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菌体液体培养

Bioresource Technology 98 (2007) 165–168

doi:10.1016/j.biortech.2005.11.007

Abstract

The molecular weight of exo-biopolymer obtained from a submerged culture of Cordyceps sinensis 16 consisted of a main unit and a subunit of 126 and 68kDa, respectively. The optimal medium for the production of mycelia and exo-biopolymer was determined to be molasses containing 2% sucrose, 0.9% yeast extract, 0.3% K 2HPO 4, and 0.4% CaCl 2. Using optimized medium, maximum productions of mycelia and exo-biopolymer in shake-X ask culture were 54.0g/L and 28.4g/L, respectively. This study suggests that large-scale production of mycelia and exo-biopolymer by C. sinensis 16 is possible in submerged culture.? 2005 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Keywords:Cordyceps sinensis ; Exo-biopolymer; Molasses; Optimization

1. Introduction

Cordyceps , a Chinese medicinal herb, resembles a worm in winter and a grass in summer. During winter, Cordyceps exhausts the nutrition supplied by Lepidoptera larvae (Chiou et al., 2000). Cordyceps sinensis is a fungus that parasitizes Lepidoptera larvae and is one of the most valued and potent herbs in traditional Chinese medicine (Wu et al., 1996; Chen et al., 1997). During the past several decades, much interest has been shown in the polysaccha-rides produced by Cordyceps due to their various biological and pharmaceutical activities (Bae et al., 1998). A number of bioactive constituents in Cordyceps species have been reported. These include cordycepin, antibacterial and anti-tumor adenosine derivatives, ophicordin, an antifungal agent, an antitumor polysaccharide, an immunopotentiat-ing galactomannan, and L -tryptophan (Bok et al., 1999). In

addition, mycelia from Cordyceps have been reported to activate the immune system (Kuo et al., 1994; Koh et al.,2001, 2002). Moreover, several mycelial strains have been isolated from natural Cordyceps and produced in large quantities by fermentation, and have been found to have pharmacological e Y cacies similar to the natural product (Li et al., 2001).

Even though physiologically active substances have been isolated from various Cordyceps species, few are being used commercially because of the di Y culties of mass production.To overcome these di Y culties, arti W cial solid media have been developed for mass production of stromata. But com-paring to the liquid culture, the yield of solid culture is not su Y cient. In addition, exo-biopolymers, which have syner-gistic biological e V ects with mycelia, can be concurrently produced in liquid culture (Bae et al., 1998). Although many researchers have described the pharmacological activities of C. sinensis (Liang et al., 1997; Yamaguchi et al.,2000; Balon et al., 2002; Huang et al., 2004), minimal infor-mation is available on mycelia and exo-biopolymer produc-tion by C. sinensis in submerged culture.

Corresponding author. Tel.: +82 2 3290 3300; fax: +82 2 926 6102.E-mail address: kimsw@korea.ac.kr (S.W. Kim).

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The objectives of this study were to determine the mole-cular composition of exo-biopolymer and optimize the culture medium for the production of mycelia and exo-biopolymer by C. sinensis 16 in submerged culture.

2. Methods

2.1. Microorganism

C. sinensis 16 was obtained from the Research Institute of Biological Control, China. A stock culture was main-tained on potato dextrose agar (PDA) plates. These plates were incubated at 25°C for 7 days and then stored at 4°C.

2.2. Media and culture conditions

Seed and main cultures were carried out in 250ml Erlen-meyer X asks containing 50ml of medium on a rotary shaker at 25°C and 150rpm. Seed was cultivated in potato dextrose broth containing yeast extract (20% potato, 2% dextrose and 0.1% yeast extract) for 3 days and then used as inocula for the main culture. The medium used for the main culture contained 2% molasses, 0.9% yeast extract, 0.3% K2HPO4, and 0.4% CaCl2.

2.3. Analytical methods

In order to determine the concentrations of mycelium and exo-biopolymer, culture broth was centrifuged at 6000g for 20min, the sediment was washed twice with dis-tilled water and dry cell weight was obtained by W ltering culture samples through a pre-weighed W lter (Whatman GF/C Cat No. 1822 047) and drying in an oven for 24h at 50°C (Wang and Rakshit, 1999).

Exo-biopolymer concentrations were determined by ethanol precipitation by adding 4 times volume of 99% (v/v) ethanol. The precipitate was collected on a pre-weighed membrane W lters and dried to constant weight at 50°C (Dorge et al., 2000). Molecular weight and component sugar of the exo-biopolymer were also determined. To determine the molecular weight of the exo-biopolymer, a precipitate of pure exo-biopolymer was analyzed by high performance liquid chromatography using an Shodex GS520+GS320+GS220 packed column (7.6￡300mm; Ashai Chemical Industry Co., Ltd., Tokyo, Japan) equipped with a refractive index detector (Waters, Milford, MA, USA). Pullulan standards (Polysciences) with narrow polydispersity and molecular weights ranging from 5kDa to 1600kDa were used to construct a calibration curve. Sodium chloride (0.2M) was used as the mobile phase at a X ow rate of 0.5ml/min.

The carbohydrate composition of the exo-biopolymer was analyzed as alditol acetates after hydrolyzing the poly-saccharide with 2M tri X uoroacetic acid (TFA) for 1.5h at 121°C by gas liquid chromatography (GLC) using an SP-2380 capillary column (0.20 m W lm, 0.25mm i.d.￡30m, Supelco, Bellefonte, PA, USA) and equipped with a X ame-ionization detector (Young-Lin Co., Ltd., Seoul, Korea). Dry oxygen-free helium (X ow rate, 1.5ml/min) was used as the carrier gas. The temperature pro W le used was pro-grammed at 60°C for 1min, followed by an increase to 215°C at 30°C per min, held at 215°C for 18.8min, fol-lowed by an increase to 250°C at 8°C per min, and then held at 250°C for 5.7min. Molar ratios were calculated from peak areas and molecular weights.

The amounts of glucose and sucrose were measured by H PLC (Young-Lin Instrument Co., Ltd., Seoul, Korea) using a 150￡6.0mm column (Agilent, Inc., Colorado Springs, Co., USA) and a refractive index detector (Young-Lin Instrument Co., Ltd., RI750F, Seoul, Korea). The column temperature was maintained at a constant 50°C. Water (70% (v/v)) and acetonitrile (30% (v/v)) were used as the mobile phase at a X ow rate of 1.0ml min?1.

2.4. Experimental design

All experiments were carried out over W ve times, and the mean values and error were calculated using SigmaPlot 8.0 (Systat Software Inc., Richmond, CA, USA).

3. Results and discussion

3.1. The molecular weight of the sugar components of the exo-biopolymer obtained from Cordyceps sinensis 16 The molecular weight of the exo-biopolymer obtained from the submerged culture of C. sinensis 16 consisted of a main unit and a subunit of 126kDa and 68kDa, respec-tively. The carbohydrate molecular sugar ratio was com-posed mainly of glucose and mannose (61.5:18.1) with small amounts of galactose, arabinose and xylose (9.4:7.0:

4.0). Li et al. (2003) isolated a polysaccharide of molecular weight 210kDa from C. sinensis which showed strong anti-oxida-tive activity, containing glucose, mannose and galactose in a ratio of 1:0.6:0.7

5. In view of this, the exo-biopolymer from C. sinensis 16 seems to be potential for new physiolog-ically active substances.

