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分子生物学研究法(上)优缺点

分子生物学研究法(上)优缺点
分子生物学研究法(上)优缺点

第五章分子生物学研究方法(上)

——DNA、RNA及蛋白质操作技术5.1 重组DNA技术

重组DNA技术(recombinantDNAtechnique)又称遗传工程,在体外重新组合脱氧核糖核酸(DNA)分子,并使它们在适当的细胞中增殖的遗传操作。

重组DNA技术一般包括四步:①获得目的基因;②与克隆载体连接,形成新的重组DNA分子;③用重组DNA分子转化受体细胞,并能在受体细胞中复制和遗传;④对转化子筛选和鉴定。

特点:不受亲缘关系限制,为遗传育种和分子遗传学研究开辟了崭新的途径。

适用于获取目标基因的表达产物。

5.2 DNA基本操作技术

(1)核酸凝胶电泳技术

将某种分子放到特定的电场中,它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率,它与电场强度成正比,与该分子所携带的净电荷数成正比,而与分子的磨擦系数成反比(分子大小、极性、介质的粘度系数等)。在生理条件下,核酸分子中的磷酸基团是离子化的,所以,DNA 和RNA实际上呈多聚阴离子状态(Polyanions)。将DNA、RNA放到电场中,它就会由负极→正极移动。

适用于DNA、RNA片段的分离。

缺点:紫外对DNA分子有损伤,染料毒性大。

(2)细菌转化与目标DNA分子的增殖

细菌转化是指一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的过程。提供转化DNA的菌株叫做供体菌株,接受转化DNA 的细菌菌株被称做受体菌株。

常用的方法:CaCl2法和电击法

大肠杆菌是最广泛使用的实验菌株。在加入转化DNA之前,必须先用CaCl2处理大肠杆菌细胞,使之呈感受态(Competent Cells),Mg2+对维持外源DNA的稳定性起重要作用。

转化载体上一般带有LacZ基因,常用带有不同抗生素的选择性培养基结合α-互补蓝白斑筛选法鉴定转化细胞。

(3)聚合酶链反应技术

用于体外快速扩增特定基因或DNA序列最常用的方法。

反应体系:模板DNA、PCR引物、四种核苷酸、Mg2+、TaqDNA聚合酶、缓冲液和超纯水。

反应过程:DNA解链(变性)、引物和模板相结合(退火)和DNA合成(链的延伸)

特点:敏感,特异,快速的核酸分析技术

(4)实时定量PCR

荧光定量PCR是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度。

适用于对目标DNA片段初始浓度的定量分析。

优点:与常规PCR相比,其特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等

缺点:实验成本较高,影响因素较多,在定量丰度低的不可培养微生物时,其准确性不强。

(5)基因组DNA文库构建

把某种生物的基因组DNA切成适当大小,分别与载体结合,导入微生物细胞形成克隆,汇集这些克隆的总汇称为基因组DNA文库。

可用于分离特定的基因片段、分析特定基因结构、研究基因表达调控、构建全基因组物理图谱和全基因组序列测定。

常用λ噬菌体载体,简单快速、易于操作。

5.3 RNA基本操作技术

(1)总RNA的提取

总RNA包括mRNA、rRNA、tRNA和一些小RNA(sRNA)

总RNA抽提方法很多,常用的方法是异硫氰酸胍-苯酚抽提法。

RNA的浓度和纯度可以通过测定OD260/OD280来判定,1.8-2.0在表示提取的RNA纯度较好。

在变性的条件下进行RNA的电泳,甲醛是常用的变性剂,电泳后如果rRNA 大小完整,而且28SrRNA和18SrRNA亮度接近2:1,mRNA分布均匀,则认为RNA质量较好。

(2)mRNA的纯化

真核细胞的mRNA分子结构特征是具有5’端帽子结构-m7G和3’端的polyA 尾巴。

实验常用寡聚(dT)-纤维素柱色谱法获得高纯度mRNA。就是利用mRNA3’端polyA的特点。mRNA在高盐缓冲液下会特异性结合在柱上,再用低盐溶液或蒸馏水洗脱mRNA。

目前许多商业化的试剂盒可用于mRNA的纯化,如Promega公司的polyAT

Tract mRNA分离系统将生物素标记的寡聚dT引物与细胞总RNA温育,加入与微磁球相连的抗生物素蛋白以结合polyA mRNA,通过磁场吸附作用将polyA mRNA从总RNA中分离。

(3)cDNA的合成

cDNA的合成包括第一链和第二链cDNA的合成。第一链是以mRNA为模板。有反转录酶(oligo dT)催化反转录成cDNA。第二链的合成是以第一链为模板,由聚合酶催化合成。

反应体系中加入甲基化dCTP,保证新和成的cDNA链被甲基化修饰,以防止构建克隆时被限制性内切酶切割。一般合成的cDNA双链5’端和3’端分别具有Eco RI和Xho I粘性末端,保证它与载体相连时有方向性。

(4)cDNA文库的构建

常用的质粒载体和噬菌体类载体都能满足cDNA文库的要求,载体的选择要根据该文库的用途来确定。常用的载体是Uni-zap XR载体。

文库的构建可用于筛选目的基因、大规模测序、基因芯片杂交等功能基因组学研究。

cDNA文库的特点:基因特异性、器官特异性、代谢或发育特异性、不均匀性和各cDNA均可获得表达

缺点:包含的遗传信息少于基因组DNA文库,并受细胞来源和发育期的影响;cDNA能反映mRNA分子结构和功能信息,但不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外大量调控序列的结构和功能方面的信息;低丰度mRNA的cDNA克隆难于分离。

(5)基因文库的筛选

基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆过程。

①核酸杂交法

用放射性标记的特异DNA探针适用于高密度的菌落杂交筛选。

特点:适用性广泛、快速。

②PCR筛选法

适用于已知足够的序列信息并获得基因特异性引物。

特点:通用性强、操作简单。

③免疫筛选法

适用于表达文库的筛选。

特点:基于抗原抗体结合原理,操作简单。

5.4 SNP理论与应用

SNP(单核苷酸多态性)指基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性。染色体DNA同一位置上的每个碱基类型叫做一个等位位点。SNP 是最简单、最常见的多态性形式,具有很高的遗传稳定性。

根据SNP在基因组中的分布位置:

同义cSNP:不影响氨基酸序列。

基因编码区SNP(cSNP)非同义cSNP:改变碱基序列。SNP分为基因调控区SNP(pSNP)

基因间随机非编码区SNP(rSNP)

SNP检测技术:

①基因芯片技术

优点:高通量,一次可对多个SNP进行规模性筛选,被检起始材料也很少,操作步骤简单。

缺点:芯片设计成本高,由于DNA样品的复杂性,有些SNP不能被检出。

②Taqman技术

优点:操作简单。可自动化。

缺点:不能高通量分析,荧光探针费用高。

③分子信标技术

与Taqman技术相似,也是在PCR体系中加入荧光标记的探针与靶序列杂交,通过检测荧光值的变化进行基因分型。

优点是操作简单,课自动化;

