GE NOVAGEN 镍柱纯化系统流程

蛋白纯化系统操作流程

一、蛋白的诱导:蛋白原核表达

1、取菌种接种于含Amp LB固体培养基中(分区划线),37℃培养过夜;

2、挑取单克隆接种于5ml含Amp LB液体培养基中,37℃振摇过夜;

3、从过夜培养物中取2ml接种于100ml Amp LB液体培养基中,振摇2h(留样1ml);

4、加入一定终浓度IPTG,37℃诱导表达4h(留样1ml),离心,弃上清收集细菌。

存入4℃。

二、蛋白表达状态分析(可溶性or包涵体表达)

取少量(1ml)诱导菌体沉淀,加入不含变性剂(如盐酸胍,尿素等)PBS(150μl),超声裂解。分离上清和沉淀,分别SDS-PAGE电泳。

三、蛋白的纯化

纯化前准备

1.推荐在中性至弱碱性条件下(pH 7-8)结合重组蛋白。磷酸盐buffer是常用的缓冲液,

Tric-Cl在一般情况下可用,但要注意它会降低结合强度。

2.避免在buffer中包含EDTA或柠檬酸盐等螯合剂

3.若重组蛋白以包涵体形式表达,在所有的buffer中添加6 M 盐酸胍或8 M 尿素

注:

1.包含尿素的样品可直接进行SDS-PAGE分析,若样品中包含盐酸胍,在SDS-PAGE前则

需先用含有尿素的buffer进行透析

2.除利用咪唑洗脱蛋白,其它方法,如低pH 值法等可被应用,详见说明书

Bingding buffer 中咪唑的浓度

在洗涤时所用的Bingding buffer 中咪唑浓度越大,重组蛋白纯度越高。但过高的咪唑浓度将导致蛋白的洗脱。合适的咪唑浓度需要优化。

Buffer 的准备

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