3.2. E V ect of molasses on the production of mycelia and

exo-biopolymer by C. sinensis 16

To identify a suitable carbon source for the production of mycelia and exo-biopolymer, C. sinensis 16 was cultivated using various carbon sources (arabinose, cellobiose, fructose, glucose, lactose, maltose, and sucrose). We found that among the various carbon sources examined, sucrose was most e V ective on the production of mycelia and exo-biopoly-mer. Song et al. (1999) reported that molasses was the best carbon source known for stimulating the mycelial growth and for the production of endo-polymers by another fungus, Lentinus edobes. Because molasses are cheaper than other carbon sources, and are mainly composed of sucrose and glucose, we investigated the e V ect of molasses on the myce-lial growth and exo-biopolymer production by C. sinensis 16

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in submerged culture. As the sucrose concentration in the molasses increased, mycelial growth was stimulated with increase of exo-biopolymer production. Maximum mycelia (6.9g/L) and exo-biopolymer (6.0g/L) production were achieved with molasses containing 2% sucrose (Fig.1).

3.3. E V ect of nitrogen and inorganics on the production of mycelia and exo-biopolymer by C. sinensis 16

Various nitrogen sources were examined to compare mycelia and exo-biopolymer production. When nitrogen sources were added, mycelia growth increased signi W cantly compared to when only molasses was used (Fig.2). Based on this result, it was thought that molasses had more e V ect on exo-biopolymer production and that nitrogen sources had more e V ect on mycelial growth. Generally, carbon sources are more related to cell growth and nitrogen sources to metabolite production. However, in the case of C. sinensis 16, it was expected that nitrogen sources would be mainly used for mycelia and stromata production. Among the various nitrogen sources examined, yeast extract caused greatest mycelia (28.6g/L) and exo-biopoly-mer (7.4g/L) production. Maximum mycelia (31.8g/L) and exo-biopolymer (8.1g/L) production were further increased by adding 0.9% yeast extract (Fig.3). In the case of inor-ganic sources, K2HPO4 and CaCl2 were found to have posi-tive e V ects on mycelia and exo-biopolymer production. Maximum production of mycelia (58.0g/L) and exo-bio-polymer (21.9g/L) were obtained at 0.3% K2HPO4 and 0.4% CaCl

(data not shown).

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The time course of the production of mycelia and exo-biopolymer, residual sugar, and pH changes in the opti-mized medium are shown in Fig.4. During the early stage of cultivation, little di V erence in pH was observed. The pH value at the end of culture was between 6.0 and 6.5. Myce-lial growth increased during the W rst 5 days of culture and then decreased and the production of exo-biopolymer increased gradually to 3 days and then increased rapidly to 6 days. Sucrose in molasses was consumed as mycelial growth and exo-biopolymer production proceeded and was consumed gradually during the W rst 3 days and then con-sumed rapidly during the subsequent 6 days. Changes in the sucrose concentration of the molasses were closely related to exo-biopolymer production. Maximum mycelia and exo-biopolymer production was reached after 5 days, when their values were 54.0g/L and 28.4g/L, respectively.

4. Conclusions

The molecular weight of exo-biopolymer consisted of a main unit and a subunit of 126kDa and 68kDa, respec-tively. We also optimized the culture medium with respect to the production of mycelia and exo-biopolymer by C. sin-ensis 16 in submerged culture. In optimal medium, a high mycelial (54.0g/L) and exo-biopolymer (28.4g/L) concen-trations were obtained in shaking X ask culture. These results suggest that the large-scale production of mycelia and exo-biopolymer by C. sinensis 16 is possible in sub-merged culture.

Acknowledgements

This study was partly supported by research grants from Nel Biotech Co., Ltd. and partly the Korea Science and Engi-neering Foundation (KOSEF) through the Applied Rheol-ogy Center (ARC), an o Y cial KOSEF-created Engineering Research Center (ERC) at Korea University, Seoul, Korea.

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厌氧培养方法

厌氧性细菌的分离培养法厌氧菌需有较低的氧化—还原势能才能生长 (例如破伤风梭状芽孢杆菌需氧化—还原电势降低至 0.11V 时才开始生长 )，在有氧的环境下，培养基的氧化—还原电势较高，不适于厌氧菌的生长。为使培养基降低势，降低培养环境的氧压是十分必要的。现有的厌氧培养法甚多，主要有生物学，化学和物理学 3 种方法，可根据各实验室的具体情况而选用。 1．生物学方法培养基中含有植物组织 (如马铃薯、燕麦、发芽谷物等 )或动物组织 (新鲜无菌的小片组织或加热杀菌的肌肉、心、脑等 ) ，由于组织的呼吸作用或组织中的可氧化物质氧化而消耗氧气(如肌肉或脑组织中不饱和脂肪酸的氧化能消耗氧气，碎肉培养基的应用，就是根据这个原理 )，组织中所含的还原性化合物如谷胱甘肽也可以使氧化—还原电势下降。另外，将厌氧菌与需氧菌共同培养在一个平皿内，利用需氧菌的生长将氧消耗后，使厌氧菌能生长。其方法是将培养皿的一半接种吸收氧气能力强的需氧菌(如枯草杆菌 )，另一半接种厌氧菌，接种后将平皿倒扣在一块玻璃板上，并用石蜡密封，置37恒温箱中培养2~3d 后，即可观察到需氧菌和厌氧菌均先后生长。 2．化学方法利用还原作用强的化学物质，将环境或培养基内的氧气吸收，或用还原氧化型物质，降低氧化—还原电势。此法系用连二亚硫酸纳 (Sodium hydrosulphite) 和碳酸钠以吸收空气中的氧气，其反应式如下： Na2S204 十Na2C03十O2 一→ Na2SO4十Na2SO3 十C02 取一有盖的玻璃罐，罐底垫一薄层棉花，将接种好的平皿重叠正放于罐内 (如系液体培养基，则直立于罐内 )，最上端保留可容纳 1~2 个平皿的空间 (视玻罐的体积而定 )，按玻罐的体积每 1000cm3 空间用连二亚硫酸纳及碳酸钠各 30g，在纸上混匀后，盛于上面的空平皿中，加水少许使混合物潮湿，但不可过湿，以免罐内水分过多。若用无盖玻罐，则可将平皿重叠正放在浅底容器上，以无盖玻罐罩于皿上，罐口周围用胶泥或水银封闭 (如图１－５ )。（２）焦性没食子酸法焦性没食子酸在碱性溶液中能吸收大重氧气，同时由淡棕变为深棕色的焦性没食橙(Purpurgallin) 。每 l00cm3 空间用焦性没食子酸1g 及 10％氢氧化纳或氢氧化钾l0ml ，其具体方法主要有下列几种： 1）单个培养皿法：将厌氧菌接种于血琼脂平板。取方形玻璃板一块，中央置纱布或棉花或重叠滤纸一片，在其上放焦性没食子酸 0.2g 及 10％ NaOH 溶液 0.5mL 。迅速拿去皿盖，将培养皿倒置于其上，周围以融化石蜡或胶泥密封。将此玻璃板连同培养皿放人 37C 温箱培养 24~48h 后，取出观察。 2） Buchner 氏试管法：取一大试管，在管底放焦性没食子酸0.5g 及玻璃珠数个或放一螺旋状铅丝。将已接种的培养管放人大试管中，迅速加入 20％ NaOH 溶液 0.5ml，立即将管口用橡皮塞塞紧，必要时周围封以石蜡， 37 培养 24~48h 后观察 (图１－６ )。３）玻罐或干燥器法：置适量焦性没食子酸于一干燥器或玻罐的隔板下面，将培养皿或试管置于隔板上，并在玻罐内置美蓝指示剂一管，从罐侧加入氢氧化钠溶液放于罐底，将焦性没食子酸用纸或纱布包好，用线系住，暂勿与氢氧化钠接触，待一切准备好后．将线放下，使焦性没食子酸落人氢