缺点是探针费用高,不能高通量分析。

④焦磷酸测序法

适用于已知序列的DNA片段进行验证分析,已知SNP的序列验证及基因分型。

优点:自动化程度高,通量大,速度快,易于建立标准化操作,适合大规模SNP研究及基因分型。

缺点:能读取的DNA长度有限。

5.5 基因克隆技术

在分子生物学中,人们把将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中,使之得以永久保存和复制的过程称为克隆

①RACE技术

适用于扩增已知cDNA序列的基础上克隆5’端或3’端缺失序列。

优点:简单、快速、廉价等

缺点:很大程度上依赖于RNA连接酶连接和寡聚帽子的快速扩增。

②应用cDNA差示分析法克隆基因

适用于在没有探针的情况下克隆控制某一特定性状或生理反应中间步骤的基因。

优点:快速简便。mRNA用量少,大大降低了假阳性率,PCR产物特异性较高,cDNA片段的纯度较高。

③Gateway大规模克隆技术

利用λ噬菌体进行位点特异性DNA片段重组,实现了不需要传统的酶切连接过程的基因快速克隆和载体间平行转移,为大规模克隆基因组注释的可译框架提供了保障。

优点:克隆重组率高;简单快速,可自动化;保持阅读框和方向;一次实验可以转移一个或多个基因到一个或多个表达载体。

④基因的图位克隆法

适用于分离未知性状目的基因

特点:无需预先知道基因的DNA顺序,也无需预先知道其表达产物的有关信息。需要构建遗传连锁图,将目的基因定位到某个染色体的特定位点,并在其两侧确定紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记。

5.6 蛋白质组与蛋白质组学技术

(1)双向电泳技术

用于分离大量混合蛋白质组。

优点:操作方便,可自动化。

缺点:低拷贝蛋白的检测受限;难于分离极酸或极碱蛋白以及分子量极大或极小蛋白;难溶蛋白的检测较困难;技术要求较高。

(2)蛋白质印迹法

用于检测样品中是否存在蛋白抗原、基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断。

优点:高效、简便、灵敏等。

(3)蛋白质的质谱分析技术

用于鉴定不同的蛋白质,特别适合于对未知肽的检测。

优点:灵敏度高、分辨率高、需要的样品量少、快速,信息量大

缺点:实验成本高,难解决细胞组织痕量调控蛋白游离显示的问题。

各种观察法的优缺点

从资料内容、观察时间、记录方式、主要优缺点、分析程序等几方面谈谈各类方法(描述方法、取样的方法、评量和检核的方法)的不同,并从中抽取出它们的共同之处。 一、日记法 * 早期婴幼儿研究的常见策略 * 使用背景 * 可了解一般幼儿的发展问题 * 进而广泛了解或认识孩子行为 (一)优点 * 作为个案研究的纪录 * 作为婴幼儿观察的重要工具 * 提供纵贯研究的需要 (二)缺点 * 有偏见的选取对象,观察样本不具代表性 * 观察者人选受限制,观察训练不易 * 有限的样本无法作为有意义的推论 * 耗时又费力 二、样本描述法 * 为个案研究常使用的方法 * 使用背景 * 不完全针对幼儿的发展或改变所做的记录。(日记法比较重发展的意义与转变) * 针对幼儿的重要或关键行为进行更详实的观察与记录。(日记法比较描述轮廓) (一)优点 * 记载欲观察行为发生时的情景与场合 * 仔细的描述欲观察行为的细节与因果 * 能提供大量连续性的质性数据 (二)缺点 * 耗时与费力,必须转化数据 * 因为须要全神灌注的观察记录,所以容易无法兼顾教保活动

三、轶事纪录法 * 样本描述的精简版 * 使用背景 * 观察者在任意时间对任何行为的好奇与关心 * 需要样本更多、更清楚的数据,但却没有太多时间来进行样本描述(一) 优点 * 用最少的工具进行记录(纸与笔) * 只要情境适合就可以做记录

* 观察容易 (二)缺点 * 容易流于主观的数据记录 * 可能失去重要焦点 四、时间取样 * 适用于外显可观察的行为,针对短时间内出现频繁的行为进行记录,可记录行为发生的频率,及行为持续的时间。 * 记录的方式 * 时段连续观察:以一段较持久的时间(约5-20分钟)针对一个幼儿进行观察。 时距取样:取短时距(约1分钟或30秒、15秒)作为记录一次行为,在此时距内,不管行为持续的时间或出现次数,都只记一次。 (一)优点 * 所要观察的事情较能控制 * 有助于决定行为或事件发生的频率 * 短时间内可以搜集大量数据 * 省力、省时的方法 * 可以在不干涉观察对象的情况下记录 * 能提供与量有关的结果 (二)缺点 * 只能适用于发生频率较高的行为 * 研究数据比较无法告知我们行为的细节(除非运用个别代码作记录) * 不易确定许多行为间的相互关系 * 没有保持行为的完整性 * 无法得知行为发生时的环境与情境 * 预设行为标准易造成期待的心理 行为发生的顺序无法有效保存下来 五、事件取样法 * 同样为一种客观有效的观察策略,可记录发生频率低的行为。 * 对于所描述的事件能更为深入且聚焦的进行观察。 * 可了解事情发生的前、中、后等关联与过程。 (一)优点 * 观察的范围包括行为和情境。 * 可以节省很多花在搜集数据的时间 * 可以用来研究或事件发生频率低的情况 (二)缺点 * 搜集的数据不像时间取样的数据已经量化,必须花时间再去进行分析 依然是将事件与过去的状况与情境分例如:观察目标:在儿童自由活动时间内观察自发的争执事件,进行描述与记录。观察对象为3-5岁幼儿,女19人,男2 0人。观察过程是:等待争执事件发生,一发生便开始制定好观察记录时,并观察与记录事件的进行情况。

分子生物学研究方法(下)概论

第六章 分子生物学研究法(下)——基因功能研究技术

基因功能的研究思路主要包括: 1. 基因的亚细胞定位和时空表达谱; 2. 基因在转录水平的调控; 3. 细胞生化水平的功能研究:对该基因的表达产物做一个细胞信号转导通路的定位; 4. gain-of-function & loss-of-function: 分别在细胞和个体水平,做该基因的超表达和敲除,从表型分析该基因的功能。 功能研究应从完整的分子-细胞-个体三个层次研究,综合分析。

本章内容 ?基因表达研究技术 ?基因敲除技术 ?蛋白质及RNA相互作用技术?基因芯片及数据分析 ?利用酵母鉴定靶基因功能?其他分子生物学技术

6.1 基因表达研究技术 6.1.1 基因表达系列分析技术6.1.2 RNA的选择性剪接技术6.1.3 原位杂交技术 6.1.4 基因定点突变技术

6.1.1 基因表达系列分析技术 基因表达系列分析技术(serial analysis of gene expression,SAGE)是1995年由Velculescu 等建立的技术,在整体水平上对细胞或者组织中的大量转录本同时进行定量分析,而无论其是否为已知基因。 9概念: 以DNA测定为基础定量分析全基因组表达模式的技术,能直接读出任何一种细胞类型或组织的基因表达信息。

