg 1mg/mlBSA - 2.5μl 5.0μl10.0μl20.0μl40.0μl 0.15mol/L NaCl 100μl97.5μl95.0μl90.0μl80.0μl60.0μl G250考马斯亮蓝溶液1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml （2）检测样品蛋白含量 ①取96孔板，实验用各孔加入4℃存储的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置30min，后即可用于测蛋白。 ②其中一孔加0.15molNaCl溶液100μl做空白对照，其余个孔加95μl 0.15molNaCl溶液和5μl 0.15molNaCl待测蛋白样品，混匀后静置2min，在酶标仪上比色分析，在595nm处测量OD值。 ③绘制标准曲线，测得的结果是5μl样品含的蛋白量。 3、SDS-PAGE电泳 （1）干净玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直置于架上准备灌胶。 （2）制备分离胶并灌胶：配置8ml 10%分离胶，3.2ml ddH2O，2.0ml 1.5mol/L Tris·HCl分离胶缓冲液（pH8.8），2.72ml 30%丙烯酰胺溶液，80μl 10%SDS，80μl 10%APS（过硫酸铵），16μl TEMED。

WB操作步骤-自己整理

Western Blot 相关实验方法与试剂（湿转法） 人工肝实验室学习姚瑶 （一）目的蛋白提取： （1）单层贴壁细胞总蛋白的提取： 1、倒掉细胞培养液，加入Hanks液洗涤一次后倒掉，根据所用细胞决定是否用胰酶消化，加入适量（约5ml）新鲜细胞培养液后，将贴壁细胞吹起，并转移至4支离心管内，配平后，1500转离心10min。 2、倒掉上清，用4度预冷PBS溶液洗涤沉淀，1500转离心10min。 共洗三次，每次十分钟。 3、倒掉上清，吸净，每管加入50ul 细胞裂解液RIPA，吹散，加入后由于DNA的释放可迅速变粘稠，故应尽快转移至1.5ml EP 管内，-20℃裂解30min。 4、超声波细胞裂解仪上将各管裂解15s。（可不做） 5、4℃，12000转离心10min。 6、将上清转移至0.5ml EP管中，每管100ul，冰浴待用。 （2）组织中总蛋白的提取： 1、取约100mg肝组织于研磨器内，加入500ul 细胞裂解液RIPA，研磨后吸出于1.5ml EP管内，再加入500ul RIPA，研磨后吸出于上EP管内。冰上裂解30min。

2、配平后，4℃，14000转离心10min。 3、将上清分装于0.5ml EP管内，每管100ul，冰浴待用（二）蛋白含量的测定： 1、稀释标准品：10ul标准品C液+90ul PBS溶液，混匀。 2、按0、1、2、4、8、12、16、20ul将稀释后的标准品加入于96孔板内，并用PBS将各孔补足20ul。 3、将第2、3排96孔板分别加入样品1ul、0.5ul，（可采用倍比稀释法），并用PBS将各孔补足20ul。 4、配制工作液：按A液：B液=50：1配制适量工作液，每孔加入200ul。 5、37℃水浴30min。 6、酶标仪测定各孔OD值（A570，Mode1）。 7、绘制标准曲线，计算样品蛋白浓度。 （三）SDS-PAGE电泳： （1）清洗玻璃板 （2）灌胶与上样： 1、配胶：根据目的蛋白的大小，决定分离胶的浓度。

Western操作步骤

Western-Blot 操作流程及注意事项 Western操作步骤 （一）蛋白样品制备 （1）单层贴壁细胞总蛋白的提取： 1. 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 2. 每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2~7.3）。平放轻轻摇动1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。 3. 按1ml 裂解液加10 μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合） 4. 每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 5. 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml 离心管中。（整个操作尽量在冰上进行） 6. 于4℃下12000rpm 离心5min。（提前开离心机预冷） 7. 将离心后的上清分装转移倒0.5min 的离心管中放于-20℃保存。 （个人感觉上述方法可操作性有待加强，细胞中蛋白本来就很少，一瓶50ml的细胞有时按照实验要求只能加100~200μl 的裂解液，按照上述操作，直接用200μl 裂解液进行裂解，根本就不够瓶壁上沾的。本人是先用预冷的PBS（一般数毫升）加入后，用细胞刮刮下细胞，转移至试管中，如果数瓶细胞是收集同一蛋白的，可以放在同一试管，离心后再将蛋白转移到EP管中，这样可操作性就比较强） （2）组织中总蛋白的提取： 1. 将少量组织块置于1~2ml 匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。 2. 加400 μl 单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中进行匀浆。然后置于冰上。 3. 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。 4. 裂解30 min 后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml 离心管中，然后在4℃下12000rpm 离心5min，取上清分装于0.5ml 离心管中并置于-20℃保存。 （3）加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取： 由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取： 1. 将培养液倒至15ml 离心管中，于2500rpm 离心5min。 2. 弃上清，加入4ml PBS并用枪轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后PBS 重复洗涤一次。 3. 用枪吸干上清后，加100 μl 裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。 4. 将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm 离心5min，取上清分装于0.5ml 离心管中并置于-20℃保存。 （二）蛋白含量的测定 （1）制作标准曲线 1. 从-20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。 2. 取18 个1.5ml 离心管，3 个一组，分别标记为0μg，2.5μg，5.0μg ，10.0μg ，20.0μg ，40.0μg。

WB实验步骤

蛋白电泳（制胶、SDS-PAGE电泳） 实验材料： SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、电泳缓冲液、提取的蛋白或全细胞裂解液、广谱彩虹预染中分子量蛋白Marker、SDS-PAGE Loading Buffer（还原，5×）、G250蛋白快速染色试剂、若干蒸馏水 实验仪器、耗材： 蛋白电泳仪、制胶仪、水平摇床、15ml离心管、5ml移液器、微量移液器、1.5ml离心管、塑料饭盒（可在微波炉里加热使用） 配制溶液： ●配制10%APS溶液：-20度保存 0.5g APS + 5ml蒸馏水、2.5g APS + 25ml蒸馏水 ●配制200 ml电泳缓冲液：CW0045 Tris-Glycine SDS（ph8.3,10×） 20 ml Tris-Glycine SDS + 180 ml 蒸馏水 ●配制1 ml loading buffer： 200 ul 5×loading buffer +800 ul蒸馏水 实验步骤： 一．制胶： 1.参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。 2.根据分离蛋白的大小配制分离胶和浓缩胶。 3.配制10%分离胶： 将不同体积的30%Acr-Bis(29:1)、分离胶缓冲液和双蒸水在小烧杯或试管中混合。 加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。 配制SDS-PAGE分离胶

4.待胶灌至距离玻璃板顶端1.5cm的时候停止灌胶，加入蒸馏水水封。静置40分钟 至1小时。 5.待分离胶凝固后（水层胶层中间出现折线），倒掉蒸馏水，用滤纸将水溶液吸干。 6.配制5%浓缩胶： 7.将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。 注意：灌胶速度要快，防止凝胶。 8.将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。静置20分钟，等待浓缩胶聚合。 9.待凝胶聚合后，小心地拔出梳子，以免破坏加样孔。赶走气泡。 二．SDS-PAGE电泳: 1. 在电泳槽的内外槽灌至电泳缓冲液。 2. 制备样品： 1）蛋白样品： 根据植物蛋白或动物组织蛋白定量结果，计算蛋白提取液加入量，制备上样溶液。 蛋白提取液+ 5×上样缓冲液+ 蒸馏水，上样量为40-60ug。 制备的样品，煮沸5分钟，12,000 rpm离心5分钟，取上清，上样。