固态发酵技术的研究与应用

固态发酵技术的研究与应用固态发酵技术在中国有着悠久的历史，早在2500年以前，在中国就有中药神曲的固态发酵生产。当时还没有把这些固态发酵技术提升到理论高度。传统的固态发酵技术因其发酵过程难以控制，容易感染杂菌，在应用于生产实践过程中，不仅劳动强度大，而且产品质量很难保证。 19世纪微生物的发现、微生物发酵的酶作用及微生物学的问世，将发酵技术带入了高速发展的快车道。二次世界大战期间，为了大规模生产青霉素，经过英美两国科学家的共同努力，一种大规模微生物深层发酵技术开发获得成功，当时由于这种新的发酵技术和传统固态发酵技术相比能够实现微生物纯种培养，同时可以采用机械搅拌通气发酵法生产，使生产效率大大提高，并由此开发生产了许多微生物新产品，如抗生素、氨基酸、用于农牧业的生物活性物质、多糖、有机酸、酶制剂等，成为发酵工程技术研究和开发的热点。但是，现代发酵工业大多采用大规模液体深层发酵方式，小分子产品在水性发酵液中含量大都在10%上下，许多高价值或大分子浓度更低，有的甚至大大低于1%，因而发酵液产品提取后产生大量的废液，生产规模越大，废液越多，污染越重。这时人们又不约而同地把眼光投向了古老的固态发酵技术，该技术具有节水、节能的独特优势，且没有废液产生，属于清洁生产技术。采用现代固态发酵技术则不仅可提高产品本身的质量，还可提高其生产的可操作性，并达到提高产品产量和质量的目的。现代固态发酵技术还可引入到其它传统发酵食品的生产中，提高其生产的技术含量，达到稳产高产的目的。一、固态发酵技术简介广义上讲固态发酵是指一类使用不溶性固体基质来培养微生物的工艺过程，既包括将固态悬浮在液体中的深层发酵，也包括在没有(或几乎没有)游离水的湿固体材料上培养微生物的工艺过程。多数情况下是指在没有或几乎没有自由水存在下，在有一定湿度的水不溶性固态基质中，用一种或多种微生物发酵的一个生物反应过程。狭义上讲固态发酵(solidstate fermentation)是指利用自然底物做碳源及能源，或利用惰性底物做固体支持物，其体系无水或接近于无水的任何发酵过程。与其他培养方式相比，固态发酵具有如下优点： (1)培养基简单且来源广泛，多为便宜的天然基质或工业生产的下脚料； (2)投资少，能耗低，技术较简单； (3)产物的产率较高； (4)基质含水量低，可大大减少生物反应器的体积，不需要废水处理，环境污染较少，后处理加工方便；

MS培养基的作用

MS培养基的作用植物组织培养中常用的一种培养基是ms培养基。 ms培养基的配制步骤这样每次使用时，取其总量的1/20(50ml)或1/200(5ml)，加水稀释，制成培养液。现将制备培养基母液所需的各类物质的量列出，供配制时使用。大量元素(母液Ⅰ)mg/l nh4no333000 kno338000 cacl2·2h2o8800mgso4·7h2o7400kh2po43400微量元素(母液Ⅱ)ki166h3bo31240mnso4·4h2o4460znso4·7h2o1720na2moo4·2h2 o50cuso4·5h2o5cocl2·6h2o5铁盐(母液 Ⅲ)feso4·7h2o5560na2-edta·2h2o7460有机成分(母液Ⅳ)Ⅳa肌醇20000Ⅳb烟酸100盐酸吡哆醇(维生素b6)100盐酸硫胺素(维生素

b1)20甘氨酸400以上各种营养成分的用量，除了母液Ⅰ为20倍浓缩液外，其余的均为200倍浓缩液。上述几种母液都要单独配成1l的贮备液。其中，母液Ⅰ、母液Ⅱ及母液Ⅳ的配制方法是：每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1l。母液Ⅲ的配制方法是：将称好的feso4·7h2o和na2-edta·2h2o 分别放到450ml蒸馏水中，边加热边不断搅拌使它们溶解，然后将两种溶液混合，并将ph调至5?5，最后定容到1l，保存在棕色玻璃瓶中。各种母液配完后，分别用玻璃瓶贮存，并且贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期等，保存在冰箱的冷藏室中。 ms培养基中还需要加入：2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-d)、萘乙酸(naa)、6-苄基嘌呤(6-ba)等植物生长调节物质，并且分别配成母液(0?1mg/ml)。其配制方法是：分别称取这3种物质各10mg，将2，4-d

食用菌液体菌种生产方法

食用菌液体菌种的生产方法（发酵罐法) 传统菌种生产工艺，一般是由试管母种扩繁成二级种、三级种，生产周期长、污染率高、成本高、需大量人工、管理困难。液体菌种生产具有纯度高、活力强、繁殖快的特点，接种到培养料内有流动性好、萌发点多，发菌迅速等特种点。应用于生产与固体菌种相比有以下优点： 1．菌种生产周期短。固体种一般需25—40天，而液体种仅需3—7天。 2．接种后，萌发点多萌发点多、发菌快、出菇周期短。接种24小时菌丝布满料面，3—15天长满菌袋，一般品种10天左右可出菇。 3．接种方便、成本低。用液体菌种接种一般每袋成本是1—3分，每人每小时可接800袋以上，提高效益4—5倍。 4．适宜工厂化生产。可直接用于栽培料进行出菇，大批量生产菌袋。为食用菌集约化、标准化生产创造了条件。因此，适宜我国国情的液体菌种设备的出现，必将在食用菌生产领域引发一场新的革命。液体菌种具有固体（颗粒）菌种无可比拟的优势，但是液体菌种生产设备是近几年刚发展起来并逐渐成熟的，因此很多人对此很陌生。在这里我们对此进行简单介绍一、液体菌种设备基本原理任何一种食用菌自身的生长必须满足其对温度、湿度、需氧量、养分等的需要，同时必须避免杂菌感染。在深层发酵技术上称之为选择性发酵技术，如啤酒生产技术当属此例，而白酒生产则是生物菌群发酵技术。液体菌种发酵设备（包括四大系统，温控系统由控制器、电热管等组成；供气系统由空气压缩机、输送管道、空气过滤器等组成；冷却系统由热交换器、进出水管道组成；搅拌系统由射流器、提升管等组成。二、液体菌种生产的关键技术 1、溶氧量液体菌种生产中最关键的是培养液中氧的溶解量，因为在菌丝生长过程中，必须不断的吸收溶解其中的氧气来维持自身的新陈代谢，氧气在液体（水）中的溶解量与压力、温度有关，同时与培养液的接触面积、渗透压有很大的关系。因此我们设计发酵设备时有效地解决了这些问题，如安装射流器使气泡细碎度增加等。 2、空气过滤技术的关键就是保证进入的空气无菌度高，因此必须选择孔径小、材料先进的过滤膜。一般细菌直径在0.5-5um,酵母菌在1-10um，病毒一般在20-400mu，所以选择过滤膜时应综合考虑以上因素。当然如果选的太小，成本将大幅度提高。另外环境对于空气影响很大,在空气压缩机房、制种车间必须保持环境清洁。 3、培养液培养液是菌丝生长发育的营养源，要求营养全面均衡。不同的菌种对营养要求偏重不同。配制原料有糖、麸皮、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素、蛋白胨、土豆汁、酵母浸膏等。配置培养液时，先将土豆片、麸皮一起煮熟，将汁液滤出，后加入其它辅料混匀即可。 4、接种培养器上端有接种口，也是装料口，将母种并瓶后加入抑菌剂，而后必须在火焰圈的保护下倒入罐体内，要求动作快、操作准确。