9原理: 根据理论上任何长度超过9~10(49=262144)个碱基的核苷酸片段可代表一种转录产物的特异序列(转录本),因此,选择特定的限制性内切酶分离转录产物中这些代表基因特异性9~10个碱基的核苷酸序列并制成标签,将这些序列标签连接、克隆和测序,根据其占总标签数的比例即可分析其对应编码基因的表达频率。

研究方法之观察法

课程概述 了解教育观察研究法的基本概念和特点 了解教育观察法的优缺点 了解观察法的类型 掌握教育观察研究的记录方式 教育观察研究的一般步骤 观察是人们对周围存在事物的现象和过程的认识。“观”是看,“察”是分析研究。强调“自然发生”的条件下,对观察对象不加任何干预控制。 日常观察是对自然存在的现象的随机的、自发的感知,无一定目的和计划,也不要求严格的记录。 优缺点:信息丰富但是具有自发性、偶然性和零碎性,不能系统的说明问题。 一、教育观察法概述 1.教育观察法:是教育研究者通过感官或借助一定的设备,有目的、有计划地考察学生或教育现象的一种研究方法。 教育观察法有以下三个基本特征: (1)直接性 (2)情感性 (3)重复性 教育观察法与日常观察法的区别 教育观察法虽然也通过研究者的亲身感受或体验来获得研究对象的感性材料,即以日常观察为基础,但它 (1)不是自发的、偶然性的活动,而是有目的、有计划的活动; (2)观察对象与方法不是随意的、自发的,而是经过选择与策划的; (3)是需要作严格详细的观察记录的。 因此,教育观察法是日常观察法的高级形式。 1、缺乏控制观察法的行为发生在天然环境里,在天然环境中,观察研究者往往对可能影响资料的外部变量难以控制。 2、难以用数量表示观察研究中的测量一般采取非数量表示的知觉形式,而不采用调查研究和实验法中常用的定量测量法。 3、样本数小调查研究法可以选择较大的样本,而观察研究很难选择很大的样本。研究结果容易带有片面性和偶然性 例子:孔子和颜回的故事 4、需获准进入 5、研究敏感性问题缺乏匿名性 2.教育观察法的类型 (1)自然观察法与控制观察法 自然观察法:观察研究是在自然发生的条件下,在对观察对象不加变革和控制的状态下进行的,如实地观察法,这种观察法称为自然观察法。

分子生物学地研究及发展

分子生物学的应用及发展 摘要:本文在文献检索的基础上,对分子生物学的发展简史,基本原理,研究领域等作了简单介绍,阐述了分子生物学在人们日常生活中的应用并结合药学专业着重讨论了其在药学及中药开发发面的应用,并进一步对分子生物学未来的研究技术、方向和前景做了展望。 一前言 生物以能够复制自己而区别于非生物。生命现象最基本的特征是进行“自我更新”。进行“自我更新”体现了一种最高级和最复杂的运动状态。这种运动就是生物机体从环境中摄取物质和能量,以更新本身的物质组成,而山现生长、繁殖,在这样的过程中保证了将自身的特征传给历代;同时也不断地向环境输送一些物质和释放能量。在生物机体的组成物质中,防水分外,有各种无机盐类和各种有机化合物。其中生物大分子——核酸和蛋白质在进行自我更新运动中,以其功能的重要性占第一位。为探索生命现象的本质问题,产生了分子生物学这一学科[1]。 分子生物学(molecular biology)是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科,它是研究核酸、蛋白质等生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学,是当前生命科学中发展最快并正在与其它学科广泛交叉与渗透的重要前沿领域[2]。 分子生物学的最终目标是远大的,从产生基本细胞行为类型的各种分子的角度,来理解这五类行为类型:生长、分裂、分化、运动和相互作用。即分子生物学力图完整地描述细胞大分子的结构、功能和相互联系,从而理解细胞为什么要采取这种方式[3]。 分子生物学作为一门新兴的边缘学科。它的迅速发展及其在整个生命科学领域的广泛渗透和应用,促使人们对生物学等生命科学的认识从细胞水平进入分子水平。在农业、畜牧、林业、微生物学等领域发展十分迅速,如转基因动植物等。在医学领域,为医学诊断、治疗及新的疫苗、新药物研制等开辟了新的途径,使医学科学中原有的学科发生分化组合,医学分子生物学等新的学科分支不断产生,使医学科学发生了深刻的变革,不认识到这一点就很难跟上科学发展的步伐。 分子生物学的发展为人类认识生命现象带来了前所未有的机会,也为人类利用和改造生物创造了极为广阔的前景。 二分子生物学发展简史 分子生物学的发展大致可分为三个阶段[4-7]:

观察法相关知识点

观察法 一、观察法的定义 观察法是指研究者根据一定的研究目的、研究提纲或观察表,用自己的感官和辅助工具去直接观察被研究对象,从而获得资料的一种方法。科学的观察具有目的性和计划性、系统性和可重复性。观察一般利用眼睛、耳朵等感觉器官去感知观察对象。由于人的感觉器官具有一定的局限性,观察者往往要借助各种现代化的仪器和手段,如照相机、录音机、显微录像机等来辅助观察。 二、观察法的优缺点 (一)观察法的主要优点是: 1.它能通过观察直接获得资料,不需其他中间环节。因此,观察的资料比较真实。 2.在自然状态下的观察,能获得生动的资料。 3.观察具有及时性的优点,它能捕捉到正在发生的现象。 4.观察能搜集到一些无法言表的材料。 (二)观察法的主要缺点是: 1.受时间的限制,某些事件的发生是有一定时间限制的,过了这段时间就不会再发生。 2.受观察对象限制。如研究青少年犯罪问题,有些秘密团伙一般不会让别人观察的。 3.受观察者本身限制。一方面人的感官都有生理限制,超出这个限度就很难直接观察。另一方面,观察结果也会受到主观意识的影响。 4.观察者只能观察外表现象和某些物质结构,不能直接观察到事物的本质和人们的思想意识。 5.观察法不适应于大面积调查。 三、观察法的要求、原则及实用 (一)要求 1.养成观察习惯,形成观察的灵敏性;集中精力勤奋、全面、多角度进行;观察与思考相结合。 2.制定好观察提纲。观察提纲因只供观察者使用,应力求简便,只需列出观