厌氧菌的培养方法

厌氧菌的培养方法录入时间:2006/6/24 8:36:41 来源：海博生物技术部厌氧菌在有氧的情况下不能生长。要培养厌氧菌，必须创造一个无氧的环境。通常用培养基中加入还原剂，或用物理、化学方法去除环境中的游离氧，以降低氧化还原电势。如疱肉培养基、硫基乙酸钠培养基，牛心脑浸液培养基等。常用的厌氧培养方法有许多，可根据实际情况选用。 1．厌氧缸法接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养，厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。 2．厌氧袋（Bio-bag）即在塑料袋内造成厌氧环境来培养厌氧菌。塑料袋透明而不透气，内装气体发生管（有硼氢化钠的碳酸氢钠固体以及5%柠檬酸安瓿）、美兰指示剂管、钯催化剂管、干燥剂。放入已接种好的平板后，尽量挤出袋内空气，然后密封袋口。先折断气体发生管，后折断美兰指示剂管，命名袋内在半小时内造成无气环境。如不突变表示袋内已达厌氧状态，可以孵育。 3．厌氧手套箱（Anaerobie glove box）是迄今为止国际上公认的培养厌氧菌最佳仪器之一。它是一个密闭的大型金属箱，箱的前面有一个有机玻璃做的透明面板，板上装有两个手套，可通过手套在箱内进行操作，故名。箱侧有一交换室，具有内外二门，内门通箱内先关着。欲放物入箱，先打开外门，放入交换室，关上外门进行抽气和换气（H2，CO2，N2）达到厌氧状态，然后手伸入手套把交换室内门打开，将物品移入箱内，关上内门。箱内保持厌氧状态，也是利用充气中的氢在钯的催化下和箱中钱残余氧化合成水的原理。该箱可调节温度，本身是孵箱或孵箱即附在其内，还可放入解剖显微镜便于观察厌氧菌菌落，这种厌氧箱适于作厌氧细菌的大量培养研究，大量培养基可放入作预还原和厌氧性无菌试验。金属硬壁型厌氧箱的抽气、充气、厌氧环境和温度等均系自动调节。 4.厌氧盒：原理同厌氧袋，有成品销售。 5.生物耗氧法：在一密闭的容器内放以生物（多是植物），消耗氧气，同时产生二氧化碳，供细菌生长用。我没见过。 6.焦性末食子酸法：在一洁净的玻片上铺上纱布或滤纸，均匀撒上焦性末食子酸，然后再混入NaHCO3粉末或NaOH溶液，迅速将已接种细菌的平板倒扣在上面，用融化的白蜡封边，造成一个封闭空间。焦性末食子酸与碱反应后耗氧。该法用于厌氧不严格的厌氧菌的培养，简单。如有梭状芽孢杆菌。

自酿白酒固态发酵法

白酒固态发酵法固态发酵法固态发酵法白酒生产特点之一，是采用比较低的温度，让糖化作用和发酵作用同时进行，即采用边糖化边发酵工艺。淀粉酿成酒必须经过糖化与发酵过程。一般糖化酶作用的最适温度在50--60℃。温度过高，酶被破坏的量就会愈大，当采用20-30℃低温时，糖化酶作用缓慢，故糖化时间要长一些，但酶的破坏也能减弱。因此，采用较低的糖化温度，只要保证一定的糖化时间，仍可达到糖化目的。酒精发酵的最适温度为28-30℃，在固态发酵法生产白酒时，虽然入窖开始糖化温度比较低(18-22℃），糖化进行缓慢，但这样便于控制。因开始发酵缓馒些，则窖内升温慢，酵母不易衰老，发酵度会高。而开始糖化温度高，则糖分过多积累，温度又高，杂菌容易繁殖。在边糖化边发酵过程中，被酵母利用发酵的糖，是在整个发酵过程中逐步产生和供给的，酵母不致过早地处于浓厚的代谢产物环境中，故较为健壮。第二个特点是，发酵过程中水分基本上是包含于酿酒原料的颗粒中。由于高梁、玉米等颗粒组织紧密，糖化较为困难，更由于是采用固态发酵，淀粉不容易被充分利用，故对蒸酒后的醅需再行继续发酵，以利用其残余淀粉。常采用减少一部分酒糟，增加一部分新料，配醅继续发酵，反复多次，这是我国所特有的酒精发酵法，称谓续渣发酵(续粮发酵)。第三个特点是采用传统的固态发酵和固态蒸馏工艺，以产生具典型风格的白酒。近年来，通过对固态法白酒和液态法白酒在风味上不同原因的深入研究，认为固态法白酒采用配醅发酵，并且配醅量很大(为原料的3-4倍)，可调整入窖的淀粉浓度和酸度，达到对残余淀粉的再利用。这些酒醅经过长期反复发酵，其中会积累大量香味成分的前体物质，经再次发酵被微生物利用而变成香味物质。例如糖类是酒精、多元醇和各种有机酸的前体物质；酸类和醇类是酯类的前体物质；某些氨基酸是高级醇的前体物质，而酒精是乙酸的前体物质等。当采用液态发酵时不配醅，就不具备固态发酵时那样多的前体物质，这就是两种制酒工艺使白酒风味不同的原因之一。此外，在固态发酵时窖内固态、液态和气态三种状态的物质同时存在，根据研究得出同一种微生物生活在均一相内(如液态、固态或气态)与生活在两个不同态的接触面上(这种接触面称作界面)，其生长与代谢产物有明显不同，这就是说界面对微生物的生长有影响。而固体醅具有较多的气-固、液-固界面，因此与液态发酵会有所不同。如以曲汁为基础，添加玻璃丝为界面剂，以形成无极性的固液界面，进行酒精酵母的发酵对比试验，其结果酸、酯都有所增加，高级醇增加幅度较小，酒精含量有所降低。

培养基成分及其作用

培养基成分及其作用植物生长发育需要多种营养和生长调节物质，当其缺乏时，生长发育受阻，形态不正常。在植物组织快繁过程中，培养物生长发育所需的营养和生长因子，主要靠培养基供给。因此，完全培养基的成分除了水分外，还要包括无机营养、有机物营养、生长调节物质及其他附加物等。一、无机营养物无机营养物即无机盐是植物生长发育所必需的，根据植物对无机盐需要的多少，将其分为大量元素和微量元素。 1. 大量元素大量元素在植物体内含量占干物重的0.1-10%，其浓度一般大于0.5mmol/L，包括氮(N)、磷(P)、钾(K)、钙(Ca)、镁(Mg)、硫(S)，若加上碳(C)、氢(H)、氧(O)，则有9种元素。在离体培养中，其C、H、O三元素是从人工加入的糖类获得的，H、O元素也可以从培养基所含的水分中获得，而其余6种矿质元素要从加入的适量的无机盐类来获取。无机氮常以硝态氮(如KNO3)和铵态氮(如NH4NO3)两种形式供应，多数培养基都是二者兼而有之。 2. 微量元素植物所需的微量元素包括铁(Fe)、硼(B)、锰(Mn)、铜(Cu)、锌(Zn)、钼(Mo)、氯(Cl)等，植物对其需要量极微，在植物体内含量占干物重的0.01%以下，起生长发育所需的浓度一般小于0.5mmol/L，稍多则产生毒害。碘(I)虽不是植物生长的必需元素，但几乎在所有的培养基中都含有碘元素，有些培养基还加入了钴(Co)、镍(Ni)、钛(Ti)、铍(Be)，甚至铝(Al)等元素。 3. 铁盐铁是用量较多的一种微量元素，是许多重要氧化还原酶的组成成分，在植物叶绿素的合成过程中起到重要的作用。若以硫酸铁和氯化铁为供铁源，培养基的pH值会达到5.2以上，形成氢氧化铁沉淀，使培养物无法吸收而出现缺铁症，故在培养基配制时，常用硫酸亚铁和EDTA二钠配成螯合态铁，成为有机态铁方被培养物吸收和利用;也可用EDTA铁盐，作为铁的供应源。这些元素参与培养物机体的建造，构成植物细胞中的核酸、蛋白质、叶绿体、酶系统和生物膜所必需的元素。二、有机营养成分

菌种的液体培养

兰州交通大学化学与生物工程学院综合能力训练Ⅰ——文献综述题目:食用菌液体菌种的研究作者：蒋成学号：201207749 指导教师：谢放完成日期：2014-7-16

食用菌液体菌种的研究摘要：本综述是对食用菌液体培养的历史以及发展进行介绍，对食用菌液体培养方法和条件进行阐述，以及影响它的因素及之中的检控参数，和液体培养的优点及其运用，和食用菌液体培养的展望的概述。关键字：液体菌种食用菌 1.引言： l.1食用菌液体培养技术概念的提出食用菌的液体发酵技术起源于美国，据资料报道，1947年，美国的H．Humfeld 对蘑菇进行深层发酵并得到菌丝体，从此食用菌的发酵生产在世界范围内兴起。1958年，J．Snlecs第一个用发酵罐来培养羊肚菌(Mon6dia)，从此食用菌液体培养制种的成功报道在国内外相继出现。1975年日本杉恒武等用1％的有机酸和0．5％的酵母膏作为培养基得到大量的香菇菌丝体，国内从1960年上海植物生理研究所的陈聿美等对蘑菇的深层培养进行研究以来，已经有许多单位和个人对数十种食用菌进行了液体培养的研究[5]。我国对食用菌液体菌种培养技术的研究始于1958年对蘑菇和侧耳液体培养的研究，并在1963年进行了羊肚菌的规模化、工业化商品生产。从此，食用菌产品的获得开始由简单的农业种植而转入工业发酵生产阶段。食用菌是一种重要的生物资源，在我国的森林山区中生长的种类与数量较多。在世界上来说，我国的食用菌资源极其丰富，也是最早开发利用食用菌资源的国家之一[1]。现在，随着社会的进步和人类生活水平的提高，人们对食用菌的需求和认识有了较大幅度的提高。但是，传统的小作坊栽培方法及生产方式已远远不能适应食用菌产业日益发展的趋势，大规模的机械化生产，已成为不可抵挡的发展趋势。当前食用菌生产过程中使用的菌种大多是固体菌种,常以玻璃瓶或聚丙烯塑料袋作容器进行菌丝的培养;菌种生产的基本步骤为:母种扩大原种生产栽培种生产;其生产模式为:试管—瓶子—小袋—大袋的手工作坊式。这种传统的食用菌菌种生产过程一般要经过2-3个月的时间才能进行栽培生产[2]。然而与固体菌种相比食用菌液体培养技术已经取得了很大的进展和可喜的成果，该技术是现代生物工程技术之一，具有生产周期短、效率高、成本低、便于工厂化大规模生产等优点，具有广阔的应用前景和较大的发展潜力[3-4]。 1.2培养条件及方法（1）母种培养将冰箱内保藏菌种接种于试管斜面,将培养好的液体菌种菌丝球接种于试管斜面上,在相同条件下(24~25度)培养,进行对比实验并观察记录。（2）液体菌种培养将冰箱内保藏菌种接种于液体培养基中,将培养好的液体菌种菌丝球继续接种于新鲜的液体培养基中进行对比实验,24~25度震荡培养,

关于厌氧菌培养方法的探讨

关于厌氧菌培养方法的探讨啤酒有害菌是纯生啤酒生产中微生物检验最重要的一项指标，如何对啤酒进行有效的厌氧菌(即有害菌)检测意义重大。影响厌氧菌检验的因素很多，其中最重要的是能否达到厌氧菌培养所需的厌氧环境。本文结合作者多年的工作经验，对厌氧培养箱法培养厌氧菌进行初步探讨 1 常见的厌氧菌培养方法 1．1 最古老的方法：蜡烛耗氧法此法利用蜡烛燃烧消耗封闭容器里的氧气，产生二氧化碳，在封闭容器内形成厌氧环境。此法产生的厌氧环境很难得到保证，培养过程不方便操作。1．2 置换法通过真空泵使二氧化碳气体从厌氧罐底部进入，二氧化碳比重比氧气大，迫使氧气上浮，随着二氧化碳气体的逐渐充满氧气从顶部排出，在厌氧罐里形成厌氧环境。使用此方法，成本较低+佩操作繁琐，厌氧程度不能得到有效保证。 1．3 厌氧盒，罐法厌氧盒，罐法是利用吸氧剂把厌氧盒，罐中的氧气吸收，使其达到无氧状态。由于厌氧盒容量一般较小，此法厌氧环境能够保证，但不能满足大生产需要；另吸氧剂成本较高。 1．4 厌氧培养箱法通过真空泵先将箱内氧气抽出，充人氮气和混合气，使箱内形成厌氧环境。此厌氧环境在正静隋况下可一直保持。每次使用时只需置换过渡间的空气，实现与培养箱内的互通，进行样品的放置或取出等操作。 2 厌氧培养箱法简单介绍 2．1 初始厌氧环境的形成为了严格保证厌氧环境，一般采取20次抽真空和充N2过程进行初始化。 2．2 样品放置的步骤在样品放置过程中．可以采用三次抽真空，两次N2清洗交替进行，使厌氧培养箱内的氧气含量低于l％。在厌氧菌培养过程中，适当保持培养箱内的厌氧气体压力，使形成轻微正压，以保证厌氧环境。 2．3 使用要点

固体发酵专题

【交流】固体发酵专题（欢迎各位战友热烈参与讨论）说起发酵，人们首先想到的肯定是深层发酵。虽然深层发酵是目前发酵工程的主体，但固体发酵在中国的传统酿造业中也有着不可替代的地位。固体发酵具有操作简便、能耗低、发酵过程容易控制、对无菌要求相对较低、不易发生大面积的污染等优点，更重要的是，真菌在静态的环境中生长得更好，次生代谢物积累的效率更高。这说明固体发酵技术具有很大的发展潜力。然而固体发酵的缺点也是显而易见的，主要体现为产能太低，现有的技术条件不利于大规模的工业化生产。虽然现在也有一些固体发酵设备，但和深层发酵相比，亦是望尘莫及。固体发酵的技术水平依旧停留在家庭作坊式的生产水平上。一些粗浅的看法，权当引玉之言。恳请各位战友就固体发酵的前景与设想、发酵技术的改进与进展、自己的操作经验与心得等方面踊跃参与讨论。支持，置顶一周！我来参与讨论！固体发酵有许多液体发酵无所比拟的优势，如为非均相系统，有利于特定培养物的自组织行为；液固相接触比表面积大，一般无液体发酵所面临的高密度培养时溶氧水平不足。但固体发酵往往在工程放大中面临热量积累导致温度失控问题。当前生物农药固体发酵技术是其中的一个热点。针对液体深层发酵中存在的弊端，经过多年的研究开发，生物农药固体发酵发酵工艺和设备已逐步从浅盘发酵向固体深层发酵发展；设备已由传统的盘式半开放式发酵发展成为全封闭、全自动固体发酵设备，生产实现计算机在线控制，生产规模可从几百吨的小规模发展到几万吨，甚至几十万吨的超大规模，从而解决了一直限制固体发酵生产生物农药向大规模和超大规模发展的瓶颈问题。由于发酵工艺和设备的改进、菌种的不断选育，产品毒力效价显著提高，形成了系统成熟的固体发酵生产微生物农药技术，并已在大规模工业生产中逐步应用。同时生物农药固体发酵采用的原料成本低；发酵过程不易大面积污染，发酵环境要求低，甚至可以是半开放式发酵，因此投资较少；发酵产物为固体，直接烘干、粉碎后即可成为产品，生产过程中有效成份流失极少，产品中不需要再加大量的助剂，产品易于运输储存；生产过程中几乎没有废水排放，不需要进行污水处理。我认为该方法还是有前途的。另外提供一篇文章：固体发酵法的技术改进，我想这也是固体发酵领域的一大改进吧！固体发酵法的技术改进.CAJ (112.97k) 固体培养法将微生物接种在固体培养基表面生长繁殖的方法，称固体培养法。它是表面培养的一种。广泛用于培养好气性微生物。例如，用于微生物形态观察或保藏的琼脂斜面培养，用于平板分离或活细胞计数的平板培养，都属于固体表面培养法。用该方法配氧微生物时，有下列特点：第一，细胞多半是重叠地生长繁殖，因此，直接与培养基相接触的细胞在此细胞上再长出的