察内容、起止时间、观察地点和观察对象即可。为使用方便还可以制成观察表或卡片。 3.按计划(提纲)实行观察,作好详细记录,最后整理、分析、概括观察结果,作出结论。 (二)使用原则 1.全方位原则在运用观察法进行社会调查时,应尽量以多方面、多角度、不同层次进行观察,搜集资料。 2.求实原则观察者必须注意下列要求。 第一,密切注意各种细节,详细做好观察记录 第二,确定范围,不遗漏偶然事件 第三,积极开动脑筋,加强与理论的联系 3.必须遵守法律和道德原则。 (三)使用范围 观察法可以在以下情况下使用: 1.对研究对象无法进行控制。 2.在控制条件下,可能影响某种行为的出现。 3.由于社会道德的需求,不能对某种现象进行控制。 为避免主观臆测和偏颇应遵循以下四条: 1.每次只观察一种行为。 2.所观察的行为特征应事先有明确的说明。 3.观察时要善于捕捉和记录。 4. 采取时间取样的方式进行观察。 四、观察法的分类 (一)按观察的情景条件,可分为自然观察和控制观察 1.自然观察也称现场观察,通常采用纸和笔对偶然现象或系统现象作描述性的记录和分析。 2.控制观察又称实验室观察或条件观察。通常要求观察程序标准化,观察问题结构化。 (二)按是否借助仪器和技术手段,可分为直接观察和间接观察

观察法案例及分析

观察法案例及分析 小学教育张颖 案例一:帕顿(Parten)关于“儿童游戏的研究”——时间取样法1926年10月——1927年6月,观察了2岁至5岁儿童在游戏中的社会参与性行为,设计了6种反映儿童参与社会性集体活动水平的预定类型指导观察,并赋予操作定义(表1),设计了时间取样表(表2)和观察记录表(表3)表1 表2 时间取样记录表

表3 儿童社会性活动观察记录表 1 2 3 4 …… 游戏类型 儿童代号联合合作 无所事事旁观单独平行 分析:这是一个典型的时间取样法的运用,通过观察记录可以得到儿童在一段的时间段内随着时间的推移他们行为发生的变化。 优缺点:较之描述法,时间取样法由于赋予了操作定义,可以克服观察者一定的主观看法,也比较省时省力;但是在观察之前需要大量的准备,也可能只得到表面现场无法知道深层原因。这个观察实验中如果给操作定义用符号来代替的话,可能记录时更加方便及时。 对教师来说,这种观察方法的运用可以帮助我们更好的了解学生的学习规律和心理发展的状态,从而对教学进行适当的调整。

案例二:达维(Helen C.Dawe)关于“儿童争持事件的研究”——事件取样法达维(Helen C.Dawe)对学前儿童的200例争执事件的研究分析,是在自然情景中运用事件取样技术的经典研究。这项研究是在幼儿园的自由时间里,对儿童的自发发生的争执事件做了观察描述。观察者对25个月至60个月的40名观察对象(女19人,男21人)进行了58小时的观察,记录争执事件200例,平均每小时3-4次。 主要观察内容 ①争执者的姓名、年龄、性别; ②争执持续的时间; ③争执发生的背景、起因; ④争执什么(玩具、领导权等); ⑤争执者把扮演的角色(侵犯者、报复者、反抗者、被动接受者等); ⑥争执时的特殊言语或动作; ⑦结局如何(被迫让步、自愿让步、和解、由其他儿童干预解决、由教师干预解决等); ⑧后果与影响(高兴、忿恨、不满等)。 经过三个多月58小时的观察,共记录争执事件200例。 观察结果 ①68例发生于室外,132例发生于室内; ②平均每小时发生争执事件3.4次; ③争执时间持续1分钟以上的只有13例;

第四章 观察法

第四章观察法 第三节观察的类型(p70) 本章说明了观察法的概念、特点及基本原则,介绍了观察法的几种主要类型,讲述了观察法准备阶段、实施阶段和记录阶段的内容及方法,指出了观察误差产生的原因及纠正方法,并对观察法的优缺点做了简要的评价。其中重点和难点是掌握观察法的类型、实施时需要注意的问题以及观察误差产生的原因等。 前课复习: 第一节和第二节的简单回顾 观察法的涵义,观察法在学前教育研究方法中的地位,观察法的基本原则等。 观察法(Observation methods)是指研究者通过眼睛、耳朵等感官或辅助仪器,有目的、有计划地对人、物体或事件进行系统感知观察并记录、分析有关感性资料的一种科学研究方法。 观察法是学前教育研究的最基本方法,在学前教育研究中应用最普遍,并且对于作为学前教育研究对象的幼儿而言,也是较适宜的方法。 运用观察法要遵循的原则: 观察要有严密的组织计划,观察要有一定地知识准备,观察记录要系统、准确,正式观察之前要先进行预观察。 讲授新课: 从不同的角度,研究者们将观察法划分为不同的类型。 1、直接观察与间接观察(根据观察的对象不同) 直接观察:是指对当前所发生的事或人的行为的直接观察和记录。

间接观察:是通过对实物的观察,来追溯和了解过去的社会情况和过去所发生过的事情。实物是指反映过去社会现象的各种物质载体,例如写实性绘画、古迹或遗址、各种腐蚀性或积累性物质痕迹,以及反映一定社会现象的物体或环境等。 例如观察一定时期内幼儿园阅览室中哪些书籍磨损严重,由此看出这一时期幼儿的阅读倾向; 间接观察法比较复杂,需要观察者有较强的分析能力,有时还需要有科学的鉴定手段和方法,而且在推论时也可能发生种种误差。在学前教育研究中间接观察法应用很少。 2、自然观察与实验室观察(根据观察的情景与条件的不同) 自然观察是在一般的日常现实生活场景中,观察行为或事件的自然发生与进程。 简单举例说明: 在幼儿园中观察一个班幼儿的一日活动,可以从幼儿入园至午睡或从下午起床至离园作观察。又比如在幼儿自由游戏时间观察幼儿的相互交往行为。 实验室观察是在实验室有控制的条件下的观察,需要设置特定的情景,观察特定条件下的特定行为。

分子生物学研究方法2013

分子生物学研究方法——其他分子生物学研究方法 李崇奇

1.凝胶滞缓实验 ●凝胶滞缓实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA);又叫作DNA迁移率变动试验(DNA mobility shift assay);又叫做凝胶阻滞实验(Gel retardation assay)是用于体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。 ●它具有简单、快捷等优点,也是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质的一种典型的实验方法。

应用 This procedure can determine if a protein or mixture of proteins is capable of binding to a given DNA or RNA sequence, and can sometimes indicate if more than one protein molecule is involved in the binding complex. Gel shift assays are often performed in vitro concurrently with DNase footprinting, primer extension, and promoter-probe experiments when studying transcription initiation, DNA replication, DNA repair or RNA processing and maturation.

文案调查法、观察法、访问法、实验法的含义、优缺点、适用范围

一、文案调查法、观察法、访问法、实验法的含义、优缺点、适用范围 (1)文案调查法: 含义:文案调研法是指利用企业内部和外部现有的各种信息、情报资料,对调查问题进行研究的调查方法,也称间接调查法、室内调查法、桌面调查法、二手资料法等。 优点:成本低,资料比较容易找到,所需时间短,不受时空限制。 缺点:1、较多依赖历史资料,难以反映正在发生的新情况、新问题。 2、收集的资料与调查目的往往不能很好地吻合,数据对所要解决的问题不能完全适用。 3、难以把握所收集资料的准确性。 4、要求调查人员具有较广泛的理论知识、较深厚的专业知识和技能,否则将无法很好把握和利用所收集的资料。 适用范围:常规性的行业报告、帮助确定新产品的目标用户群、针对高端用户的奢侈品消费市场调查、在做大型的实地调查之前的辅助调查 (2)访问法: 含义:通过询问(语言或文字交流)的方式向调查者了解有关情况的方法。 (一)面谈调查的1、优点2、缺点 1)准确率高;1)调查费用支出较高; 2)成功率高;2)现场访谈质量的监督和控制较难; 3)答案质量高。3)对调查员的素质要求较高。 (二)电话调查 1、电话调查的优点 2.缺点:1)需要掌握电话号码。 1)通常问题简单,容易回答。2)拒访率较高。 2)调查的地域范围广。3)无法询问一些比较专业和复杂的问题。3)调查消费支出少。 4)被调查者没有现场心理压力,能轻松进行回答。 (三)邮寄调查 邮寄调查的优点:1)调查的区域广。2)费用支出少。3)可以询问较为敏感和复杂的问题,问题数可多一点。4)答案不受调查人员态度和倾向性意见的影响。 缺点:1)回收率低;2)回收问卷时间长;3)对答案的可靠性较难判断。 (四)网络调查 网络调查的优点:1)调查受时空限制少。2)便于快速收集资料。3)成本低。4)便于提供音像资料。 缺点:1)样本的选择不易控制。2)较难吸引被调查者参与。3)难以判断信息的真实性。适用范围:1,事实访问;2,意见访问;3,解释访问 (3)观察法: 含义:调查者在调查现场对要调查的人或物用感官或仪器进行跟踪记录,以获取被观察对象信息资料的。观察的结果通常是客观真实的。 优点:1、直观,真实性强。2、没有回答偏差3、调查实施简单、容易操作 缺点:1、无法观察行为的原因和所有内在因素 2、调查的时间较长,成本高 3、对调查人员的素质要求较高 适用范围:1、商店顾客购物行为观察 2、消费行为观察

(完整版)分子生物学习题与答案

第0章绪论 一、名词解释 1.分子生物学 2.单克隆抗体 二、填空 1.分子生物学的研究内容主要包含()、()、()三部分。 三、是非题 1、20世纪60年代,Nirenberg建立了大肠杆菌无细胞蛋白合成体系。研究结果发现poly(U)指导了多聚苯丙氨酸的合成,poly(G)指导甘氨酸的合成。(×) 四、简答题 1. 分子生物学的概念是什么? 2. 你对现代分子生物学的含义和包括的研究范围是怎么理解的? 3. 分子生物学研究内容有哪些方面? 4. 分子生物学发展前景如何? 5. 人类基因组计划完成的社会意义和科学意义是什么? 6.简述分子生物学发展史中的三大理论发现和三大技术发明。 7. 简述分子生物学的发展历程。 8. 二十一世纪生物学的新热点及领域是什么? 9. 21世纪是生命科学的世纪。20世纪后叶分子生物学的突破性成就,使生命科学在自然科学中的位置起了革命性的变化。试阐述分子生物学研究领域的三大基本原则,三大支撑学科和研究的三大主要领域? 答案: 一、名词解释 1.分子生物学:分子生物学就是研究生物大分子之间相互关系和作用的一门学科,而生物大分子主要是指基因和蛋白质两大类;分子生物学以遗传学、生物化学、细胞生物学等学科为基础,从分子水平上对生物体的多种生命现象进行研究。

2.单克隆抗体:只针对单一抗原决定簇起作用的抗体。 二、填空 1.结构分子生物学,基因表达与调控,DNA重组技术 三、是非题 四、简答题 1. 分子生物学的概念是什么? 答案: 有人把它定义得很广:从分子的形式来研究生物现象的学科。但是这个定义使分子生物学难以和生物化学区分开来。另一个定义要严格一些,因此更加有用:从分子水平来研究基因结构和功能。从分子角度来解释基因的结构和活性是本书的主要内容。 2. 你对现代分子生物学的含义和包括的研究范围是怎么理解的? 分子生物学是从分子水平研究生命本质的一门新兴边缘学科,它以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究对象,是当前生命科学中发展最快并正在与其它学科广泛交叉与渗透的重要前沿领域。狭义:偏重于核酸的分子生物学,主要研究基因或DNA的复制、转录、表达和调节控制等过程,其中也涉及与这些过程有关的蛋白质和酶的结构与功能的研究。分子生物学的发展为人类认识生命现象带来了前所未有的机会,也为人类利用和改造生物创造了极为广阔的前景。所谓在分子水平上研究生命的本质主要是指对遗传、生殖、生长和发育等生命基本特征的分子机理的阐明,从而为利用和改造生物奠定理论基础和提供新的手段。这里的分子水平指的是那些携带遗传信息的核酸和在遗传信息传递及细胞内、细胞间通讯过程中发挥着重要作用的蛋白质等生物大分子。这些生物大分子均具有较大的分子量,由简单的小分子核苷酸或氨基酸排列组合以蕴藏各种信息,并且具有复杂的空间结构以形成精确的相互作用系统,由此构成生物的多样化和生物个体精确的生长发育和代谢调节控制系统。阐明这些复杂的结构及结构与功能的关系是分子生物学的主要任务。 3. 分子生物学主要包含以下三部分研究内容:A.核酸的分子生物学,核酸的分子生物学研究核酸的结构及其功能。由于核酸的主要作用是携带和传递遗传信息,因此分子遗传学(moleculargenetics)是其主要组成部分。由于50年代以来

观察分析法

观察分析法 所谓观察分析法,一般是由有经验的人,通过直接观察的方法,记录某一时期内工作的内容、形式和方法。并在此基础上分析有关的工作要素,达到分析目的的一种活动。 观察的形式、有公开性观察与隐蔽性观察,他人观察与自我观察等不同形式。(1)直接观察法:工作分析人员直接对员工工作的全过程进行观察。(如餐厅服务员的工作过程) (2)阶段观察法:为完整观察到一些周期性较长的工作,采用分段进行观察的方式。(如观察行政人员年底筹备年终总结工作经验) (3)工作表演法:工作分析人员对某些工作周期很长、突发事件较多的的工作,让员工进行该工作的表演,从中进行观察的方式。(如保安人员盘问可疑人员)二、工作观察法的适用范围和使用原则 (1)适用范围 1.观察法对那些程序化较强的,较多通过身体动作完成的工作更适合。 2.适用的工作类型:门卫、流水线上的作业工人、警察、前台服务员等 3.不太适用的工作:脑力活动(律师、设计工程师、科学家);突发或偶发事件(急救护士等) 4.直接观察法与访谈法结合,口语报告(厨师、蛋糕师)。 (2)观察法的使用原则 观察员的工作应该相对稳定,即在一定的时间内,工作内容、程序、对工作人员的要求不会发生明显的变化; 适用于大量标准化的、周期较短的以体力活动为主的工作,不适用于脑力劳动为主的工作; 要注意工作行为为样本的代表性,有时,有些行为在观察过程中可能未表现出来;观察人员尽可能不要引起被观察者的注意,不应干扰观察者的工作; 观察前要有详细的观察提纲和行为标准。 观察法优缺点 优点:非常适用于那些常规性和重复性的工作,如流水线工人。通过实际观察整个工作过程,对工作任务、工作程序、工作方法、工作环境等有了相对直观和客观的了解。另外,利用观察法还可以测定任务的实际完成时间,对作业过程进行动态分析。 缺点:对于包含有思维性活动的复杂工作,以及工作内容、工作方式经常发生变化的工作来说,观察法就不适用。另外,观察法往往不是从工作任务本身和需求出发收集信息,而是受任职人员工作和能力现状影响较大,在观察状态下被观察者表现出来的行为往往不是其常态行为,影响了信息的准确性。 工作者自我记录法(写实分析法)——这种方法是观察者与被观察者合二为一的的方法 员工记录法优缺点:该方法省时方便,但是使用范围较小;任职者有时夸大工作任务,影响信息准确性。 主管人员分析法 这种方法是由主管人员通过日常的管理权力来记录与分析所管辖人员的工作任务、责任与要求等因素。