细胞培养基中的添加剂及其作用

培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养;RPMI-1640做悬浮细胞和人白血病细胞单层培养是一个好的开始，它也广泛应用于哺乳动物细胞和杂交瘤细胞的培养，如人骨髓瘤细胞、鼠杂交瘤细胞、人白细胞以及B细胞和T细胞;各种目的无血清培养最好首选AIM V(12005)培养基(SFM)。选择细胞的培养基也可以到ATCC上查询，ATCC (American Type Culture Collection) 收集了绝大多数细胞的详细资料。打开ATCC网页的Cells and hybridomas链接，输入细胞名称就可以搜索ATCC的细胞数据库。数据库中有每一种细胞的详细描述，包括细胞的来源，培养和冻存条件，以及相关文献等资料。同一种培养基也会因其添加物的不同而应用于不同的细胞培养和不同的实验需求，下面就详细介绍下培养基中各种添加剂的功能。 1. L-谷氨酰胺(L-Glutamine)在细胞培养中重要吗?它在溶液中不稳定吗? 是细胞生长的必须氨基酸，为培养的细胞提供重要的能量来源。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，降解率随保存温度而变。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。 2. GlutaMAX-I是什么?培养细胞如何利用GlutaMAX-I?这个二肽有多稳定? GlutaMAX-I 即谷丙氨酸二肽，是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。 3. 培养基中丙酮酸钠的作用是什么? 丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。 4. Hank′s 平衡盐溶液(HBS)和Earle′s平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别? HBS和EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagle′s (2.2g/L)中比在Hanks′ (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagle′s液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks′液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagle′s液，。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks′液就可以了。 5. 培养液pH对细胞生长的影响? 由于大多数细胞适宜pH为7.2-7.4，偏离此范围可能对细胞生长将产生有害的影响。但各种细胞对pH的要求也不完全相同，原代培养细胞一般对pH变动耐受差，无限细胞系

食用菌液体菌种生产方法(发酵罐法)

食用菌液体菌种生产方法（发酵罐法）传统菌种生产工艺，一般是由试管母种扩繁成二级种、三级种，生产周期长、污染率高、成本高、需大量人工、管理困难。液体菌种生产具有纯度高、活力强、繁殖快的特点，接种到培养料内有流动性好、萌发点多，发菌迅速等特种点。应用于生产与固体菌种相比有以下优点： 1．菌种生产周期短。固体种一般需25—40天，而液体种仅需3—7天。 2．接种后，萌发点多萌发点多、发菌快、出菇周期短。接种24小时菌丝布满料面，3—15天长满菌袋，一般品种10天左右可出菇。 3．接种方便、成本低。用液体菌种接种一般每袋成本是1—3分，每人每小时可接800袋以上，提高效益4—5倍。 4．适宜工厂化生产。可直接用于栽培料进行出菇，大批量生产菌袋。为食用菌集约化、标准化生产创造了条件。因此，适宜我国国情的液体菌种设备的出现，必将在食用菌生产领域引发一场新的革命。液体菌种具有固体（颗粒）菌种无可比拟的优势，但是液体菌种生产设备是近几年刚发展起来并逐渐成熟的，因此很多人对此很陌生。在这里我们对此进行简单介绍一、液体菌种设备基本原理任何一种食用菌自身的生长必须满足其对温度、湿度、需氧量、养分等的需要，同时必须避免杂菌感染。在深层发酵技术上称之为选

择性发酵技术，如啤酒生产技术当属此例，而白酒生产则是生物菌群发酵技术。液体菌种发酵设备（包括四大系统，温控系统由控制器、电热管等组成；供气系统由空气压缩机、输送管道、空气过滤器等组成；冷却系统由热交换器、进出水管道组成；搅拌系统由射流器、提升管等组成。二、液体菌种生产的关键技术 1、溶氧量液体菌种生产中最关键的是培养液中氧的溶解量，因为在菌丝生长过程中，必须不断的吸收溶解其中的氧气来维持自身的新陈代谢，氧气在液体（水）中的溶解量与压力、温度有关，同时与培养液的接触面积、渗透压有很大的关系。因此我们设计发酵设备时有效地解决了这些问题，如安装射流器使气泡细碎度增加等。 2、空气过滤技术的关键就是保证进入的空气无菌度高，因此必须选择孔径小、材料先进的过滤膜。一般细菌直径在0.5-5um,酵母菌在1-10um，病毒一般在20-400mu，所以选择过滤膜时应综合考虑以上因素。当然如果选的太小，成本将大幅度提高。另外环境对于空气影响很大,在空气压缩机房、制种车间必须保持环境清洁。 3、培养液培养液是菌丝生长发育的营养源，要求营养全面均衡。不同的菌种对营养要求偏重不同。配制原料有糖、麸皮、磷酸二氢钾、硫酸镁、

培养基的几大分类

按照培养基的成分来分培养基按其所含成分，可分为合成培养基、天然培养基和半合成培养基三类。 (1)合成培养基。合成培养基的各种成分完全是已知的各种化学物质。这种培养基的化学成分清楚，组成成分精确，重复性强，但价格较贵，而且微生物在这类培养基中生长较慢。如高氏一号合成培养基、察氏(Czapek)培养基等。 (2)天然培养基。由天然物质制成，如蒸熟的马铃薯和普通牛肉汤，前者用于培养霉菌，后者用于培养细菌。这类培养基的化学成分很不恒定，也难以确定，但配制方便，营养丰富，所以常被采用。 (3)半合成培养基。在天然有机物的基础上适当加入已知成分的无机盐类，或在合成培养基的基础上添加某些天然成分，如培养霉菌用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。这类培养基能更有效地满足微生物对营养物质的需要。养基三类。 (1)固体培养基。是在培养基中加入凝固剂，有琼脂、明胶、硅胶等。固体培养基常用于微生物分离、鉴定、计数和菌种保存等方面。 (2)液体培养基。液体培养基中不加任何凝固剂。这种培养基的成分均匀，微生物能充分接触和利用培养基中的养料，适于作生理等研究，由于发酵率高，操作方便，也常用于发酵工业。 (3)半固体培养基。是在液体培养基中加入少量凝固剂而呈半固体状态。可用于观察细菌的运动、鉴定菌种和测定噬菌体的效价等方面。

培养基和霉菌培养基等四类。常用的细菌培养基有营养肉汤和营养琼脂培养基；常用的放线菌培养基为高氏1号培养基；常用的酵母菌培养基有马铃薯蔗糖培养基和麦芽汁培养基；常用的霉菌培养基有马铃薯蔗糖培养基、豆芽汁葡萄糖(或蔗糖)琼脂培养基和察氏培养基等。养基。 (1)加富培养基。是在培养基中加入血、血清、动植物组织提取液，用以培养要求比较苛刻的某些微生物。 (2)选择性培养基。是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。 (3)鉴别培养基。是在培养基中加入某种试剂或化学药品，使培养后会发生某种变化，从而区别不同类型的微生物。

厌氧培养

厌氧培养 1．厌氧缸法接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养，厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。 2．厌氧袋（Bio-bag）即在塑料袋内造成厌氧环境来培养厌氧菌。塑料袋透明而不透气，内装气体发生管（有硼氢化钠的碳酸氢钠固体以及5%柠檬酸安瓿）、美兰指示剂管、钯催化剂管、干燥剂。放入已接种好的平板后，尽量挤出袋内空气，然后密封袋口。先折断气体发生管，后折断美兰指示剂管，命名袋内在半小时内造成无气环境。如不突变表示袋内已达厌氧状态，可以孵育。 3．厌氧手套箱（Anaerobie glove box）是迄今为止国际上公认的培养厌氧菌最佳仪器之一。它是一个密闭的大型金属箱，箱的前面有一个有机玻璃做的透明面板，板上装有两个手套，可通过手套在箱内进行操作，故名。箱侧有一交换室，具有内外二门，内门通箱内先关着。欲放物入箱，先打开外门，放入交换室，关上外门进行抽气和换气（H2，CO2，N2）达到厌氧状态，然后手伸入手套把交换室内门打开，将物品移入箱内，关上内门。箱内保持厌氧状态，也是利用充气中的氢在钯的催化下和箱中钱残余氧化合成水的原理。该箱可调节温度，本身是孵箱或孵箱即附在其内，还可放入解剖显微镜便于观察厌氧菌菌落，这种厌氧箱适于作厌氧细菌的大量培养研究，大量培养基可放入作预还原和厌氧性无菌试验。金属硬壁型厌氧箱的抽气、充气、厌氧环境和温度等均系自动调节。 4.厌氧盒：原理同厌氧袋，有成品销售。 5.生物耗氧法：在一密闭的容器内放以生物（多是植物），消耗氧气，同时产生二氧化碳，供细菌生长用。我没见过。 6.焦性末食子酸法：在一洁净的玻片上铺上纱布或滤纸，均匀撒上焦性末食子酸，然后再混入NaHCO3粉末或NaOH溶液，迅速将已接种细菌的平板倒扣在上面，用融化的白蜡封边，造成一个封闭空间。焦性末食子酸与碱反应后耗氧。该法用于厌氧不严格的厌氧菌的培养，简单。如有梭状芽孢杆菌。 7.疱肉培养基：本身就是一个不需特殊设备的厌氧培养法。疱肉和肉汤装入大试管，液面封凡士林，造成无氧环境。

食用菌液体培养技术的发展与应用(一)

食用菌液体培养技术的发展与应用(一) 论文关键词食用菌液体培养；发展状况；优势；应用前景论文摘要食用菌液体培养技术因其生产周期短、产量大、质量高、经济效益突出等优势而被广泛研究和应用。对食用菌液体培养技术的发展、食用菌液体菌种技术的优势以及液体培养技术在食品、医药等行业中的应用前景作了综述。食用菌液体培养又称深层发酵或液体发酵。主要原理是在发酵罐或三角瓶中加入液体培养基，通入无菌空气以增加培养基中溶氧含量，提供食用菌菌丝体呼吸代谢所需要的氧气，同时加以搅拌或振荡，并控制适宜的外界条件等，使菌体在液体深处繁殖发育，获得大量的菌丝体或代谢产物。目前，国外的食用菌深层发酵研究主要是获取风味物质（食品）和特殊代谢产物（医药、饲料），国内研究则集中在液体菌种的生产及提取代谢产物等1，2]。本文对食用菌液体培养技术的发展、液体培养技术生产食用菌菌种的优势及其在食品、生物医药等行业中的应用和发展前景等加以介绍。 1食用菌液体培养技术发展状况 1.1食用菌液体培养法的起源与发展食用菌的液体发酵是在抗生素发酵技术的基础上发展起来的，1947年美国的汉姆非特（HumfeldH）首先提出了液体培养法生产蘑菇菌丝体。1948~1954年他们选出了适合液体培养的蘑菇菌株。1953年美国人布洛克博士（S.S.Block）用废柑汁深层培养出了野生蘑菇。1958年沙克斯（SzuecsJ）第1个在发酵罐内培养出羊肚菌菌丝球。日本的杉森恒武等于1977年用1%的有机酸和0.5%的酵母膏组成液体培养基，取得大量香菇菌丝体。从此，食用菌的培植开始从农业生产跨入了工业生产的领域。 1.2我国食用菌液体培养技术的发展我国是在1958年开始研究蘑菇、侧耳深层发酵。到1963年，已经能进行羊肚菌的工业化商品生产。从此，食用菌产品的获得开始由简单的农业种植而转入工业发酵生产。20世纪60年代末期，我国已能大规模采用深层发酵法生产食用菌，主要研究单位有四川抗生素研究所、三明真菌研究所、中国医药科学院药物研究所、上海新型发酵厂等。研究主要集中在药用菌的生产，如灵芝、蜜环菌、银耳芽孢等菌类3]。20世纪70年代开始研究香菇、冬虫夏草、猴头、黑木耳等食用菌的液体发酵。20世纪90年代，由于发现食用菌多糖有抗癌活性，使得一些具有生理活性物质的菌类（如云芝、灰树花等）引起了更多的关注，针对这些菌类的深层发酵培养技术的研究也得到长足发展。目前对食用菌液体发酵的报道很多，而在利用液体菌种直接用来生产食用菌子实体方面，国内只有少量的报道4]。如甘肃省科学院生物研究所的李玉珍等研究了侧耳液体菌种在不同培养料上的性状表现，重庆师专的朱健勇等进行了液体发酵菌种生产金针菇子实体的试验，得到了菌丝生活力强、接种面大、发菌速度快的一些结果。但是这些试验一般也都停留在实验室阶段，没能在生产上推广应用。究其主要原因，是因为液体深层发酵的设备投入大、风险高，一般个体生产户不愿投入；接种技术不过关，在接种过程中往往容易产生污染；菌种不易保存，发酵以后必须马上投入使用等，因而造成了液体菌种生产子实体技术一直未能推广应用。 2液体培养技术制备食用菌菌种的优势 2.1生产周期短制备液体菌种一般只要5~7d，周期短，速度快。而培养1瓶固体栽培菌种需要30d左右，仅发菌时间就比固体菌种减少了1/2以上。此外，用液体菌种作为母种或原种来扩大培养原种或栽培种时，也要比采用固体菌种快得多。一般液体种要比固体种提前成熟10~20d。因为液体菌种有流动性，各个菌丝球和菌丝片断可以流散在不同的部位萌芽，发育点多，内外上下一起长，6~12h菌丝萌发，15~20d可长满栽培袋，大多数品种10多天就可出菇。