各种工作分析方法的优缺点及使用范围比较表

各种工作分析方法的优缺点及使用范围比较表 方法优点缺点试用情况 访谈法简单、有效;访谈的过程是一个双向沟 通的过程,具有灵活性和参与性;不仅 能了解到工作本身的信息,还能了解到 工作者的工作态度与工作动机等深层 次的内容;有助于员工了解工作分析目 的,消除抵触情绪 访谈花费大量时间和精力,成本 很高;访谈法需要工作分析人员 具有专门的技巧,需要经过培 训;员工可能由于不了解工作分 析的真正目的而故意隐瞒或歪 曲信息 适合于工作样本数量少时使 用;常用于收集工作描述、工 作分类、工作范围、工作所需 要能力、知识和技能等方面内 容的信息 问卷调查法规范化、数量化;调查范围广;速度快、 能在较短时间内收集到大量信息 问卷设计成本较高;被调查者在 填写调查表时单独进行,缺乏沟 通和交流;信息真实性可能会受 影响 问卷调查法之一用于工作范 围、职务任职资格等方面的信 息 资料分析法成本低;工作效率高;能为进一步工作 分析提供基础资料、信息 缺乏灵活性;一般收集到的信息 不够全面,尤其是小型企业或管 理落后的企业,往往无法收集到 有效、及时的信息 适用于比较常见、正规且有一 定历史的工作;一般不能单独 使用,要与其他工作分析法结 合使用 观察法客观性和可信度较高;更全面、更深入 地了解工作的要求会影响员工的行为;员工在主观 上可能调整自身工作节奏,工作 顺序等,影响信息的真实性;不 能获得任职者资格的相关信息 用于收集工作内容、工作环境、 体力要求等相关信息;适用于 以体力劳动为主的工作周期 短、有标准化工序的工作;不 适用于脑力劳动为主的、工作 周期长且主观性强的工作 工作日志发经济,花费少;日志记录提供了详细具 体的工作内容和过程,信息遗漏少,可 靠性高 监控不力会造成填写信息不够 详细;流水式的记录使得信息凌 乱繁杂,整理工作量大;任职者 可能会不按照要求时间填写,会 造成信息不完整 适用于确定有关工作职责、工 作内容、工作关系、劳动强度 等方面的信息;适用范围局限 于周期较短、状态稳定、复杂 琐碎的工作 职位分析问卷 法(PAQ)便于工作之间的比较,并据此制定出薪 酬等级;不需要修改就可用于不同组 织,不同工作 问卷的设计时间成本高;填写人 员要接受专门的培训以帮助他 们准确理解和填写问卷;描述因 素重要程度的尺度之间刻画不 清楚,阅读能力差的人不适用 适用范围较广 管理职位描述问卷法(MPD Q)能将数据信息转化为信息报告和表格, 信息充足、简单易懂;能运用于人力资 源的其他职能领域 成本比较高;投入比较大针对管理层的工作分析 职能工作分析法(FJA)详细分析工作任务要求,能全面具体地 描述工作内容;能对工作进行分类和等 级划分,为确定工作的报酬等级和培训 内容提供依据 需要对每项任务做详细分析,消 耗大量精力和时间 适用于对目标职位的功能性要 素分析

工作分析的方法及优缺点

工作分析的方法及优缺点 一般而言,工作分析的方法可以分为职务定向方法与行为定向方法。前者相对静态地描述与分析职务的特征,收集各种有关“工作描述”一类的材料;后者集中于与“工作要求”相适应的工作行为,属于相对动态的分析。关键事件法就就是一种常用的行为定向方法。这种方法要求管理人员、员工以及其她熟悉工作职务的人员记录工作行为中的“关键事件”——使工作成功或者失败的行为特征或事件。 在大量收集关键事件以后,可以对它们作出分析,并总结出职务的关 键特征与行为要求。关键事件法既能获得有关职务的静态信息,也可以了解职务的动态特。主要方法如下: 一、访谈分析法 访谈法又称面谈法,就是一种应用最为广泛的职务分析方法。就是指工作分析人员就某一职务或职位面对面地询问任职者、主管、专家等人对工作的意见与瞧法。在一般情况下,应用访谈法时可以以标准化方谈格式记录,目的就是便于控制访谈内容及对同一职务不同任职者的回答相互比较。 1、访谈法的优点: ①可以结合工作者的工作态度与工作动机等较深层次的内容有比较 详细的了解; ②运用面广,能够简单而迅速地收集多方面的工作资料; ③使工作分析人员了解到短期内直接观察法不容易发现的情况,有助于管理者发现问题; ④为任职者解释工作分析的必要性及功能; ⑤有助于与员工沟通,缓解工作压力。 2、访谈法的缺点: ①访谈法要专门的技巧,需要受过专门训练的工作分析专业人员; ②比较费精力费时间,工作成本较高; ③收集的信息往往已经扭曲与失真; ④访谈法易被员工认为就是其工作业绩考核或薪酬调整的依据,所以她们会故意夸大或弱化某些职责。 3、工作分析的访谈内容: 访谈法广泛运用于以确定工作任务与责任为目的的情况。访谈的内容主要就是得到任职者四个方面的信息: ①工作目标:组织为什么设置这个工作岗位,并根据什么给予报偿。 ②工作的范围与性质(面谈的内容):工作在组织中的关系,所需的一 般技术知识、管理知识与人际关系知识,需要解决问题的性质及自主权,工作在多大范围内进行,员工行为的最终结果如何度量。 ③工作内容:任职者在组织中发挥多大作用,其行动对组织的影响有 多大。 ④工作的责任:涉及组织战略决策、执行等方面的情况,另外需注意访谈的典型提问方式。 二、问卷调查分析法 问卷调查法就是工作分析中最常用的一种方法,具体来说,由有关人 员事先设计出一套职务分析的问卷,再由随后工作的员工来填写问卷,也可由工作分析人员填写,最后再将问卷加以归纳分析,做好详细记录,并据此写出