我国传统白酒固态酿造和液态食用酒精发酵的对比研究

我国传统白酒固态酿造和液态食用酒精发酵的对比研究摘要：我国的酒文化源远流长，酒制品的酿造一直有自己独特的方式。近年来，酒精制品的作用逐渐显著，被广泛的运用到各个领域中，如医疗、工业生产等，酒精的发酵问题逐渐的受到了关注。我国白酒的固态酿造工艺与液态发酵的食用酒精发酵技术存在一些相似之处，但也存在着更大的不同。本文根据中国传统白酒酿造与食用酒精液态发酵的工艺和特点，从酿造方式、所用原料等方面进行了比较和分析，为后续研究提供参考。关键词：生产原料；预处理方法；比较；引言我国是白酒的起源之地，古代便利用谷物自然发酵进行提炼，可以获得高纯度的白酒。我国白酒的品种繁多，口感丰富，可以说，我国的酒文化享誉全球。从古至今，酒一直都是人们生活中不可或缺的要素，从古人的“劝君更进一杯酒”，到如今的餐厅对饮，酒产品丰富了人们的生活。液态发酵的食用酒精已经成为现代发展的基础化工原料，在各个领域都发挥着重要的作用。二者进行参考比较，既可以改善白酒的酿造水平，提高酿造效率，也能为液态发酵的食用酒精保留住白酒特有的风味提供思路，从而带动二者的共同进步。 1生产原料的比较食用酒精液态发酵是建立在传统酿酒工业的基础上得出的，其应用领域越来越广泛，带动了下游产业的发展。由于生物酶的特异性，发酵得到的食用酒精纯度极高，已经替代工业酒精，在下游化工行业得到广泛应用。食用酒精液态发酵同时借鉴其它工业产品生产过程及技术其自身也在不断进步和发展。早在二十世纪初期阶段，我国液态发酵的食用酒精产业开始起步，并不断的进步与更新，同时，白酒的酿造工艺也不断的得到优化。研究二者的不同可以带动双方水平的提高。二者明显的区别是原材料的不同，原材料的质量与酿造的质量息息相关。我国传统酿酒技术所使用的原材料大多是优质谷物，如高粱、大米、小麦等谷物，这些谷物丰富的有机物组份造成所酿造的白酒营养成分较高，口感醇爽，对人的身体有一定的益处。白酒的生产原料本身具有较高的营养物质，如小麦中所含的淀粉含量较高，具有丰富的氨基酸物质，发酵后产生的微量有益物质能够有效的促进人体新陈代谢，所以一直以来都是进行白酒酿造的主要原料。高粱产品是酿酒中使用频率最高的一种，它含有大量的淀粉物质，出酒率较高。同时，高粱谷物的栽种较为容易，能够大面积的种植，市场价格较低，作为白酒的生产原料能有有效的降低生产成本，因此很受当下制酒企业的欢迎。与传统的白酒酿造原料相比，液态发酵的食用酒精所需原材料来源广泛。除了传统的淀粉质原料外，还可以用其它的糖质和纤维素原料进行酒精发酵。纤维素原料满足了当下我国所提倡的可持续发展的战略目标。纤维素可以通过生物酶等预处理手段获得酵母发酵所需要的糖原料，从而液体发酵获取食用酒精。目前大自然中存在大量未被利用的纤维素原料，如果能够有效的收集并利用，就可以避免资源的浪费，实现有效的生物质循环链。近年来，随着食用酒精液态发酵法所需的原料价格逐渐走高，我国大量科研院校开始针对廉价的纤维素进行研究，国家也在大力发展纤维素乙醇。纤维素乙醇符合不与农争地的原则，能够获得国家和农业部的大力支持。同时发展纤维素乙醇可以大量的减少废弃物对于环境的污染，达到了保护土地和水资源等的效果，能够获得生态环保部的支持。当然，由于纤维素中含有较多的杂质，其只适合现代化的液态发酵和精馏工艺，通过多道提纯手段达到食用标准。所以纤维素乙醇是未来液态发酵食用酒精的主要原材料之一，具有很大的发展空间。 2预处理方法的比较白酒酿造技术与食用酒精液态发酵技术的预处理方法上有很大的不同。在白酒的酿酒过程中，由于原材料内部的淀粉等物质成颗粒状，具有不容易被水解的特点，因此在酿造的过程中需要对原料进行适当的预处理。传统酿酒工艺中预处理技术主要是对原材料只进行蒸煮等相关处理，破坏细胞的同时达到杀菌作用，细胞破坏后淀粉物质流出，高温让淀粉链打断从而降

培养基的类型及应用

培养基的类型及应用培养基种类繁多, 根据其成份、物理状态和用途可将培养基分成多种类型。 1．按成份不同划分 (1)天然培养基(complex medium) 这类培养基主要以化学成分还不清楚或化学成分不恒定的天然有机物组成, 牛肉膏蛋白胨培养基和麦芽汁培养基就属于此类。基因克隆技术中常用的 LB(Luria-Bertani) 培养基也是一种复合培养基,其组成见表4-10。常用的天然有机营养物质包括牛肉浸膏、蛋白胨、酵母浸膏( 表4-11 ) 、豆芽汁、玉米粉、土壤浸液、麸皮、牛奶、血清、稻草浸汁、羽毛浸汁、胡罗卜汁、椰子汁等, 嗜粪微生物(coprophilous microorganisms) 可以利用粪水作为营养物质。复合培养基成本较低, 除在实验室经常使用外, 也适于用来进行工业上大规模的微生物发酵生产。 (2)合成培养基(synthetic medium) 合成培养基是由化学成份完全了解的物质配制而成的培养基，也称化学限定培养基(chemically defined medium), 高氏1 号培养基和查氏培养基就属于此种类型。配制合成培养基时重复性强, 但与天然培养基相比其成本较高, 微生物在其中生长速度较慢, 一般适于在实验室用来进行有关微生物营养需求、代谢、分类鉴定、生物量测定、菌种选育及遗传分析等方面的研究工作。 2．根据物理状态划分根据培养基中凝固剂的有无及含量的多少, 可将培养基划分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基三种类型。 (1)固体培养基(solid medium) 在液体培养基中加入一定量凝固剂即为固体培养基。理想的凝固剂应具备以下条件:1. 不被所培养的微生物分解利用;2. 在微生物生长的温度范围内保持固体状态。在培养嗜热细菌时,由于高温容易引起培养基液化, 通常在培养基中适当增加凝固剂来解决这一问题;3. 凝固剂凝固点温度不能太低, 否则将不利于微生物的生长;4. 凝固剂对所培养的微生物无毒害作用;5. 凝固剂在灭菌过程中不会被破坏;6. 透明度好,粘着力强;7. 配制方便且价格低廉。常用的凝固剂有琼脂(agar) 、明胶(gelatin) 和硅胶(silica gel) 。表4-12 列出琼脂和明胶的一些主要特征。对绝大多数微生物而言, 琼脂是最理想的凝固剂, 琼脂是由藻类(海产石花菜) 中提取的一种高度分支的复杂多糖；明胶是由胶原蛋白制备得到的产物, 是最早用来作为凝固剂的物质, 但由于其凝固点太低, 而且某些细菌和许多真菌产生的非特异性胞外蛋白酶以及梭菌产生的特异性胶原酶都能液化明胶, 目前已较少作为凝固剂；硅胶是由无机的硅酸钠(Na2SiO3) 及硅酸钾(K2SiO3) 被盐酸及硫酸中和时凝聚而成的胶体,它不含有机物, 适合配制分离与培养自养型微生物的培养基。除在液体培养基中加入凝固剂制备的固体培养基外, 一些由天然固体基质制成的培养基也属于固体培养基。例如, 由马铃薯块、胡罗卜条、小米、麸皮及米糠等制成固体状态的培养基就属于此类。如生产酒的酒曲，生产食用菌的棉子壳培养基。在实验室中，固体培养基一般是加入平皿或试管中，制成培养微生物的平板或斜面。固体培养基为微生物提供一个营养表面，单个微生物细胞在这个营养表面进行生长繁殖，可以形成单个菌落。固体培养基常用来进行微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏等。