第九章观察法

第九章观察法 通过学习本章,主要了解观察法的概念、基本特征及其优点和局限,了解影响观察的信度与效度的因素,提高观察的信度与效度的方法;熟悉观察实施的主要阶段和每个阶段的工作要点。 第一节观察法概述 一、观察法的概念和特征 1.观察法的概念 观察是科学研究的最基本的方法之一,无论自然科学还是社会科学都是如此。 社会科学研究中的观察法就是研究者根据研究课题的需要,利用眼睛、耳朵等感觉器官和其他辅肋观察设备,有目的地对研究对象进行考察,以取得研究所需要的第一手资料的一种方法。 2.观察法的特征 观察具有二重性,它既是日常生活中人们感知周围世界、认识客观事物的最基本的途径,也是科学研究者探究研究对象,从研究对象那里获取研究所需原始资料的重要手段,为了区别,将前者称为日常观察,将后者称为科学观察。社会研究中的观察法就是一种科学的观察,将后者称为科学观察。 (简述科学观察的一般特征)与日常观察相比,科学观察一般具有如下特征: (1)在观察之前先具有一定的研究目的或假设,然后根据研究需要有目的地通过观察获取资料; (2)需要有系统的观察设计; (3)有系统完整的记录; (4)观察过程应避免主观和偏见; (5)观察的过程和获得的资料可以重复查证。 许多社会科学家经常对观察法有一种不正确的看法,认为观察研究的结果不适于量化,这其实是一种历史的偏见。 二、观察法的优缺点 (试述观察法的优缺点) 1.观察法的优点 具有三大优点: 第一,观察法可以实时地观察到社会现象或行为的发生。 第二,能够得到不能直接进行访问调查或不便于进行访问调查的对象的资料。 第三,通过一些特殊的设备或特殊的方式,观察者可以在不干扰被观察者的情况下,获取最真实的资料,这是其他方法都不能做到的。 2.观察法的缺点 观察法也有其自身无法克服的缺点。这些缺点常常是和他的优点相对应的。 第一,观察法可获取最生动真实的资料,但真正碰到要观察的事件有时候是可遇而不可求的。 第二,人类社会中有许多现象是不适宜或不可能直接观察的,特别是涉及人的隐私行为,如夫妻间的吵架或亲密行动. 第三,研究事物或现象在长时间内发展变化的历程或趋势,观察法具有很大的局限性。 第四,当意识到有观察者在场时很可能会改变被观察者的行为,使其表现与没有观察者在场时有所不同,因此研究者由观察所提到的资料可能会在一定程度上被扭曲。

分子生物学研究法

第五章分子生物学研究法(上)------DNA、RNA及蛋白质操作技术 1、哪些重要的科学发现和实验推动了DNA重组技术的生产和发展? 三大成就:a、在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者,即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质,解决了遗传的物质基础问题;b、50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题;c、50年代末至60年代,相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功的破译了遗传密码,阐明了遗传信息的流动与表达机制。 2、如何理解PCR扩增的原理和过程? PCR (Polymerase Chain Reaction) 是体外高效复制DNA的技术,该技术几乎贯穿于现在分子生物学的各个领域。PCR体系由模板,特异性引物,高温聚合酶,脱氧核糖核酸几部分组成。反应过程分模板高温变性(Denaturation),引物与模板低温退火(Annealing),引物在高温聚合酶的作用下延伸(Extention),在一定的条件下,退火和延伸可以合二为一。 3、简述定量PCR的原理和过程。 原理:1;在含有插入性染料或特异性探针的体系中扩增目标序列. 2 光学系统激发并检测报告荧光 3 报告荧光的强度与所扩增DNA的量呈比例关系 反应过程分模板高温变性(Denaturation),引物与模板低温退火(Annealing),引物在高温聚合酶的作用下延伸(Extention),在一定的条件下,退火和延伸可以合二为一。 4、基因组DNA文库和cDNA文库在构建原理和用途上的主要区别是什么? 基因组DNA文库含有一种生物的全部基因,从基因组文库中获得的基因是完整的,cDNA文库含有一种生物的部分基因,cDNA本质就是外显子,基因组文库大,其中基因含有启动子和内含子,cDNA文库小,没有内含子和启动子 5、基因克隆的方法主要有哪几种?简述各种方法的原理和用途。 6、在基因操作实践中有哪些检测核酸和蛋白质相对分子质量的方法? 电泳,核酸通过琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳,蛋白质通过SDS-PAGE 7、蛋白质组学的研究对象和目的是什么?主要有哪些技术和方法? 8、SNP作为第三代遗传标记的优点是什么? 9、基因分型的方法有哪些?简述其原理。 10、已知一个cDNA3'端的部分序列,请设计实验流程得到该基因的全长cDNA。

复习资料 第九章 观察法

第九章观察法 第一节观察法概述 1.观察法的概念 观察是科学研究的最基本方法之一。英国社会学家C.A.摩瑟说“观察可称为科学研究的第一等方法”。 社会科学研究中的观察法就是研究者根据研究课题的需要,利用眼睛、耳朵等感觉器官和其他辅助观察设备,有目的地对研究对象进行考察,以取得研究所需要的第一手资料的一种方法。 2.观察法的特征 观察具有二重性,它既是日常生活中人们感知周围世界、认识客观事物的最基本途径,也是科学研究者探究研究对象,从研究对象那里获取研究所需原始资料的重要手段,为了区别,将前者称为日常观察,将后者称为科学观察。社会研究中的观察法就是一种科学的观察。科学观察一般具有5个特征: (1)在观察之前先具有一定的研究目的或假设,然后根据研究需要有目的地通过观察获取资料; (2)需要有系统的观察设计; (3)有系统完整的记录; (4)观察过程应避免主观和偏见; (5)观察的过程和获得的资料可以重复查证。 二、观察法的优缺点: (一)观察法的优点: (1)观察法可以实时地观察到社会现象或行为的产生; (2)能够得到不能直接进行访问调查或不便于进行访问调查的对象的资料;婴儿、精神异常者的行为就不能通过访问调查所得到。 (3)通过一些特殊的设备(如单面透视镜)或特殊的方式(如观察者也是被观察者中的一员),观察者可以在不干扰被观察者的情况下,获取最真实的资料。 (二)观察法的缺点: (1)第一,观察法可获取最生动真实的资料,但真正碰到要观察的事件有时候是可遇不可求的; (2)第二,人类社会中有许多现象是不适宜或不可能直接观察的,特别是涉及人的隐私行为,如夫妻吵架或者亲密行为。 (3)第三,研究事物或现象在长时间内发展变化的历程或趋势,观察法具有很大的局限性;(一个人的成长史、文化变迁)。 (4)第四,当意识到有观察者在场时很可能会改变被观察者的行为,使其表现与没有观察者在场时有所不同,得到的资料可能会在一定程度上被扭曲。 第二节观察法的基本类型 一、实验室观察和实地观察 根据观察场所和对观察的情景与条件的控制程度的不同,观察法可分为实验室观察和实地观察。 1.试验室观察 实验室观察是在实验室中进行的,在对观察的情景与条件进行严格控制的前提下,对研究对象进行观察并记录观察结果的一种研究方法。 试验室观察的一个很好的例子,是班杜拉等人进行的有关模仿学习的研究。 实验室观察兼具观察法和实验法的优点和缺点: (一)优点: (1)实验室观察具有科学研究所要求的精确、客观和可重复验证性,可以用来研究和发现事物之间的因果关系; (2)可以用来收集研究对象的自然发生的行为的最真实、完整、全面的资料。 (二)缺点和局限:

常用的分子生物学基本技术

常用的分子生物学基本技术?核酸分子杂交技术 ?由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性,它已成为分子生物学中最常用的基本技术,被广泛应用于基因克隆的筛选,酶切图谱的制作,基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下(适宜的温室度及离子强度等)可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针(probe),待测核酸序列可以是克隆的基因征段,也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的,能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。? 固相杂交 ?固相杂交(solid-phase hybridization)是将变性的DNA固定于固体基质(硝酸纤维素膜或尼龙滤膜)上,再与探针进行杂交,故也称为膜上印迹杂交。? 斑步杂交(dot hybridization)??是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的DNA或RNA探针进行杂交。该法的特点是操作简单,事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永分离核酸样品,可在同一张膜上同时进行多个样品的检测;根据斑点杂并的结果,可以推算出杂交阳性的拷贝数。该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量,而且特异性较差,有一定比例的假阳性。 印迹杂交(blotting hybridization) ?Southern印迹杂交:凝胶电离经限制性内切酶消化的DNA片段,将凝胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上,经干烤固定,再与相对应结构的已标记的探针进行那时交反应,用放射性自显影或酶反应显色,检测特定大小分子的含量。可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性长度多态性分析(RELP)等。 ?Northern印迹杂交:由Southerm印杂交法演变而来,其被测样品是RNA。经甲醛或聚乙二醛变性及电泳分离后,转移到固相支持物上,进行杂交反应,以鉴定基中特定mRNA分子的量与大小。该法是研究基因表达常用的方法,可推臬出癌基因的表达程度。? 差异杂交(differential hybridization) ?是将基因组文库的重组噬菌体DNA转移至硝酸纤维素膜上,用两种混合的不同cDNA探针(如:转移性和非转移性癌组织的mRNA逆转录后的cDNA)分别与滤膜上的DNA杂交,分析两张滤膜上对应位置杂交信息以分离差异表达的基因。适用于基因组不太复杂的真核生物(如酵母)表达基因的比较,假阳性率较低。但对基因组非常复杂的盐酸核生物(如人),则因工作量太大,表达的序列所占百分比较低(仅5%左右),价值不大。 ?cDNA微点隈杂交(cDNAmicroarray hybridization)? 是指将cDNA克隆或cDNA的PCR产物以高度的列阵形式排布并结合于固相支持物上(如:尼龙膜或活化的载玻片)以微点阵,然后用混合的不同DNA探针与微点阵上的DNA进行杂交。再利用荧光、化学发光、共聚焦显微镜等技术扫描微点阵上的杂交信息。它比差异杂交技术的效率高、速度快、成本低,适用于大规模的分析。已成商品问世。其缺点是无法克服保守的同源序列及重序对杂交信息的干扰。??寡核苷酸微点隈杂交(oligonucleotidemicroarrayhybridization)? 是在特殊的固相支持物上原位合成寡核苷酸,使它共价结合于支持物表面,与平均长度为20-50nt的混合RNA或cDNA探针进行杂交,以提高杂交的特异性和灵敏度。应用共聚焦显微镜可检测跨越三个数量级的杂交信息。适用于低丰度mRNA的检测,以区分基因家族不同成员的差异表达特征,或鉴定同一转录在不同组织和细胞中的选择性剪接。但有工作量较大、

第八章 观察法

第八章观察法讲课稿 本章说明了观察法的概念、特点及基本原则,介绍了观察法的几种主要类型,讲述了观察法准备阶段、实施阶段和记录阶段的内容及方法,指出了观察误差产生的原因及纠正方法,并对观察法的优缺点做了简要的评价。其中重点和难点是掌握观察法的类型、实施时需要注意的问题以及观察误差产生的原因等。 一、观察法的概念及类型 观察法也叫实地观察法,是观察者有目的、有计划地运用自己的感觉器官和辅助工具,能动地了解处于自然状态下的社会客观现象的方法。它的主要作用就在于收集到真实可靠的资料,并通过对资料的科学分析得出正确的结论。它通常用于在实地调查中收集社会初级信息或原始资料,而且通常结合其他调查方法共同使用。 从不同的角度,可以将观察法划分为不同的类型。根据观察程序的不同,观察法可分为结构式观察和非结构式观察两大类;根据观察场所的不同,观察法可分为实验室观察和实地观察两大类;根据观察者的角色不同,观察法可分为非参与观察和参与观察两大类;根据观察对象的不同,观察法可分为直接观察和间接观察两大类。 1.结构式观察和非结构式观察 根据观察程序的不同,观察法可分为结构式观察和非结构式观察两大类。 结构式观察也称有结构观察、有控制观察或系统观察,是根据事先设计好的观察项目和要求进行观察的类型。在实际观察过程中,要严格按照设计要求进行观察,并作详细的观察记录。结构式观察有些类似于问卷调查,对观测数据的整理、分析也近似于对问卷资料的处理分析,即可进行定量分析和相关分析。但它缺乏弹性,而且比较费时。 2.非结构式观察。非结构式观察也称无结构观察、无控制观察或简单观察,是没有先期具体设计要求的观察类型。它一般只要求观察者有一个总的观察目的和要求,或一个大致的观察内容和范围,但是并没有很明确的研究假设和具体的观察内容与要求。也不是仅专注于某些特定的行为与现象,而是到观察现场去根据当时环境和条件变化随时进行观察内容和观察角度的调整。无结构观察比较灵活,适应性较强,而且简便易行,因此最为常用。但非结构式观察所得的材料分散在许多方面,也没有制定适于量化的观察结构,故无法进行定量分析和严格的对比研究。它主要用于对观察对象的定性分析。 2.实验室观察与实地观察 根据观察场所的不同,观察法可分为实验室观察和实地观察两大类。 1.实验室观察。它是指在有各种观察设施的实验室或者经过一定布置的活动室、会议室等场所内,对研究对象进行观察的方法。它常常用于了解人们某些具体的、细微的行为特征。在这种实验室观察中,核心的问题是不能让观察对象知道被人“监视”,否则会影响观察的真实性,所以一般是借助一种单向透镜来进行观察,里面的人看到的可能是一块不透明的黑板,而外面的人却可以对里面一览无余。 2.实地观察。它是指在现实社会生活场景中所进行的观察。它与实验室观察相比,

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